KR102234135B1

KR102234135B1 - GFP 유전자의 발현을 억제하는 dsRNA 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102234135B1
Application number: KR1020190136570A
Authority: KR
Inventors: 신찬석; 박민수
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2019-10-30
Filing date: 2019-10-30
Publication date: 2021-03-31

Abstract

본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 dsRNA(double-stranded RNA)를 유효성분으로 포함하는 GFP(Green Fluorescent Protein) 유전자의 발현 억제용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 조성물을 이용하면 GFP 유전자에 도입 유전자를 융합시켜 식물체 내에서 도입 유전자의 발현 제어를 통한 기능 연구 등에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

GFP 유전자의 발현을 억제하는 dsRNA 및 이의 용도{dsRNA for inhibition of GFP gene expression and uses thereof}

본 발명은 GFP(Green Fluorescent Protein) 유전자의 발현을 억제하는 dsRNA(double-stranded RNA) 및 이의 용도에 관한 것이다.

RNA 간섭(RNA interference; RNAi) 기술은 이중가닥 RNA(double-stranded RNA; dsRNA)가 세포내로 유입되어 일어나는 유전자 침묵(gene silencing) 현상이다. dsRNA가 세포 내로 전달되면 dsRNA를 20개 내외의 뉴클레오티드로 절단하는 기능을 하는 다이서(dicer) 효소에 의해 dsRNA가 인지되면서 반응은 개시된다. 절단된 dsRNA는 siRNA(small interfering RNA)라 불리며 Argonaute이라 불리는 핵산분해 효소와 함께 RISC(RNA-induced silencing complex)를 형성하게 된다. RISC 내로 로딩된 siRNA의 한 가닥(가이드 가닥)에 의해, 상보적인 서열을 가진 목적 mRNA의 서열 부위가 절단되고 그 이후의 과정으로 세포 내에 존재하는 여러 핵산분해효소들에 의해 mRNA의 빠른 분해가 일어나게 되어 결과적으로 목적 mRNA에 의해 코딩된 단백질의 생성이 억제된다. RNA 간섭은 유전자 특이적이며 강력한 효과를 가지기 때문에 특정한 유전자를 표적으로 하는 dsRNA를 합성하여 원하는 유전자의 발현을 억제할 수 있다는 이점으로 농업해충방제, 암세포의 발현억제, 형질전환식물 등 다양한 분야에서 활용되고 있다.

세포 내로 dsRNA의 전달(delivery) 과정 및 그 메커니즘의 이해는 dsRNA의 처리 방법, 농도, 시간 등이 매우 중요한 요인이다. 이에 본 발명자는 dsRNA 처리 조건을 알기 위해 eGFP 형질전환 애기장대와 발현되는 GFP 유전자를 표적으로 하는 dsRNA를 이용하여 식물체에서 dsRNA의 전달 메커니즘을 확인하고자 하였다.

한편, 한국등록특허 제0963896호에는 '녹색형광단백질 리포터 넉인벡터를 이용하여 제조된 넉아웃벡터, 이의 제조방법 및 이를 이용하여 동물세포에서 유전자를 넉아웃 시키는 방법'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2001-0071315호에는 '식물에서의 이본쇄 RNA-매개된 유전자 발현 조절'이 개시되어 있으나, 본 발명의 GFP 유전자의 발현을 억제하는 dsRNA 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 eGFP 코딩 서열을 포함하는 재조합 벡터로 애기장대 식물체를 형질전환한 뒤, 형질전환 식물체에서 GFP의 발현이 유도되는 것을 확인하였다. 그 후, GFP 유전자의 5' 부위 또는 3' 부위를 각각 표적으로 하는 dsRNA를 침지(dipping) 또는 분사(spray)의 방법으로 상기 형질전환 식물체에 처리한 결과, GFP 유전자의 5' 부위를 표적으로 하는 dsRNA를 침지 처리한 조건에서 근단(root tip) 부위의 GFP 발현이 현저히 감소되는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 dsRNA(double-stranded RNA)를 유효성분으로 포함하는 GFP(Green Fluorescent Protein) 유전자의 발현 억제용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 프로모터 하류에 GFP(Green Fluorescent Protein) 단백질 코딩 서열을 작동 가능하게 연결시켜 제조된 재조합 벡터로 형질전환된 식물체에 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 dsRNA(double-stranded RNA)를 유효성분으로 포함하는 조성물을 처리하는 단계를 포함하는, GFP의 발현을 억제하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 GFP 코딩서열의 하류에 목적 단백질 코딩 서열이 연결된 재조합 벡터로 형질전환된 식물체에 상기 조성물을 처리하여 목적 단백질의 발현을 억제하는 단계; 및 상기 목적 단백질의 발현이 억제된 형질전환 식물체의 표현형을 분석하는 단계;를 포함하는 목적 단백질의 기능을 분석하는 방법을 제공한다.

