KR102232535B1 - 재조합 ccmv 외피 단백질을 발현시키는 재조합 벡터 및 이를 이용하여 재조합 ccmv 바이러스유사입자를 획득하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 바이러스유사입자의 대량생산이 가능한, 재조합 CCMV 외피 단백질을 발현시키는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터를 이용하여 CCMV 바이러스유사입자를 획득하는 방법을 제공한다. 상세하게는 엽록체를 타겟팅하는 염기서열; 카우피 클로로틱 모틸 바이러스(Cowpea chlorotic mottle virus, CCMV)의 외피 단백질을 코딩하는 염기서열; 및 단백질 분리 정제를 위한 태그를 코딩하는 염기서열을 포함하는 재조합 벡터 및 이를 이용하여 재조합 CCMV 바이러스유사입자를 획득하는 방법을 제공한다.
Description
본 발명은 식물에서 재조합 CCMV 외피 단백질을 발현시키는 재조합 벡터를 제공하고, 상기 재조합 벡터를 이용하여 획득된 CCMV 외피 단백질을 이용하여 제조되는 재조합 CCMV 바이러스유사입자를 획득하는 방법을 제공하는 것이다.
바이러스유사입자(Virus-like particle, VLP)는 바이러스 외피 단백질의 자기 조립에 의해 형성되는 거대분자 구조체이다. 바이러스유사입자는 바이러스 게놈을 포함하지 않기 때문에 전염성을 가지지 않는다는 안정성과 더불어 백신개발, 종양 표적 치료, 유전자치료등과 같은 다양한 분야에의 활용 가능성으로 인해 순수 분리된 바이러스유사입자의 생산에 다양한 기술들이 개발되고 있다.
한편, CCMV(Cowpea chlorotic mottle virus)는 브로모바이러스(Bromovirus)속에 속하며 많은 작물에 병을 일으키는 외가닥 RNA 바이러스이다. 20kDa 크기의 CCMV 외피 단백질 180개가 자가조립을 통해 CCMV의 외피를 형성하는 것으로 알려져 있으며 이러한 외피 단백질의 자가조립 기작에 대해서는 비교적 잘 알려져 있다.
상기 CCMV 바이러스유사입자를 생산하기 위해 이종 발현 시스템을 활용하여 재조합 CCMV 외피 단백질을 발현시키고자 하는 시도들이 보고되어 있다. 예를 들어, 대장균을 이용하여 재조합 CCMV 외피 단백질을 발현시킬 수 있는데, 이러한 경우 발현되는 재조합 외피 단백질은 불용성인 봉입체 형태로 존재한다. 따라서 이를 분리 정제하기 위해서는 우레아와 같은 화학물질을 사용하여 녹여낸 후 다시 원래 구조로 되돌리는 과정을 거친 후 자가조립을 거쳐야 하는 관계로 비용과 시간이 많이 소요되는 문제가 있다.
또한 자가조립을 통해 형성된 재조합 CCMV 외피 단백질을 분리하기 위해서는 초원심분리기를 활용한 자당밀도구배원심분리(sucrose density gradient centrifugation)를 수행해야 하며 이 과정이 재조합 CCMV 바이러스유사입자의 대량생산에 큰 걸림돌이 되고 있다.
한편, 대한민국 공개특허 제2014-7011886호와 같이, 식물에서 바이러스유사입자 수득율을 증가시켜 바이러스유사입자를 대량생산 할 수 있는 방법에 대해 연구하고 있으나, CCMV 바이러스유사입자를 대량생산하기 위한 방법에 대해서는 아직 연구가 미흡한 실정이다.
이러한 기술 배경 하에서, 본 출원의 발명자들은 식물발현 시스템을 활용하여 용해도가 높은 재조합 CCMV 외피 단백질을 발현, 분리정제가 가능함을 확인하였다. 또한 식물에서 발현된 재조합 CCMV 외피 단백질의 자가조립을 통해 형성된 바이러스유사입자를 크기배제 크로마토그래피를 통해 효율적으로 분리 가능함을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 한 측면은 재조합 CCMV 외피 단백질을 발현시킬 수 있는 염기서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명은 다른 측면은 식물에서 높은 용해성을 가진 재조합 CCMV 외피 단백질을 발현시킬 수 있는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 재조합 벡터를 이용하여 재조합 CCMV 바이러스유사입자를 획득하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 견지에 의하면, 서열번호 1에 기재된 염기서열을 포함하는 재조합 벡터가 제공된다.
