KR101611417B1

KR101611417B1 - 마이오신 라이트 체인 유전자를 포함하는 형질전환 벡터 및 이의 형질전환 식물체

Info

Publication number: KR101611417B1
Application number: KR1020140093289A
Authority: KR
Inventors: 한범수; 심준수; 정하영
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2014-07-23
Filing date: 2014-07-23
Publication date: 2016-04-12
Also published as: KR20160011946A

Abstract

본 발명은 선충 유전자인 마이오신 라이트 체인(myosin light chain) 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 마이오신 라이트 체인 유전자에 대한 RNAi 염기서열을 포함하는 뿌리혹선충 저항성 재조합 벡터를 이용하여 뿌리혹선충 저항성을 가지는 형질전환 식물체를 제작하였으므로 다양한 식물체에서 선충에 의한 피해를 줄일 수 있는 기반기술로 유용하게 이용될 것이다.

Description

마이오신 라이트 체인 유전자를 포함하는 형질전환 벡터 및 이의 형질전환 식물체 {Expression vector comprising the myosin light chain gene and transgenic plants transformed with the expression vector}

본 발명은 마이오신 라이트 체인(myosin light chain) 유전자에 대한 RNAi(ribonucleic acid interference) 염기서열을 포함하는 뿌리혹선충 저항성 재조합 벡터 및 마이오신 라이트 체인 유전자에 대한 RNAi에 의해 뿌리혹선충 저항성이 증가한 형질전환 식물체에 관한 것이다.

연작 재배로 선충에 의한 농작물의 피해가 급증하고 있으며 이는 생산성 감소로 이어지고 있다(세계적으로 40개 작목의 피해규모: 1,180달러, 총생산량 10% 감소를 유발). 선충 방제를 위한 살선충제 이용시 환경 및 인체 유해성이 심각하기 때문에 저항성 유전자를 이용한 품종개발이 주목받게 되었고, 이러한 경우 선충변이체에 의한 저항성 품종의 무력화가 발생하므로 생명공학을 이용한 새로운 대안이 필요한 실정이다.

선충 유전자의 기능분석을 통하여 선충을 치사할 수 있는 유전자 개발이 필요하며 이를 위해 모델 식물체를 활용한 효율적인 뿌리혹선충 유전자 기능 검정법의 개발이 필요하다. 국내에서도 체계적인 선충 유전체 및 단백질 연구에 대한 요구가 커지고 있으며 뿌리혹선충 항체를 활용한 유전자 기능분석 및 정밀 동정 체계 구축이 필요하다. 현재 국내에서는 3종(당근뿌리혹선층, 고구마뿌리혹선충, 땅콩뿌리혹선충)의 식물기생선충이 가장 문제가 되고 있으며, 전국적인 분포를 보이고 있으나 분류 및 동정체계는 형태적 분류방법이 가장 일반적이나 정확성이 낮다.

최근 효소동정법 및 PCR 동정법이 확립되어 신속하고 정밀한 동정 체계가 구축되었으나 국내에서 선충치사유전자를 활용한 선충방제 연구는 아직까지 보고되어 있지 않다. 또한 국외 연구현황은 2003년에는 워싱턴 대학 의학부에서 뿌리혹선충 EST 정보의 부분 공개, 2001년에는 예쁜꼬마선충을 이용한 RNAi 기작 규명, 2008년에는 뿌리혹선충 게놈서열 분석을 완료하는 등의 선충 유전자 연구와 RNA 간섭(interference)을 이용한 식물 기생 선충 유전자 억제 연구가 활발히 이루어지고 있다.

RNA 간섭(RNA interference; RNAi)은 특정부위의 유전자의 발현을 짧은 이중가닥 RNA(double-[0002] strand RNA; dsRNA)에 의해 억제하는 현상으로 식물과 동물 및 인간에서 모두 발생한다. 이러한 짧은 이중가닥 RNA를 간섭 RNA(interfering RNA) 또는 siRNA라고 하는데, 이 짧은 이중 나선 RNA가 유전정보를 전달하는 메신저-RNA(messenger-RNA; mRNA)를 분해하여 특정 유전자가 발현되지 못하게 한다. DNA에 들어있는 유전정보는 mRNA에 복사되어 단백질을 만드는 세포 내 소기관으로 전달되는데, 이 과정에서 이중나선 RNA가 자신과 같은 염기서열을 가진 mRNA를 파괴함으로써 유전자가 발현되지 못하게 하는 것이다.

이에, 본 발명자는 선충 EST 분석을 통하여 선충의 발현 유전자를 탐색하였으며 RNA 간섭(RNAi)을 통해 뿌리혹선충을 치사할 수 있는 유전자인 마이오신 라이트 체인 유전자를 선발하였다. 이를 활용하여 뿌리혹선충 저항성을 가지는 형질전환 식물체를 제작하였으므로 다양한 식물체에서 모든 선충에 의한 피해를 줄일 수 있는 기반기술로 유용하게 이용될 것이다.

