KR102211890B1 - 캐쳐스 전처리를 이용한 모발, 손톱 중 니코틴 대사물질 추출방법 - Google Patents

캐쳐스 전처리를 이용한 모발, 손톱 중 니코틴 대사물질 추출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 QuEChERS 전처리를 이용한 니코틴 대사물질 추출방법에 관한 것으로서, 생체시료인 모발 또는 손톱을 세척 및 건조하는 단계, 세척한 생체시료를 세절하는 단계, 세절한 생체시료를 강염기로 가수분해 하는 단계, 가수분해된 생체시료에 아세토니트릴과 QuEChERS를 적용하여 니코틴 대사물질을 추출하는 단계, 추출 후 dSPE (dispersive solid-phase extraction)를 적용하여 시료를 정제하는 단계 및 정제된 시료를 분석하는 단계를 포함한다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, QuEChERS 전처리를 이용한 니코틴 대사물질 추출방법을 제공함으로써, 보편화된 소변검사가 힘든 영유아나 환자를 대상으로 비침습적으로 수집이 가능한 생채시료를 가지고 검출이 가능하다. 또한 검출대상자뿐만 아니라 분석 수행자가 노출되는 독성물질을 회피함으로써, 대상자와 수행자 모두 안전하게 검사할 수 있고, 기존의 QuEChERS 방법의 장점인 빠른 시간 내에 분석이 가능하다는 점이 접목되어, 안전하면서도 신속한 니코틴 대사물질 분석이 가능한 효과가 있다.

Description

캐쳐스 전처리를 이용한 모발, 손톱 중 니코틴 대사물질 추출방법 {Nicotine metabolites extraction from hair and nail using QuEChERS sample preparation}
본 발명은 캐쳐스(QuEChERS) 전처리를 이용하여 모발, 손톱 중 니코틴 대사물질을 효율적으로 추출하는 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 농산물 중 잔류농약을 전처리하는 QuEChERS 방법을 인체시료에 적용하여 니코틴 대사물질을 추출하는 방법에 관한 것이다.
담배(Nicotiana tabacum)가 인체에 해롭다는 것은 널리 알려진 일반적인 사실이며, 담배의 위해성은 아무리 강조해도 지나치지 않는 것으로 폐암의 직접적인 원인이 되는 흡연으로 인한 사망자 수는 매년 증가하는 추세이다. 성인 남자를 기준으로 하루 20개비 이상 담배를 피우는 사람은 그렇지 않은 사람보다 폐암에 걸릴 확률이 6배 이상 높다고 알려져 있다. 그리고 이 이외에도 담배를 피우면 심장근육으로 혈액을 보내는 동맥이 좁아지므로 심장근육에 영영과 산소가 부족하여 심근경색이나 협심증에 걸리기 쉽고, 기타 흡연의 위험성으로 위궤양, 십이지장궤양의 발병 가능성도 증가하며, 불임증과 유산의 원인이 되기도 한다. 이러한 담배의 폐해를 줄이기 위하여 국가 차원에서 다양한 금연정책, 홍보활동 등이 펼쳐지고 있으며, 담배의 유해성분을 제거하는 다양한 방법 등이 연구되고 있는 실정이다. 그러나 무엇보다도 담배는 중독성이 강하여 흡연자의 의지로 중단하기가 매우 어렵다. 흡연자들이 금연을 시도하였을 경우 성공할 확률은 약 3% 정도 밖에 되지 않으며, 이 역시 장기간 흡연에 노출된 경우에는 더욱 금연이 힘들어진다는 것이 일반적인 사실이다.