본 발명의 다른 견지에 의하면, 엽록체를 타겟팅할 수 있는 단백질을 코딩하는 염기서열; 카우피 클로로틱 모틸 바이러스(Cowpea chlorotic mottle virus, CCMV)의 외피 단백질을 코딩하는 염기서열; 및 단백질 분리 정제를 위한 태그를 코딩하는 염기서열을 포함하는 재조합 벡터가 제공된다.
본 발명의 또 다른 견지에 따르면, 본 발명의 재조합 벡터가 발현된 식물의 단백질 추출물을 획득하는 단계; 상기 단백질 추출물에서 재조합 벡터로부터 발현된 단백질을 분리하는 단계; 및 분리된 단백질로부터 바이러스유사입자를 획득하는 단계를 포함하는 재조합 CCMV 바이러스유사입자 획득 방법이 제공된다.
본 발명은 식물 발현 시스템을 활용하여 용해도가 높은 재조합 CCMV 외피 단백질을 발현할 수 있고, 이로 인해 CCMV 바이러스유사입자의 대량생산이 가능하다. 나아가 상기 CCMV 바이러스유사입자는 인간 또는 동물을 대상으로 약물전달 시스템 또는 치료목적의 면역반응을 유도하기 위한 물질로 활용이 가능하다.
도 1은 본 발명의 실시예1에서 제조된 재조합 CCMV 외피 단백질의 발현을 위한 재조합 벡터에 대한 모식도이다.
도 2는 본 발명의 실시예1의 재조합 벡터를 니코티아나 벤타미아에서 발현된 재조합 CCMV 외피 단백질의 웨스턴블로팅(Western blotting)한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 실시예4에서 분리정제된 재조합 CCMV 외피 단백질의 단백질 전기영동(SDS-PAGE)한 후 염색한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 실시예4에서 분리정제된 재조합 CCMV 외피 단백질의 크기배제 크로마토그래피 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 실시예4에서 분리정제된 재조합 CCMV 외피 단백질로 형성된 바이러스유사입자를 투과전자현미경으로 촬영한 이미지를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 실시예1의 재조합 벡터를 니코티아나 벤타미아에서 발현된 재조합 CCMV 외피 단백질의 웨스턴블로팅(Western blotting)한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 실시예4에서 분리정제된 재조합 CCMV 외피 단백질의 단백질 전기영동(SDS-PAGE)한 후 염색한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 실시예4에서 분리정제된 재조합 CCMV 외피 단백질의 크기배제 크로마토그래피 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 실시예4에서 분리정제된 재조합 CCMV 외피 단백질로 형성된 바이러스유사입자를 투과전자현미경으로 촬영한 이미지를 나타낸 것이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시 형태를 설명한다. 그러나, 본 발명의 실시 형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 의하면 용해도가 높은 재조합 CCMV 외피 단백질을 생산할 수 있는 재조합 벡터가 제공되며, 식물 시스템을 이용하여 재조합 CCMV 외피 단백질을 발현시키고 분리 정제를 대량으로 신속하고 간단하게 수행할 수 있다.
상세하게, 본 발명의 재조합 벡터는 서열번호 1에 기재된 염기서열을 포함할 수 있다.
보다 상세하게, 본 발명의 재조합 벡터는 엽록체를 타겟팅할 수 있는 단백질을 코딩하는 염기서열; 카우피 클로로틱 모틸 바이러스(Cowpea chlorotic mottle virus, CCMV)의 외피 단백질을 코딩하는 염기서열; 및 단백질 분리 정제를 위한 태그를 코딩하는 염기서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
상기 엽록체를 타겟팅할 수 있는 단백질을 코딩하는 염기서열은 CCMV의 외피 단백질을 코딩하는 염기서열의 5'말단에 결합되며, 루비스코 트렌짓 펩티드(Rubisco transit peptide) 또는 캡 트렌짓 펩티드(chlorophyll a/b binding protein (Cab) transit peptide)를 코딩하는 염기서열일 수 있다.
상기 재조합 벡터는 서열번호 1에 기재된 염기서열을 포함할 수 있으며, 서열번호 1에 기재된 염기서열은, 루비스코 트랜짓 펩티드를 코딩하는 염기서열인 서열번호 2, CCMV 외피 단백질을 코딩하는 염기서열인 서열번호 3 및 단백질 분리 정제를 위한 태그를 코딩하는 염기서열인 서열번호 4를 포함할 수 있다.
상기 CCMV 외피 단백질을 코딩하는 염기서열은 발현시키고자 하는 식물에 따라 달라질 수 있으며, 서열번호 1에 기재된 염기서열에 포함되는 CCMV 외피 단백질을 코딩하는 염기서열은 니코티아나 벤타미아나에서의 발현이 최적화된 서열일 수 있다.
