KR102241282B1 - 씀바귀 추출물 또는 이의 유효성분을 포함하는 상아질 또는 치수조직 재생용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발병은 씀바귀 추출물 또는 이의 유효성분을 포함하는 상아질 또는 치수조직 재생용 조성물에 관한 것이다.

Description

씀바귀 추출물 또는 이의 유효성분을 포함하는 상아질 또는 치수조직 재생용 조성물 {Composition for hard tissue formation and, dentin or pulp regeneration containing Ixeris dentata extract and its active compound}
본 발병은 씀바귀 추출물 또는 이의 유효성분을 포함하는 상아질 또는 치수조직 재생용 조성물에 관한 것이다.
충치, 즉 치아우식증은 플랙(치면세균막)내의 세균(S. mutans)이 배설하는 산에 의해서 치아 표면의 칼슘과 인 같은 무기질이 빠져나가고 그 속의 단백질과 같은 유기질이 용해되어 결국 치아의 파괴 현상을 초래하는 증상을 말한다. 이러한 산은 플랙(치면세균막)의 수소이온농도를 pH 4.0 내지 4.5까지 낮출 수 있다. 일반적으로 수소이온농도지수가 pH 5.0 ~ 5.5 정도 이하이면 치면의 탈회(Demineralization)가 일어나게 되는데 치면에 부착된 플랙의 세균이 배설하는 산에 의해 치면의 탈회가 일어나는 현상을 치아우식이라고 한다. 치아우식 발생에 작용하는 인자는 환자 자신의요인(치아의 위치, 형태, 타액의 양과 점조도, 유전, 질병, 임신), 세균요인(구강내 산성세균의 종류, 양, 활동성 등) 및 환경요인(구강 위생 상태, 음식의 종류, 식수의 불소농도 등) 이 3가지가 합쳐지는 곳에서 치아우식이 발생하며 여기에 시간 요인이 합쳐져서 치아우식이 진행되게 된다.
초기 우식 단계에는 치과에서 우식된 부위를 치과용 드릴로 긁어내고 그 자리에 아말감, 금 또는 레진(합성수지의 일종)과 같은 치과용 재료로써 채워주는 충전 치료가 필요하다. 이 경우에는 신경치료로 치료가 되는 경우도 있지만 대부분의 경우 치료가 불가능하여 치아를 뽑게 된다. 충치치료를 한 후 충전물이 깨지거나 충전물과 치질사이에 또다시 우식이 발생될 수 있게 된다.
인간 유래 치수줄기세포 (human dental pulp stem cells; HDPSCs)는 치아의 내부에 있는 치수 조직에서 얻을 수 있다. 치수줄기세포는 중간엽 줄기세포 (MSC)와 같은 다분화능을 가지는 세포로써 상아질 이외에 뼈 조직, 혈관, 치수 결체조직 및 신경 등으로 분화될 수 있다. 한편 치아에서 상아 전구세포에서 치아 발생(odontogenesis)을 통해 상아질을 만든다. 상아질은 법랑질, 백악질과 함께 치아를 구성하고 있는 고도로 석회화된 경조직들 중 하나이다. 상아질은 상아질 모세포라는 전구세포가 유리하는 신호분자와 단백질에 의해 주변 기질의 석회화를 유도함으로써 형성된다. 그러나 충치나 외상 등에 의해 이들 조직에 손상이 생길 경우 재생되기 매우 어려우므로 현재 치과적인 치료법은 치아 경조직과 유사한 물성을 지닌 치과용 재료로 치아를 충전하는 방식에 의하고 있다. 따라서 상아질로만 특정하게 분화될 수 있는 상아 전구세포를 치수줄기세포로부터 얻기 위한 최적의 분화 조건에 대한 연구의 필요성이 있다. 예를 들어 한국출원특허번호 제10-2016-0179277호에 개시되어 있는 치수줄기세포의 상아 전구세포로의 분화용 조성물과 같은 것이 있다. 그러나 치아재생에 효과가 있다고 알려진 화합물과는 다른 부작용이 없는 천연물 성분의 치아재생 촉진용 조성물의 개발이 절실히 필요한 상태이다.
씀바귀(Ixeris dentata NAKAI)는 국화과(Compositae)에 속하는 다년생 초본으로서, 전초를 산고매라고 지칭하며, 동속 식물로서는 선씀바귀(Ixeris chinensis NAKAI), 벋은 씀바귀(Ixeris debilis A. GARY) 등이 있으며, 요로결석, 폐렴, 타박상 등의 치료에 사용되어 온 바 있다. 본원 발명자들은 씀바귀 메탄올 추출물을 대상으로 하여, 구강 건조증에 대한 억제효과를 확인하여 문헌에 발표한 바가 있다.
이에 본 발명자들은 섭취가 용이하고 인체에 안전하며 구강건강을 증진 시킬 수 있는 물질을 찾고자 연구 노력한 결과, 씀바귀 에탄올 추출물과 유효성분을 7일과 14일 동안 처리시 Alizarin red 염색을 통한 mineralization이 증가하였고 ALP 활성도도 증가함을 확인하였다. 이를 통해 씀바귀를 이용한 osteogenic effect가 높았으며, 분화능력에 영향을 미치는 것을 확인하였다. 씀바귀 추출물이 손상된 골의 재생을 위한 조직공학에서 중요한 공급원으로 사용이 가능함을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명자들은 치수줄기세포로부터 상아질 또는 치수조직으로 분화 될 수 있는 상아질 전구세포로의 최적의 분화 조건에 대하여 연구하였다. 씀바귀 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물 익세린(ixerin) M, (ID-56D1B) 화합물을 치수줄기세포에 처리한 결과, 상아 전구세포로 분화가 증가하여 osteogenic 및 odontogenic mineralization을 증가시키고, 이와 관련된 바이오마커의 발현을 증가시키는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기의 목적을 달성하기 위해 본 발명은 씀바귀 추출물 또는 이로부터 분리된 익세린(ixerin) M, (ID-56D1B) 화합물을 포함하는 치수줄기세포의 상아 전구세포로의 분화 유도용 조성물을 제공할 수 있다.
