KR102216033B1 - 나노스파이크 어레이를 갖는 합성 살균 표면 - Google Patents

Abstract

본 발명은 살균작용을 나타내는 재료 및 특히 세포와 접촉시 세포에 치명적인 신규한 표면 위상을 나타내는 표면에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 표면을 포함하는 기기, 그러한 표면의 제조방법 및 그러한 표면에 세포를 노출시켜 세포의 생존을 감소시키거나 세포를 제거하는 방법에 관한 것이기도 하다. 특히 본 발명은 나노스파이크 어레이를 포함하는 합성 살균 표면에 관한 것으로서 상기 나노스파이크는 상기 표면 상의 세포의 세포막을 관통함으로써 상기 세포를 치사시키는 것인 합성 살균 표면, 및 실리콘을 포함하는 기판 표면을 반응성-이온 에칭에 노출시키는 것을 포함하는, 나노스파이크 어레이를 포함하는 합성 살균 표면의 제조방법에 관한 것으로서 상기 나노스파이크는 상기 표면 상의 세포의 세포막을 관통함으로써 상기 세포를 치사시키는 것인 합성 살균 표면의 제조방법에 관한 것이다.

Description

나노스파이크 어레이를 갖는 합성 살균 표면{A SYNTHETIC BIOCIDAL SURFACE COMPRISING AN ARRAY OF NANOSPIKES}

[0001] 본 발명은 살균 활성을 나타내는 재료에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 접촉하는 세포에 치명적인 신규한 표면 지형(topography)을 나타내는 표면에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 표면을 갖는 기기(device), 이러한 표면을 제조하는 방법, 이러한 표면에 세포가 노출될 경우 세포의 생존을 없애거나 감소시키는 방법에 관한 것이다.

[0002] 나노구조 재료는 종종 깊은 과학적 관심을 받는 표면 특성을 갖는다. 이러한 독특한 특성은 첫째로는 이들의 물리적 구조에서 발생한다. 예를 들어, 여러가지 나노재료는 특별한 습윤 특징, 예컨대 초소수성(superhydrophobicity) 및 이방성(anisotropic) 습윤을 나타낸다. 초소수성 표면은 보통 상당량의 공기를 포착 가능하게 하여 효과적인 접촉각을 증가시키는 계층적 나노크기 표면 구조를 갖는다. 또한, 표면에 접촉하는 액적은 이 표면에 대한 접착력이 낮고, 표면을 쉽게 이동하여 오염 입자를 쓸어버릴 수 있다는 점에서 이 표면은 자정(self-cleaning)된다. 때때로 이 자정 능력은 바이오-방오(antibiofouling)라고 일컫는, 미생물 세포의 접착력을 감소시키는데 까지 확장될 수 있다. 나노재료는 이들의 물리적 구조의 규모가 여러 가지 세포 유형, 특히 세균과 비슷한 정도이므로, 생물학적 활성의 범위를 수행하는데 있어 높은 잠재력을 갖는다.

[0003] 독특한 특성을 갖는 나노구조는 자연에서 흔히 발견된다. 예를 들어, 상어의 피부, 도마뱀붙이(gecko)의 발, 식물의 잎 및 곤충의 날개는 나노구조의 천연 재료의 몇가지 예이다. 생물의 가장 오래된 유형의 일부로서, 곤충은 표면 오염과 관련된 해로운 영향에 대응하기 위한 전략을 진화시켜 왔다. 진화과정을 통해 많은 곤충은 그들 자신을 깨끗하고 건조하게 유지할 수 있도록 날개에 마이크로- 및 나노-지형 표면 특성을 개발해 왔다. 진화를 통해 곤충에 의해 개발된 것과 유사한 전략을 활용하여, 새로운 기능성 나노재료의 생성을 위해 이들 구조를 활용할 가능성이 상당히 있다.

[0004] 본 발명의 연구자들은 최근 매미 Psaltoda claripennis가 기회감염 인간 병원균^{1 ,2,3}인 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)에 대한 강력한 살균 작용을 갖는다는 것을 보고하였다. 매미 날개는 천연 나노재료의 한 예이다; 그 표면은 규칙적으로 이격된 나노기둥 구조체의 어레이(array)로 덮여져 있고, 이는 비교적 과량의 공기를 포착할 수 있으므로, 그 결과 날개 표면은 초소수성이 된다. 또한, 이 날개의 살균(bactericidal) 특성은 날개의 생화학적 기능과 독립적으로^{23 ,26}, 표면의 나노구조에 기반한 물리적 현상에서 발생하며, 이는 나노기둥 사이의 틈새에서 세균 세포막의 연신을 수반하여, 세포막의 영역에서 변형시키고 궁극적으로는 세포의 용해 및 사멸을 가져온다는 것이 밝혀졌다. 기본 물리적 원칙을 바탕으로, 다른 지형은 구조적으로 유도된 세포 사멸 및 항균(antimicrobial) 특성을 나타내는 표면 구조양식을 가질 수 있다.

[0005] 세포(특히 미생물)의 표면 오염은 수많은 산업 및 보건 분야들이 직면하고 있는 세계적인 문제이다. 예를 들어, 세균 세포가 금속 파이프의 내부에 부착되면 생물학적으로 유도된 부식 및 피팅(pitting)으로 이어질 수 있으며, 이는 파이프의 무결성을 손상시킬 수 있다. 티타늄 임플란트에 병원성 세균이 부착되면 수술후 심각한 합병증으로 이어질 수 있으며, 전신 감염의 원인이 될 수 있다. 식품 가공 장비는 건강에 부정적인 결과를 피하기 위하여 대장균(Escherichia coli ) 및 살모넬라 균(Salmonella typhimurium )과 같은 식중독 병원균이 없도록 유지해야 한다. 미생물의 표면 정착 및 오염의 부정적인 영향은 매우 심각할 수 있어, 상당한 경제적 손실의 원인이 되며, 인간의 건강에 심각한 영향을 끼치고, 일부의 경우, 죽음을 가져올 수 있다.

[0006] 화학 소독제 및 살균제는 현재의 세균 박멸 양식이며, 의료 환경에서 일반적으로 광범위 항생제의 형태를 취한다. 병원성 미생물 중의 항생제 내성의 출현은 불안스러운 세계적 공중 보건 문제이며, 이는 세균의 높은 적응력, 및 항생제의 과처방(over-prescription)에 의해 초래된 가속화된 진화, 및 자연 선택의 과정과 혼합된다. 추가적으로, 새로운 항생제의 개발 및 생산은 미생물 내성의 발생 보다 훨씬 느린 속도로 이루어진다. 표면 코팅 또는 표면 화학 개질에 대한 최근의 수많은 노력의 결과, 세균 부착을 방지하는 바이오-방오 표면의 어레이가 제조되었으나^{22 -24}, 첨단 소재의 핵심 구성요소로서 새로운 항세균 표면에 대한 탐구는 높은 연구 우선순위로 남아있다.

[0007] 세포에 대해 치명적이거나 또는 항균, 특히 항세균(antibacterial) 작용(일반적으로 본 명세서에서 "살균(biocical)" 작용을 일컬음)을 나타내거나, 또는 세포의 성장 및/또는 증식을 감소시키는 합성 표면 지형의 개발이 이 맥락의 범위에서 상업적으로 중요하다. 예를 들어, 합성 살균 표면의 사용은 큰 유용성을 가질 수 있으며, 효율성, 개선된 건강 결과, 감소된 질병 전파 및 /또는 보건 의료 제공 및 수술, 공중 보건, 위생 및 국부 위생, 식품 가공, 제조, 생산 및 저장, 해양 및 수생 환경, 축산, 동물 병원, 노인 용양 시설, 학교 및 보육 시설, 배관 설비, 폐기물 처리 및 재활용 등의 분야에서 비용 절감에 기여할 것이다. 특히, 중요한 장점은 살균 표면을 피팅, 기기 및 장치, 예컨대 공공, 상업 또는 가정 환경에서의 벽, 바닥, 천장, 핸드레일, 문 손잡이 및 핸들, 시트커버, 테이블, 의자, 전등 스위치, 화장실, 수도꼭지 및 그밖의 표면, 음식 준비 표면, 요리 및 음식 준비 용품 및 기기, 식품 및 음료 포장 및 저장 용기, 식품 랩, 의료, 수술 및 치과 도구, 기구 및 장비, 의료, 치과 및 수의학 임플란트; 병원의 표면, 예컨대 바닥, 벽, 싱크, 대야, 벤치탑, 침대, 매트리스 및 배게커버, 병원 가구, 외과, 의료 및 식품 준비용 장갑, 헤어 드레싱 도구 및 장비, 예컨대 빗, 브러쉬, 면도기 및 가위, 상업 및 가정 부엌에서의 표면, 예컨대 바닥, 벽, 싱크, 대야 및 벤치탑, 식품 및 음료 믹서 및 가공/포장 기기 또는 기계, 식품 및 음료 가공 라인, 도살장, 보호복, 고글 및 안경, 물 및 하수 파이프, 탱크 및 배수구, 보트 선체 및 둑, 부두 및 철기둥, 해상 및 수중 파이프 및 케이블 및 오일 및 가스 설비 등의 수중 및 해양 설비의 그밖의 표면에 사용하는 데에서 예상할 수 있다.

[0008] 상기 유용성을 배경으로 염두하여, 본 발명자들은 살균 작용을 나타내는 나노구조의 합성 표면을 제조하고 특징지었다. 본 발명의 더욱 상세한 사항, 장점 및 적용은 이하 상세한 설명에서 더욱 명백해질 것이다.

[0009] 본 발명의 일 구현예에서, 나노스파이크에 의해 세포막이 관통되기 때문에 표면 위의 세포에 치명적인, 나노스파이크의 어레이를 갖는 합성 살균 표면이 제공된다.

[0010] 본 발명의 다른 일 구현예에서, 전술한 바와 같은 표면을 포함하는 기기가 제공된다.

[0011] 본 발명의 추가적 일 구현예에서, 나노스파이크에 의해 세포막이 관통되기 때문에 표면 위의 세포에 치명적인, 나노스파이크의 어레이를 갖는 합성 살균 표면을 제조하는 방법, 및 실리콘(silicon)을 포함하는 기판 표면을 반응성-이온 에칭에 노출시키는 것을 포함하는 방법이 제공된다.

[0012] 본 발명의 추가적 일 구현예에서, 전술한 바와 같은 방법에 의해 제조된, 나노스파이크에 의해 세포막이 관통되기 때문에 표면 위의 세포에 치명적인, 나노스파이크의 어레이를 갖는 합성 살균 표면이 제공된다.

[0013] 본 발명의 추가적 일 구현예에서, 전술한 바와 같은 합성 살균 표면에 노출될 경우 세포의 생존을 없애거나 감소시키는 방법이 제공된다.

[0014] 이하, 도면을 참조하여 본 발명을 더욱 상세히 기술한다.