상기 단백질 분리 정제를 위한 태그를 코딩하는 염기서열은 CCMV 외피 단백질을 코딩하는 염기서열의 3' 말단에 결합되며, 예를 들어 5 또는 6개의 연속된 히스티딘을 코딩하는 염기서열일 수 있으나, 단백질 분리 정제에 사용되는 염기서열이면 제한되지 않고 사용할 수 있다.
상기 재조합 벡터는 식물 발현용 벡터인 것이 바람직하며, 이 경우 식물체에서 단백질을 발현 시켜 획득할 수 있다. 이때, 상기 식물 발현용 벡터는 pCAMBIA 1300, pBI121 등으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나인 식물 발현용 벡터일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 본 발명의 재조합 벡터를 이용하여 CCMV 바이러스유사입자를 획득하는 방법을 제공한다.
보다 상세하게, 본 발명의 재조합 벡터가 발현된 식물의 단백질 추출물을 획득하는 단계; 상기 단백질 추출물에서 재조합 벡터로부터 발현된 단백질을 분리하는 단계; 및 분리된 단백질로부터 바이러스유사입자를 획득하는 단계를 포함하는 재조합 CCMV 바이러스유사입자 획득 방법이 제공된다.
상기 재조합 벡터가 발현된 식물은, 상기 재조합 벡터를 화학적 방법 또는 전기천공법에 의해 식물을 감염시킬 수 있는 균에 도입하여 배양한 다음, 배양된 균을 식물에 주입함으로써 제공할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법을 통해 재조합 벡터를 아그로박테리아에 도입한 다음, 상기 아그로박테리아를 배지에 배양하고, 배양된 아그로박테리아를 식물에 주입함으로써 제공할 수 있다.
이 때, 상기 식물은 니코티아나 벤타미아나, 애기장대, 상추, 배추, 벼, 밀, 보리, 옥수수 등일 수 있으나, 본 발명의 발현 벡터로 형질전환될 수 있는 식물체라면 이에 제한 되지 않는다.
식물로부터의 단백질 추출물을 획득하는 단계는 재조합 백터가 발현된 식물에 단백질 추출용액을 첨가한 다음, 파쇄 및 원심분리를 통해 단백질 추출액을 획득할 수 있다.
상기 단백질 추출액은 상기 재조합 백터로부터 발현된 단백질뿐만 아니라 식물의 여러 단백질을 포함하고 있기 때문에, 친화크로마토그래피(affinity chromatography)를 통해 재조합 백터로부터 발현된 단백질을 분리할 수 있다.
상기 친화크로마토그래피를 통해 분리된 단백질은 대부분이 삼합체(Trimer) 형태의 재조합 CCMV 외피 단백질로 존재하며, 낮은 pH에서 상기 재조합 CCMV 외피 단백질은 자가조립을 통해 바이러스유사입자(Virus-like particle, VLP)를 형성한다. 그러므로, 상기 친화크로마토그래피를 통해 분리된 단백질은 대부분 자가조립되지 않은 재조합 CCMV 외피 단백질이다.
따라서, 상기 재조합 CCMV 외피 단백질의 자가조립을 위해, 상기 친화크로마토그래피를 통해 분리된 단백질을 산성의 바이러스 완충용액에 주입한다. 상기 산성의 바이러스 완충용액의 pH는 3 내지 6일 수 있으며, 바람직하게는 5.2이다. 이 때, 상기 재조합 CCMV 외피 단백질은 자가조립을 통해 재조합 CCMV 바이러스유사입자를 형성하며, 약 2000kDa 내지는 그 이상의 크기를 갖는다.
다만, 자가조립하여 바이러스유사입자를 형성하는 과정의 효율은 바이러스 완충용액의 pH 및 상기 완충용액에 보관하는 시간에 따라 다를 것으로 판단되나, 모든 재조합 CCMV 외피 단백질이 자가조립하여 바이러스유사입자를 형성하는 것으로 보이지는 않는다.
나아가, 재조합 CCMV 바이러스유사입자는 상기 낮은 pH의 바이러스 완충 용액에 주입된 단백질로부터 크기배제 크로마토그래피를 이용하여 분리할 수 있다.
상기 크기배제 크로마토그래피를 통해 분리되는 재조합 CCMV 바이러스유사입자는 2000 kDa 내지는 그 이상의 크기를 가진다. 100 kDa 미만으로 분리되는 단백질은 다량체 형태의 재조합 CCMV 외피 단백질일 수 있어, 약물전달을 위한 매개채로 사용되기 어렵다. 예를 들어 280nm 파장에서의 흡광도를 분석하여 2,000kDa에 해당하는 피크를 가지는 재조합 CCMV 바이러스유사입자를 획득할 수 있다.