직접흡연 뿐만 아니라 간접흡연에 의한 위험성이 연구결과로 밝혀지면서 2차 흡연, 3차 흡연으로 인한 영유아의 간접흡연도 문제가 되고 있다. 따라서 영유아를 대상으로 간접흡연 정도를 평가할 환경위생학적 필요성이 높아지고 있다. 영유아의 경우 간단한 소변검사라 할지라도 필요에 따라 소변을 샘플링하는 것이 용이하지 않아, 이를 보완하기 위해 생체시료 중에 비침습적인 방법으로 샘플링할 수 있는 모발이나 손톱을 검사에 이용할 수 있다. 이러한 생체시료는 언제 어디서든지 채취가 가능하고, 간접흡연의 정도 및 노출 시기와 빈도 등에 대한 정보를 얻을 수 있다는 장점이 있어 유용하게 사용될 수 있을 것으로 판단된다.
대한민국 등록특허 제 10-1029306호 “대마 대사체 분석방법”
본 발명의 목적은, 캐쳐스(QuEChERS) 전처리를 이용한 니코틴 대사물질의 추출방법을 제공함으로써, 기존 추출방법의 독성을 피하면서도 효율적이고 재현성 있는 니코틴 대사물질 추출이 가능하도록 함에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 생체시료인 모발과 손톱을 세척 및 건조하는 단계, 세척한 생체시료를 세절하는 단계, 세절한 생체시료를 강염기로 가수분해 하는 단계, 가수분해된 생체시료에 아세토니트릴과 캐쳐스(QuEChERS) 방법을 적용하여 니코틴 대사물질을 추출하는 단계, 추출 후 dSPE (dispersive solid-phase extraction)를 적용하여 시료를 정제하는 단계 및 정제된 시료를 분석하는 단계를 포함하는 QuEChERS 전처리를 이용한 니코틴 대사물질의 추출방법을 제공한다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 캐쳐스(QuEChERS) 전처리를 이용한 니코틴 대사물질의 추출방법을 제공함으로써, 보편화된 소변검사가 힘든 영유아나 환자를 대상으로 비침습적으로 수집 가능한 생채시료에서 니코틴 대사물질의 검출이 가능하다. 또한 검출대상자뿐만 아니라 검출수행자가 노출되는 독성물질을 회피함으로써, 대상자와 수행자 모두 안전하게 검사할 수 있고, 기존의 QuEChERS 방법의 장점인 빠른 시간 내에 검출이 가능하다는 점이 접목되어, 안전하면서도 빠른 니코틴 대사물질의 검출이 가능한 효과가 있다.
도 1 은 ESI parameter 최적화 전후 cotinine과 trans-3-hydroxy cotinine의 peak 면적을 도시하였다.
도 2 는 cotinine과 trans-3-hydroxycotinine의 MS/MS spectrum을 도시하였다.
도 3 은 cotinine과 trans-3-hydroxycotinine 표준품의 LC-MS/MS 크로마토그램을 도시하였다.
도 4 는 가열식 가수분해 과정 중 모발시료의 cotinine 손실을 도시하였다.
도 5 는 강염기성 용액에서 cotinine과 trans-3-hydroxycotinine 성분의 안정성 평가 결과를 도시하였다.
도 6 은 cotinine의 크로마토그램, AOAC QuEChERS와 PSA를 적용한 시료에서 크로마토그램, original QuEChERS와 C18을 적용한 시료에서 크로마토그램, original QuEChERS와 PSA를 적용한 시료에서 크로마토그램을 순차적으로 도시하였다.
도 7은 QuEChERS 과정 중 용매의 증발건조 가열 여부에 따른 cotinine의 회수율을 도시하였다.
도 8 은 모발 시료 세척 과정에 의한 cotinine의 손실도를 도시하였다.
도 9 은 실제 모발에서의 cotinine과 trans-3-hydroxycotinine의 LC-MS/MS 크로마토그램 측정 결과를 도시하였다.
도 10 는 모발 시료 중 cotinine과 trans-3-hydroxycotinine의 직선성을 도시하였다.
도 11 는 실제 손톱에서의 cotinine과 trans-3-hydroxycotinine의 LC-MS/MS 크로마토그램 측정 결과를 도시하였다.