상기 조성물에 덱사메타손 (dexamethasone)을 추가로 더 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 치수 줄기세포에 씀바귀 추출물 또는 이로부터 분리된 익세린(ixerin) M, (ID-56D1B) 화합물을 처리하는 단계;를 포함하는 치수줄기세포의 상아 전구세포로의 분화 유도방법을 제공할 수 있다.
상기 처리는 7일 내지 14일 동안 수행될 수 있다.
본 발명은 씀바귀 추출물 또는 이로부터 분리된 익세린(ixerin) M, (ID-56D1B) 화합물을 포함하는 치수줄기세포의 상아 전구세포로의 분화 유도용 키트를 제공할 수 있다.
본 발명은 또한 씀바귀 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물 익세린(ixerin) M, (ID-56D1B) 화합물을 포함하는 상아질-치수질환 또는 치주질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 상아질, 뼈 또는 백악질을 포함하는 경조직 또는 치수조직의 재생을 촉진시키는 것일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 치수세포에서 상아모세포, 뼈모세포 또는 백악모세포의 분화를 촉진시키는 것일 수 있다.
상기 상아질-치수질환은 상아질 지각과민증, 치수충혈, 치수염, 치수변성 또는 치수의 괴사 또는 괴저증일 수 있다.
상기 치주 질환은 치은염, 치주염, 치주낭 또는 치주농양일 수 있다.
본 발명의 씀바귀 추출물 또는 이의 유효성분을 인간 치주 줄기 세포 (human dental pulp stem cells' HDPSCs)에 처리한 결과 osteogenic 및 odontogenic mineralization이 증가하는 효과가 있다. 씀바귀 추출물 및 이의 유효성분인 Ixerin M은 osteogenic 및 odontogenic mineralization의 바이오 마커인 ALP, OSTEOCALCIN, BSP, DSPP, DMP-1 및 RUNX2의 발현을 각각 증가시키는 효과가 있다. 상기 Ixerin M 및 덱사메타손을 치주 줄기 세포 (human dental pulp stem cells' HDPSCs)에 동시에 처리한 결과, Ixerin M 및 덱사메타손을 각각 단독으로 처리한 군에 비해 osteogenic 및 odontogenic mineralization이 더욱 증가하고, ALP 활성 및 발현을 증가 시켜 석회화를 증가시키는 효과가 있다.
도 1은 씀바귀를 농도별 에탄올로 추출한 후, 상기 각기 다른 씀바귀 에탄올 추출물을 21일 동안 처리한 후 Alizarin red 염색을 실시한 결과이다.
도 2는 각기 다른 씀바귀 에탄올 추출물 및 씀바귀의 유효 성분을 같이 21일 동안 처리한 후 Alizarin red 염색을 실시한 결과이다.
도 3은 씀바귀 에탄올 추출물 및 씀바귀의 유효 성분을 각각 21일 동안 처리한 후 osteogenic 및 odontogenic mineralization 마커인 ALP, OSTEOCALCIN, BSP, DSPP, DMP-1 및 RUNX2의 발현을 확인한 결과이다.
도 4는 Ixerin M와 dexametasone을 21일 동안 처리한 후 Alizarin red 염색을 실시한 결과이다.
도 5은 Ixerin M와 dexametasone을 21일 동안 처리한 후 ALP 활성도 및 발현을 확인한 결과이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
충치나 외상 등에 의해 이들 조직에 손상이 생길 경우 재생되기 매우 어려우므로 현재 치과적인 치료법은 치아 경조직과 유사한 물성을 지닌 치과용 재료로 치아를 충전하는 방식에 의하고 있다. 따라서 상아질로만 특정하게 분화될 수 있는 상아 전구세포를 치수줄기세포로부터 얻기 위한 최적의 분화 조건에 대한 연구의 필요성이 있다. 이에 본 발명자들은 섭취가 용이하고 인체에 안전하며 구강건강을 증진 시킬 수 있는 물질을 찾고자 연구 노력한 결과, 씀바귀 에탄올 추출물 또는 이로부터 분리한 유효성분 익세린 M을 치수줄기세포에 처리한 결과, 상아 전구세포로 분화가 증가하여 osteogenic 및 odontogenic mineralization을 증가시키고, 이와 관련된 바이오마커의 발현을 증가시키는 것을 확인하였다. 또한 상기 익세린 M과 덱사메타손을 함께 치수줄기세포에 처리한 결과, 상아 전구세포로 분화가 증가하여 osteogenic 및 odontogenic mineralization을 더욱 증가시키고, ALP 활성을 증가시켜 석회화가 증가되는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 씀바귀 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물 익세린(ixerin) M, (ID-56D1B) 화합물을 포함하는 치수줄기세포의 상아 전구세포로의 분화 유도용 조성물을 제제공할 수 있다.