이하, 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 예시에 불과하며, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예1: 식물 발현용 CCMV 외피 단백질 발현 벡터 제작
서열번호 1에 기재된 염기서열과 같이 니코티아나 벤타미아나에서의 발현에 최적화된 서열로 CCMV 외피 단백질 유전자를 합성하였다.
상기 CCMV 외피 단백질 유전자의 5' 말단에 엽록체 이동 신호인 루비스코 트랜짓 펩티드(rubisco transit peptide)를 코딩하는 유전자 서열을 결합하여 발현된 재조합 CCMV 외피 단백질이 엽록체로 이동하여 보존 될 수 있도록 하였다.
나아가, 발현된 재조합 CCMV 외피 단백질의 분리 정제를 위해 6개의 연속된 히스티딘을 암호화하는 유전자서열을 CCMV 외피 단백질 유전자의 3’말단에 결합하였다. 합성된 유전자는 식물 발현 벡터 pCAMBIA1300에 삽입하여 재조합 발현 벡터(도 1)를 완성하였다.
실시예 2: 재조합 CCMV 외피 단백질의 식물체 일시 발현
상기의 실시예 1에서 준비한 재조합 CCMV 외피 단백질 발현 벡터를 전기충격법을 이용하여 아그로박테리아에 도입시켰다.
형질 전환된 아그로박테리아를 5ml의 YEP 액체 배지(효모 추출물 10g, 펩톤 10g, NaCl 5g, 카나마이신 50mg/L, 리팜피신 25mg/L)에서 28℃의 조건에서 16시간 동안 진탕배양 한 후 1차 배양액 1ml을 50ml의 새 YEP 배지에 접종하여 28℃의 조건에서 6시간 동안 진탕배양 하였다.
상기와 같이 배양된 아그로박테리아는 원심분리(7,000rpm, 4℃, 5분)하여 수집한 후, 600nm의 파장에서 O.D. 1.0의 농도로 인필트레이션 버퍼(10mM MES (pH 5.7), 10mM MgCl2, 200μM 아세토시링곤)에 현탁시켰다. 아그로박테리아 현탁액은 주사 바늘을 제거한 주사기를 이용하여 니코티아나 벤타미아나 잎의 뒷면에 주입하는 방법으로 아그로-인필트레이션 (Agro-infiltration)을 수행하였다.
실시예 3: 식물에서 재조합 CCMV 외피 단백질 발현 및 용해성 확인
상기 실시예 2에서 아그로박테리아가 주입된 니코티아나 벤타미아 잎을 막자사발에 담고 액체질소를 이용하여 분말화시켰다.
상기 식물 분말 0.2g에 단백질 추출 용액(50mM sodium phosphate (pH 8.0), 300mM NaCl, 0.1% Triton X-100, 1X 단백질가수분해효소 억제제) 1mL을 첨가하고 와동시켜 잘 혼합한 후 4℃에서 14,000rpm으로 10분간 원심분리하여 상등액과 침전물을 따로 회수하였다.
상등액과 침전물을 각각 5X SDS-PAGE 로딩 완충액(60mM Tris-Cl pH 6.8, 25% 글리세롤, 2% SDS, 14.4mM β-머캅토에탄올, 0.1% 브로모페놀 블루)에 잘 혼합한 후 히스티딘 항체를 사용한 웨스턴 블로팅을 수행하여 재조합 CCMV 외피 단백질의 발현과 용해성을 확인하였다.
상기 웨스턴 블로팅의 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에 나타난 바와 같이 발현된 재조합 CCMV 외피 단백질의 대부분은 상등액에 존재함을 확인할 수 있었다.
실시예 4: 식물에서 발현된 재조합 CCMV 외피 단백질 분리 정제
상기 실시예 2에서 아그로박테리아가 주입된 니코티아나 벤타미아 잎 40g에 단백질 추출 용액(50mM sodium phosphate (pH 8.0), 1M NaCl, 10mM Imidazole, 0.1% Triton X-100, 1X 단백질가수분해효소 억제제(protease inhibitor)) 200mL을 첨가하고 블랜더로 조직을 파쇄한 후 13,000rpm에서 30분간 4℃에서 원심분리하여 단백질 추출액을 회수하였다.