국내 공개 특허 제10-2009-0038871호

본 발명의 목적은 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 마이오신 라이트 체인 유전자(myosin light chain)에 대한 RNAi(ribonucleic acid interference) 염기서열을 포함하는 뿌리혹선충 저항성 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 뿌리혹선충 저항성 형질전환 식물체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 뿌리혹선충 저항성 형질전환 식물체의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 해결하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 마이오신 라이트 체인 유전자(myosin light chain)에 대한 RNAi(ribonucleic acid interference) 염기서열을 포함하는 뿌리혹선충 저항성 재조합 벡터를 제공한다.

상기 마이오신 라이트 체인은 근육의 주요한 구조 단백질로, 선충의 발생단계 시 마이오신 라이트 체인 단백질이 없으면 뿌리혹선충이 치사되는 것을 본 발명에서 확인하였다. 구체적으로, 상기 마이오신 라이트 체인 유전자에 대한 RNAi 염기서열을 포함하는 뿌리혹선충 저항성 재조합 벡터가 식물에서 발현되면 마이오신 라이트 체인에 대한 siRNA가 전사되고 선충 내의 마이오신 라이트 체인 mRNA에 결합하여 dsRNA를 만들어 RNAi를 유발하므로 마이오신 라이트 체인 단백질의 번역(translation)이 일어나지 않는다. 따라서 선충 내에서 마이오신 라이트 체인 단백질이 생성되지 않으므로 뿌리혹선충에 저항성을 가지게 된다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 유전자를 포함하는 마이오신 라이트 체인(myosin light chain) 유전자에 대한 RNAi(ribonucleic acid interference) 유전자는 벡터에 정방향 및 역방향으로 삽입되어(도 4) RNA 간섭 기술을 이용할 수 있는 dsRNA의 제조가 가능하며, 역방향으로 삽입된 유전자가 RNAi 유전자로써 기능하게 된다.

보다 구체적으로, 도 4에 나타낸 RNAi 발현벡터를 제작하여 형질전환 식물체를 통해 형질전환 식물체의 세포 내에서 발현시키면 유비퀴틴 프로모터로부터 표적 염기서열(구체적으로, 마이오신 라이트 체인의 염기서열)의 정방향 및 역방향 염기 서열이 게이트웨이 시스템(gateway system)을 활용하여 두 개의 인트론(intron)을 사이에 두고 위치하며 발현되게 되고, 이를 통해 작은 헤어핀 구조의 shRNA가 합성되게 된다. 이렇게 합성된 shRNA는 세포 안에 존재하는 Dicer라는 RNase III 효소에 의해 분해되어 정확한 구조를 갖는 약 21~23 뉴클레오타이드의 크기를 가지는 siRNA로 전환되게 되고, RISC(RNA-induced Silencing Complex)라는 단백질 복합체와 결합하여 표적 mRNA를 분해시켜 마이오신 라이트 체인 유전자의 발현제어를 유도하게 된다.

상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 마이오신 라이트 체인 유전자의 CDS(coding sequence)는 서열번호 2로 표시하였다.

선충의 움직이는 기관에는 어디든지 근육이 분포하고 있으며, 상기 마이오신 라이트 체인은 근육의 주요한 구조 단백질로서 세포골격(cytoskeleton)의 주요 성분인 액틴(actin)과 결합하여 근수축의 원동력이 된다. 또한, 예쁜꼬마선충에서 발현이 억제되면 선충이 정상적으로 분화할 수 없게 된다고 보고되어 있다.

서열번호 1의 염기서열을 갖는 유전자 외에도 상기 서열들의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 본다. 변이체는, 염기서열은 변화되지만 서열번호 1 내지 3의 염기서열과 유사한 기능적 특성을 갖는 염기서열로 이루어진 유전자이다.

본 발명에 있어서, 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "발현 벡터"는 흔히 "재조합 벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "재조합 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 유비퀴틴, 액틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다. 본 발명에 따른 재조합 벡터는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진 유비퀴틴(ubiquitin,UBQ) 프로모터를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 a-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신, 테트라사이클린 및 바스타(BASTA) 제초제에 대한 내성 유전자가 있다. 본 발명에 따른 재조합 벡터는 바스타(BASTA)에 대한 내성을 가지는 유전자를 포함하나, 이에 한정하지 않는다.

용어 "RNAi"는 짧은 이중가닥 RNA가 자신의 염기서열에 해당하는 표적 mRNA를 선택적으로 분해하여 표적 유전자의 전사와 단백질 합성을 중단시키는 과정이다. 이러한 RNAi 현상을 특이적으로 유도하는데 사용되는 siRNA(small interfering RNA)을 제조하기 위해서 in vitro에서 siRNA를 직접 합성한 후 transfection을 통해 세포 안으로 도입시키는 방법과 세포 내에서 siRNA를 발현할 수 있도록 제작된 shRNA(short hairpin RNA) 발현벡터를 활용하는 방법이 널리 사용되고 있다.