본 발명은 대표적인 리포터 유전자로 사용되고 있는 GFP에 대해 우수한 발현 억제 효과를 보이는 dsRNA를 제공하고 있으므로, GFP 유전자에 도입 유전자를 융합시켜 식물체 내에서 도입 유전자의 발현 제어를 통한 기능 연구 등에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다. 또한, dsRNA의 식물체 내로의 이동을 기반으로 하는 다양한 기술적 연구, dsRNA 기반의 살균제, 살충제 그리고 화학농약의 대체재 연구 등에 활용할 가치가 있다.

도 1은 eGFP 표적 dsRNA의 모식도로, A는 eGFP 유전자상의 5' 부위 표적 dsRNA(dsRNA_5')와 3' 부위 표적 dsRNA(dsRNA_3')의 위치를 보여주는 모식도이고, B는 dsRNA_5'와 dsRNA_3'의 서열정보이다. 노란색 박스는 두 dsRNA 간의 중첩지역을 나타낸다.
도 2는 eGFP 형질전환 애기장대에서 dsRNA_5'의 침지 처리 후 반응을 분석한 결과로, A는 dsRNA 처리 후 eGFP 발현을 현미경으로 관찰한 이미지이며, B 내지 D는 dsRNA 처리 후 1일, 2일 및 4일차의 eGFP 전사체 발현 수준을 RT-qPCR로 분석한 결과이다. Con은 dsRNA 대신 물을 처리한 eGFP 형질전환 애기장대를 의미한다.
도 3은 eGFP 형질전환 애기장대에서 dsRNA_3'의 침지 처리 후 반응을 분석한 결과로, A는 dsRNA 처리 후 eGFP 발현을 현미경으로 관찰한 이미지이며, B 내지 D는 dsRNA 처리 후 1일, 2일 및 4일차의 eGFP 전사체 발현 수준을 RT-qPCR로 분석한 결과이다. Con은 dsRNA 대신 물을 처리한 eGFP 형질전환 애기장대를 의미한다.
도 4는 eGFP 형질전환 애기장대에서 dsRNA_5'의 분사 처리 후 반응을 분석한 결과로, A는 dsRNA 처리 후 eGFP 발현을 현미경으로 관찰한 이미지이며, B 내지 E는 dsRNA 처리 후 1일, 2일, 4일 및 6일차의 eGFP 전사체 발현 수준을 RT-qPCR로 분석한 결과이다. Con은 dsRNA 대신 물을 처리한 eGFP 형질전환 애기장대를 의미한다.
도 5는 eGFP 형질전환 애기장대에서 dsRNA_3'의 분사 처리 후 반응을 분석한 결과로, A는 dsRNA 처리 후 eGFP 발현을 현미경으로 관찰한 이미지이며, B 내지 E는 dsRNA 처리 후 1일, 2일, 4일 및 6일차의 eGFP 전사체 발현 수준을 RT-qPCR로 분석한 결과이다. Con은 dsRNA 대신 물을 처리한 eGFP 형질전환 애기장대를 의미한다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 dsRNA(double-stranded RNA)를 유효성분으로 포함하는 GFP(Green Fluorescent Protein) 유전자의 발현 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 dsRNA는 세포내에서 RNA 간섭(RNA interference; RNAi)에 의해 작용한다. RNA 간섭은 식물과 동물을 포함한 진핵생물에서 폭넓게 존재하는 전사 후 유전자 발현 조절 기작이다. 세포에 도입된 dsRNA는 RNase Ⅲ 효소인 Dicer에 의해 처리되어, siRNA(small interfering RNA)의 형태로 RISC라 불리는 리보뉴클레오복합체를 형성하여 표적 서열 부위에 상보적 결합을 통해 표적 유전자를 절단하거나, 단백질 합성을 억제한다.