[0015] 도 1은 35 000×배율에서(스케일 막대 = 200 nm) (a) bSi 및 (b) 잠자리 앞날개의 상면의 주사전자현미경 사진이며, 이들 두 샘플의 표면 패턴을 나타낸다. 표면을 53°의 각도로 기울이면, 블랙 실리콘의 나노구조는 더 날카로와지고, 서로 더 구별되며, 잠자리 날개의 약 2배 높이임을 알 수 있다. 이러한 차이는 광학 프로필로메트리를 사용하면 더 강조되었다 (c, d). 일부 시각적 차이에도 불구하고, (a) 및 (b)에서와 같이 위에서 보았을 때 두개의 공간적 패턴이 다소 유사하고, 이는 (e) 및 (f)에서 더 예시되었는데, 여기서 현미경사진은 변위 맵 생성을 통해 입체 모델로 변환된다.
[0016] 도 2는 녹농균(P. aeruginosa), 황색포도구균(S. aureus), 고초균 식물 세포(B. subtilis vegetative cells), 고초균 포자(B. subtilis spores)의 대표적 SEM 현미경사진을 나타내며, 잠자리 날개 및 블랙 실리콘과의 상호작용의 결과에서 모두 상당히 파괴된 것으로 드러난다(a-d, i-l). 대응하는 공초점 주사현미경 사진(e-h, m-p)은 이러한 파괴는 세포에 치명적인 것이었음을 확인시켜준다. 비생존 세균 세포 및 포자는 오오드화 프로피디움(적색)으로 염색되었고, 생존 세포는 SYTO^®9(녹색)으로 염색되었다. 모든 세포가 적색으로 나타남으로써, 세균를 비활성화시키는데 높은 표면 효율을 증명하였다. SEM 스케일 막대 = 200 nm, CLSM 스케일 막대 = 5 ㎛.
[0017] 도 3은 (a) 블랙 실리콘 및 잠자리 날개 표면의 살균 효율의 그래프이다. bSi 및 D. bipunctata 날개 표면의 동적 살균 효율은 배양 시간 분당, 샘플 접근 표면적의 제곱센티미터당 사멸 세포의 수로 계산하였다. 사멸 세포의 수는 해당 시간 간격에서 대조군에 남아있는 세포 수로부터 생존 세포의 수를 차감함으로써 결정되었다. 대조군에서 시간이 지난 후 세균 수의 작은 감소는 영양이 부족한 인산완충생리식염수에서 약간의 자연적 세포 사멸에 기인한다. 오차 막대는 생물학적 시스템과 연관된 자연적 변동을 나타낸고, 집락 형성 단위의 표준 편차에 기인하여 생성되었다. (b)는 bSi의 돌출된 표면적과 시험대상 세포 유형의 최소 감염 용량을 중화하는데 필요한 시간의 관계를 나타내는 그래프이다. 이 그래프는 모든 세포 유형의 감염 용량은 아주 작은 bSi 샘플에 의해서 매우 짧은 시간 내에 중화될 수 있음을 증명한다. 예를 들어, 크기가 0.2 cm² 인 bSi 샘플은 감염 용량의 고초균 세포를 약 5분 이내에 죽일 수 있을 만큼 큰 것이다.
[0018] 도 4는 (a)잠자리 날개와 (b) bSi 표면의 상부층의 원소 조성을 알아내기 위하여 0 내지 1400 eV에서 수행한 검사 스캔의 XPS 스펙트럼 정보이다. 고해상도 스캔 인셋(inset)을 O 1s 및 C 1s 피크에 걸쳐 약 20 eV 간격으로 수행하였다. (c) 날개 및 (b) bSi 표면에 대한 정적 접촉각 측정값은 날개가 초소수성임을 보여주는 반면, 블랙 실리콘은 적당히 소수성임을 보여준다.
[0019] 도 5는 금-코팅된 bSi 및 D. bipunctata 잠자리 날개의 살균 작용을 나타내는 주사현미경사진이다. bSi (a, b) 및 잠자리 날개 (c, d)의 살균 효율은 금 박막을 코팅한 후에 시험하였다. 양쪽 표면 모두 녹농균(a, c) 및 황색포도구균(b, d)에 대하여 살균 작용을 유지하였다.
[0020] 도 6은 유리 제어 표면에서 (a) 녹농균, (b) 황색포도구균, (c) 고초균 식물 세포, (d) 고초균 포자의 세포 형태를 나타내는 주사전자현미경사진이다. 스케일 막대는 1 ㎛이다.
[0021] 도 7은 매끄러운 실리콘 제어 표면에서 (a) 녹농균, (b) 황색포도구균, (c) 고초균 식물 세포, (d) 고초균 포자의 세포 형태를 나타내는 주사전자현미경사진이다. 스케일 막대는 1 ㎛이다.
[0022] 도 8은 bSi 표면에 의해 세균 세포 농도가 감소하는 것을 보여주는 막대 그래프이다. bSi 표면의 존재하에 30시간 동안 배양했을 때 현탁액에서 모든 유형의 세포 수가 감소하였다. 긴 시간 간격(특히, 24시간 및 30시간)에서 배양했을 때, 영양-결핍 배지 때문에 대조군에서의 세포수도 감소하는 경향이 있었다. 24시간 및 30시간 후 현탁액의 포자에 대한 데이터는 포자의 발아에 인해 발생하는 복잡성 때문에 제외하였다.
[0023] 도 9는 블랙 실리콘 자기-조직(self-organised) 나노기둥 어레이 표면과 적혈구와의 상호작용의 정량적 분석을 제공한다. (a) SEM 이미지 (평면도)는 3시간 접촉 이상 bSi 표면과 적혈구와의 상호작용을 나타냄. (b) bSi 및 상업적 실리콘 웨이퍼의 동적 부착; 데이터는 3개의 독립적 실험의 10개의 서로 다른 부위로부터 부착된 세포의 평균 총수로 그려졌다. (c) bSi 표면의 손상없는 적혈구 및 파괴된 적혈구의 비율; 표면에서 양면이 오목한(biconcave) 형태를 유지한 적혈구는 손상이 없는 세포로 간주하고, 나노기둥에서 손상된 세포의 '세포 프린트'는 '파괴된 세포'로 간주하였다.
[0024] 도 10은 bSi 나노기둥 어레이 표면과 상호작용하는 동안 적혈구의 형태학적 변화를 나타낸다. SEM 현미경사진 (a) 평면도 및 (b) 측면도는 하나의 적혈구의 단계별 파괴 과정을 보여준다. 건강한, 양면이 오목한 세포는 표면과 한번 접촉한 후 변형되고 결국에는 파괴되었다. 파괴된 세포 및 또는 막의 일부 조각들을 볼 수 있으며 이들은 '세포 프린트' CLSM 분석으로 간주될 수 있다. (c)는 적혈구의 파괴를 확인시켜준다. 세포는 1,1'-디옥타데실-3,3,3',3'-테트라메틸인도카르보시아닌 퍼클로레이트로 염색되었다. CLSM 이미지는 세포가 bSi 표면에 접촉한 후 5, 15 및 30분에 촬영하였다.
[0025] 도 11은 블랙 실리콘 표면에 부착되고 파괴된 RBCs의 라만 분석을 제공한다. (a) 520 cm^-1 에서 실리콘의 특징적인 피크 및 (c) 480 cm^-1 내지 560 cm^-1에서 라만 활성의 통합 (b) 적혈구의 헤모글로빈 분자의 특징적 피크 및 (d) 1209 cm^-1 내지 1660 cm^-1의 라만 활성의 통합 (e) CLSM 및 (f) 블랙 실리콘 표면의 적혈구 파괴의 SEM 이미지. 적혈구는 모든 실험에서 bSi와 함께 30분 동안 배양하였다. 파란색 둥근 점선은 양면이 오목한 형태를 여전히 유지하는 세포를 지시한다. 노란색 사각형 점선은 완전히 파괴된 적혈구의 '세포 프린트'를 지시한다.
[0026] 도 12는 자기-조직 나노기둥 어레이 실리콘의 표면 분석을 제공한다. (a) 5분 동안 에칭된 나노기둥 실리콘의 일반적인 평면 SEM 이미지(스케일 막대 500 nm). (b) 100 nm의 직경까지 연장하여, 집단의 경우 38 nm에서 최대이고, 면적%의 경우 49 nm에서 최대임을 보여주는 나노기둥의 면적% 및 집단 분포. 분포의 어깨와 꼬리는 나노기둥의 팁의 응집을 나타낸다. (c) 평면 SEM 고속 푸리에 변환은 4개의 넓은 직교 로브로 확장된 강한 링을 나타낸다; 이는 왜곡된 사각형 패턴의 증거이다. (d) 로브 쌍 중 하나에서 그레이스케일 강도(0 내지 255 순위) 프로파일은 인접한 나노기둥 간의 평균 거리의 측정값이 185 nm임을 나타내었고, 확장된 어깨는 더 먼 거리에 정렬된 나노기둥을 의미한다. (e) 나노기둥의 일반적인 측면 SEM 이미지. (f) 다섯개의 SEM 이미지에서 50회 측정의 평균 ±편차로 계산된 크기를 갖는 나노기둥의 개략도.

[0027] 본 명세서 및 아래 청구범위 전반에 걸쳐, 문맥이 달리 요구하지 않고서는, "포함한다"라는 용어, 및 "포함한다" 및 "포함하는"과 같은 변형은 명시된 정수 또는 단계 또는 정수의 군 또는 단계의 군을 포함하지만, 그외의 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 군을 배제하는 것은 아님을 암시하는 것으로 이해될 것이다.

[0028] 이 명세서 내에서 인용된 문헌들은 여기에 참조 통합된다.

[0029] 이 명세서에서 종래기술에 대한 인용은, 종래기술이 오스트레일리아의 일반적인 상식의 일부를 형성한다는 확인이나 제안의 형태가 아니며 그렇게 여겨져서는 아니 된다.

[0030] 전술한 바와 같이, 하나의 광범위한 구현예에서 본 발명은 나노스파이크에 의해 세포막이 관통되기 때문에 표면 위의 세포에 치명적인, 나노스파이크의 어레이를 갖는 합성 살균 표면에 관한 것이다. 본 발명의 표면은 인공 생산 또는 합성 공정에 의해 제조되는 것을 분명히 하고, 이로써 자연에 존재하는 유사한 표면 지형을 가질 수 있는 본 발명의 표면의 범위를 배제하기 위하여 "합성"으로 일컫는다.

[0031] 세포에 치명적이거나 항균, 특히 항세균 작용을 나타내는 본 발명에 다른 합성 표면 지형은 일반적으로 본 명세서 전체에서 "살균" 작용을 나타내는 것으로 간주한다. 즉, 이 표면에 접촉하면 세포는 용해되고 사멸할 것이다. 그러나, 비록 "살균"이어도, 본 발명의 표면은 이 표면에 노출된 모든 세포를 즉시 사멸하지는 않을 것이라고 이해될 것이다. 그보다는, 표면에 노출된 세포 집단에서 일정 비율의 세포를 표면 나노스파이크("나노기둥"이라고도 일컬음)에 물리적으로 접촉시켜, 그 결과 세포막이 천공될 수 있도록 일정 기간의 노출이 요구될 것이다. 따라서, 표면에 노출되는 세포의 농도에 따라서, 노출 기간 및 이들이 노출되는 표면의 표면적은 모든 세포에 치명적이지는 않을 수 있다. 그러나, 세포 집단에서 적어도 일부의 세포에 치명적일 것인 가운데, 장기적으로 세포 성장 및/또는 증식의 감소가 관찰될 것이다. 세포 정착수 및/또는 증식을 결정하는 일상적인 분석(예컨대, 표준 플레이트 카운트⁹) 및 세포 용해를 식별하기 위한 염색이 살균 작용을 입증하는데 사용가능하다. 공초점 레이저 주사현미경 및 주사전자현미경과 같은 현미경 기술도 본 발명에 따른 표면의 살균 효과를 관찰하는데 사용될 수 있다.

[0032] 살균 표면에 더하여, 본 발명은 살균 표면에의 노출을 수반하여, 세포를 제거하고, 세포의 생존을 감소시키고 및/또는 세포 성장 및/또는 증식을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 좋기로는, 이러한 노출은, 제거하도록 의도된 세포 집단의 높은 비율이 표면에 물리적 접근을 하여, 세포와 나노스파이크 사이에 직접적인 상호작용을 허용하도록 이루어질 것이다. 이러한 역학은 표면에 노출된 매체에서의 세포 농도를 변경함으로써, 세포가 노출되는 나노구조 표면의 표면적을 변경함으로써, 및 노출 기간을 변경함으로써 변형될 수 있다. 세포 성장, 증식 및/또는 생존의 감소는, 불활성 표면, 예컨대 매끄러운 실리콘 또는 유리에 노출된 동등 세포 집단과 비교하여, 상술한 기술을 사용하여 용이하게 결정될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 표면은 처음 3시간 동안 최대 450 000 세포 분-1 cm^-2의 치사 속도로 정량되는 살균 작용을 나타낼 수 있다. 아래 표 1은 다양한 병원성 세균의 감염 용량^{17 -19}을 일정 범위의 기간 동안 제거하기 위해 필요한 표면적을 제공한다. 세균 감염 시도의 범위에서, 이들 표면 지형은 시험된 기간 동안 각각의 감염 용량을 제거하기 위하여 103 - 104 ㎛² 정도의 면적을 필요로 한다.