본 발명에서는 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 유전자를 포함하는 마이오신 라이트 체인(myosin light chain) 유전자의 발현을 제어하기 위해 RNAi 기술을 활용하였으며, 마이오신 라이트 체인(myosin light chain) 유전자에 대한 RNAi(ribonucleic acid interference) 염기서열을 포함하는 뿌리혹선충 저항성 재조합 벡터를 제작하였다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 뿌리혹선충 저항성 형질전환 식물체를 제공한다.

상기 식물체는 담배, 애기장대, 수박, 참외, 오이. 호박, 토마토, 풋고추, 가지, 당근, 땅콩, 감자, 고구마, 및 기타 약용작물인 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.

상기 식물체는 마이오신 라이트 체인 유전자에 대한 RNAi에 의해 뿌리혹선충 저항성이 증가하고 선충의 뿌리혹(roor knot) 및 에그 메스(egg mass)의 수가 감소하는 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.

아울러, 본 발명은 뿌리혹선충 저항성 형질전환 식물체 제조 방법을 제공한다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움이 매개된 유전자 전달을 포함한다. 상기 방법들은 이 기술분야에 널리 공지되어 있다.

본 발명은

(1) 제 1항의 마이오신 라이트 체인 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계;

(2) 상기 벡터를 아그로박테리움을 이용하여 식물체에 형질전환하는 단계; 및

(3) 상기 형질전환체를 선별하는 단계를 포함하는 뿌리혹선충 저항성 형질전환 식물체 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 마이오신 라이트 체인 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 식물체는 뿌리혹선충에 대하여 저항성을 가지므로 선충에 의해 피해를 입는 작물에 유용하게 이용할 수 있다.

도 1은 고구마 뿌리혹선충(M. incognita)의 마이오신 라이트 체인 유전자 RNA 전체 서열과 사용된 CDS(coding sequence)서열(녹색 표시)를 나타낸 도이다.
도 2는 예쁜꼬마선충(C.elegans)의 마이오신 라이트 체인과 고구마 뿌리혹선충의 마이오신 라이트 체인 유전자의 염기서열(nucleic acid sequence)의 상동성(homology)을 비교 분석한 것을 나타낸 도이다.
도 3은 예쁜꼬마선충의 마이오신 라이트 체인과 고구마 뿌리혹선충의 마이오신 라이트 체인 유전자의 단백질 서열을 이용하여 예상 도메인(domain)을 비교분석한 것을 나타낸 도이다.
도 4는 마이오신 라이트 체인의 RNAi 벡터를 나타낸 모식도이다.
도 5는 RNAi 벡터를 이용하여 dsRNA 흡수조건 분석을 통해 마이오신 라이트 체인의 기능분석을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 선충의 발생 단계별 마이오신 라이트 체인 mRNA 발현을 real-time qPCR을 통하여 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 마이오신 라이트 체인 RNAi 형질전환 식물체의 생물 검정 분석 결과를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 통상의 기술분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실시예 1> 마이오신 라이트 체인 유전자 확보 및 분석

뿌리혹선충을 온실 내에서 토마토(Lycopersicon esculentum cv. Rutgers)에 감염시켜 증식하였다. 그런 다음 알과 제 2령의 선충을 25㎛ 크기의 거름망을 이용하여 수집하였고, 1% NaOCl로 소독 후 증류수로 세척하였다. 선충 시료는 액체질소로 동결 후에 막자사발을 이용해 분쇄하였고 트리졸(Trizol) 시약을 이용하여 전체 RNA(total RNA)를 수집하였다. 전장 라이브러리(full-length library)는 뿌리혹선충 알과 제 2령의 선충의 전체 RNA를 이용하여 제작하였다.

구체적으로, 10μg의 전체 RNA를 3 유닛(unit)의 박테리아 알칼리성 인산가수 분해효소(baterial alkaline phosphatase)로 처리하였다. 그런 다음 피놀 추출과 에탄올 침전을 실시하였고, 전체 RNA는 100 유닛의 담배 acid pyrophosphatase(Waco, 일본)로 처리하였다. 전 처리된 전체 RNA는 250 유닛의 RNA ligase(TaKaRa, 일본)를 사용하여 0.4μg의 5'-올리고리보뉴클레오타이드(oligoribonucleotide)를 라이게이션(ligation)하였다. 정제된 mRNA로부터 첫 번째 사슬 cDNA를 합성하였고 Maruyama and Sugano(1994) 등의 방법에 따라 cDNA를 증폭하였다. 증폭된 PCR 산물은 제한효소 SfiI를 이용하여 절단하였고, 0.5 kb보다 큰 cDNA는 DraIII로 절단된 pCNS-D2(GenBank accession no. AF416744)에 접합하였다. 접합된 cDNA는 대장균Top10F'(Invitrogen, 미국)에 형질전환하였다.