본 발명에 따른 GFP 유전자의 발현 억제용 조성물에 있어서, 상기 GFP 유전자의 발현을 억제하는 dsRNA(double-stranded RNA)는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 상기 dsRNA는 표적 유전자의 센스(sense) 서열 내에 상동성이 높고, 특히 표적(목적) 유전자의 mRNA 서열에 대해 동일한 서열을 포함하는 dsRNA이다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 GFP 유전자의 발현 억제용 조성물에 있어서, 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열은 dsRNA에서 센스 가닥의 염기서열을 의미하는 것으로, 표적인 GFP에 결합하는 안티센스(antisense) 가닥은 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열과 상보적인 서열로 이루어진 것일 수 있다. 용어 "상보적"은, 제1 뉴클레오티드 서열 (예컨대, 센스 가닥)을 제2 뉴클레오티드 서열 (예컨대, 안티센스 가닥)과 관련하여 기재하는 데에 사용된 경우, 당업자에게 이해될 바와 같이, 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드가 특정 조건 하에 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드와 혼성화하여 이중체(duplex) 구조를 형성할 수 있는 능력을 의미한다.

본 발명의 조성물에 있어서, 상기 dsRNA는 안정성 또는 표적 세포 내로의 흡수를 증진시킬 수 있는 다양한 물질 등으로 변형될 수 있고, 상기 dsRNA는 당업계에 공지된 방법에 따라 합성 및 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 GFP 유전자의 발현 억제용 조성물은 예를 들어, 직접 분사가능한 용액, 분말 및 현탁액의 형태 또는 고농축 수성, 유성 또는 다른 현탁액, 분산액, 에멀젼, 유성 분산액, 페이스트, 분진, 흩뿌림 물질 또는 과립제로 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한, 프로모터 하류에 GFP(Green Fluorescent Protein) 단백질 코딩 서열을 작동 가능하게 연결시켜 제조된 재조합 벡터로 형질전환된 식물체에 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 dsRNA(double-stranded RNA)를 유효성분으로 포함하는 조성물을 처리하는 단계를 포함하는, GFP의 발현을 억제하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 GFP의 발현을 억제하는 방법에 있어서, 상기 프로모터는 식물 발현 벡터에 사용될 수 있는 프로모터로, 이에 한정되지 않으나, CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있다.

본 발명에서 용어, "작동가능하게 연결된"은 이종 단백질을 발현하기 위한 단위로서 기능하는 발현 카세트의 성분을 말한다. 예를 들면, 단백질을 코딩하는 이종 DNA에 작동가능하게 연결된 프로모터는 이종 DNA에 해당하는 기능적 mRNA의 생산을 촉진한다. 상기 프로모터와 목적 단백질을 코딩하는 유전자의 연결 방법은 PCR, 제한효소 절단 및 라이게이션법 등 당업자에 의해 용이하게 실시될 수 있는 통상의 기술을 사용할 수 있다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

본 발명에 따른 GFP의 발현을 억제하는 방법에 있어서, 상기 처리는 dsRNA 처리 대상 식물체를 dsRNA를 포함하는 조성물에 전식물체를 침지하거나, dsRNA를 포함하는 조성물을 식물체에 분사하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 GFP의 발현을 억제하는 방법은, 리포터 유전자로 많이 이용되는 GFP를 표적으로 하는 dsRNA를 이용한 것으로, 도입(목적) 유전자의 발현 조절 연구 등의 분야에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

용어 "리포터(reporter) 유전자"는 형질전환된 생명체에서 그들의 표현형이 분석되는 유전자를 의미하며, 리포터 유전자는 조절 지역의 유전자 삭제여부, 즉, 유전자 넉아웃 분석에 주로 이용된다. 리포터 유전자를 선택하는 첫 번째 조건으로는 리포터 유전자가 숙주에서 발현되지 않는 표현형을 나타낼 수 있어야 하며, 숙주로 클로닝 되었을 때 검정하기 용이하고, 그 표현형을 정량적으로 분석 가능해야 한다. 이러한 조건을 충족시키는 다양한 리포터 유전자가 유전자 조절에 관한 연구를 위해 이용되고 있는데, 형광 단백질(fluorescence protein)이 많이 이용된다, 특히, 형광 단백질은 리포터로서 숙주세포에 발현되지 않으며, 누구나가 쉽게 검정이 용이하게 가장 널리 사용되는 리포터 유전자 중 하나이다.

본 발명은 또한,

GFP 코딩서열의 하류에 목적 단백질 코딩 서열이 연결된 재조합 벡터로 형질전환된 식물체에 상기 GFP 유전자의 발현 억제용 조성물을 처리하여 목적 단백질의 발현을 억제하는 단계; 및

상기 목적 단백질의 발현이 억제된 형질전환 식물체의 표현형을 분석하는 단계;를 포함하는 목적 단백질의 기능을 분석하는 방법을 제공한다.