상기 단백질 추출액으로부터 재조합 CCMV 외피 단백질의 분리 정제를 위해 Ni-NTA 아가로스 레진이 충진된 컬럼으로 친화크로마토그래피를 실시하였다. 상기 컬럼에 레진을 5mL 충진한 후 세척 용액(50mM sodium phosphate (pH 8.0), 1M NaCl, 10mM Imidazole) 50mL로 평형화 시켰다.
회수한 단백질 추출액을 컬럼에 적용하고 평형화 시킨 다음, 세척 용액 100mL을 흘려 보내 레진을 세척하고 용출 용액(50mM sodium phosphate (pH 8.0), 300mM NaCl, 300mM Imidazole)으로 재조합 CCMV 외피 단백질을 용출하였다.
재조합 CCMV 외피 단백질이 포함된 용출 용액은 30kDa 크기의 필터를 사용하여 바이러스 완충 용액(100mM Na-acetate (pH 5.2), 1mM DTT, 1M NaCl)으로 교체 및 농축을 실시하였다. 분리 정제된 재조합 CCMV 외피 단백질은 단백질 전기영동 (SDS-PAGE) 후 쿠마시 염색법 (coomassie staining)을 통해 확인하였다.(도 3)
상기 단백질 전기영동 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에 보이는 바와 같이, 재조합 CCMV외피 단백질이 높은 순도로 분리 정제되었음을 확인할 수 있었다.
실시예 5: 재조합 CCMV 바이러스유사입자 분리 및 확인
재조합 CCMV 외피 단백질은 자가조립을 통해 재조합 CCMV 바이러스유사입자를 형성한다. 따라서 상기 바이러스 완충용액에 포함된 재조합 CCMV 바이러스유사입자를 분리하기 위해 크기배제 크로마토그래피를 사용하였다.
실시예 4의 상기 재조합 CCMV 외피 단백질이 포함된 바이러스 완충 용액을 HiLoad 16/600 superdex 200 컬럼에 로딩하고 크기별로 분리를 하여 2,000kDa 과 66kDa 에 해당하는 피크의 분획을 각각 획득하였다.
상기 크기배제 크로마토그래피로 분리한 결과를 도4에 나타내었다.
2,000kDa에 해당하는 피크의 분획에 포함된 단백질을 최종 농도가 100nM이 되도록 희석하여 매질염색을 수행하였다. 5μl의 단백질 용액을 카본이 코팅된 그리드에서 1분간 반응시킨 후 3차 증류수로 3번 세척하고 최종적으로 1% uranyl acetate로 30초 동안 반응시켰다. 준비된 그리드는 Philips Tecnai T10 투과전자현미경을 사용하여 20,000배의 배율로 이미지를 획득하였다.
상기 Philips Tecnai T10 투과전자현미경을 통해 획득된 이미지를 도 5에 나타내었다.
이상에서 본 발명의 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.
본 발명의 서열 목록은 하기와 같다.
서열번호 1: 엽록체를 타겟팅하는 염기서열; 카우피 클로로틱 모틸 바이러스(Cowpea chlorotic mottle virus, CCMV)의 외피 단백질을 코딩하는 염기서열; 및 단백질 분리 정제를 위한 태그를 코딩하는 염기서열을 포함하는 염기서열
ATGGCTTCCTCTATGCTCTCTTCCGCTACTATGGTTGCCTCTCCGGCTCAGGCCACTATGGTCGCTCCTTTCAACGGACTTAAGTCCTCCGCTGCCTTCCCAGCCACCCGCAAGGCTAACAACGACACTACTTCCATCACAAGCAACGGCGGAAGAGTTAACTGCATGCAGGTGTGGCCTCCGATTGGAAAGAAGAAGTTTGAGACTCTCTCTTACCTTCCTGACCTTACCGATTCCGGGATCCTTACTCGTGTGGTCCAACCTGTTATTGTAGAACCCATCGCTTCAGGCCAAGGCAAGGCTATTAAAGCATGGACCGGTTACAGCGTATCGAAGTGGACCGCCTCTTGTGCGGCTGCCGAAGCTAAAGTAACCTCGGCTATAACTATCTCTCTCCCTAATGAGCTATCGTCCGAAAGGAACAAGCAGCTCAAGGTAGGTAGAGTTTTATTATGGCTTGGGTTGCTTCCCAGTGTTAGTGGCACAGTGAAATCCTGTGTTACAGAGACGCAGACTACTGCTGCTGCCTCCTTTCAGGTGGCATTAGCTGTGGCCGACAACTCGAAAGATGTTGTCGCTGCTATGTACCCCGAGGCGTTTAAGGGTATAACCCTTGAACAACTCACCGCGGATTTAACGATCTACTTGTACAGCAGTGCGGCTCTCACTGAGGGCGACGTCATCGTGCATTTGGAGGTTGAGCATGTCAGACCTACGTTTGACGACTCTTTCACTCCGGTGTATCACCACCATCACCACCATTAG
서열번호 2: 루비스코 트렌짓 펩티드를 코딩하는 염기서열
ATGGCTTCCTCTATGCTCTCTTCCGCTACTATGGTTGCCTCTCCGGCTCAGGCCACTATGGTCGCTCCTTTCAACGGACTTAAGTCCTCCGCTGCCTTCCCAGCCACCCGCAAGGCTAACAACGACACTACTTCCATCACAAGCAACGGCGGAAGAGTTAACTGCATGCAGGTGTGGCCTCCGATTGGAAAGAAGAAGTTTGAGACTCTCTCTTACCTTCCTGACCTTACC