[0033] 표 1: 3시간 및 18시간 기간 동안의 잠자리 및 블랙 실리콘 표면의 치사 효율 (a) 및 같은 기간 동안 감염 용량을 제거하기 위하여 필요한 표면적 (b). 이들 두가지 지형적으로 관련된 표면의 살균 작용은 포자에 대한 작용을 포함하여 광범위하게 유사하게 나타난다.

(a)

(b)

[0034] 본 발명의 표면 및 방법은 세포를 제거하고, 세포 생존을 감소시키고, 세포 성장 및/또는 증식 또는 원핵세포 및 진핵세포를 비롯한 폭넓은 유형의 세포, 특히 그람 양성 및 그람 음성 세균 세포 (포자 포함), 식물 세포 (조류 포함), 동물 세포, 해양 및 수중 생물 세포, 진균 세포 (효모 포함), 원생생물 세포, 기생충 세포, 기타 미생물, 예컨대 원생 동물, 고세균, 로티퍼 및 플라나리아 세포를 감소시키는데 효과적이다. 바이러스 감염 세포 역시 본 발명에 따라 제거될 수 있다. 본 발명은 특히 보기흉한 (예컨대, 조류, 곰팡이, 진균류), 악취나는, 부식성 및 특히 인간이나 동물 건강에 위협이 되는 세포 또는 유기체의 제거에 적합할 것이다. 본 발명에 따라 제거될 수 있는 병원성 및 비병원성 세포 또는 유기체의 특정 예로는, 비제한적으로 녹농균(Pseudomonas aeruginosa ), 슈도모나스 플루오레센스 대장균(Pseudomonas fluorescens Escherichia coli), 브라나멜라 카탈리스(Branhamella catarrhalis), 플라노코쿠스 마리티무스(Planococcus maritimus), 황색포도구균(Staphylococcus aureus), 고초균(Bacillus subtilis)을 들 수 있다. 특히 본 발명의 표면은 유사한 세포벽 구조를 갖는 기타 원핵 생물에 치명적인 것으로 예상되는데, 이는 세포벽 구조가, 세포 형태 또는 계통발생적 친화성과 관계없이¹², 세포 강성, 및 그 결과로서의 기계적-반응 표면에 대한 세포 감수성을 결정하는 주요한 요소 중 하나라는 것이 본 발명자들에 의해 증명되었기 때문이다.

[0035] 본 발명에 따른 살균 표면은 표면에 노출된 세포에 치명적인 나노스파이크의 질서있는 또는 무질서한 어레이의 존재를 특징으로 한다. 예를 들어, 나노스파이크는, 주어진 표면 내에서 평균적으로, 표면으로부터 약 100 nm 내지 약 600 nm, 예컨대 약 150 nm 내지 약 550 nm, 약 200 nm 내지 약 500 nm, 약 250 nm 내지 약 450 nm 또는 약 300 nm 내지 약 400 nm의 높이를 갖는다. 본 발명의 일 측면에서, 나노스파이크는 평균높이가 약 300 nm내지 약 500 nm이다. 높이 (및 나노스파이크의 기타 평균 크기)는 예컨대 주사전자현미경에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 필수적이지 않지만, 나노스파이크는 이들의 자유 단부를 향하여 직경이 약 4 nm만큼 미세한 팁(tip)이 되도록 이들의 베이스에서 더 큰 직경을 가질 수 있다 (즉, 표면에 스파이스 부착시). 예를 들어, 나노스파이크는 최대 높이의 절반 높이에서 직경이 약 20 nm 내지 약 300 nm, 예컨대 약 20 nm 내지 약 150 nm, 25 nm 내지 약 100 nm, 30 nm 내지 약 60 nm 또는 약 35 nm 내지 약 50 nm이다. 일 측면에서, 나노스파이크는 최대 높이의 절반 높이에서 평균 직경이 약 20 nm 내지 약 50 nm 또는 25 nm 내지 약 40 nm이다.

[0036] 본 발명자들은 나노구조 표면의 살균 작용은 세포막을 관통하는 나노스파이크에 기인하는 것으로 이해하기 때문에, 나노스파이크의 날카로움은 살균 작용에서 중요한 요소라고 생각된다. 따라서, 일 측면에서, 나노스파이크의 자유 단부의 팁은 직경이 평균 약 4 nm 내지 약 50 nm, 예컨대 약 10 nm 내지 약 40 nm 또는 약 15 nm 내지 약 30 nm, 및 바람직하기로는 평균 팁 직경은 약 10 nm 내지 약 25 nm이다.

[0037] 일 측면에서, 나노스파이크의 중심은, 위에서 표면을 볼 때, 평균적으로 약 200 nm 내지 약 700 nm, 예컨대 약 250 nm 내지 약 600 nm 또는 약 300nm 내지 약 500 nm 이격되어 위치할 수 있다. 본 발명에 따른 일부 표면에서, 나노스파이크의 적어도 일부는 종종, 필수적인 것은 아니지만, 자유 단부에서 또는 단부를 향하여 갈라져서 그 결과 두개 이상, 종종 두개 또는 세개의 팁을 갖는다.

[0038] 전술한 다양한 팁 직경, 최대높이의 절반 높이에서 나노스파이크 직경, 나노스파이크의 이격 거리 및 나노스파이크의 높이는 (실행가능한 경우) 조합될 수 있으며, 여기에 구체적으로 개시된 것으로 여겨진다. 본 발명의 일 구현예에서, 가로세로비율 (높이/폭 (절반 최대높이에서 전체 폭))은 약 0.7 내지 약 3, 예컨대 약 1 내지 약 2.5 또는 약 1.5 내지 약 2이다.

[0039] 필요한 것은 아니지만, 나노스파이크는 인접한 나노스파이크의 팁이 균열 없이 서로 모이는 것이 가능하도록 일정한 유연성을 나타내는 것이 바람직하다. 인접한 나노스파이크의 분리는 예컨대 대기 습도, 표면 습윤성 및 용매에 의한 표면 처리를 제어함으로써 제어될 수 있다. 일 측면에서, 나노스파이크는 탄성 영률(Young's modulus of elasticity)이 약 10 GPa 내지 약 300 GPa, 예컨대 약 50 GPa 내지 약 200 GPa 또는 약 100 GPa 내지 약 150 GPa인 것을 특징으로 한다.

[0040] 일반적으로 본 발명의 표면은 어떤 방식으로 기판 재료에 부착거나 또는 접착될 것이고, 예컨대 단일 재료에 의해 일체형으로 형성됨으로써 기판 재료와 일체일 수 있으며, 또는 점진적 공정을 통해 형성됨으로써, 예컨대 여기서 기판과 표면 사이에 정해진 경계가 없으나, 더 기판 재료다운 것으로부터 더 표면 재료다운 것에 가까워지는 경향의 점진적 변화가 있음으로써 기판 재료와 일체일 수 있다. 예를 들어, 기판 재료와 표면 재료 사이의 이러한 점진적 계면은, 플라즈마 생성 가스 함량이 점차 기판 재료에 더 가까운 것에서 표면 재료에 더 가까운 것으로 변화되는 플라즈마 증착 생산법에 의해 형성될 수 있다. 기판 및 표면 재료의 특성에 따라, 표면 재료는 종래의 접착제, 열 접착 등과 같은 공지된 방법으로 기판 재료에 부착될 수 있다. 또한, 본 발명의 표면은 기판 물품 또는 기기에 맞추어 준비된 형태와 크기를 갖는 코팅, 외피 또는 커버의 형태, 예컨대 탈착형 끼움(removable fitting)을 허용하는 형태를 취할 수도 있다.

[0041] 본 발명에 따른 표면이 적용될 수 있는 기판은, 비제한적으로 금속, 반도체, 폴리머, 복합물 및/또는 세라믹 재료를 포함한다. 이러한 재료들은 다른 기기, 도구, 피팅 또는 장치의 부품 또는 구성요소를 형성할 수 있으며, 이들의 표면에서는 생물학적 세포, 특히 예컨대 감염성, 병원성, 악취나는 및/또는 보기흉한 세포의 성장 또는 증식을 제거하거나 적어도 늦추는 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 기기, 도구, 피팅 및 장치는 비제한적으로 벽, 바닥, 천장, 핸드레일, 문 손잡이, 핸들, 시트커버, 테이블, 의자, 전등 스위치, 화장실, 수도꼭지, 싱크, 대야, 벤치탑, 침대, 매트리스 및 배게커버, 병원 가구, 음식 준비 표면, 요리 및 음식 준비 용품 및 기기, 식품 및 음료 포장 및 저장 용기, 식품 랩, 의료, 수술, 수의학 및 치과 도구, 기구 및 장비, 의료, 치과 및 수의학 임플란트; 장갑, 빗, 브러쉬, 면도기 및 가위, 식품 및 음료 믹서 및 가공/포장 기기 또는 기계, 식품 및 음료 가공 라인, 도살장 피팅 및 도구, 보호복, 고글 및 안경, 물 및 하수 파이프, 탱크 및 배수구, 보트 선체 및 수중 및 해양 설비; 및 비제한적으로, 벽 및 바닥 타일 및 바닥, 가구, 벽, 벤치탑 및 그밖의 표면을 위한 라미네이트를 포함하는 이들의 구성요소를 포함한다. 본 발명의 나노구조 표면은 기판을 형성하기 위한 폴리머 생산 블렌드 및 코팅 또는 인쇄 조성물, 예컨대 페인트, 염료 또는 잉크(3D 잉크 포함)에 포함될 수 있는, 또는 살균 작용을 기판에 부여하기 위하여 기판에 적용될 수 있는, 예를 들어 스트랜드, 섬유, 단편 또는 입자(예컨대, 나노- 또는 마이크로-입자, 예컨대 나노- 또는 마이크로-스피어)의 형태로 재료에 적용될 수도 있다. 본 발명의 나노구조 표면이 부여된 재료의 섬유, 원사(yarns) 또는 가닥은 살균/소독 특징을 제품에 부여하기 위하여 직물, 및 보호복, 장막, 침대 시트, 가구 커버, 옷, 수건, 상처 드레싱, 얼굴 마스크, 붕대 및 와이프(wipe)를 비롯한 천 등의 제품에 통합될 수 있는 재료에 통합될 수 있다. 또한, 본 발명의 표면은 세포의 용해 또는 파열을 개시하는데 사용될 수 있으며, 사람 또는 다른 포유류 세포에서 감염, 질환, 세포 생화학, 유전적 소인 등을 검출하는 경우와 같이, 그 내용물을 분석하는 것이 바람직할 수 있다. 구체적으로, 이 기술은 본 발명에 따른 표면을 시료 병, 현미경 슬라이드, 분석 구성요소, 마이크로유체 기기 등에 사용하여, 혈액 세포, 특히 적혈구에 적용될 수 있다.