그 결과, 2.1 x 10⁷의 콜로니의 숫자를 갖는 라이브러리를 확인할 수 있었다. Normalized cDNA 라이브러리를 만들기 위해, Vieira 등의 방법에 따라 사슬 DNA 라이브러리를 제작하였다(Vieira and Messing, 1987). 그런 후에 플라스미드 DNA를 대장균 Top10F에 형질전환하였고 2시간 동안 helper phage M13K07를 감염하였다. 그 후 오염된 두사슬 DNA는 hydroxyapatite(HAP) 크로마토그라피를 이용하여 제거하였다. Soares 등에 따라 단일 사슬 DNA 라이브러리는 정규화되었다(Soares et al., 1994). 간단히 설명하면, 단일 사슬 DNA 라이브러리에 올리고뉴클레오티드 프라이머(oligonucleotide primer)를 첨가하여 부분적인 두 번째 사슬을 합성하였다. 부분적인 이중원으로 구성된 DNA를 얻고자 수산화인회석(hydroxyapatite, HAP) 크로마토그라피를 이용하였다. 최종 추출물은 에탄올 침전을 통해 회수하였다. 그런 후 결합되지 않는 단일사슬원은 수산화인회석(hydroxyapatite, HAP) 크로마토그라피를 이용하여 분리하였다. Normalized cDNA circles는 랜덤 결합체(random hexamers)와 T7 DNA polymerase를 이용하여 partial duplexes로 전환하였다. 그런 다음 피놀 추출과 에탄올 침전법으로 cDNA를 회수하였고 대장균에 형질전환하였다. 그 결과 5 x 10⁴의 콜로니를 갖는 라이브러리를 만들었다.

또한, 형질전환된 각각의 대장균은 LB 배지에서 37에서 하룻밤 키운 후에 플라스미드를 정제하여 pCNS 벡터 프라이머(5'-GGT CTA TAT AAG CAG AGC TC-3', 서열번호 4)를 이용하여 cDNA 내에 들어 있는 서열을 결정하였다.

구체적으로, 상기 취합된 각각의 EST서열을 phred 프로그램을 이용하여 Base-calling과 질적 평가를 실시하였다(Ewing et al., 1998). 벡터 서열이 제거된 100 bp 이상의 크기를 갖는 EST를 수집하였다. 그런 후 stackPACK v2.1.1을 이용하여 유사한 서열을 갖는 EST 끼리 군집화하였고(Burke et al., 1999) CAP3 프로그램을 활용하여 하나의 서열로 만들었다(Huang and Madan, 1999). 그 후 단백질과 염기서열 유사성을 비교할 수 있는 PEDANT software suite 프로그램을 활용하여 각각의 EST의 기능을 유추하였다. 기능이 유추된 EST 중 마이오신 라이트 체인의 유전자 서열을 확보하였으며(도 1), 예쁜꼬마선충(C. elegans) 마이오신 라이트 체인과 핵산 및 유전자 서열의 유사성을 비교분석하는 한편 단백질 서열을 이용하여 예상 도메인을 비교 분석하였다(도 2 및 3).

< 실시예 2> 마이오신 라이트 체인 RNAi 벡터 제작

<2-1> 벡터 제작

상기 실시예 1에서 확보한 마이오신 라이트 체인은 예쁜꼬마선충에서 발현이 억제되면 선충이 정상적으로 분화할 수 없게 된다고 보고되어 있다. 따라서 본 발명에서는 마이오신 라이트 체인이 뿌리혹선충에서 같은 역할을 하는지 기능을 알아보고자 마이오신 라이트 체인의 RNAi 벡터를 제작하여 담배 형질전환체를 만들었고, 선충의 감염시 선충 증식 억제 효과를 나타내는지 알아보았다.

구체적으로, pCAMBIA 2300 벡터(CAMBIA, 호주)를 제한 효소 HindIII로 절단 후 탈인산화 효소(calf intestine phosphatase)를 사용하여 탈인산화하였다. 그런 후 플라스미드 pDPG165(Kausch et al., 2001, Mesophyll-specific, light and metabolic regulation of the C4PPCZm1 promoter in transgenic maize. Plant Mol Biol 45:1-15)를 HindIII로 절단하고, 절단된 pCAMBIA 2300에 연결하여 플라스미드 pBS221를 제조하였다. 상기 플라스미드 pBS221에 있는 BamHI, KpnI, XbaI 제한효소 자리는 각각의 제한 효소로 절단 후 T7 폴리머라제로 중합 반응을 실시하여 제거하였다. 한편, pBI221(clontech, 미국) 벡터에 폴리클로닝 위치를 삽입하고자, pBI221 벡터를 SacI과 XbaI으로 절단한 후 합성된 올리고뉴클레오티드-1(5'-GACGCGTGAGCTCGGTACCTCGCGAGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTG-3', 서열번호 5)와 연결시킨 다음, T7 폴리머라제로 중합 반응하여 블런트로 만들어 연결하였다.