도 12 는 손톱 시료 중 cotinine과 trans-3-hydroxycotinine의 직선성을 도시하였다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 형태에 따라 캐쳐스(QuEChERS) 전처리를 이용한 니코틴 대사물질 추출방법을 제공한다.
상기 캐쳐스(QuEChERS)는 Quick, Easy, Cheap, Effective Rugged, and safe의 약자로 농산물의 잔류농약 분석법의 일종이다.
상기 QuEChERS 전처리를 이용한 니코틴 대사물질 추출방법은 생체시료인 모발과 손톱을 세척 및 건조하는 단계, 세척한 생체시료를 세절하는 단계, 세절한 생체시료를 강염기로 가수분해 하는 단계, 가수분해된 생체시료에 아세토니트릴과 QuEChERS를 적용하여 니코틴 대사물질을 추출하는 단계, 추출 후 dSPE (dispersive solid-phase extraction)를 적용하여 시료를 정제하는 단계 및 정제된 시료를 분석하는 단계를 포함한다.
상기 세척은 0.1% 황산도데실나트륨(sodium dodecyl sulfate, SDS) 수용액으로 수행할 수 있고, 상기 건조는 상온에서 수행할 수 있다.
상기 강염기는 1 M 수산화나트륨(NaOH) 수용액일 수 있고, 상기 가수분해는 상기 1 M 수산화나트륨(NaOH) 수용액에 하룻밤(overnight) 동안 방치하는 것 일 수 있다.
상기 QuEChERS는 original QuEChERS (황산마그네슘(magnesium sulfate, MgSO4), 아세트산나트륨(sodium acetate, C2H3NaO2) 포함), AOAC QuEChERS (association of analytical community의 약자, 황산마그네슘(magnesium sulfate, MgSO4), 아세트산나트륨(sodium acetate, C2H3NaO2)을 포함), EN QuEChERS (european committee for standardization의 약자, 황산마그네슘(magnesium sulfate, MgSO4) 염화나트륨(sodium chloride, NaCl), 소듐 시트레이트 트리베이직 디하이드레이트(sodium citrate tribasic dihydrate, 구연산), 소듐 시트레이트 디베이직 세스퀴하이드레이트 (sodium citrate dibasic sesquihydrate)을 포함) 일 수 있다.
상기 니코틴 대사물질은 코티닌(cotinine, COT) 또는 트랜스-3-하이드록시코티닌(trans-3-hydroxycotinine, 3-HCOT)일 수 있다.
상기 dSPE (dispersive solid-phase extraction)는 C18 흡착제와 PSA (primary secondary amine) 흡착제로 이루어진 군에서 선택된 하나 일 수 있다.
상기 정제는 2,800 g에서 원심분리하여 상징액을 25℃ 질소 기류 하에서 건조하는 것일 수 있다.
상기 분석은 액체 크로마토그래프(liquid chromatograph, LC)를 통해 분리된 각 성분을 트리플 4 극 탠덤 질량분석기 (triple quadrupole tandem mass spectrometry , MS/MS)를 사용하여 검출하는 것 일수 있다.
일반적으로 니코틴 대사물질인 코티닌은 독성이 강한 디클로로메탄(Dichloromethane) 유기용매를 사용한 고전적인 액체-액체추출법(LLE)으로 전처리를 시도하였으며, 그 결과 모발 중에 검출된 코티닌의 평균농도는 0.074-2.82 ng/mg으로 보고되었다.
이렇게 독성이 강한 유기용매의 사용을 줄여 검출자의 작업환경을 개선하고 동시에 검출시간을 단축하는 방법을 검토하던 중, 농산물의 잔류농약 전처리 방법인 QuEChERS 법을 생체시료에 적용하고자 하였다. QuEChERS 방법은 상대적으로 안전한 전처리 방법으로, 이를 적용하여 가장 주요한 니코틴 대사물질인 코티닌과 소변 중에 두 번째로 많이 대사되는 trans-3-hydroxycotinine을 추가하여 동시분석을 진행하였다.
Figure 112018132505492-pat00001
분석은 LC-MS/MS 분석을 수행하였으며, 아래와 같은 조건으로 수행하였다.