[0042] 본 발명의 나노구조 표면은 다양한 재료, 예컨대 금속, 반도체, 폴리머, 복합물 및/또는 세라믹 재료로부터 형성될 수 있다. 이러한 재료는 금속, 반도체, 폴리머, 복합물 및/또는 세라믹의 블록, 시트, 필름, 호일, 튜브, 스트랜드, 섬유, 단편 또는 입자 (예컨대, 나노- 또는 마이크로-입자, 예컨대 나노- 또는 마이크로-스피어), 분말, 형태가 있는 물품, 의도된, 질감의 또는 성형된 물품 또는 직물 또는 시트로 가압된 섬유 덩어리 (예컨대 종이)의 형태를 취할 수 있다. 나조구조 표면을 형성하는데 사용되는 재료의 특성에 따라서, 제조공정은 필요에 따라 변형될 것이다. 그러나, 나노기술 분야의 종래기술, 예컨대 리소그래피 및 화학증가방법을 채용할 수 있다. 적절한 재료와 함께 도입될 수 있는 특정 방법의 예로는, X-레이 리소그래피, 포토리소그래피, 극자외선 리소그래피(EUV), 열화학 나노리소그래피(TCNL), 자기리소그래피(ML), 스캐닝 프로프 리소그래피(SPL), 원자간력 현미경 나노리소그래피(AFM), 전자빔 직접 기록 리소프래피(EBDW), 나노임프린트 리소그래피(NIL), 주사 터널링 현미경 리소그래피(STM) 및 반응성 이온 에칭(RIE)을 들 수 있다.

[0043] 예를 들어, 반응성 이온 에칭(RIE)은 SF₆ 및 O₂의 존재하에 수행될 수 있다. 일 구현예에서, 붕소 도핑 실리콘 재료는 RIE에 노출된 기판으로 사용되며, 다른 기판, 예컨대 폴리머 또는 다른 유형의 Si 기판(n- 및 p-유형 또는 반-절연성 포함)이 동등하게 활용될 수 있다. 특정 일 실시예에서, (100) 방향의 525±25 ㎛ 두께의 저항이 10-20 Ωcm^-1인 p-유형 붕소-도핑 100 mm 직경의 상업적 Si 웨이퍼(Atecom Ltd, 대만)가 RIE을 위한 기판으로 사용될 수 있으며, 이 경우 bSi가 형성된다. 예컨대, 약 30mTorr 내지 약 40mTorr의 처리 압력 및 약 80W 내지 약 120W의 RIE 전원이 편리하게 채용될 수 있다. RIE 방법의 사용에 대한 자세한 사항은 특히 블랙-Si의 제조와 관련하여 다른 곳에서 제공된다^4,5.

[0044] 본 명세서에 사용된 "금속" 또는 "금속성"이라는 용어는 적어도 일부가 금속 결합을 갖는 성분, 합금 또는 혼합물을 일컫는다. 본 발명에 따른 바람직한 금속으로는 원소로서 철, 구리, 아연, 납, 알루미늄, 티타늄, 금, 백금, 은, 코발트, 크롬, 바나듐, 탄탈, 니켈, 마그네슘, 망간, 몰리브덴, 텅스텐 및 이들의 합금 및 혼합물을 들 수 있다. 본 발명에 따른 특히 바람직한 금속 합금은 코발트 크롬, 니켈 티타늄, 티타늄 바나듐 알루미늄 및 스테인리스강을 포함한다.

[0045] 본 명세서에 사용된 "세라믹"이라는 용어는 무기 및 비금속 화합물로부터 실질적으로 형성된 결정성 또는 적어도 부분적으로 결정성 구조체를 포함하는 재료를 포괄하는 것으로 의도된다. 이들은 일반적으로 냉각으로 고체화되거나, 형성되고 가열에 의해 동시에 또는 연속적으로 성숙되는(소결되는) 용융물로부터 형성된다. 점토, 유리, 시멘트 및 도자기 제품은 모두 세라믹의 카테고리에 속하며, 세라믹의 종류는 예컨대 산화물, 규산염, 규화물, 질화물, 탄화물 및 인산염을 포함한다. 특히 바람직한 세라믹 화합물은 마그네슘 옥사이드, 알루미늄 옥사이드, 하이드록시아파타이트, 티타늄 니트라이드, 티타늄 카바이드, 알루미늄 니트라이드, 실리콘 옥사이드, 아연 옥사이드 및 인듐 주석 옥사이드를 포함한다.

[0046] 본 명세서에서 "반도체"라 함은 도체보다 높은 저항을 갖지만 저항체보다는 낮은 저항을 갖는 재료를 의미한다; 즉 이들은 전기 및 전자 분야, 예컨대 다이오드, 트랜지스터 및 집적 회로에 유용하게 활용될 수 있는 밴드갭을 나타낸다. 반도체 재료의 예로는 실리콘, 실리콘 다이옥사이드(실리카), 게르마늄, 갈륨 아세나이드, 인듐 안티모나이드, 다이아몬드, 비정질 카본, 비정질 실리콘을 들 수 있다. 실리콘이 사용될 경우, 실리콘은 붕소-도핑 실리콘과 같이 도핑된 실리콘일 수 있다.

[0047] 본 발명의 일 측면에서, 본 발명의 나노구조 표면이 만들어지는 재료는 블랙 실리콘 (bSi)이다. 블랙 실리콘은 플라즈마²⁰ 또는 레이저 처리²¹에 의해 만들어질 수 있는 유망한 광전지 재료로 상당한 관심을 받아온 나노재료이다. 이 재료는 광산란 및 흡수 특성 때문에 '블랙 실리콘(black silicon)'으로 일컫는데, 이는 표면에 이칭된 침상 기둥에 기인한다. 이는 비교적 간단한 반응성 이온 에칭 방법^{4 ,5}에 의해 쉽게 제조될 수 있다. 에칭 조건을 조작함으로써, 나노크기 특성 치수에 대한 제어 정도를 달성할 수 있다^{4 ,5}. 그러나, 지금까지 어떠한 연구도 bSi의 생물학적 특성, 특히 본 발명에 따른 특별한 특성을 갖는 bSi를 보고한 바 없었다.

[0048] 본 발명에서 이해되는 "복합" 재료는 다른 재료와의 조합물 또는 혼합물, 예컨대 금속/세라믹 복합 재료 ("서멧(cermat)"이라 함) 및 금속, 세라믹 또는 반도체 내용물, 성분 또는 요소를 일부 함유하는 폴리머 재료의 복합물을 포함한다. 이러한 복합물은 다양한 유형의 재료의 긴밀한 혼합물을 포함할 수 있으며, 또는 다양한 재료의 규칙적인, 어레이 또는 층 또는 소정의 요소를 포함할 수 있다.

[0049] 본 발명의 맥락에서 "폴리머"는 비제한적으로, 기존의 폴리머 및 플라즈마 증착으로 생성된 폴리머, 예컨대 저밀도 폴리에틸렌(LDPE)을 비롯한 폴리올레핀, 폴리프로필렌(PP), 고밀도 폴리에틸렌(HDPE), 초고분자량 폴리에틸렌(UHMWPE), 폴리올레핀과 다른 폴리머 또는 고무와의 혼합물; 폴리에테르, 예컨대 폴리옥시메틸렌(Acetal); 폴리아미드, 예컨대 폴리(헥사메틸렌 아디프아미드)(나일론 66); 폴리이미드; 폴리카보네이트; 할로겐화 폴리머, 예컨대 폴리비닐리덴플로라이드(PVDF), 폴리테트라-플루오로에틸렌(PTFE)(테프론^TM), 플루오르화 에틸렌-프로필렌 코폴리머(FEP), 및 폴리비닐 클로라이드(PVC); 방향족 폴리머, 예컨대 폴리스티렌(PS); 케톤 폴리머, 예컨대 폴리에테르에테르케톤(PEEK); 메타크릴레이트 ㅍ폴리머, 예컨대 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA); 폴리에스테르, 예컨대 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET); 및 코폴리머, 예컨대 ABS 및 에틸렌 프로필렌 디엔 혼합물(EPDM)을 들 수 있다.

[0050] 본 명세서에서 "공동-증착(co-deposition)"이라 함은 표면에 적어도 두종류를 동시에 증착시키는 증착 공정을 의미하며, 이 방법은 표면 증착의 점진적 층을 획득하기 위하여 2종 이상의 성분의 비율을 시간에 따라 변화시키는 것을 수반할 수 있다. 가장 좋기로는, 이러한 점진층의 증착은, 탄소 함유 종의 증착 전에 증착된 층들은 효과적인 기판이 될 것을 주의하면서, 기판 재료만의 증착으로 시작된다. 그 결과, 재료들 간에 혼합된 또는 점진적인 계면을 형성할 수 있다.

[0051] "혼합된 또는 점진적인 계면"이라는 용어는, 2종 이상의 구성 성분들의 상대적인 비율을 소정의 프로파일에 따라 점차 달리하는, 재료내 영역을 명시하기 위하여 사용된다. 혼합된 도는 점진적인 계면이 생성되는 한가지 방법은 이온 주입(ion implantation)이다. 이는 기판 재료로부터 증착된 플라즈마 폴리머 재료로의 전이를 달성한다. 이 과정에서, 기판에 적용되는 전압, 펄스 길이, 주파수, 플라즈마 침지 이온 주입(PIII) 펄스의 듀티 사이클 중에 하나 또는 이들의 조합은 시간에 따라 달라질 수 있으며, 그 결과, 플라즈마에서 발생되는 종들이 주입되는 정도가 달라진다. 점진적 금속/플라즈마 폴리머 계면을 달성할 수 있는 다른 방법의 예로는 공동-증착이 있는데, 여기서 증착된 및/또는 주입된 재료가 보다 금속성인 것으로부터 보다 폴리머답게 점진적으로 변화되도록, 마그네트론 또는 금속의 캐소드 아크 소스에 공급되는 전원, 또는 공정 챔버에 공급되는 가스의 조성이 변화된다.

[0052] "플라즈마" 또는 "가스 플라즈마"라는 용어는 이온화 증기의 상태를 설명하기 위하여 일반적으로 사용된다. 플라즈마는 하전된 이온, 분자 또는 분자 단편(양 또는 음), 음전하를 띤 전자, 및 중성 종으로 이루어진다. 당해 분야에 공지된 바와 같이, 플라즈마는 연소, 화염, 물리적인 충격, 또는 좋기로는 전기 방전, 예컨대 코로나 또는 글로우 방전에 의해 생성될 수 있다. 고주파(RF) 방전에서, 처리될 기판은 진공 챔버에 배치되고, 낮은 압력의 증기를 시스템에 흐르게 한다. 용량 또는 유도 RF 전극에 의해 생성된 전자기장은 증기를 이온화하는데 사용된다. 증기 내의 자유 전자는 전자기장으로부터 에너지를 흡수하고 증기 분자를 이온화하여, 더 많은 전자를 생성한다.

[0053] 플라즈마 처리 수행시, 통상 플라즈마 처리 장치(예컨대 헬리콘, 평행 플레이트 또는 중공 캐소드 플라즈마 소스 또는 기타 유도성 또는 용량성 결합 플라즈마 소스를 통합하는 것)는 진공 펌프에 진공 노즐을 부착함으로써 배기된다. 증기, 액체 또는 고체 소스로부터 생성된, 적절한 플라즈마 형성 증기는 챔버 내의 원하는 증기 압력 및 챔버에 걸쳐 차동(differential)이 얻어질 때까지 가스 유입구를 통하여 배기 장치로 흘러간다. RF 전자기장은 RF 발생기로부터 전극에 원하는 주파수의 전류를 인가함으로써 장치 내에서 발생된다. 이 장치에서 증기의 이온화는 전자기장에 의해 유도되며, 생성된 플라즈마는 처리 공정을 거치는 금속, 반도체, 폴리머, 복합물 및/또는 세라믹 기판 표면을 개질한다. 사용될 수 있는 바람직한 플라즈마 형성 가스는 아르곤, 질소 및 유기 전구체 증기, 및 기판에서 발견되는 것과 동일하거나 유사한 종으로 이루어진 무기 증기이다.