상기 올리고뉴클레오티드가 삽입된 pBI221 벡터에서 CaMV 35 프로모터, 폴리클로닝 위치와 Nos 터미네이터가 포함된 절편을 분리, 증폭하기 위하여, 상기 올리고뉴클레오티드가 삽입된 pBI221 벡터를 주형으로 하고, 서열번호 6의 프라이머-2(5'-CGGAATTCAGATTAGCCTTTTCAATTTCAGAAAG-3') 및 서열번호 7의 프라이머-3(5'-CGGAATTCGATCTAGTAACATAGATGACACC-3')를 사용하여 PCR(반응조건 : 95 5분, 1회; 94 30초, 60 30초, 72 2분, 30회; 72 7분, 1회)을 이용하여 증폭하였다. 증폭된 절편을 제한효소 EcoRI를 사용하여 절단 후 상기 pBS221에 클로닝하여 벡터 pBSNB22101를 제조하였다.

<2-2> 마이오신 라이트 체인 유전자에 대한 RNAi 벡터 제작

상기 실시예 2-1에서 만들어진 pBSNB22101를 활용하여 RNAi 벡터를 다음과 같이 제작하였다.

구체적으로, pBSNB22101에 UBQ 프로모터와 Gus 유전자를 삽입하기 위해서 두 프라이머 RNAiatUBQ1F4:5'-cggaattcAGGTGCCAAATCTTTGATTGGAG-3'(서열번호 8)과 RNAiatUBQ1R6:5'-cggggtaccCTTTTGTGTTTCGTCTTCTCTCA-3'(서열번호 9)를 이용하여 PCR 산물을 얻었고 다른 두 프라이머(GUSF3:5'-cggggtaccATGTTACGTCCTGTAGAAACCCC-3'(서열번호 10)과 GusR2:5'-cccaagcttTCATTGTTTGCCTCCCTGCTG-3'(서열번호 11)를 이용하여 PCR산물을 얻고 UBQ 프로모터 PCR 산물에 EcoRI과 KpnI의 제한효소 처리를 하였고 Gus 유전자 PCR 산물에 KpnI과 HindIII 제한효소를 처리하였다. 그런 다음 제한효소로 절단된 두 PCR 산물을 ligase로 연결하고 재 PCR을 두 프라이머(RNAiatUBQ1F4:5'-cggaattcAGGTGCCAAATCTTTGATTGGAG-3'(서열번호 12)와 GusR2:5'-cccaagcttTCATTGTTTGCCTCCCTGCTG-3'(서열번호 13)를 이용하여 실시하였다. 새롭게 생성된 PCR 산물은 UBQ 프로모터-gus 유전자를 함유한다. 이 PCR 산물에 제한효소 EcoRI과 HindIII를 처리하여 pBSNB22101에서 한쪽 EcoRI 제한효소 자리가 제거된 pBSNB22101-EcoRI 벡터에 삽입하였다.

또한, RNAi 벡터를 제조하기 위하여 먼저 pK7GWIWG2(II)의 게이트웨이 카세트(gateway cassette)를 pBluscsript SK+에 삽입하였다.

구체적으로, pBluscsript SK+를 먼저 SacI으로 처리후 T4 DNA 중합효소 처리 후 두 프라이머(MCSF8:5'-CCGAGCTCGCCCAAGCTTACGCGTGGATCCCTGCAG-3'(서열번호 14)와 (MCSR8:5'-CTGCAGGGATCCACGCGTAAGCTTGGGCGAGCTCGG-3'(서열번호 15)로 만들어진 양사슬 올리고머를 삽입하여 SacI에 HindIII 제한효소를 삽입(pBluscsript SK-1)하였다. 그런 후 pK7GWIWG2(II)에 ApaI 제한효소와 SpeI 제한효소를 처리하여 35S 터미네이터와 attR2 사이의 DNA 절편을 추출 후 위에 pBluscsript SK-1에 삽입하였고 이름을 pBluscsript SK-2로 명명하였다. 그런 후 pK7GWIWG2(II)를 SpeI 제한효소를 처리하여 Intron I과 attR1 사이의 DNA 절편을 추출 후 pBluscsript SK-2에 삽입하였고 이름을 pBluscsript SK-3로 명명하였다. 식물 형질전환용 벡터인 pBSNB22101에 UBQ 프로모터를 삽입하기 위해서 먼저 두 프라이머(RNAi UBQ1 F8: 5'-cggaattcAGGTGCCAAATCTTTGATTGGAG-3'(서열번호 16)과 RNAi UBQ1 R14: 5'-cggaattcggtaccctcgagaagcttCTTTTGTG-3'(서열번호 17)를 이용하여 PCR을 실시하였고 제한효소 EcoRI을 이용하여 절단하여 EcoRI으로 절단된 pBSNB22101에 삽입하였다. 결과적으로 UBQ1 프로모터의 3에 HindIII-XhoI-KpnI의 제한 효소가 더 삽입하였으며 pBSNB22101-UBQ로 명명하였다.