서열번호 3: CCMV의 외피 단백질을 코딩하는 염기서열
ACTCGTGTGGTCCAACCTGTTATTGTAGAACCCATCGCTTCAGGCCAAGGCAAGGCTATTAAAGCATGGACCGGTTACAGCGTATCGAAGTGGACCGCCTCTTGTGCGGCTGCCGAAGCTAAAGTAACCTCGGCTATAACTATCTCTCTCCCTAATGAGCTATCGTCCGAAAGGAACAAGCAGCTCAAGGTAGGTAGAGTTTTATTATGGCTTGGGTTGCTTCCCAGTGTTAGTGGCACAGTGAAATCCTGTGTTACAGAGACGCAGACTACTGCTGCTGCCTCCTTTCAGGTGGCATTAGCTGTGGCCGACAACTCGAAAGATGTTGTCGCTGCTATGTACCCCGAGGCGTTTAAGGGTATAACCCTTGAACAACTCACCGCGGATTTAACGATCTACTTGTACAGCAGTGCGGCTCTCACTGAGGGCGACGTCATCGTGCATTTGGAGGTTGAGCATGTCAGACCTACGTTTGACGACTCTTTCACTCCGGTGTAT
서열번호 4: Histidine-tag를 코딩하는 염기서열
CACCACCATCACCACCAT
서열번호 1: 엽록체를 타겟팅하는 염기서열; 카우피 클로로틱 모틸 바이러스(Cowpea chlorotic mottle virus, CCMV)의 외피 단백질을 코딩하는 염기서열; 및 단백질 분리 정제를 위한 태그를 코딩하는 염기서열을 포함하는 염기서열
ATGGCTTCCTCTATGCTCTCTTCCGCTACTATGGTTGCCTCTCCGGCTCAGGCCACTATGGTCGCTCCTTTCAACGGACTTAAGTCCTCCGCTGCCTTCCCAGCCACCCGCAAGGCTAACAACGACACTACTTCCATCACAAGCAACGGCGGAAGAGTTAACTGCATGCAGGTGTGGCCTCCGATTGGAAAGAAGAAGTTTGAGACTCTCTCTTACCTTCCTGACCTTACCGATTCCGGGATCCTTACTCGTGTGGTCCAACCTGTTATTGTAGAACCCATCGCTTCAGGCCAAGGCAAGGCTATTAAAGCATGGACCGGTTACAGCGTATCGAAGTGGACCGCCTCTTGTGCGGCTGCCGAAGCTAAAGTAACCTCGGCTATAACTATCTCTCTCCCTAATGAGCTATCGTCCGAAAGGAACAAGCAGCTCAAGGTAGGTAGAGTTTTATTATGGCTTGGGTTGCTTCCCAGTGTTAGTGGCACAGTGAAATCCTGTGTTACAGAGACGCAGACTACTGCTGCTGCCTCCTTTCAGGTGGCATTAGCTGTGGCCGACAACTCGAAAGATGTTGTCGCTGCTATGTACCCCGAGGCGTTTAAGGGTATAACCCTTGAACAACTCACCGCGGATTTAACGATCTACTTGTACAGCAGTGCGGCTCTCACTGAGGGCGACGTCATCGTGCATTTGGAGGTTGAGCATGTCAGACCTACGTTTGACGACTCTTTCACTCCGGTGTATCACCACCATCACCACCATTAG
서열번호 2: 루비스코 트렌짓 펩티드를 코딩하는 염기서열
ATGGCTTCCTCTATGCTCTCTTCCGCTACTATGGTTGCCTCTCCGGCTCAGGCCACTATGGTCGCTCCTTTCAACGGACTTAAGTCCTCCGCTGCCTTCCCAGCCACCCGCAAGGCTAACAACGACACTACTTCCATCACAAGCAACGGCGGAAGAGTTAACTGCATGCAGGTGTGGCCTCCGATTGGAAAGAAGAAGTTTGAGACTCTCTCTTACCTTCCTGACCTTACC
서열번호 3: CCMV의 외피 단백질을 코딩하는 염기서열
ACTCGTGTGGTCCAACCTGTTATTGTAGAACCCATCGCTTCAGGCCAAGGCAAGGCTATTAAAGCATGGACCGGTTACAGCGTATCGAAGTGGACCGCCTCTTGTGCGGCTGCCGAAGCTAAAGTAACCTCGGCTATAACTATCTCTCTCCCTAATGAGCTATCGTCCGAAAGGAACAAGCAGCTCAAGGTAGGTAGAGTTTTATTATGGCTTGGGTTGCTTCCCAGTGTTAGTGGCACAGTGAAATCCTGTGTTACAGAGACGCAGACTACTGCTGCTGCCTCCTTTCAGGTGGCATTAGCTGTGGCCGACAACTCGAAAGATGTTGTCGCTGCTATGTACCCCGAGGCGTTTAAGGGTATAACCCTTGAACAACTCACCGCGGATTTAACGATCTACTTGTACAGCAGTGCGGCTCTCACTGAGGGCGACGTCATCGTGCATTTGGAGGTTGAGCATGTCAGACCTACGTTTGACGACTCTTTCACTCCGGTGTAT
서열번호 4: Histidine-tag를 코딩하는 염기서열
CACCACCATCACCACCAT
<110> POSCO
<120> Recombinant vector for expressing recombinant CCMV capsid protein
<130> DPP181766
<160> 4