[0054] 플라즈마 폴리머 표면은 탄소 함유 종 및 공동-증착과 함께 플라즈마 이온 주입을 통해 생성될 수 있는데, 여기서 공동-증착의 조건은 기판 재료의 비율을 점차 줄이며 탄소 함유 종의 비율을 증가시키고 및/또는 에너지 이온 충격으로 플라즈마 폴리머 표면층을 증착시키는 가운데, 기판 재료가 탄소 함유 종으로 증착되는 것이다. 이 맥락에서, 탄소 함유 종은 하전된 탄소 원자 또는 다른 단일한 탄소 함유 분자, 예컨대 이산화탄소, 일산화탄소, 불화탄소, 또는 선택적으로 치환된 분지 또는 선형 사슬 C₁ 내지 C₁₂의 알칸, 알켄, 알킨 또는 아릴 화합물, 및 폴리머 화학분야에서 폴리머 화합물의 생성을 위한 단량체로 보다 통상적으로 여겨지는 화합물, 예컨대 n-헥산, 알릴아민, 아세틸렌, 에틸렌, 메탄 및 에탄올을 포함할 수 있다. 추가적으로 적합한 화합물로는 비제한적 목록에서 선택될 수 있다: 부탄, 프로판, 펜탄, 헵탄, 옥탄, 시클로헥산, 시클로옥탄, 디시클로펜타디엔, 시클로부탄, 테트라메틸아닐린, 메틸시클로헥산 및 에틸시클로헥산, 트리시클로데칸, 프로펜, 알렌, 펜텐, 벤젠, 헥센, 옥텐, 시클로헥센, 시클로헵텐, 부타디엔, 이소부틸렌, 디-파라-자일렌, 프로필렌, 메틸시클로헥산, 톨루엔, p-자일렌, m-자일렌, o-자일렌, 스티렌, 페놀, 클로로페놀, 클로로벤젠, 플루오로벤젠, 브롬페놀, 에틸렌 글리콜, 디에틸렌 글리콜, 디메틸 에테르, 2,4,6-트리메틸 m-페닐렌디아민, 퓨란, 티오펜, 아닐린, 피리딘, 벤질아민, 피롤, 프로피온니트롤, 아크릴로니트릴, 피롤리딘, 에탄올, 프로판올, 메탄올, 헥산올, 아세톤, 포름산, 아세트산, 테트라플루오로메탄, 플루오로에틸렌, 클로로포름, 트리플루오로메탄, 테트라클로로메탄, 트리클로로메탄, 트리플루오로메탄, 비닐리덴 클로라이드, 비닐리덴 플로라이드, 헥사메틸디실록산, 트리에틸실록산, 디옥산, 퍼플루오로-옥탄, 플루오로시클로부탄, 옥타플루오로시클로부탄, 비닐트리에톡시실란, 옥타플루오로톨루엔, 테트라플루오로메탄, 헥사메틸디실록산, 헵타데카플루오로-1-데켄, 테트라메틸디실라잔, 데카메틸-시클로펜타실록산, 퍼플루오로(메틸시클로헥산), 2-클로로-p-자일렌.

[0055] 전형적인 플라즈마 처리 조건(100 제곱센치미터의 표면을 처리하기 위해 요구될 수 있는 전력은 여기에 참조 인용되지만, 시스템 크기에 따라 크기조절될 수 있다)은 전력이 약 1 watt 내지 약 1000 watts, 좋기로는 약 5 watts 내지 약 500 watts, 가장 좋기로는 약 30 watts 내지 약 300 watts (적절한 전력의 예는 순방향 전력 100 watts 역전력 12 watts임); 주파수는 약 1 kHz 내지 100 MHz, 좋기로는 약 15 kHz 내지 약 50 MHz, 더욱 좋기로는 약 1 MHz 내지 약 20 MHz (적절한 주파수의 예는 13.5 MHz임); 축 플라즈마 한정 자기장 강도는 약 0 G (즉, 축방향의 자기장을 인가하는 것이 필수적이지 않음) 내지 약 100 G, 좋기로는 약 20 G 내지 약 80 G, 가장 좋기로는 약 40 G 내지 약 60 G (적절한 축 자기장 강도는 약 50 G임); 노출 시간은 약 5초 내지 12시간, 좋기로는 약 1분 내지 2시간, 더욱 좋기로는 약 5분 내지 약 20분 (적절한 노출 시간의 예는 약 13분임); 가스/증기 압력은 약 0.0001 내지 약 10 torr, 좋기로는 약 0.0005 내지 약 0.1 torr, 가장 좋기로는 약 0.001 torr내지 약 0.01 torr (적적한 압력의 예는 약 0.002 torr임); 가스 흐름 속도는 약 1 내지 2000cm³/min일 수 있다.

[0056] 본 발명의 표면은, 이를 생성하는 재료에 따라, 필수적이지는 않지만, 종종 친수성을 띨 것이다. 친수성 표면은, 제거하고자 하는 세포가 종종 수성 매질에 존재하고, 친수성 표면은 표면이 액체를 갖는 수성 세포로 습윤되는 것을 도우며, 그 결과 세포가 최적으로 퍼지는 것을 돕고 세포가 살균 표면을 접촉하는 데 도움이 될 것이기 때문에, 본 발명의 일부 측면에서 바람직하다. "친수성"이라 함은 물과 같은 극성 액체에 의해 습윤될 수 있는 표면으로서, 강하게 및 약하게 친수성인 습윤 특성을 갖는 표면을 포함한다. 매끄러운 표면에 있어, 친수성이라 함은 수접촉각이 0 내지 약 90도 범위를 의미한다. 반대로, "소수성" 표면이라 함은 물과 같은 극성 액체를 쫓아버리는 표면으로서, 매끄러운 표면에 있어, 수접촉각이 90도를 초과하는 것으로 특징될 것이며, 수접촉각이 150도를 초과하는 것으로 특징되는 표면은 "초소수성"이라고 간주된다.

[0057] 본 발명은 이하 비제한적인 실시예를 참고하여 기술한다.

실시예

실시예 1 - 블랙 실리콘의 살균 작용

[0058] 이 연구에서, 우리는 두 가지 나노재료의 항세균 잠재력을 평가 및 비교하였다: 합성 bSi 및 잠자리 Diplacodes bipunctata의 날개. 3가지 서로다른 균주과 여러가지 세포벽 구조(그람 음성 막대형 세균 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 그람 양성 황색 포도구균(Staphylococcus aureus) 및 그람 양성 막대 고초균(Bacillus subtilis)의 식물 세포 및 포자 모두)에 대한 항세균 작용을 평가하기에 앞서, 실리콘 및 천연 날개 표면의 물리화학적 특성은 화학적으로 및 구조적으로 특징지어졌다.

재료 및 방법

반응성 이온 빔 에칭

[0059] Oxford PlasmaLab 100 ICP380 장비를 사용하여 SF₆ 및 O₂으로 반응성 이온 에칭(RIE)을 5분동안 수행하여 실리콘 웨이퍼 상에 나노스파이크를 얻었다. (100) 방향 표면의 525±25 ㎛ 두께의 저항이 10-20 Ωcm^-1인 p-형 붕소-도핑 100 mm 직경의 상업적 Si 웨이퍼(Atecom Ltd, 대만)를 bSi 형성을 위한 기판으로 사용하였다. 블랙-Si의 제조에 대한 더 자세한 사항은 다른 곳에서 보고되었다^4,5.

곤충 날개 준비

[0060] 잠자리 시료(Diplacodes bipunctata, Order Odonata) 를 브리스베인(오스트레일리아) 공원 지역으로부터 수집하였다. 날개는 가위 또는 메스를 사용하여 정확하게 절개하였다. 그런 다음, 양면 테이프에 의해 원형 디스크에 부착된 후, MilliQ 물(18.2 MW cm^-1의 저항, Millipore, Billerica, MA, 미국)로 충분히 세척하였고, 이어서 99.99% 순도의 질소 가스로 건조하였다.

표면 나노구조양식의 특징

[0061] 전계방출 SEM (FESEM; ZEISS SUPRA 40 VP, Oberkochen, BW, 독일)을 사용하여 3 kV에서 35,000×, 70,000×, 150,000×, 및 1,000,000×배율에서 bSi 및 잠자리 날개의 고화질 전자현미경 사진을 기록하였다. 보기에 앞서, 이전에 보고된 바와 같이⁶, 날개 샘플은 Dynavac CS300을 사용하여 얇은 금 필름으로 코팅하였다. 형태학적 일관성을 확인하기 위하여, bSi 샘플의 여러 부위 및 날개의 복수의 부위를 포함하여 복수의 영역의 사진이 기록되었다.

[0062] Bruker AXS Contour GT 3D 광학 프로파일링 시스템을 사용하여 백색광 수직 주사 간섭 모드에서 4×및 230×대물 렌즈를 사용하여 표면 구조양식을 분석하였다. 표면에 5개의 서로다른 위치에서의 자세한 지형 프로파일링 전에, 표면의 전반적인 균일성을 평가하기 위하여 이들 샘플을 스캔하였다. bSi 및 날개 표면에서 나노구조의 크기 특성이 광학 해상도 한계 미만이었기 때문에, 이들 구조양식은 광학 이미지의 노이즈 패턴에서 관찰되었다.

표면 조성의 특징

[0063] 단색 X-선 소스(Al Kα, hν= 1486.6 eV)가 구비된 Kratos Axis Ultra DLD X-선 광전자 분광기(Kratos Analytical Ltd., 영국)를 이용하여 150 W에서 작동시켜 X-선 광전자 분광법(XPS)을 수행하였다. 83.98 eV의 결합에너지(BE)에서의 Au 4f_{7 /2} 광전자 피크를 사용하여 분광계 에너지 스케일을 보정하였다. 표면 대전을 방해하기 위하여 분석 중에 저에너지 전자로 샘플을 가득 채웠다. C 1s 피크 (결합 에너지 285.0 eV)의 탄화수소 성분은 대전 보정을 위한 기준으로 사용되었다. 표면 상에 존재하는 요소는 각각 간격 및 전달 에너지 1 eV 및 160 eV에서 0-1400 eV 범위의 검사 스펙트럼으로 결정되었다. XPS에 의해 검출된 원소의 상대적인 원자 농도는 Kratos 기기에 대한 감도 인자를 사용하여 검사 스펙트럼에서 피크 면적에 의거하여 정량하였다. C 1s, O 1s 및 Si 2p 각각에 대하여 고해상도 스캔을 수행한 다음, 선형 백그라운드 신호(Kratos Vision II 소프트웨어)를 제거한 후 Gaussian-Lorentzian 성분에 맞추었다.

표면 습윤성

[0064] 정적법(sessile drop method)¹을 이용하여 bSi 및 날개에 대하여 정적 수접촉각을 측정하였다. 접촉각 측정은 나노디스펜서가 장착된 FTA1000c (First Ten Angstroms, Inc., Portsmouth, VA, 미국)를 이용하여 공기 중에서 수행하였다. 액적의 부피는 약 1.0 ㎕이었다. 접촉각은 Pelco model PCHM 575-4 카메라를 사용하여 2 s에 걸쳐 50개의 이미지를 기록하고, 액적이 표면에 약 1초 동안 머문 후에 접촉각을 측정함으로써 측정되었다.

균주, 성장 조건 및 샘플 준비

[0065] 세가지 균주가 사용되었다: 녹농균 ATCC 9027, 황색포도구균 CIP 65.8^T 및 고초균 NCIMB 3610^T. 선택된 균주는 3가지 대형 세균 분류학적 계통의 전형적인 대표이며, 미국 미생물 보존 센터(ATCC, Manassas, VA, 미국), 프랑스 파스퇴르 연구소미생물 은행(CIP, Paris, 프랑스) 및 영국 국립 산업 및 해양 세균 은행(NCIMB, Aberdeen, 영국)으로부터 얻었다. 각 세균 부착 실험 전에, 육수의 한천배지(Oxoid, Basingstoke, Hampshire, 영국)에서 세균 배양을 새롭게 하였다. 신선한 세균 현탁액을 5　mL 영양배지(Oxoid, Basingstoke, Hampshire, 영국)에서 37℃에서 밤새 성장시켰다. 세균 세포를 대수생장기에 수집하고, 전술한 바와 같이¹ 현탁액을 OD₆₀₀　=　0.3으로 조정하였다. 원형 디스크 상에 올린 곤충 날개를 5 mL의 세균 현탁액에 1시간, 3시간, 또는 18시간의 배양 간격으로 침지하였다.