또한, pBluscsript SK-3에 KpnI과 HindIII를 처리하여 얻은 DNA 절편을 KpnI과 HindIII로 처리된 pBSNB22101-UBQ 벡터에 삽입하여 최종 RNAi 벡터를 완성하였고 pBSNB22101-UBQ-RNAi 벡터라 명명하였다.

이렇게 완성된 RNAi 벡터에 마이오신 라이트 체인 유전자를 삽입하기 위해서 pCR8/GW/TOPO TA cloning kit를 이용하여 두 프라이머(Myosin light chain F1:5'-cggggatcctCCTTCTTTAAAAATGCCATCCCAA-3'(서열번호 18)와 Myosin light chain R1:5'-cggggatccCACTTTCTTGATAAACTGATCATAAT-3'(서열번호 19)을 이용한 PCR 산물을 접합하였고 pCR8/GW-MLCF라 명명하였다. 그 후 pBSNB22101-UBQ-RNAi에 마이오신 라이트 체인 유전자를 삽입하기 위해 LR 반응을 실시하였다.

최종적으로 RNAi cassette에 마이오신 라이트 체인 유전자가 삽입된 pBSNB22101-UBQ-MLC의 벡터를 완성하였으며 도 4에 나타내었다.

< 실시예 3> 마이오신 라이트 체인 유전자에 대한 RNAi 벡터를 이용한 형질전환 식물체 제작

마이오신 라이트 체인 유전자가 함유된 RNAi 벡터를 아그로박테리움(EHA 105)에 형질전환하고 PCR 기법을 사용하여 아그로박테리움의 T-DNA에 마이오신 라이트 체인 유전자가 함유된 RNAi 벡터의 삽입을 확인하였다. 기내 배양된 담배(Nicotina benthamiana)를 0.5 cm 크기로 자른 후, 마이오신 라이트 체인 유전자가 함유된 RNAi 벡터의 삽입이 확인된 형질전환 아그로박테리움(EHA105; 농도 0.4 at 599.9 nm)에 5분간 감염(20 rpm)하였다. 감염된 담배잎에 남아있는 물기를 멸균된 휴지로 제거한 후 MS104(2.5 mg/l BAP, 0.1 mg/l의 IAA) 배지에 치상하여, 2일간 암배양하였다. 암배양 후 멸균된 증류수에 3회 세척 후, 500 mg/l 의 cefotaxim, 3 mg/l의 ppt가 함유된 MS104에 치상, 2주마다 배지를 교체하였다. 유도된 shoot는 100 mg/l의 세포탁심(cefotaxim)과 3 mg/l의 ppt가 함유된 배지에서 뿌리를 유도하였다. 뿌리가 유도된 식물체는 1주일간 순화 후 온실에서 증식하였다.

< 실험예 1> RNAi 에 의한 마이오신 라이트 체인의 발현 기능 분석

식물체에서 생성된 선충 유래 dsRNA가 선충 치사 유전자 발현기능에 영향을 미치는지 알아보기 위해서 위에서 제작된 벡터에 유전자의 일부를 가지고 RNAi 벡터를 만들고 담배에 형질전환을 실시하였다. 형질전환된 담배에 선충을 감염 후에 한달 뒤에 뿌리혹 수의 측정을 통해 마이오신 라이트 체인 유전자의 발현 억제를 통한 선충 방제의 효과를 알아보았다.

구체적으로, dsRNA 10ug/ml를 포함하는 DEPC water 50μl를 J2 선충 약 2000 마리에 넣어주었다. 상온에서 각각 1시간, 4시간 8시간 동안 암상태에서 쉐이킹(shaking) 후 DEPC water을 이용하여 3번 세척 후 CoreZol을 이용하여 RNA를 추출한 후 타카라 cDNA 합성 kit를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 100 ng의 cDNA와 SYBR 5X qPCR mix를 사용하여 qPCR 분석을 수행하였다.

그 결과, 1 시간째에서는 1.6배, 4 시간째에서는 4.9배의 감소율을 보여주었다. 8시간 후도 전사억제 효과를 나타냈으나 4시간에 비해서는 높게 나타나지 않았다(도 5).

< 실험예 2> 선충의 발생 단계별 마이오신 라이트 체인 mRNA 발현 분석

선충 내의 마이오신 라이트 체인 mRNA 발현 양상을 실시간(real-time) qPCR을 통하여 분석하였다.

선충을 각 단계별(egg, J2, J3, J4, female)로 모아 DEPC water을 이용하여 3번 세척 후 CoreZol을 이용하여 RNA를 추출하고 타카라 cDNA 합성 kit를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 100ng의 cDNA와 SYBR 5X qPCR mix를 사용하여 qPCR 분석을 수행하였다.