씀바귀(Ixeris dentata NAKAI)는 국화과(Compositae)에 속하는 다년생 초본으로서, 전초를 산고매라고 지칭하며, 동속 식물로서는 선씀바귀(Ixeris chinensis NAKAI), 벋은 씀바귀(Ixeris debilis A. GARY) 등이 있으며, 요로결석, 폐렴, 타박상 등의 치료에 사용되어 온 바 있다. 본원 발명자들은 씀바귀 메탄올 추출물을 대상으로 하여, 구강건조증에 대한 억제효과를 확인하여 문헌에 발표한 바가 있다. 그러나 치수줄기세포의 상아 전구 세포로의 분화를 증가시킨다는 것은 개시가 없다.
상기 씀바귀 추출물의 씀바귀는 재배한 것 또는 시판되는 것 등 제한 없이 사용할 수 있다. 상기 씀바귀은 씀바귀의 뿌리, 줄기, 잎 또는 전초 모두 이용 가능하며, 이에 한정되지 않는다.
치수 줄기세포에 분화제를 처리하지 않은 대조군 (BM)에서는 분화능에서는 효과가 없었지만, 60% 에탄올 추출물을 처리한 군에서는 다른 에탄올 추출물을 처리한 군에 비해 색상이 진해짐을 확인하였다 (도 1). 이는 60% 에탄올 추출물에서 osteogenic 및 odontogenic mineralization이 증가함을 확인하였다.
상기 추출물은 물, C1 내지 C2의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출한 것일 수 있으며, 자세하게는 물, 메탄올, 에탄올 및 이들의 혼합 용매로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 용매로 추출한 것일 수 있다. 바람직하게는 에탄올 추출을 할 수 있으며, 상기 에탄올은 20%, 40%, 60%, 80% 및 100% 에탄올을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 40 내지 80% 에탄올 일 수 있고, 더 바람직하게는 60% 에탄올 일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
씀바귀 추출물의 추출 방법으로는 여과법, 열수 추출, 침지 추출, 환류냉각 추출 및 초음파추출 등 당업계의 통상적인 방법을 이용할 수 있다. 상기 추출용매는 건조된 씀바귀 분량의 2 내지 20 배 첨가하여 추출하는 것이 바람직하다. 추출온도는 20 내지 80℃인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 추출시간은 10 내지 100 시간인 것이 바람직하며, 구체적으로 24 내지 96 시간이 더욱 바람직하고, 보다 구체적으로 72 시간이 가장 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 씀바귀로 부터 분리된 화합물 익세린(ixerin) M, (ID-56D1B) 화합물의 제조 방법은 한국출원특허 제 10-2016-0011329에 개시된 것일 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다. 씀바귀 유효성분인 (ID-57D, Ixerin M, ID-54E과 cynaroside)에서 osteogenic 및 odontogenic mineralization의 효과를 연구하고자 인간유래치수줄기세포에 14일 동안 처리한 후, Alizarin-red Solution을 염색을 통해 분화능을 확인 한 결과, 분화제를 처리하지 않은 대조군 (BM)에서는 분화능에서는 효과가 없었지만, 씀바귀 유효성분인 Ixerin M이 다른 유효성분에 비해 색상이 진해짐을 확인하였다(도 2).
이에 대해 씀바귀 60% 에탄올 추출물과 유효성분인 Ixerin M이 다른 유효성분에 비해 osteogenic 및 odontogenic 마커인 ALP, OSTEOCALCIN, BSP, DSPP, DMP-1와 RUNX2의 발현이 증가함을 확인하였다 (도 3). 자세하게는 60% 에탄올 추출물과 유효성분인 Ixerin M은 인간유래치수줄기세에서 상아모세포 분화 마커 유전자인 DSPP(Dentin sialophosphoprotein)의 유전자 발현수준을 증가시켰다. 또한 뼈모세포 및/또는 백악모세포 분화 마커 유전자인 DMP1(dentin matrix protein 1) 및 BSP(Bone sialoprotein) 유전자의 발현수준을 증가시켰다. Osteocalcin은 뼈와 상아질에서 발견되는 비 콜라겐 성 단백질 호르몬으로 골 형성 촉진 또는 뼈 형서에 관여한다. 씀바귀 60% 에탄올 추출물과 유효성분인 Ixerin M은 Osteocalcin의 유전자의 발현수준을 증가시켰다. RUNX2은 골아 세포의 분호와 관련된 중요한 전사이다. RUNX2은 미성숙 골아 세포에서 상향 조절되고, 성숙 골아 세포에서는 하향 조절 되며, 미성숙 골아 세포로의 다능성 중간엽 세포의 분화를 유도하고 골아 세포 분화 및 골 기질 유전자를 유지하는 몇 가지 핵심 하류 단백질의 발현을 활성화한다. RUNX2가 증가하면 골아 세포의 분화가 활성화 되는데 씀바귀 60% 에탄올 추출물과 유효성분인 Ixerin M은 RUNX2의 발현 수준을 증가시켰다.
DMP1 및 BSP 유전자의 mRNA 발현 수준이 증가되면, 뼈모세포 및/또는 백악모세포의 분화와, 뼈 및/또는 백악질의 재생이 촉진된다고 알려져 있으므로, 상기 DMP1 및 BSP 유전자의 mRNA 수준을 증가시키는 효과를 나타내는 씀바귀 60% 에탄올 추출물과 유효성분인 Ixerin M은 뼈모세포 및/또는 백악모세포의 분화와, 뼈 및/또는 백악질의 재생을 촉진하는 효과를 나타냄을 알 수 있었다
상술한 바와 같이 본원에 따른 씀바귀 60% 에탄올 추출물과 유효성분인 Ixerin M은 치계(dental origin)인 인간 치수세포에서 상아모세포, 뼈모세포 및/또는 백악모세포의 분화를 촉진한다. 이에 더해, 사람의 사랑니 등에서 분리할 수 있는 인간 치수줄기세포(humandental pulp stem cell; hDPSC)는 일반적으로 인간 치수세포에 혼재되어 있으며, 상아모세포, 뼈모세포 및/또는 백악모세포로 분화 가능하므로, 본원에 따른 씀바귀 60% 에탄올 추출물과 유효성분인 Ixerin M은 는 인간 치수줄기세포의 상아모세포, 뼈모세포 및/또는 백악모세포로의 분화를 촉진하는 효과를 나타낼 수 있음을 알 수 있다.