[0066] 포자 형성을 위하여, 고초균 NCIMB 3610의 식물 세포 현탁액으로부터 분취량을 한천배지(Oxoid) 플레이트에 펼치고 37℃에서 산소 없이 7일 동안 배양하였다. 포자형성(>95 %)은 말라카이트 그린으로 포자를 염색하고 건강한 세포는 사프라닌으로 대비염색함으로써⁷, 유리 슬라이드에서 현미경으로 관찰되었다. 다음으로, 포자는 인산완충생리식염수(PBS)에 현탁시키고, 13000 rpm에서 5분 동안 세척하고, 다시 현탁시켰다. 곤충 날개에 배양시키기 전에, PBS 중의 포자 현탁액을 OD₆₀₀ = 1으로 조정하였다. 그런 다음, 1, 3 및 18시간 부착 실험을 위해 곤충 날개를 포자 현탁액과 함께 배양하였다.

세포 생존 분석

[0067] LIVE/DEAD^® BacLightBacterial 생존율 키트, L7012를 이용하여 생존 세포와 사멸 세포의 비율을 가시화하기 위하여 공초점 레이저 주사현미경(CLSM)을 사용하였다. SYTO^®9 및 요오드화 프로피디움 형광 염료(Molecular Probes™ Invitrogen, Grand Island, NY, USA)의 혼합물. SYTO^®9는 손상없는 및 손상된 세포막 모두에 침투하여 485 nm 파장의 레이저에 의해 들뜬 상태가 될 때 핵산 및 형광 녹색과 결합한다. 반면, 요오드화 프로피디움은 단독으로, 생존불가능한 것으로 간주되는 상당한 막 손상이 있는 세포에만 침입하고, SYTO^® 9 보다 핵산에 더 높은 친화력으로 결합한다. 세균 현탁액은 제조자의 프로토콜에 따라 염색하였으며, Fluoview FV10i 반전 현미경 (Olympus, Tokyo, 일본)을 사용하여 영상화하였다.

[0068] 포자 염색을 위하여, 이 프로토콜⁸을 약간 변경하였다. 포자는 0.9 mM의 요오드화 프로피디움 및 5 mM의 SYTO^® 9의 혼합물로 15-20분간 염색하였다. 샘플은 공초점 현미경하에 영상화하였다.

세균 생존율 플레이트 카운트

[0069] 표준 플레이트 카운트⁹에 의해 생존율 분석을 수행하였다. 녹농균, 황색포도구균 및 고초균 세포 및 포자를 5 mL 인산완충식염수(PBS)에 현탁시키고, OD₆₀₀ = 0.1로 조정하였다. 재현탁된 세포를 1:10로 희석하고; 그 다음, 3.5 cm 직경의 웰에서 3중으로 배양하였고, 각 웰은 D. bipunctata 날개, bSi, 매끄러운 실리콘 웨이퍼 또는 유리 커버 슬립의 1 cm² 면적의 하층 샘플을 갖는다. 다음으로, 각 세포 현탁액을 분리된 시간 간격(3시간 및 18시간)에 샘플링하고(100 ㎕), 연속적으로 1:10으로 희석하고, 각 희석액을 3개의 한천배지 플레이트에 펼쳤다. 얻어진 집락의 수를 세고, ml 당 집락 형성 단위의 수를 계산하였다. 집락 형성 단위의 수는 현탁액 중 생존 세포의 수에 상당하는 것으로 가정하였다⁹. 최대 살균 효율은 배양시간 분당 샘플의 제곱센티미터당 비활성화된 세포의 수로 측정하였고, 대응하는 대조군 조건의 현탁액에 남아있는 세포 수를 감산하여 계산하였다.

결과 및 토론

표면 특징화

[0070] bSi와 잠자리 날개는 두 가지 모두 나노크기의 수많은 주상(columnar) 돌출부로 덮여있지만, 이들은 실상 서로 매우 다르다 (도 1). bSi 표면 상의 나노크기 돌출부는 나노스파이크라 칭해지고 대략 500 nm 길이를 가지며 서로 구별되고 팁(tip)이 다듬어져있다 (도 1a, 내부 도면). 잠자리 날개의 나노크기 돌출부는 나노기둥이라 칭해지며 bSi 나노스파이크보다 짧고 (~240 nm) 베이스에 일종의 네트워크를 형성하는 것으로 나타나있다 (도 1b, 내부 도면). 이들 두 가지 표면 모두의 몇몇 나노돌출물들은 팁에서 한데 그룹을 형성하는 경향이 있지만, 네트워크는 형성되지 않았다. 이 나노구조물(nanoarchitecture)은 모양, 크기, 해당 영 모듈 및 재료 밀도에 따라 달라지는, 나노기둥의 휨 강도가 보다 낮기 때문에 자연적인 표면에서 더 많이 나타난다¹⁰. 아이젠버그(Aizenberg)와 동료 연구자들은 전체적인 기하학 및 기계적 표면 특성 영향 하에 모세관힘이 어떻게 자가-재조직화를 유도하는지 입증한 바 있다¹¹. 광학 프로필로메트리(Optical profilometry)는 이 초기 구조물의 존재를 확인해주었다 (도 1c, d). 마이크로그래프로부터 나노크기 돌출불의 수직 스케일이 이들 두개의 표면 사이에 다양하지만, 공간 패턴은 bSi와 잠자리 날개 표면 사이에 다소 유사함을 알 수 있는데, 이는 변위 맵 기법(displacement map technique)으로 제작된, 표면도의 3차원 모델에서 추가로 예시된다 (도 1e, f).

[0071] bSi와 잠자리 날개의 화학 관능기와 표면 보습능의 차이는 더욱 확정적이다. 곤충의 날개는 주로 다양한 소수성 지질과 왁스에 기인하는 복잡한 화학 조성을 나타낸다는 것이 이전부터 알려져 있다. X-레이 광전자 분광학(XPS)을 이용하여, 본 발명자들은 잠자리 (D. bipunctata) 날개가 문헌 상에 확립된 그것과 유사한 화학 조성을 갖는다는 것을 확인하였다. 서베이 스펙트럼 연구 결과 오직 2개의 검출가능한 원소인 C와 O만이 존재하는 것으로 나타났다 (도 4a). 서베이 스펙트럼에 기반한 원소데이터 분석 결과 C는 표면의 97.5 at.%를 구성하는 반면 O는 2.5 at.%를 구성하는 것으로 나타났는데 이것은 탄소 장쇄 백본을 함유하는 소수성 지질 분자들에 의해 뒤덮인 표면의 그것과 일치하는 것이다. O가 존재하는 것은 표면 지질의 상대적으로 적은 부분과연관된 지방산 분자에 기인하는 것일 것이다. 예상된 바와 같이, 블랙 실리콘(bSi)의 XPS 스펙트럼은 2개의 원소, 즉 O와 Si가 주로 존재한다는 것과 후자는 주로 무정형 Si의 검출에 기인한 것임을 나타내었다 (도 4b). 소량의 탄소가 검출되었는데, 대부분 대기 오염에 기인하는 듯하다. 곤충 날개의 놀라운 한 가지 특성은 이들의 초소수성인데 이 성질은 잠자리 날개와 bSi 양자 모두의 습윤성(wettability) 관점에서 평가되었다. 잠자리날개는 초소수성이었으며 평균 정수접촉각 값은 153.5 ± 3.9°인 반면(도 4c), bSi는 훨씬 낮은 소수성 (실제로는 약간 친수성)을 띠어; 평균 물접촉각이 79.7 ± 2.4°(도 4d)였는데, 이는 주로 프로세싱이 이루어지는 동안 표면 산화에 기인한 것이다.

[0072] 박테리아 세포 및 구조화된 표면 상의 포자의 형태 (도 5)를 각각 도 6 및 도 7에 나타난 바와 같은 동등한 평면 유리 및 실리콘(silicon) 대조군 표면과 비교해볼 수 있다.

살균 표면 활성 (Bactericidal surface activity)

*[0073] bSi와 잠자리 날개 표면의 살균 특성을 정량화하기 위해, 30 시간에 걸쳐 각 표면에 3종의 박테리아를 인큐베이션하고, 박테리아의 생존능을 모니터링하였다. 시험된 박테리아 종들은 주요 원핵생물 분류를 대표하는 것들로서, 그램-음성 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa) ATCC 9027, 그램-양성 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 65.8^T, 그리고 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) NCIMB 3610^T의 영양세포와 포자를 이용하였다. bSi와 잠자리 날개의 표면에 부착된 모든 세포와 포자들의 형태학적 외관은 대조군 표면 역할을 한 평면 유리 및 실리콘 표면에 결합된 그것들과 현저히 다른 것으로 밝혀졌다. (도 2a-d, i-l; 대조군은 도 6 및 도 7에 나타냄). 모든 종들의 세포 완전성(cellular integrity)은 표면 화학과 소수성에 있어서의 유의차에도 불구하고, 이들 기층(substrata) 양자 모두에 존재하는 나노기둥에 의해 유의적으로 파괴된 것으로 나타났다 (도 2 및 도 4). 3종의 영양세포 유형 뿐만 아니라 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) 포자의 경우에도 유의적인 변형과 에워쌈(engulfment)이 관찰되었다. 본 발명자들은 매미 날개에 부착된 P. aeruginosa 세포가 유사하게 물리적으로 변형된 것을 앞서 관찰한 바 있는데¹, 이들은 부착 후에 불활성화된 것으로 나타났다. bSi와 잠자리 날개와 접촉한 세포들의 생존능을 공초점 레이저주사 현미경을 이용하여 분석한 결과 모든 세포와 포자들 역시도 이 경우 부착 후에 생존하지 못한 것으로 확인되었다 (도 2e-h, m-p). 세포 파괴는, 파열된 모든 세포들에 침투하여, 적색 형광을 일으켜서 불활성화를 가리키는 형광염료인 프로피디움 요오다이드를 이용하여 평가하였다. 주목할만한 것은, bSi와 잠자리 날개 표면이 그램-음성 P. aeruginosa 세포에 대해서뿐만 아니라 그램-양성 S. aureus 및 B. subtilis 세포에 대해서도 효과가 있었다는 것이다. 앞서 수행된 매미 날개 연구는 매미 날개 기판의 경우 그램-음성 세포에 대해서만 효과가 있는 것으로 나타났었다¹. 그램-양성 세포들은 그램 음성 세포에 비해 일반적으로 좀 더 단단하고 기계적 용해(mechanical lysis)에 대해서도 보다 내성이 있는데 이는 그램 양성 세포들의 펩티도글리칸 세포벽의 두께는 그램-음성 박테리아의 그것보다 약 4-5배 더 더껍기 때문이다. 이와 같이 보다 두꺼운 세포벽 두께로 인해 세포벽을 파괴하고, 내막을 변형시켜 세포를 죽이는데 더 큰 변형 응력이 필요하다. 시험된 세균의 영양세포에 대해 효과를 나타낸 것에 더해, bSi 및 잠자리 표면의 나노구조물은 포자의 생존능을 제어하는, 다중층 포자각을 분명히 파괴할 수 있었다. 포자각은 커다란 내구성을 부여하고, 건조와 같은 외부 스트레스에 대해 내성을 부여하므로, 포자를 스트레스 조건 하에서의 박테리아 생존에 가장 효과적인 수단으로 만들어준다. 이것은 bSi와 잠자리(D. bipunctata) 날개 양자 모두가 세균 세포에 적용할 수 있는 변형 응력이 실질적이라는 것과, bSi가 세균의 생존 전략에 대응하여 사용할 수 있는 유의적인 잠재능을 가지고 있음을 가리키는 것이다.