그 결과, J2에서 가장 높은 발현 양상을 확인하였다(도 6). 선충은 보통 egg, J2, J3, J4, female(성체)의 단계를 거친다. J2는 egg에서 부화된 이후의 상태로 성장이 덜된 상태로 짧고 가늘며 운동능력을 가지고 있어서 식물의 뿌리에 감염하는 시기이므로 높은 발현양상을 보인다.

< 실험예 3> 마이오신 라이트 체인 RNAi 형질전환 식물체의 생물 검정 분석

식물체 내에서 발현되는 dsRNA에 의해 선충 치사 유전자의 발현 억제를 알아보기 위해서 마이오신 라이트 체인의 벡터를 가지고 형질전환한 담배 식물체를 가지고 선충 감염에 대한 생물 검정을 실시하였다.

구체적으로, RNAi 벡터를 이용하여 형질전환된 담배(T1: 각 유전자 당 30개체 확보)를 가지고 선충 1,000마리를 감염 후 4주 후에 뿌리혹 수와 에그 메스(egg mass)의 수를 측정하였다.

그 결과, 대조군에 비하여 선충 유전자인 마이오신 라이트 체인의 단백질 번역이 억제된 형질전환 담배의 에그 메스(egg mass)는 39%에서 59% 정도 감소하였고 뿌리혹 수는 40%에서 60% 정도 감소되는 것을 확인하였다(도 7).

<110> Republic of Korea <120> Expression vector comprising the myosin light chain gene and transgenic plants transformed with the expression vector <130> P14R12D0624 <160> 19 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 860 <212> DNA <213> myosin light chain <400> 1 atgtcaacat cttcggatag cagtggtgct gtgttgtata ctaggaaaga agtcagtgtc 60 catgatgaag tttgggatga cactgagttg atcaaaatgt atgaaaaatc tacggccaag 120 acttatgaaa aattgcaaaa taactttaac aataaaaaca acacttcaaa aaattctggg 180 tcaaaaatta agtggaagat tggtgatcat tgcatggcgc catatgagga tgatggtaga 240 tggtatccag ccaaaattga atcgattaat attgctaaag gaaattgttt agttattttt 300 gatggttaca atacaaaggc tacagttaaa ttggattcgc ttatgacgga agaggatgtt 360 gaatgggtta gcgatgaagc agaccaagaa gagaatggcc gcaaaaaaag cgatgacaag 420 actactgatc ttgagcctcc ttcaaccaca aaaaatactg gaaagacaaa caaggctaat 480 attggtagta tttttccgat tcccgatctt tgtcctcctc caccagacta tttaattaat 540 aaggtttctg ctgctggaac tgatagagag gcattaacta atgcgttgat gagttggtat 600 atggctgggt accatacagg attctaccaa ggattgatgg ctcaaagaac ggaaaacccc 660 aagaatccaa caagtgggac gaaaaagaat gagaaaatct aaaaagtgga taaaaaagga 720 atattttttt gttttatttt atgtggattt gttgggggag aagaggaggg ttgtgatctc 780 tcattgaaaa aaaaagttta ctatcatttt aagaaaaaat aaaagatatt tttgcctaaa 840 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 860 <210> 2 <211> 702 <212> DNA <213> coding sequence of myosin light chain <400> 2 atgtcaacat cttcggatag cagtggtgct gtgttgtata ctaggaaaga agtcagtgtc 60 catgatgaag tttgggatga cactgagttg atcaaaatgt atgaaaaatc tacggccaag 120 acttatgaaa aattgcaaaa taactttaac aataaaaaca acacttcaaa aaattctggg 180 tcaaaaatta agtggaagat tggtgatcat tgcatggcgc catatgagga tgatggtaga 240 tggtatccag ccaaaattga atcgattaat attgctaaag gaaattgttt agttattttt 300 gatggttaca atacaaaggc tacagttaaa ttggattcgc ttatgacgga agaggatgtt 360 gaatgggtta gcgatgaagc agaccaagaa gagaatggcc gcaaaaaaag cgatgacaag 420 actactgatc ttgagcctcc ttcaaccaca aaaaatactg gaaagacaaa caaggctaat 480 attggtagta tttttccgat tcccgatctt tgtcctcctc caccagacta tttaattaat 540 aaggtttctg ctgctggaac tgatagagag gcattaacta atgcgttgat gagttggtat 600 atggctgggt accatacagg attctaccaa ggattgatgg ctcaaagaac ggaaaacccc 660 aagaatccaa caagtgggac gaaaaagaat gagaaaatct aa 702 <210> 3 <211> 743 <212> DNA <213> promotor of ubiquitin <400> 3 aggtgccaaa tctttgattg gagttgataa aatattttta tttggttgta attttgtaat 60 atcccgggat atttcacaaa ttgaacatag actacagaat tttagaaaac aaactttctc 120 tctcttatct cacctttatc ttttagagag aaaaagttcg atttccggtt gaccggaatg 180 tatctttgtt ttttttgttt tgtaacatat ttcgttttcc gatttagatc ggatctcctt 240 ttccgttttg tcggaccttc ttccggttta tccggatcta ataatatcca tcttagactt 300 agctaagttt ggatctgttt tttggttagc tcttgtcaat cgcctcatca tcagcaagaa 360 ggtgaaattt ttgacaaata aatcttagaa tcatgtagtg tctttggacc ttgggaatga 420 tagaaacgat ttgttatagc tactctatgt atcagaccct gaccaagatc caacaatctc 480 ataggttttg tgcatatgaa accttcgact aacgagaagt ggtcttttaa tgagagagat 540 atctaaaatg ttatcttaaa agcccactca aatctcaagg cataaggtag aaatgcaaat 600 ttggaaagtg ggctgggcct tttgtggtaa aggcctgtaa cctagcccaa tattagcaaa 660 accctagacg cgtacattga catatataaa cccgcctcct ccttgtttag ggtttctacg 720 tgagagaaga cgaaacacaa aag 743 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> primer of pCNS vector <400> 4 ggtctatata agcagagctc 20 <210> 5 <211> 62 <212> DNA <213> oligonucleotide-1 <400> 5 gacgcgtgag ctcggtacct cgcgaggatc ctctagagtc gacctgcagg catgcaagct 60 tg 62 <210> 6 <211> 34 <212> DNA <213> primer-2 <400> 6 cggaattcag attagccttt tcaatttcag aaag 34 <210> 7 <211> 31 <212> DNA <213> primer-3 <400> 7 cggaattcga tctagtaaca tagatgacac c 31 <210> 8 <211> 31 <212> DNA <213> RNAiatUBQ1F4_forward <400> 8 cggaattcag gtgccaaatc tttgattgga g 31 <210> 9 <211> 32 <212> DNA <213> RNAiatUBQ1R6_reverse <400> 9 cggggtaccc ttttgtgttt cgtcttctct ca 32 <210> 10 <211> 32 <212> DNA <213> GUSF3_forward <400> 10 cggggtacca tgttacgtcc tgtagaaacc cc 32 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> GusR2_reverse <400> 11 cccaagcttt cattgtttgc ctccctgctg 30 <210> 12 <211> 31 <212> DNA <213> RNAiatUBQ1F4_forward <400> 12 cggaattcag gtgccaaatc tttgattgga g 31 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> GusR2_reverse <400> 13 cccaagcttt cattgtttgc ctccctgctg 30 <210> 14 <211> 36 <212> DNA <213> MCSF8_forward <400> 14 ccgagctcgc ccaagcttac gcgtggatcc ctgcag 36 <210> 15 <211> 36 <212> DNA <213> MCSR8_reverse <400> 15 ctgcagggat ccacgcgtaa gcttgggcga gctcgg 36 <210> 16 <211> 31 <212> DNA <213> RNAi UBQ1 F8_forward <400> 16 cggaattcag gtgccaaatc tttgattgga g 31 <210> 17 <211> 34 <212> DNA <213> RNAi UBQ1 R14_reverse <400> 17 cggaattcgg taccctcgag aagcttcttt tgtg 34 <210> 18 <211> 34 <212> DNA <213> Myosin light chain F1_forward <400> 18 cggggatcct ccttctttaa aaatgccatc ccaa 34 <210> 19 <211> 35 <212> DNA <213> Myosin light chain R1_reverse <400> 19 cggggatccc actttcttga taaactgatc ataat 35