상기 조성물에 덱사메타손 (dexamethasone)을 추가로 더 포함할 수 있다.
상기 익세린(ixerin) M 및 덱사메타손 (dexamethasone)을 동시에 인간유래치수줄기세포에 처리한 결과, 각각 단독으로 처리한 군 보다 Ixerin M와 dexametasone을 동시에 처리하였을 때 Alizarin-red Solution의 염색이 더 많이 증가하였고, 이는 Ixerin M와 dexametasone가 osteogenic 및 odontogenic mineralization에 시너지 효과가 있음을 알 수 있었다 (도 4). 또한 ALP Solution으로 염색한 후 ALP 발현과 활성도를 측정한 결과, Ixerin M와 dexametasone 단독 처리한 군에 비해 Ixerin M와 dexametasone을 동시에 처리하였을 때 ALP 활성도가 더 많이 증가하는 것을 화인하였고, Ixerin M와 dexametasone가 ALP의 활성에 시너지 효과가 있어 더 많은 석회화가 이루어짐을 확인하였다 (도 5). 웨스턴블랏으로, 상기 osteogenic 및 odontogenic mineralization와 관련된 바이오 마커를 확인한 결과, 발현량이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
상아 전구세포(odontoblast)는 상아질(dentin)과 닿아있으며, 상아질을 형성하는 원주형 세포로 기능적으로 치아의 주된 구성성분인 상아질을 직접적으로 만드는 역할을 하며, 이 세포자체는 상아질 내측에 존재하는 치수(pulp) 조직의 한 구성성분으로 치아 내부의 치수강 벽에 배열되어 존재한다. 치아의 대부분을 차지하는 상아질은 상아 전구세포로부터 형성된다. 상아질은 치아의 중요한 구성 성분으로서, 치관과 치근의 대부분을구성하며, 치아의 맹출 후에는 외부 자극에 반응하여 2차 상아질을 형성함으로 치수(pulp)를 보호하는 작용을 한다.
본 발명에서 치수줄기세포(dental pulp stem cell)는 치계 (dental origin) 중간엽 줄기세포의 일종으로, 상기치계 중간엽 줄기세포는 ‘치계상피세포의 영향을 받은 (일부분의) 줄기세포들을 의미하며, 중배엽성 기원으로 치아내부의 치수와 치아 주위조직에 분포하는 줄기세포를 말한다. 예컨대 치수줄기세포(dental pulp stem cell (DPSC)), 탈락 유치 줄기세포(stem cell from exfoliated deciduous teeth (SHED)), 치주 인대 줄기세포 (periodontal ligament stem cells (PDLSC)), 치근단 유두 줄기세포(stem cell from the apical papilla (SCAP), 및 치배 줄기세포(dental follicle precursor cells (DFPC))가 있다.
본 발명에서 치수줄기세포는 동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간 유래의 세포일 수 있다.
본 발명의 치수줄기세포는 자가 (autologous), 동종 (allogenic), 이종(xenogenic) 세포일 수 있다.
치수줄기세포는 치아내부의 치수와 치아 주위 조직에 존재하고, 이를 분리 및 배양하는 과정은 당업계에 잘 알려져 있다.
본 발명에서 씀바귀 추출물 또는 씀바귀로 부터 분리된 화합물 익세린(ixerin) M, (ID-56D1B) 화합물은 치수줄기세포가 상아 전구세포로 분화의 분화 효율이 유의적으로 증가하고 기질의 석회화를 유도하며, 상아 전구세포의 상아질로의 분화능이 향상된다. 따라서 치수줄기세포의 상아 전구세포로의 분화용 조성물 또는 키트에 사용될 수 있고 상아질을 재생시켜 치수와 상아질의 손상을 회복시킬 수 있는 효과가 있다.
본 발명은 치수 줄기세포에 씀바귀 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물 익세린(ixerin) M, (ID-56D1B) 화합물을 처리하는 단계;를 포함하는, 치수줄기세포의 상아 전구세포로의 분화 유도방법을 제공할 수 있다.
상기 처리는 7일 내지 14일 동안 수행할 수 있다.
본 발명은 씀바귀 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물 익세린(ixerin) M, (ID-56D1B) 화합물을 포함하는 상아질-치수질환 또는 치주질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 상아질, 뼈 및 백악질을 포함하는 경조직 또는 치수조직의 재생을 촉진시키는 것일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 치수세포에서 상아모세포, 뼈모세포 또는 백악모세포의 분화를 촉진시키는 것일 수 있다.