[0074] 살균 활성을 이끌어낸 그램-음성 세균과 매미 날개 나노기둥 간의 상호반응은 앞서, 단단한 벽 구조를 갖는 세포에 전자파 조사를 인가함으로써 최근 입증된 바와 같이, 세포의 강성 및 표면의 물리적 구조에 의존하는 것으로 나타난 바 있다. 전자파 조사는 세포벽의 강성을 저감시켜 세포벽을 이들 날개의 나노기둥의 작용에 보다 민감하게 만든다^{1 ,2}. 또한 금(gold) 박층으로 날개를 스퍼터-코팅하자 항세균 활성을 억제하는데 실패한 것으로부터 매미 날개의 살균 효과의 기계적 특징이 확인되었다. 유사한 실험을 본 발명에서도 수행하였는데(도 5 및 도 8), 그 결과 bSi와 잠자리 날개 표면의 살균 작용 역시 나노기계적(nanomechanical)인 것으로 확인되었다. 또한 세포벽 구조가 실제로 세포 강성의 주요 결정인자들 중 하나라는 것과 그 다음으로, 기계-반응성 표면에 감수성 역시도 주요 결정인자들 중 하나라는 것도 입증되었다. 그램-반응과 세포 형태학의 상이한 조합을 갖는 계통분류학적으로 다양한 세균 종들의 감수성을 조사하는, 매미 날개에 대한 시스템 연구에서, 세포의 형태나 계통분류학적 소속과 무관하게, 그램-음성 박테리아가 날개 표면의 살균 효과에 취약한 것으로 일관되게 밝혀졌다.¹²

[0075] 최근 세균 세포의 물리적 모형화와 직접 원자간력 현미경 나노리소그래피(AFM) 측정 측면, 특히 세포벽의 기계적 특성과 이들의 내부 삼투압 팽압을 시험하는 관점에서, 커다란 진전이 이루어졌다^{13 ,14}. 예를 들어, 모형화 및 직접 AFM 측정 양자 모두를 적용함으로써, 외부에서 가해진 교란 하에 세포의 벌징 변형(bulging strain)을 분석한 결과, 이 뎅(Yi Deng) 등은 살아있는 대장균의 세포벽 영 모듈이 축방향과 원주 방향에서 23 MPa 및 49 MPa인 반면 세포 팽압은 20 kPa인 것으로 정량화하였다¹⁵. 압입 변형에 의해 초래된 세포벽 장력의 결과, 세포벽의 펩티도글리칸 네트워크의 유의적인 지수법칙 응력 강성화가 1.2의 지수를 갖는 것으로 나타났다. 여기서, 본 발명자들은 매미 표면에 비해 bSi와 잠자리 날개 구조물의 모세관현상과 세포막의 탄성 간의 경쟁이 그의 증가된 변형 및 세포벽 응력과 함께 증가된 에워쌈 현상(engulfment)에 더 유리하게 작용하고 이것은 bSi의 보다 길고 보다 확연한 나노스파이크의 경우 더 증가한다고 보고 있다.

[0076] 매미 날개와 관련하여 bSi와 잠자리 날개의 높은 살균 효능은 이들의 표면 상의 패턴 차이에 기인하는 것일 수 있다. bSi와 잠자리 날개는 날카로운 팁을 갖는, 길고 (100-600 nm) 얇은 (팁 두께 10-50 nm) 스파이크를 갖는데 (Fig 1); 이와 대조적으로, 매미 날개는 팁이 둥근 두꺼운 기둥을 갖는다 (60 nm). bSi의 나노미터-크기의 날카로운 팁은 그 규모가 막 두께 수준에 필적하므로, 막을 관통할 수 있다. 이와 대조적으로, 매미 날개 패턴의 뭉툭하고 둥근 기둥은 막 두께보다 훨씬 큰 차원을 갖는다. 막은 기둥 표면에 흡착되어 오직 기둥들 간의 막의 스트렛칭에 의해서만 파열될 수 있는데, 이것이 막의 직접적인 관통능력과 관련한 효율성을 제한시키는 것일 수 있다. 이러한 메카니즘을 정량하기 위해, 본 발명자들은 지질 이중층의 평형 및 기계적 특성을 적절히 설명할 수 있고 나노-대상체에 의한 이중층의 관통과 상호작용에 대해 미시 정보를 제공할 수 있는, 단쇄평균장(Single Chain Mean Field: SCMF) 이론을 이용하였다. 도 1로부터 취해진 bSi의 팁의 크기를 갖는 소수성 콘 원추형 형태로 상호작용하는 대상체를 구축하고 지질 분자용 3-비드 모델을 이용하여, 본 발명자들은 원추체와 지질 이중층 간의 상호작용을(도 2) 이중층의 중심으로부터 팁까지의 거리의 함수로서 테스트하였다. 30 nm 박스 안의 지질의 갯수를 약 3000개로 일정하게 유지시켰는데 이 수치는 지질 당 면적이 약 60 Å인, 교란되지 않은 평형 지질 이중층에 상응하는 것이다². 수평 크기(horizontal dimensions)가 동일한 스파이크의 주기적 패턴을 주기적 경계조건 모델로 삼았다. 테일(tails)과 팁 간의 상호작용을 -10 kT로 선택하자, 결과적인 구조가 다른 기하형태에서 얻어진 결과와 일치한다. 작은 삽입부(insertions)에서, 소수성 원추체가 이중층의 위상을 변화시키지 않으면서 지질의 테일을 유인한다. 그러나, 몇몇 중간 삽입부에서는 팁 주변의 포어 형성과 연관하여 이중층 구조의 돌발적인 변화가 일어난다 (도 2). 지질의 테일은 팁의 소수성 표면으로 유인되고 이는 다시 지질의 헤드부가 원추체 표면을 향하도록 지질을 재배향시킴으로 해서, 도넛형의 포어(toroidal pore)가 형성된다. 도 2에 도시된 전이 지점(transition point)에서는 포어가 있는 위상과 포어가 없는 위상에 대응하는 2가지 해법이 공존하므로, 이는 그 전이가 제1순위 전위와 유사하고 포어가 자연발생적으로 형성됨을 가리킨다. 이 메카니즘에서는 매미 날개 표면의 경우 제안된 바와 같이, 그리고 도 2에 도시된 바와 같이, 패턴 내로 막을 깊이 삽입할 필요가 없으며, 박테리아 세포는 스파이크의 팁과 접촉하면 bSi 패턴에 의해 파열된다.

[0077] bSi와 잠자리(D. bipunctata) 날개 표면의 살균 효능을 표준 생존능 플레이트-카운트 기술을 이용하여 30 시간에 걸쳐 정량 평가하였다. 이 플레이트-카운트 분석법은 벌크 살균기술보다는, 표면의 항세균 잠재력을 평가하기 위해 접종 규모를 조절한, 식품 살균 평가를 위한 FDA 프로토콜에 기반하여 개발되었다¹⁶. bSi의 살균 효능의 상세한 명세를 도 3에 나타내었다. 저조한 영양섭취 조건에 의한 낮은 수준의 자연적인 세포 사멸을 설명하기 위해, bSi와 잠자리 날개에 의해 살해된 세포의 수를 살아있는 세포 수와 동일한 인큐베이션 기간 동안, 대조군에 남아있는 세포 수 간의 차이로서 구하였다. 각각의 표면에 의해 살해된 세포수에 기반하여, 각각의 효능을 분당 cm² 당 살해된 세포수로서 구하였다 (도 3a). bSi와 잠자리 날개 양자 모두 테스트된 모든 세포 종류에 대해 일반적으로 동등하게 효과적이으나, P. aeruginosa에 대해서는 bSi 표면이 약간 더 효과적인 것으로 나타났다. 생물학적 시스템과 연관된 고도의 가변성으로 인해, 잠자리 날개보다 bSi 표면이 P. aeruginosa에 대해 상상 더 효과적이라고 단언할 수 없는데 이는 오차값이 너무 크기 때문이다. bSi는 모든 세포 종류에 대해 매우 효과적이었으며, 이것은 각 세포 종류의 최소 감염 투여량에 따른 이들 값을 비교함으로써 명확히 입증된다^{17 -19}. 이러한 효능 수준에 의거할 때, 1.5 cm²의 돌출 면적을 갖는 bSi 표면이면, 테스트된 모든 세포 종류의 최소 감염 투여량을 1분 이내에 무력화시키는데 충분할 것으로 예상된다 (도 3b).

[0078] bSi 표면은 평가된 모든 박테리아에 대해 유의적인 살균 효능을 갖는 것으로 밝혀졌으며, 3종의 모든 세포 종류의 현탁액에서는 물론 B. subtilis 포자에 대해서도 세포수를 감소시켰다 (도 8a-d).

결론(Conclusions)

[0079] 합성 bSi에 의해 나타난 강력한 살균작용은, 세포로 하여금 표면 구조물의 물리적 상호작용력 (및 그들의 부수적인 응력)에 반응하도록 하여, 세포를 변형 및 사멸에 이르게 하는, 기계-반응형 미생물학에 대한 새로운 접근법을 제공하는 기회로 삼을 수 있다. 이러한 나노재료는 용이하게 제작할 수 있어서 생물의학 분야 및 공업분야 양자 모두에 사용하기 위한 광범한 살균 표면을 개발하는데 이들을 사용할 수 있는 가능성을 제시해준다. 본 발명자들의 연구 결과는 (i) 나노구조형 bSi 및 천연 D. bipunctata 잠자리 날개가 고도로 효과적인 살균 표면으로서, 그 살균활성은 상기 표면 나노구조물에 의해 펩티도글리칸 세포벽 및 세포 내막에 가해지는 변형 응력에 대한 기계적 및 구조적 반응에 의해 구동되는 것임과, (ii) 박테리아 세포를 살해하는데 있어 잠자리 날개 표면 구조와 유사한 효능을 갖는 합성 항세균 나노재료를 쉽게 제작할 수 있음을 입증하는 것이다. 이러한 표면은 그의 표면 화학 관능성과 무관하게 효과적인 것으로 나타났다. 또한, 본 발명의 연구 결과는 (iii) 그와 같은 합성 표면이 그에 대응하는 천연의 카운터파트에 비해 증강된 살균 활성을 나타낼 수 있음을 입증한다. 이러한 데이터는 기계-반응성 표면이 미생물 오염에 대항하는 작용을 할 수 있다는 충격적인 사실을 명쾌하게 입증하는 것이다.

실시예 2 - 적혈구 세포에 대한 블랙 실리콘의 활성

재료 및 방법

적혈구 채취 및 샘플 제조

[0080] 동물윤리위원회 (Animal Ethics Committee: AEC)의 지침에 따라 Animal House, Monash University에서 건강한 래트로부터 혈액을 채취하였다. 신선한 혈액을 구3.8% (w/v) 구연산나트륨에 모았다. 응혈처리된 적혈구를 25℃에서 5분간 1400 rpm에서 원심분리하여 혈장과 백혈구 연층을 제거하였다. 분리된 적혈구를 10 mM 인산나트륨 완충액(PBS, pH 7.4)으로 2회 세척하였다. 최종 세포 현탁액을 4 x 10⁶ 세포/ml 밀도로 조정하였다.