Claims

서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 마이오신 라이트 체인(myosin light chain) 유전자에 대한 RNAi(ribonucleic acid interference) 염기서열을 포함하는 뿌리혹선충 저항성 재조합 벡터.
제 1항에 있어서, 상기 RNAi 염기서열은, 상기 마이오신 라이트 체인(myosin light chain) 유전자가 정방향 및 역방향으로 삽입된 것인 뿌리혹선충 저항성 재조합 벡터.
제 1항에 있어서, 상기 벡터는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진 유비퀴틴(ubiquitin,UBQ) 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 하는 뿌리혹선충 저항성 재조합 벡터.
제 1항의 재조합 벡터로 형질전환된 뿌리혹선충 저항성 형질전환 식물체.
제 4항에 있어서, 상기 식물체는 마이오신 라이트 체인 유전자에 대한 RNAi에 의해 뿌리혹선충 저항성이 증가한 것을 특징으로 하는 뿌리혹선충 저항성 형질전환 식물체.
제 4항에 있어서, 상기 식물체는 선충의 뿌리혹(roor knot) 및 에그 메스(egg mass)의 수가 감소하는 것을 특징으로 하는 뿌리혹선충 저항성 형질전환 식물체.
(1) 제 1항의 마이오신 라이트 체인(myosin light chain) 유전자에 대한 RNAi 염기서열을 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계;
(2) 상기 벡터를 아그로박테리움을 이용하여 식물체에 형질전환하는 단계; 및
(3) 상기 형질전환체를 선별하는 단계를 포함하는 뿌리혹선충 저항성 형질전환 식물체 제조 방법.