본 발명의 용어 "상아질-치수질환"이란, 상기 치수조직의 손상으로 인하여, 치수조직과 이에 결합된 상아질이 손상되어 발병되는 질환을 의미한다
상기 상아질-치수질환은 상아질 지각과민증, 치수충혈, 치수염, 치수변성 또는 치수의 괴사 또는 괴저증인 것일 수 있다. 본 발명의 용어 "치주질환(periodontal disease)" 이란, 풍치라고도 하며, 치은(잇몸)과 치아 사이의 틈에 박테리아가 감염되어 치주인대와 인접조직을 손상시키는 질환을 의미하는데, 병증의 정도에 따라 치은염과 치주염으로 구분된다. 상기 치주질환의 발병시 염증이 진행되어 더 많은 조직이 손상되면서 치주낭(periodontal pocket)이 형성되고, 치주염이 심할수록 치주낭의 깊이가 깊어지게 되는데, 치주낭이 깊어지면서 치주인대에 염증이 생기게 되고 최종적으로는 골소실이 유발된다고 알려져 있다.
상기 치주질환은 치은염, 치주염, 치주낭 또는 치주농양인 것일 수 있다.
본 발명의 용어 "예방"이란, 본 발명의 약학 조성물의 투여로 상아질-치수질환 및/또는 치주질환의 발생을 저해 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 용어 "치료"란, 본 발명의 약학 조성물을 상아질-치수질환 및/또는 치주질환의 치료가 요구되는 개체에 투여하여, 상아질 또는 치수조직의 재생을 촉진함으로써 치수질환의 치료가 수행되도록 하는 모든 행위, 및/또는 뼈와 백악질의 재생을 촉진함으로써 치주질환의 치료가 수행되도록 하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 약학 조성물은, 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체(자연적 또는 비자연적 담체), 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 상아질-치수질환 및/또는 치주질환을 치료용 약학 조성물의 형태로 제조될 수 있다. 구체적으로, 상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 상아질-치수질환 및/또는 치주질환이 유발된 부위에 투여할 수 있는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에서, 상기 약학조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조 에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 콜라겐 등을 들 수 있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 특히, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제, 연고제(예를 들어, 치수이장재 등) 등이 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에 포함된 씀바귀 추출물의 농도는 10 내지 500 ug/ml 일 수 있으며 바람직하게는 100 내지 500 ug/ml일 수 있다. 씀바귀로부터 분리된 화합물 익세린(ixerin) M, (ID-56D1B) 화합물의 농도는 10 내지 100 ug/ml일 수 있으며, 바람직하게는 5 내지 100 ug/ml일 수 있다. 상기 씀바귀 추출물 또는 씀바귀로부터 분리된 화합물 익세린(ixerin) M, (ID-56D1B) 화합물의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 최종 조성물 총 중량을 기준으로 0.0001 내지 50 중량%, 보다 바람직하게는 0.01 내지 20 중량%의 함량으로 포함될 수 있다.
상기 본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 단독으로 투여하거나 공지된 상아질-치수질환 및/또는 치주질환을 치료용 약학 조성물과 병용하여 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
본 발명의 약학 조성물의 투여량은 사용목적, 질환의 중독도, 환자의 연령, 체중, 성별, 기왕력, 또는 유효성분으로서 사용되는 물질의 종류 등을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물은 성인 1인당 약 0.1 ng 내지 약 100 mg/kg, 바람직하게는 1 ng 내지 약 10 mg/kg로 투여할 수 있고, 본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명은 다른 하나의 양태로서 상기 약학 조성물을 약제학적으로 유효한 양으로 상아질-치수질환 및/또는 치주질환이 발병된, 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상아질-치수질환 및/또는 치주질환의 예방 또는 치료방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 용어 "개체"란 상아질-치수질환 및/또는 치주질환의 치료가 요구되는 쥐, 가축 등을 포함하는 포유동물 등을 제한 없이 포함할 수 있으나, 상기 질환이 발병된 개체 중에서 인간을 제외한다.
본 발명의 약학 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여도 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 목적하는 바에 따라 구강내 투여 또는 구강내 주사 등의 경로를 통해 투여 될 수 있다.
본 발명은 씀바귀 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물 익세린(ixerin) M, (ID-56D1B) 화합물을 포함하는 상아질-치수질환 및/또는 치주질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어, "개선"이란, 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 개선은 씀바귀 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물 익세린(ixerin) M, (ID-56D1B) 화합물을 유효 성분으로 포함하는 조성물을 상아질-치수 질환 및/또는 치주질환의 치료가 요구되는 개체에 투여하여, 상아질 또는 치수조직의 재생을 촉진함으로서 상아질-치수질환의 증상이 호전되거나 또는 이롭게 되도록 하는 모든 행위, 및/또는 뼈 및 백악질의 재생을 촉진함으로써 치주질환의 증상이 호전되거나 또는 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미하는 것으로 해석될 수 있다.
본 발명의 용어 "의약외품"이란, 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 개선, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 물품들 중 의약품보다 작용이 경미한 물품들을 의미하는 것으로, 예를 들어 약사법에 따르면 의약외품이란 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것으로, 사람ㆍ동물의 질병 치료나 예방에 쓰이는 섬유ㆍ고무 제품, 인체에 대한 작용이 경미하거나 직접 작용하지 않으며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염병을 막기 위한 살균ㆍ살충제 등이 이에 포함된다
본 발명에 있어서, 씀바귀 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물 익세린(ixerin) M, (ID-56D1B) 화합물을 포함하는 상아질-치수질환 및/또는 치주질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물의 종류나 제형은 특별히 제한되지 않으나, 일 예로서, 구강용 소독 청결제, 구강청정용품, 치약, 치실, 구강용 연고제 등일 수 있다.
본 발명은 씀바귀 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물 익세린(ixerin) M, (ID-56D1B) 화합물을 포함하는 상아질-치수질환 및/또는 치주질환의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 용어, "식품"은 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료, 비타민 복합제, 건강 기능 식품 및 건강 식품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.