본 발명의 목적 단백질의 기능을 분석하는 방법에 있어서, 상기 GFP 유전자의 발현 억제용 조성물은 전술한 것과 같다.

또한, 본 발명에 따른 목적 단백질의 기능 분석 방법은, GFP 코딩서열의 하류에 융합된 목적 단백질이 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 dsRNA 처리에 의해 식물체 내에서 발현이 억제되고, 상기 목적 단백질의 발현 억제에 따라 나타나는 식물체의 표현형적 특징을 분석하여, 목적 단백질의 식물체 내 기능을 분석할 수 있는 것이다. 상기와 같은 목적 단백질의 기능 분석을 통해, dsRNA의 식물체 내로의 이동을 기반으로 하는 다양한 연구, dsRNA 기반의 살균제, 살충제 그리고 화학농약의 대체재 등으로 활용가능한 기능성 목적 단백질을 스크리닝 할 수 있을 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. eGFP 과발현 형질전환 애기장대 확보

프로모터와 이의 하류에 작동가능하게 연결된 eGFP(enhanced GFP) 코딩 서열을 포함하는 재조합벡터로 형질전환된 애기장대를 확보한 후, eGFP 작동 여부를 RT-qPCR과 현미경을 이용하여 분석하였다. 그 결과, eGFP 형질전환 애기장대에서 야생형(WT)에 비해 eGFP의 발현이 높게 유도되는 것을 확인하였다.

2. eGFP 표적 dsRNA 제작

eGFP 유전자를 표적하는 dsRNA는 eGFP 염기서열의 5' 부위 500 bp를 표적으로 하는 dsRNA(이하, dsRNA_5', 서열번호 1)와 3' 부위 500 bp를 표적으로 하는 dsRNA(이하, dsRNA_3', 서열번호 2)를 주형으로 하고, Invitrogen사의 MEGAscript RNAi 키트를 이용하여 각각 제작하였다(도 1).

3. eGFP 표적 dsRNA 처리 방법

dsRNA를 처리하는 방법은 여러 가지가 있다. 그 중 가장 효율적인 방법을 선택하기 위해 다음과 같은 방법으로 eGFP 표적 dsRNA를 처리하였다.

3-1. 침지(Dipping): 짧은 시간 내에 식물체에 도입된 dsRNA의 작동 여부 확인이 가능한 방법

1/2 MS 배지에서 7일간 재배된 어린 eGFP 형질전환 애기장대 식물체를 배지에서 떼어낸 후 20ng/㎕ 농도의 dsRNA를 함유하는 멸균수 3㎖에 1, 2 또는 4일 동안 담가둔 후, 각 식물체로부터 총 RNA를 분리하고, cDNA를 합성한 후 RT-qPCR을 수행하여 eGFP의 발현 수준을 분석하였다.

RT-qPCR에 사용된 프라이머 정보

	프라이머명	서열정보 (5'→3')
dsRNA_5'처리시 eGFP의 3'을 읽는 프라이머 세트	GFP_3' 정방향	ACAACCACTACCTGAGCACC (서열번호 3)
dsRNA_5'처리시 eGFP의 3'을 읽는 프라이머 세트	GFP_3' 역방향	CTCGTCCATGCCGAGAGTG (서열번호 4)
dsRNA_3'처리시 eGFP의 5'을 읽는 프라이머 세트	GFP_5' 정방향	GACGTAAACGGCCACAAGTTCA (서열번호 5)
dsRNA_3'처리시 eGFP의 5'을 읽는 프라이머 세트	GFP_5' 역방향	CTGCACGCCGTAGGTCA (서열번호 6)

3-2. 분사(Spray): dsRNA를 작물에 활용 시 적합한 방법

1/2 MS 배지에서 7일간 재배된 어린 eGFP 형질전환 애기장대 식물체에 20ng/㎕ 농도의 dsRNA를 함유하는 멸균수를 분사한 후, 1, 2, 4 또는 6일 후에, 각 식물체로부터 총 RNA를 분리하고, cDNA를 합성한 후 RT-qPCR을 수행하여 eGFP의 발현 수준을 분석하였다.