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 765
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Recombinant DNA sequence for expressing recombinant CCMV capsid
protein.
<400> 1
atggcttcct ctatgctctc ttccgctact atggttgcct ctccggctca ggccactatg 60
gtcgctcctt tcaacggact taagtcctcc gctgccttcc cagccacccg caaggctaac 120
aacgacacta cttccatcac aagcaacggc ggaagagtta actgcatgca ggtgtggcct 180
ccgattggaa agaagaagtt tgagactctc tcttaccttc ctgaccttac cgattccggg 240
atccttactc gtgtggtcca acctgttatt gtagaaccca tcgcttcagg ccaaggcaag 300
gctattaaag catggaccgg ttacagcgta tcgaagtgga ccgcctcttg tgcggctgcc 360
gaagctaaag taacctcggc tataactatc tctctcccta atgagctatc gtccgaaagg 420
aacaagcagc tcaaggtagg tagagtttta ttatggcttg ggttgcttcc cagtgttagt 480
ggcacagtga aatcctgtgt tacagagacg cagactactg ctgctgcctc ctttcaggtg 540
gcattagctg tggccgacaa ctcgaaagat gttgtcgctg ctatgtaccc cgaggcgttt 600
aagggtataa cccttgaaca actcaccgcg gatttaacga tctacttgta cagcagtgcg 660
gctctcactg agggcgacgt catcgtgcat ttggaggttg agcatgtcag acctacgttt 720
gacgactctt tcactccggt gtatcaccac catcaccacc attag 765
<210> 2
<211> 231
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Recombinant DNA sequence for expressing rubisco transit peptide
<400> 2
atggcttcct ctatgctctc ttccgctact atggttgcct ctccggctca ggccactatg 60
gtcgctcctt tcaacggact taagtcctcc gctgccttcc cagccacccg caaggctaac 120
aacgacacta cttccatcac aagcaacggc ggaagagtta actgcatgca ggtgtggcct 180
ccgattggaa agaagaagtt tgagactctc tcttaccttc ctgaccttac c 231
<210> 3
<211> 498
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Recombinant DNA sequence for expressing Cowpea chlorotic mottle
virus(CCMV) capsid protein
<400> 3
actcgtgtgg tccaacctgt tattgtagaa cccatcgctt caggccaagg caaggctatt 60
aaagcatgga ccggttacag cgtatcgaag tggaccgcct cttgtgcggc tgccgaagct 120
aaagtaacct cggctataac tatctctctc cctaatgagc tatcgtccga aaggaacaag 180
cagctcaagg taggtagagt tttattatgg cttgggttgc ttcccagtgt tagtggcaca 240
gtgaaatcct gtgttacaga gacgcagact actgctgctg cctcctttca ggtggcatta 300
gctgtggccg acaactcgaa agatgttgtc gctgctatgt accccgaggc gtttaagggt 360
ataacccttg aacaactcac cgcggattta acgatctact tgtacagcag tgcggctctc 420
actgagggcg acgtcatcgt gcatttggag gttgagcatg tcagacctac gtttgacgac 480
tctttcactc cggtgtat 498
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Recombinant DNA sequence for expressing histidine-tag
<400> 4
caccaccatc accaccat 18
Claims (10)
- 엽록체를 타겟팅하는 루비스코 트렌짓 펩티드(Rubisco transit peptide)를 코딩하는 염기서열을 포함하는, 서열번호 1에 기재된 염기서열을 포함하고, 니코티아나 벤타미아나에서 발현되는 재조합 벡터.