[0081] 멸균된 bSi 나노기둥 어레이 및 대조군(유리, 젤라틴-커버된 유리 및 Si 웨이퍼) 샘플을 2mL의 최종 세포 현탁액에 침지시키고 다양한 시간 간격으로(5, 15, 30, 60, 120 및 180분) 37℃, 100% 상대습도, 5% CO₂ 분위기에서 인큐베이션시켰다. 가시화하기 전에, 인큐베이션된 모든 샘플들을 1 mL의 10 mM PBS (pH =7.4)로 가볍게 세척하였다. 앞서 설명된 바와 같이 세척된 모든 샘플을 2.5% 글루타르알데히드(Sigma)에 고정한 다음, 에탄올(30, 50, 70, 90 및 100%) 로 연속 탈수하고 주사전자현미경으로 가시화하였다.^{25, 26}

주사전자현미경(Scanning electron microscopy)

[0082] 전계방출 SEM(FESEM; ZEISS SUPRA 40 VP, Germany)을 이용하여 3kV에서, 적혈구가 부착된 표면의 고해상도 주사전자현미경(SEM) 이미지를 1000x, 5000x 및 15000x 배율로 찍었다. 상기 개발된 공정에 따라 SEM으로 관찰하기 전에, 글루타르알데히드로 고정된부착 적혈구를 갖는 샘플을 Dynavac CS300을 이용하여 10 nm 금박으로 피복하였다.^{27 , 28, 29} 1000x 배율로 찍은 이미지를 이용하여 부착 및/또는 손상된 세포수를 정량하였다. 3회의 독립적인 실험으로부터 상이한 2개의 샘플마다 20 개소를 찍었다. 양면이 오목한(biconcave) 적혈구를 온전한 세포(intact cell)"이라 칭하고 손상된 RBCs는 "파열된 세포(ruptured cell)"이라 칭하여 세포 형태학 변화에 기초하여 정량하였다.

[0083] 나노기둥과 적혈구 간의 상호반응 인터페이스를 가시화하기 위해, 세포가 부착된 나노구조형 샘플들을 파열시키고 이들의 단면 이미지를 전계방출 SEM (FESEM; ZEISS SUPRA 40 VP, Germany)을 이용하여 3kV에서 촬영하였다.

공초점 레이저 주사현미경(Confocal laser scanning microscopy)

[0084] 공초점 레이저 주사현미경(CLSM)을 이용하여 부착된 적혈구의 가시화를 수행하였다. 앞서 설명한 바와 같이, 4 x 10⁶ 밀도의 세포들을 예비혼합된 막-표지 용액 (1,1'-디옥타데실-3,3,3',3'-테트라메틸인도카르보시아닌 퍼클로레이트 (DiI)에 현탁시켰다.^{30 ,31} 미리염색한 세포 현탁액을 이용하여 12 웰 배양 플레이트에서 나노기둥 배열된 샘플들과 함께 다양한 불연속적 시간 간격(5, 15 및 30 분)으로 인큐베이션하였다. 적혈구가 부착된 기판을 1 mL의 PBS로 가볍게 세척하고, 4% 파라포름알데히드로 후고정하였다.^{30 , 31} 대조군 표면과 나노구조체에 부착된 적혈구의 이미지와 이들의 세포 매트릭스를 Olympus Fluorview FV10i Spectroscopic Confocal System (Olympus, Japan)을 이용하여 기록하였다. 이미징 소프트웨어 Fluorview FV 7.0을 이용하여 CSLM 이미지 및 구조체의 3차원(3D) 이미지를를 가공하였다.

라만 미세분광학(Raman microspectroscopy)

[0085] 적혈구가 부착된, 나노기둥 어레이의 실리콘 표면을 532 nm 레이저 파장(hυ = 2.33 eV)에서 라만 미세분광기(WiTEC)을 이용하여 지도 작성(mapping)하였다. 수침형 60 x 오브젝티브(수치 구경 = 0.9, Olympus)를 이용하여 블랙 실리콘 상의 적혈구의 부착 지도를 작성하였다. 10 ㎛ x 10 ㎛의 주사 면적에 대해 100 스펙트럼 x 100 스펙트럼의 그리드를 획득하였다. 단일 스펙트럼에 대한 노출 시간은 0.15 초였다. 5종의 상이한 샘플에 대해 독립적으로 2회씩 주사하였다. 데이터 획득은 WiTEC Control 소프트웨어 패키지를 이용하여 제어하였다.

통계 분석(Statistical analysis)

[0086] 흔히 이용되는 프로토콜에 따라 결과를 평균값 및 측정량의 대응하는 표준편차로서 표현하였다. 쌍체 Student' 양측 꼬리 t-검정법을 이용하여 통계 데이터를 가공함으로써 결과의 일관성을 평가하였다 (도면과 표에서 p　<　0.05이면 별표 표시함).

결과

적혈구와 나노기둥 배열된 실리콘 표면과의 시간-의존성 상호반응

[0087] 나노기둥이 배열된 표면과 5, 15 및 30분간 상호반응 후의 적혈구의 형태학적 변화를 도 9에 나타내었다. 정면과 측면의 SEM 마이크로그래프로부터 적혈구 1의 단계별 파열 프로세스를 알 수 있다 (도 10(a) 및 (b)). 양면이 오목한 건강한 세포가 일단 상기 표면과 접촉하자 변형되어 종국에는 파열되었다. 파열된 세포의 몇몇 조각 및 또는 막 역시도 관찰되며 '세포 프린트(cell print)'로 간주되었다. 손상을 계속 일어나는 것으로 나타났고 상호반응 시간이 15, 30, 60, 120 및 180 분으로 연장됨에 따라 손상도도 극적으로 심화되었다 (도 9(a)). 나노기둥이 배열된 실리콘 표면 상에 부착된 세포의 총 갯수는 인큐베이션 시간이 증가함에 따라 비례하여 증가하였으며, 시판되는 실리콘 표면상에 부착된 세포의 수와 필적하였다 (도 9(b)). 60분간의 인큐베이션 기간 동안, 나노구조형 실리콘 상의 파열 세포의 갯수는 온전한 적혈구의 거의 절반에 달하는 것으로 나타났고 (p = 0.05); 60분 후에는, 파열된 세포가 나노기둥-배열된 표면을 거의 점령하였으며, 3시간 후에는 표면이 부착된 적혈구 및/또는 이들의 '세포 프린트'로 거의 포화되었다.

적혈구-표면 인터페이스의 특징화

[0088] 단일 적혈구와 나노기둥의 접점들을 SEM 및 CLSM 이미지를 이용하여 가시화하였다 (도 11 및 12). 접촉면적은 나노기둥 팁의 단지 20-30 nm만을 차지하는 것으로 평가되었다. CLSM 이미지 및 라만 미세분광학(RS)의 분석에 의해 실리콘 나노기둥 상의 적혈구의 변형 및 파열을 확인하였다 (도 12).

[0089] RBCs가 부착된 에칭된 실리콘 표면의 스펙트럼을 도 12에 도시하였다. 690 cm^-1 내지 1909 cm^-1의 적혈구의 라만 피크들은 형질막과 상호반응하는 서브막(sub-membrane) 헤모글로빈과 유리 세포질을 비롯하여, 모든 헤모글로빈 분자의 헴(heme)에서의 결합 진동에 대응한다. 파열된 세포들로부터의 몇몇 조직파편(debris)이 세포막 잔해물 아래 나노기둥 상에 덩어리지어 보이며 여기서 헤모글로빈은 검출되지 않았다 (도 12(e)). 헤모글로빈은 나노기둥에 의해 손상되지 않은 온전한 적혈구들에서는 쉽게 검출되었다 (도 12(e)). 이러한 결과는 SEM 분석과 일치하는 것으로 나타났다 (도 12(f)).

참조문헌

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Claims (24)

1. 무질서한 나노스파이크 어레이를 포함하는 합성 살균 표면으로서 상기 표면은 친수성인 합성 살균 표면.
2. 제1항에 있어서, 상기 나노스파이크는 높이가 100 nm 내지 600 nm인 것인 표면.
3. 제1항에 있어서, 상기 나노스파이크의 직경은 그의 자유 단부보다 베이스에서 더 큰 것인 표면.
4. 제1항에 있어서, 상기 나노스파이크는 최대 높이의 절반 높이에서 직경이 20 nm 내지 300 nm인 것인 표면.
5. 제4항에 있어서, 상기 나노스파이크의 팁의 직경은 4 nm 내지 50 nm인 것인 표면.
6. 제1항에 있어서, 나노스파이크들은 중심에서 중심까지 200 nm 내지 700 nm만큼 이격되어 있는 것인 표면.
7. 제1항에 있어서, 상기 나노스파이크는 상기 어레이 내부의 인접하는 나노스파이크들의 팁들이 함께 닿을 수 있을 정도로 구부러질 수 있는 것인 표면.
8. 제1항에 있어서 나노스파이크의 탄성 영 모듈은 10 GPa 내지 300 GPa인 것인 표면.
9. 제1항에 있어서, 상기 나노스파이크는 갈라진 것인 표면.
10. 제9항에 있어서, 상기 나노 스파이크는 나노 스파이크의 자유 단부에서 또는 자유 단부를 향해 갈라져 있는 것인 표면.
11. 제1항에 있어서, 상기 표면이 형성되는 기판은 실리콘을 포함하는 것인 표면.
12. 제1항에 있어서, 상기 표면이 형성되는 기판은 붕소가 도핑된 실리콘을 포함하는 것인 표면.
13. 제1항에 있어서, 상기 표면은 블랙 실리콘(b-Si)를 포함하는 것인 표면.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 기재된 표면을 포함하는 기기, 도구, 핏팅 또는 장치.
15. 제14항에 있어서, 벽, 바닥, 천장, 핸드레일, 문 손잡이 및 핸들, 시트커버, 테이블, 의자, 전등 스위치, 화장실, 수도꼭지, 싱크, 바닥, 벽, 싱크, 대야, 벤치탑, 침대, 매트리스 및 베개 커버, 병원 가구, 음식 준비 표면, 요리 및 음식 준비 용품 및 기기, 식품 및 음료용 포장 및 보관 용기, 식품용 랩, 의료, 수술, 수의학 및 치과 도구, 기구 및 장비, 의료, 치과 및 수의학 임플란트, 장갑, 빗, 브러쉬, 면도기, 가위, 식품 및 음료용 믹서 및 가공/포장용 기기 또는 기계, 식품 및 음료 가공 라인, 도축장 부품 및 도구, 보호복, 고글 및 안경, 물 및 하수 파이프, 탱크 및 배수구, 보트 선체 및 수중 및 해양 설비로부터 선택된 것인 기기, 도구, 핏팅 또는 장치.
16. 무질서한 나노스파이크 어레이를 포함하는 합성 살균 표면의 제조방법으로서, 상기 표면은 친수성이고, 상기 방법은 실리콘(silicon)을 포함하는 기판 표면을 반응성-이온 에칭에 노출시키는 것을 포함하는 것인 방법.
17. 제16항에 있어서, 기판은 붕소가 도핑된 실리콘을 포함하는 것인 방법.
18. 제16항에 있어서, 상기 반응성-이온 에칭은 SF₆ 및 O₂에서 수행되는 것인 방법.
19. 제16항에 있어서, 상기 반응성-이온 에칭(RIE)은 30 mTorr 내지 40 mTorr의 처리 압력 및 80 W 내지 120 W의 RIE 전력에서 수행되는 것인 방법.
20. 제16항의 방법에 의해 제조된, 나노스파이크 어레이를 포함하는 합성 살균 표면으로서 상기 표면은 친수성인 합성 살균 표면.
21. 제1항에 기재된 합성 살균 표면에 세포를 노출시킴으로써, 세포를 제거하거나 세포 생존을 감소시키는 방법.
22. 제21항에 있어서, 세포는 박테리아 세포, 박테리아 포자, 바이러스 감염된 세포, 조류(algae) 세포 또는 해양생물 또는 수생생물의 세포인 것인 방법.
23. 제1항에 기재된 합성 살균 표면에 분석하고자 하는 세포를 노출시킴으로써 분석을 위한 세포를 용해(lysing)시키는 방법.
24. 삭제

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