실시예 1. eGFP를 표적하는 dsRNA의 침지(dipping) 처리 후 발현 억제 확인

7일간 재배된 어린 eGFP 형질전환 애기장대 식물체에 대하여 dsRNA 대신 물을 처리한 대조군과 dsRNA_5'(서열번호 1) 또는 dsRNA_3'(서열번호 2)를 각각 침지처리한 실험군을 비교한 결과, 처리 후 1일째에 근단(root tip) 지역에서 eGFP의 발현이 완전히 억제되었다(도 2A 및 3A). 본 발명자는 시간이 경과함에 따라 식물체의 다른 지역(elongation zone 등)의 eGFP 발현도 억제될 것으로 예상하였으나, dsRNA 처리 후 4일째까지 근단에서의 eGFP 발현 억제 외 다른 지역에서의 eGFP 발현억제는 확인되지 않았다(도 2A 및 3A). 제작된 두 개의 eGFP 표적 dsRNA 모두 식물체 내에 도입된 후 RNA 간섭(RNA interference)에 의해 eGFP 유전자의 발현이 억제되었고 그 중 dsRNA_5'가 dsRNA_3' 보다 더 효율적으로 eGFP의 발현을 억제하는 것으로 확인되었다(도 2B-D 및 3B-D).

실시예 2. eGFP를 표적하는 dsRNA의 분사(spray) 처리 후 발현 억제 확인

7일간 재배된 어린 eGFP 형질전환 애기장대 식물체에 대하여 dsRNA 대신 물을 처리한 대조군과 dsRNA_5' 또는 dsRNA_3'를 각각 분사 처리한 실험군을 비교한 결과, 1일, 2일 및 4일째의 eGFP 발현 억제 수준이 침지 처리에 비해 다소 약한 것으로 확인되었으나, dsRNA 분사 처리 후 6일차에는 침지 처리 후 4일차의 발현 수준에 비해 eGFP 발현이 더 억제된 것으로 확인되었다(도 4A 및 5A). 제작된 두 개의 eGFP 표적 dsRNA 모두 식물체 내에 도입된 후 RNA 간섭에 의해 eGFP 유전자의 발현을 억제되었고 그 중 5' 지역을 표적으로 한 dsRNA_5'이 dsRNA_3' 보다 더 효율적으로 eGFP의 발현을 억제하는 것으로 관찰되었다(도 4B-E 및 도 5B-E).

<110> Seoul National University R＆DB Foundation <120> dsRNA for inhibition of GFP gene expression and uses thereof <130> PN19346 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 500 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dsRNA_5 <400> 1 atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60 ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120 ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180 ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240 cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300 ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360 gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420 aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480 ggcatcaagg tgaacttcaa 500 <210> 2 <211> 503 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dsRNA_3 <400> 2 gccgctaccc cgaccacatg aagcagcacg acttcttcaa gtccgccatg cccgaaggct 60 acgtccagga gcgcaccatc ttcttcaagg acgacggcaa ctacaagacc cgcgccgagg 120 tgaagttcga gggcgacacc ctggtgaacc gcatcgagct gaagggcatc gacttcaagg 180 aggacggcaa catcctgggg cacaagctgg agtacaacta caacagccac aacgtctata 240 tcatggccga caagcagaag aacggcatca aggtgaactt caagatccgc cacaacatcg 300 aggacggcag cgtgcagctc gccgaccact accagcagaa cacccccatc ggcgacggcc 360 ccgtgctgct gcccgacaac cactacctga gcacccagtc cgccctgagc aaagacccca 420 acgagaagcg cgatcacatg gtcctgctgg agttcgtgac cgccgccggg atcactctcg 480 gcatggacga gctgtacaag taa 503 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 acaaccacta cctgagcacc 20 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ctcgtccatg ccgagagtg 19 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gacgtaaacg gccacaagtt ca 22 <210> 6 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ctgcacgccg taggtca 17

Claims

서열번호 1의 염기서열로 이루어진 dsRNA(double stranded RNA)를 유효성분으로 포함하는 GFP(Green Fluorescent Protein) 유전자의 발현 억제용 조성물.
프로모터 하류에 GFP(Green Fluorescent Protein) 단백질 코딩 서열을 작동 가능하게 연결시켜 제조된 재조합 벡터로 형질전환된 식물체에 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 dsRNA(double-stranded RNA)를 유효성분으로 포함하는 조성물을 처리하는 단계를 포함하는, GFP의 발현을 억제하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 dsRNA의 처리는 침지 또는 분사의 방법인 것을 특징으로 하는 GFP의 발현을 억제하는 방법.
GFP 코딩서열의 하류에 목적 단백질 코딩 서열이 연결된 재조합 벡터로 형질전환된 식물체에 제1항의 조성물을 처리하여 목적 단백질의 발현을 억제하는 단계; 및
상기 목적 단백질의 발현이 억제된 형질전환 식물체의 표현형을 분석하는 단계;를 포함하는 목적 단백질의 기능을 분석하는 방법.