- LC-(MS/MS) 분석 조건 최적화
LC 분석 장비는 UHPLC (Agilent 1290 Infinity system)이고, 컬럼은 Phenomenex Kinetex C18 (2.1 × 100 mm, 2.6 μm), 이동상은 2가지로 (A) 물, (B)는 메탄올/아세토니트릴(50:50, v/v)로 수행하였으며, 유속은 0.2 mL/min, 주입양은 5 μL, 컬럼 온도는 30℃였다. 그리고 이동상의 기울기 용리 프로그램은 하기 표 1과 같다.
Time (min) Solvent A (%) Solvent B (%)
0.0 90 10
8.0 10 90
12.0 10 90
12.1 90 10
15.0 90 10
- 전자분사이온화법(Electrospray Ionization, ESI) parameter 최적화
LC를 통해 분리된 각 성분의 검출에 triple quadrupole tandem mass spectrometry (MS/MS)를 사용하였고, ESI 이온화 방식으로 대상 성분들을 이온화하여 MRM (multiple reaction monitoring) mode로 분석하였다.
Cotinine과 trans-3-hydroxycotinine의 이온화 효율을 극대화하기 위해 자동화된 소프트웨어 기능을 이용하여 ESI 이온 소스의 각 파라미터 조건을 최적화 하였으며, 그 결과 capillary voltage: 3000 V, nozzle voltage: 500 V, nebulizer pressure: 25 psi, drying gas temperature: 290℃, drying gas flow rate: 16 L/min, sheath gas temperature: 400℃ 및 sheath gas flow rate: 12 L/min로 최적화 하였다.
ESI parameter 최적화 전후 cotinine과 trans-3-hydroxycotinine의 peak 면적을 비교하였으며, 최적화 전의 면적을 기준으로 하여 백분율로 도식화하여 도 1에 도시하였다.
도 1을 참조하면, ESI parameter 조건을 최적화한 후, cotinine과 trans-3-hydroxycotinine의 분석 시그날이 2~2.3 배 향상된 결과를 확인할 수 있었다.
- MRM 조건 설정
MS/MS 분석 시, 각 성분 별로 collision energy 및 cell accelerator voltage (CAV)를 조절하여 fragment ions의 response가 최대가 되도록 조정하였으며, 그 결과 최적의 precursor ion/product ion pair를 선정하였다. 또한 가장 좋은 감도를 보이는 fragment ion (base peak)을 정량 이온 (quantification ion)으로 설정하고, 다음으로 크게 검출되거나 그 분자에 특징적으로 검출되는 fragment ion들을 정성 이온 (confirmation ion)으로 설정하여 확인하였다.
이를 통해 설정된 cotinine과 trans-3-hydroxycotinine 및 내부표준물질의 MRM parameters를 하기 표 2에 도시하였으며, cotinine과 trans-3- hydroxycotinine의 MS/MS spectrum은 도 2에, cotinine과 trans-3-hydroxy cotinine 표준품의 LC-MS/MS 크로마토그램은 도 3에 도시하였다.
Target compound Precursor ion
(m/z) ([M+H]+)		 Product ions (m/z)
정량이온(CE) 정성이온(CE)
COT 177.1 80.0 (29) 98.0 (21), 70.1 (24)
COT-d3 180.1 80.0 (28) 101.0 (23), 73.1 (39)
3-HCOT 193.1 80.0 (30) 134.1 (20), 106.0 (29)
3-HCOT-d3 196.1 79.9 (32) 134.0 (19), 106.0 (31)
상기 표 2의 CE는 collision energy를 뜻한다.
■ 모발시료 전처리 과정의 최적화
- 모발시료 가수분해
모발 및 손톱은 견고한 큐티클 층을 포함하는 고체 시료이기에, 시료를 균질한 용액으로 만들기 위한 산 또는 염기 가수분해 과정을 진행하였다. 세 가지 가수분해 방법 (가열, 상온 방치, 배양)을 주로 사용하였으며, 산, 염기 용액으로 강산인 2 M hydrochloride (HCl) 용액과 강염기인 2 M sodium hydroxide (NaOH) 용액을 사용하였다.