상기 건강 식품(health food)은 일반식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품(health supplement food)은 건강보조 목적의 식품을 의미한다. 경우에 따라, 건강 기능 식품, 건강 식품, 건강보조식품의 용어는 혼용될 수 있다.
구체적으로, 상기 건강 기능 식품은 씀바귀 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물 익세린(ixerin) M, (ID-56D1B) 화합물을 음료, 차류, 향신료, 껌류, 과자류 등의 식품 소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져 오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용이 없는 장점이 있다.
본 발명의 식품 조성물은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 상아질-치수질환 및/또는 치주질환의 예방 또는 개선에 대하여 높은 효과를 기대할 수 있으므로, 매우 유용하게 사용될 수 있다.
상기 식품 조성물은 생리학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는데, 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다.
또한, 상기 식품 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다.
또한, 상기 식품 조성물은 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT)등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품첨가물(food additives)을 포함할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.
씀바귀 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물 익세린(ixerin) M, (ID-56D1B) 화합물 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 식품 조성물은 식품 또는 음료에 대하여 50 중량부 이하, 구체적으로 20 중량부 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 장기간 섭취할 경우에는 상기 범위 이하의 함량을 포함할 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물의 일 예로 건강음료 조성물로 사용될 수 있으며, 이 경우 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드; 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강음료 조성물 100 ㎖ 당 일반적으로 약 0.01 내지 0.04 g, 구체적으로 약 0.02 내지 0.03 g이 될 수 있다.
상기 외에 건강음료 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산, 펙트산의 염, 알긴산, 알긴산의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 또는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일주스, 과일주스 음료, 또는 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강음료 조성물 100 중량부당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명의 식품 조성물은 상아질-치수질환 및/또는 치주질환의 예방 또는 개선 효과를 나타낼 수 있다면 다양한 중량%로 포함할 수 있으나, 구체적으로 씀바귀 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물 익세린(ixerin) M, (ID-56D1B) 화합물 식품 조성물의 총 중량 대비 0.00001 내지 100 중량% 또는 0.01 내지 80 중량%로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하에서는 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 하기 실시 예는 본 발명의 바람직한 일 구체적인 예일 뿐이며, 본 발명의 권리범위가 하기 실시 예의 범위로 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 과잉치 발치 및 치수세포의 채취
전신질환이 없는 성인의 상악 정중 매복 과잉치를 발치하여 오염과 감염이 되지 않도록 즉시 항생제와 소혈청 20%를 함유한 α-MEM media (GIBCO LifeTechnologies, Grand Island, NY, USA)에 보관하였다. 당일 치수 세포 채취를 위해 실험실로 옮겼고, 백악법랑경계 (cementoenamel junction, CEJ) 부분에서 치수가 노출되지 않도록 치질만 삭제한 후 멸균된 파일을 이용 하여 치수세포를 채취하였다.
<실시예 2> 골분화 유도 후 세포형태 관찰
줄기세포의 분화능을 알아보기 위해 골분화를 유도하였다. 각 계대에서 줄기세포의 골모세포로의 분화유도를 평가하기 위해 HDPSCs를 분화제를 처리하지 않은 군과 분화제를 처리한 군으로 나누어 배양하였다. 골분화를 유도하기 위해, α-MEM (Gibco, LifeTechnologies, Grand Island, NY, USA)에 10% fetal bovine serum (FBS; Gibco, Life Technologies Corporation, Carlsbad, Calif, USA)에 5mM β-glycerophosphate (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA), 100 nM Dexamethasone (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 그리고 100 μM Ascorbic acid (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 를 혼합하여 제작한 골분화 배지에서 배양하였다. 배양액은 2일에 1회씩 교환해주며 20배 광학현미경 하에서 세포의 형태학적 특성을 7일, 14일 두 번 관찰하였다.
<실시예 3> 씀바귀 추출물의 제조방법 및 Ixerin M의 분리 방법
실험에 사용된 건조 상태의 씀바귀(Ixeris dentata)은 정우당 (정우당 http://www.herbseoul.com/, 서울)으로 부터 구입하였다. 분쇄시료 30~40g을 HPLC용 20%, 40%, 60% 또는 100% 에탄올 용액 200mL으로 50℃에서 초음파분쇄기 (BRAONSON Ultrasonication corporation, ultrasonic cleaner, BRANSON)를 이용하여 추출하였고 이 추출액을 무형광 솜을 사용하여 여과시킨 후, 농축시켰다. 상기 시료를 동결 건조시킨 후 건조물을 하기 실험에 사용하였다. 상기 실시예 3의 씀바귀 에탄올 추출물로부터 하기와 같은 분리공정으로 (1) 11,13-dihydrointegrifolin 3-O-βD-glucopyranoside, (이하, ID-56B2이라 함, 참고문헌: J. Marco, Juan F. Sanz-Cervera, Alberto Yuste, M. Carmen Oriola. Sesquiterpene lactones and dihydroflavonols from Andryala and Urospermum species. Phytochemistry, Page 727, Compound 4, 1994), (2) ixerisoside A, (ID-56D2이라 함, 참고문헌: Tsutomu Warashina, Mie Ishino, Toshio Miyase, Akira Ueno. Sesquiterpene glycosides from Ixeris debilis and Ixeris repens. Phytochemistry, Page 3220, Compound 9, 1990), (3) ixerin M, (ID-56D1B이라 함, 참고문헌: Keiichi Nishimura, Toshio Miyase, Akira Ueno, Tadataka Noro, Masanori Kuroyanagi, Seigo Fukushima. Sesquiterpene lactones from Ixeris stolonifera A. Gray. Chemical and Pharmaceutical Bulletin, Page 3363, Compound 1, 1985), (4) 8-epiisolipidiol-3-β-D-glucopyranoside, (ID-57D이라 함, 참고문헌: W. Kisiel, B. Barszcz. Sesquiterpene lactone glycosides from Crepis pyrenaica. Phytochemistry, Page 1396, Compound 4, 1995)을 각각 분리하였고 이들의 물성치를 각각 기존 문헌에 기재된 바와 비교하여 그 화합물 구조를 동정하였다.