- 제1항에 있어서,
상기 서열번호 1에 기재된 염기서열은,
엽록체를 타겟팅하는 루비스코 트렌짓 펩티드(Rubisco transit peptide)를 코딩하는 염기서열;
카우피 클로로틱 모틸 바이러스(Cowpea chlorotic mottle virus, CCMV)의 외피 단백질을 코딩하는 염기서열; 및
단백질 분리 정제를 위한 태그를 코딩하는 염기서열이 순차적으로 작동 가능하게 연결된 염기서열을 포함하며,
니코티아나 벤타미아나에서 발현되는 재조합 벡터.
- 삭제
- 제2항에 있어서, 상기 단백질 분리 정제를 위한 태그를 코딩하는 염기서열은 5 또는 6개의 연속된 히스티딘을 코딩하는 염기서열인, 재조합 벡터.
- 삭제
- 삭제
- 제1항, 제2항 및 제4항 중 어느 한 항의 재조합 벡터가 발현된 니코티아나 벤타미아나의 단백질 추출물을 획득하는 단계;
상기 단백질 추출물에서 재조합 벡터로부터 발현된 단백질을 분리하는 단계; 및
분리된 단백질로부터 바이러스유사입자를 획득하는 단계를 포함하는 재조합 CCMV 바이러스유사입자 획득 방법.
- 삭제
- 제7항에 있어서, 상기 단백질을 분리하는 단계는 친화크로마토그래피로 수행하는, 재조합 CCMV 바이러스유사입자 획득 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 바이러스유사입자를 획득하는 단계는
상기 분리된 단백질을 산성의 바이러스 완충용액에 주입하는 단계; 및
상기 바이러스 완충용액에 크기배제 크로마토그래피를 수행하여 바이러스유사입자를 분리하는 단계를 포함하는, 재조합 CCMV 바이러스유사입자 획득 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020180141670A KR102232535B1 (ko) | 2018-11-16 | 2018-11-16 | 재조합 ccmv 외피 단백질을 발현시키는 재조합 벡터 및 이를 이용하여 재조합 ccmv 바이러스유사입자를 획득하는 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020180141670A KR102232535B1 (ko) | 2018-11-16 | 2018-11-16 | 재조합 ccmv 외피 단백질을 발현시키는 재조합 벡터 및 이를 이용하여 재조합 ccmv 바이러스유사입자를 획득하는 방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20200057371A KR20200057371A (ko) | 2020-05-26 |
| KR102232535B1 true KR102232535B1 (ko) | 2021-03-26 |
Family
ID=70915219
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020180141670A KR102232535B1 (ko) | 2018-11-16 | 2018-11-16 | 재조합 ccmv 외피 단백질을 발현시키는 재조합 벡터 및 이를 이용하여 재조합 ccmv 바이러스유사입자를 획득하는 방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102232535B1 (ko) |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100769584B1 (ko) * | 2004-07-30 | 2007-10-23 | 학교법인 포항공과대학교 | 셀룰로오스의 자가가수분해를 위한 셀룰라아제 발현형질전환 식물체 및 이를 이용한 수용성 당의 생산방법 |
| KR101292240B1 (ko) * | 2009-12-01 | 2013-08-02 | 헬릭스 주식회사 | 엽록체 타겟팅용 ｄｎａ 단편 및 이를 포함하는 재조합 벡터 |
-
2018
- 2018-11-16 KR KR1020180141670A patent/KR102232535B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Afshin Hassani-Mehraban 등. BMC Biotechnology. Vol. 15, No. 80, 페이지 1-17 (2015.08.27.)* |
| Genbank Accession number M28818 (1993.08.02.)* |
| Genbank Accession number XM_024153625 (2018.02.26.)* |
| 공개특허공보 제10-2011-0061171호(2011.06.09.)* |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20200057371A (ko) | 2020-05-26 |
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Legal Events
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| E601 | Decision to refuse application | ||
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