상기 화합물을 분리하고자 먼저 건조된 씀바귀 5 kg을 100% MeOH로 4시간 동안 3회 반복 초음파추출한 뒤, 추출액을 여과 후 감압 농축하여 MeOH extract 700 g을 얻었다. 이를 물에 분산시켜 chloroform (CHCl3), ethyl acetate (EtOAc), H2O 순으로 분획하여 각각 53.3 g, 17 g, 550 g의 추출물을 얻었다. H2O 분획을 HP-20 resin에 통과시켰으며, 이 때 용매로는 Water:MeOH(0:1 → 1:0)을 사용하여 5개의 fraction으로 나누었다 (3A-3E). 3B fraction에 대하여 silica gel column(30*40㎝) chromatography를 반복하였으며 용출 용매로는 CHCl3-MeOH = 4:1을 사용하여 ID-56B2 (15.0 mg) 을 얻었다. 3D fraction에 대하여 15% Acetonitrile in H2O를 용출용매로 하여 prep-LC를 실행하여 ID-56D2 (7.0 mg), ID-56D1B (4.6 mg)와 ID-57D (10.3 mg) 을 얻었다.
<실시예 4> Alizarin-red solution 염색
분화 여부를 시각적으로 확인하기 위해 Alizarin-red solution (ARS, pH 4.5) 염색을 시행하였다. 이를 통해 세포 밖에 형성된 석회화 결절을 시각적으로 비교하였다. DPSCs에서 % 에탄올 씀바귀 추출물로 인한 osteogenic 및 odontogenic mineralization의 효과를 연구하고자 HDPSCs에 20%, 40%, 605, 80%와 100% 에탄올의 씀바귀 추출물을 농도 의존적으로 (50, 100 및 500 μg/ml) 14일 동안 처리하였다. 그 후 세포를 ７0% 에탄올에 5분간 고정하고 2% Alizarin-red solution (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)으로 45분간 염색한 다음 증류수로 세척한 후 건조하였다. 분화제를 처리하지 않은 대조군 (BM)에서는 분화능에서는 효과가 없었지만, 60% 에탄올 추출물을 처리한 군에서는 다른 에탄올 추출물을 처리한 군에 비해 색상이 진해짐을 확인하였다 (도 1). 이는 60% 에탄올의 씀바귀 추출물에서 osteogenic 및 odontogenic mineralization이 증가함을 확인하였다. 상기 60% 에탄올 씀바귀 추출물과 씀바귀 유효성분인 (ID-57D, Ixerin M, ID-54E과 cynaroside)에서 osteogenic 및 odontogenic mineralization의 효과를 연구하고자 HDPSCs에 14일 동안 처리하였다. 그 후 세포에 Alizarin-red Solution을 염색한 후 분화능을 확인 한 결과, 분화제를 처리하지 않은 대조군 (BM)에서는 분화능에서는 효과가 없었지만, 씀바귀 유효성분인 Ixerin M이 다른 유효성분에 비해 색상이 진해짐을 확인하였다(도 2). 이는 60% 에탄올 씀바귀 추출물 및 이의 유효성분인 Ixerin M에서 osteogenic 및 odontogenic mineralization이 증가함을 확인하였다. DPSCs에 Ixerin M와 dexametasone 단독과 Ixerin M와 dexametasone을 동시에 처리하였을 때 osteogenic 및 odontogenic mineralization의 시너지 효과를 연구하고자 HDPSCs에 7일과 14일 동안 처리하였다. 그 후 세포에 Alizarin-red Solution을 염색한 후 분화능을 확인 한 결과, Ixerin M와 dexametasone 단독 처리한 군에 비해 Ixerin M와 dexametasone을 동시에 처리하였을 때 Alizarin-red Solution의 염색이 더 많이 증가함을 확인하였다 (도 4). 이는 Ixerin M와 dexametasone가 osteogenic 및 odontogenic mineralization에 시너지 효과가 있음을 확인하였다.
<실시예 5> Alkaline phosphatase (ALP) 활성도 측정
HDPSCs에 Ixerin M (50 μg/ml)와 dexametasone (10 nM) 단독으로 처리하고, Ixerin M (50 μg/ml)와 dexametasone (10 nM)을 동시에 처리하였을 때 ALP 활성도의 시너지 효과를 연구하고자 HDPSCs에 7일과 14일 동안 처리하였다. 그 후 7일과 14일 배양한 세포를 PBS로 세척하였다. PBS를 제거한 뒤 alkaline phosphatase substrate (alkaline phosphatase yellow (pNPP) liquid substrate system for ELISA (sigma)) 0.5 mL를 넣고 incubation 한 뒤 3 N NaOH로 반응을 중단시켰다. 405 nm에서 흡광도를 측정한 후 standard curve (p-nitrophenol standard solution, sigma)를 그려 alkaline phosphatase activity를 계산하였다. ALP Solution으로 염색한 후 ALP 발현과 활성도를 측정한 결과, Ixerin M와 dexametasone 단독 처리한 군에 비해 Ixerin M와 dexametasone을 동시에 처리하였을 때 ALP 발현 및 활성도가 더 많이 증가함을 확인하였다 (도 5). 이는 Ixerin M와 dexametasone가 ALP의 활성에 시너지 효과가 있어 더 많은 석회화가 이루어짐을 확인하였다.
<실시예 6> RT-PCR
씀바귀 추출물 및 이의 유효성분의 osteogenic 및 odontogenic 유전자 마커의 발현에 미치는 영향을 연구하고자, 60% 에탄올 씀바귀 추출물 (100 ug/ml)과 씀바귀 유효성분인 ID-57D, Ixerin M, ID-54E 및 cynaroside을 각각 50ug/ml농도로 HDPSCs에 7일과 14일 동안 처리하였다. Total RNA는 trizol extraction method (invitrogen light tech)를 사용하여 실험군과 대조군에서 공히 채취하였다. 채취 된 RNA는 cDNA 합성을 위하여 사용하였으며, RT-PCR premix (Bioneer, m대전, 한국)를 이용하여 RT-PCR을 수행 하였다. 분리한 total RNA를 cDNA로 역전사한 후, primer 쌍을 이용하여 증폭하였다. ALP, OSTEOCALCIN, BSP, DSPP, DMP-1와 RUNX2의 발현을 측정하고, 내부 대조군으로 GAPDH를 사용하였다. 60% 에탄올 씀바귀 추출물과 유효성분인 Ixerin M이 다른 유효성분에 비해 osteogenic 및 odontogenic 마커인 ALP, OSTEOCALCIN, BSP, DSPP, DMP-1와 RUNX2의 발현이 증가함을 확인하였다 (도 3).
<실시예 7> 웨스턴 블롯(Western Blot) 분석
HDPSCs에 Ixerin M (50 μg/ml)와 dexametasone (10 nM) 단독으로 처리하고, Ixerin M (50 μg/ml)와 dexametasone (10 nM)을 동시에 처리하였을 때 ALP의 발현 수준의 시너지 효과를 연구하고자 HDPSCs에 7일과 14일 동안 처리하였다. HDPSCs에 RIPA Buffer 완충액 (20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM Na2EDTA, 1 mM EGTA, 1% NP-40, 1% sodium deoxycholate, 2.5 mM sodium pyrophosphate, 1 mM β-glycerophosphate, 1 mM Na3VO4)에 단백질 분해효소 억제제(P3100-001, GenDEPOT)를 처리하여 단백질을 추출하였다. 각 시료를 완충액과 섞어 5분간 끓인 후 Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide 겔(0227, AMRESCO)에서 전기영동 하여 단백질은 크기 별로 분리한 후 차단 완충액(blocking buffer(REF232100, BD Difco)으로 차단하고 소포체 스트레스 관련 항체의 발현을 확인하고자 4℃에서 하룻 밤 동안 반응 시킨 후, 이차 항체로 상온에서 1시간 반응시켰다. ECL 용액 (Dae Myung Science Co., Ltd, Korea)를 사용하여 단백질 발현을 확인하였다. Membrane을 actin 항체와 다시 반응시켜 일정한 양의 단백질을 사용하였는지 확인하였다. 그 결과 Ixerin M와 dexametasone 단독 처리한 군에 비해 Ixerin M와 dexametasone을 동시에 처리하였을 때 ALP 발현이 증가하는 것을 확인하였다 (도 5).
<실시예 8> 통계학적인 처리
결과들은 평균 ±표준오차로 표시하고, 변수의 분석들은 Duncan's test를 사용하였다. P 값이 0.05 미만인 경우에 통계적으로 유의 하다는 판정을 하였으며, 모든 실험은 독립적으로 3회 이상 실시하여 통계 처리를 하였다.

Claims (10)

  1. 씀바귀 추출물로부터 분리된 화합물 익세린(ixerin) M, (ID-56D1B) 화합물을 포함하는 치수줄기세포의 상아 전구세포로의 분화 유도용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 조성물에 덱사메타손 (dexamethasone)을 추가로 더 포함하는, 치수줄기세포의 상아 전구세포로의 분화 유도용 조성물.
  3. 치수 줄기세포에 씀바귀 추출물로부터 분리된 화합물 익세린(ixerin) M, (ID-56D1B) 화합물을 처리하는 단계;를 포함하는, 치수줄기세포의 상아 전구세포로의 in vitro 분화 유도 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 처리는 7일 내지 14일 동안 수행되는, 치수줄기세포의 상아 전구세포로의 in vitro 분화 유도 방법.
  5. 씀바귀 추출물로부터 분리된 화합물 익세린(ixerin) M, (ID-56D1B) 화합물을 포함하는, 치수줄기세포의 상아 전구세포로의 분화 유도용 키트.
  6. 씀바귀 추출물로부터 분리된 화합물 익세린(ixerin) M, (ID-56D1B) 화합물을 포함하는, 상아질-치수질환 또는 치주질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 상아질, 뼈 및 백악질을 포함하는 경조직 또는 치수조직의 재생을 촉진시키는 것인, 조성물.
  8. 제 6항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 치수세포에서 상아모세포, 뼈모세포 또는 백악모세포의 분화를 촉진시키는 것인, 조성물.
  9. 제 6항에 있어서, 상기 상아질-치수질환은 상아질 지각과민증, 치수충혈, 치수염, 치수변성 또는 치수의 괴사 및 괴저증인 것인, 조성물.
  10. 제 6항에 있어서, 상기 치주질환은 치은염, 치주염, 치주낭 또는 치주농양인 것인, 조성물.
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