예비 실험으로 water bath를 이용한 가열식 가수분해를 시도한 결과, 높은 농도임에도 불구하고 강산성 용액 (염산)에서는 모발시료의 가수분해가 완전하게 진행되지 않았으나, 강염기성 용액에서는 모발시료가 완전히 가수분해 되었다.
2 M NaOH 용액으로 90℃에서 모발시료를 처리하였을 때, 시료가 2시간 이내에 모두 가수분해 됨을 확인하였으나, 가열에 의한 cotinine과 trans-3- hydroxycotinine의 안정성을 검토하기 위해 cotinine 표준액을 가수분해 과정 전과 후에 각각 추가하여 분석한 결과, 가수분해 과정 중 가열로 인한 일부 손실 (4%)을 확인하였다(도 4).
전처리 후 최종 추출액에서 pH의 확인 결과, 전처리 방법으로 original QuEChERS 방법을 도입하였고 2 M NaOH를 사용한 샘플의 최종 추출액 pH는 약 8.0으로 확인되었다. 이는 QuEChERS salts에 의해 NaOH가 salting out 되어 최종 추출액에 일부 남은 것으로 추측되었다. 그러나 염기성 pH에 의한 HPLC 컬럼의 보호를 위해 시료 가수분해 용액을 1 M NaOH로 변경하였고 동일 시간 적용 (overnight) 후에도 시료가 완전히 가수분해 됨을 확인하였으며, 1 M NaOH로 변경한 최종 추출액 pH는 7.0으로 확인되었다. 따라서, 시료 가수분해 과정은 1 M NaOH 용액에서 overnight 방치하는 방법이 최적화된 방법임을 확인하였으며, 가수분해 효율 및 컬럼 보호와 분석 성분 안정성 등을 모두 만족하는 결과임을 확인하였다(도 5).
- QuEChERS법 적용 및 비교
모발 시료를 대상으로 3가지 QuEChERS 방법 (original, AOAC, EN)을 모두 적용하여 비교한 결과, original QuEChERS 방법에서 선택성과 회수율이 양호하였으며, primary secondary amine (PSA)으로 시료를 정제 하였을 때 간섭 물질이 만족스럽게 정제되는 것을 확인하였다 (도 6).
QuEChERS 과정 중 용매의 증발 건조를 위한 가열 여부에 따른 cotinine의 회수율을 비교한 결과, 최종 추출액을 증발 건조할 때(40℃) 회수율이 14 % 감소하였는데, 이는 밀폐되지 않은 상태로 열을 가하여 용매를 증발하는 과정 중에 대상 성분의 일부 소실이 발생한 것으로 추측되어, 해당 과정은 대상 성분의 소실을 최소화하기 위해 상온에서 진행하는 것이 최적임을 확인하였다(도 7).
- 모발 시료 세척 과정 최적화
모발 시료 표면의 세척 용액으로 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS) 수용액과 MeOH (총 2회)을 선정하였고, cotinine이 검출된 모발 시료를 사용하여 세척하지 않은 시료와 세척 과정을 진행한 시료 중 cotinine의 피크 크기를 비교하여 모발 시료 세척 과정에 의한 cotinine의 손실도를 도 8에 도시였다.
도 8을 참조하면, (A) 세척하지 않은 시료, (B) 0.1% SDS 수용액으로만 세척한 시료, (C) 0.1% SDS 수용액 세척 후 MeOH 세척을 1 분간 진행한 시료, (D) 0.1% SDS 수용액 세척 후 MeOH 세척을 30 분간 진행한 시료의 cotinine 손실비율을 확인할 수 있다. 이때 SDS 수용액을 사용하여 모발 시료를 세척한 시료에서 코티닌의 손실이 적었으며, MeOH 세척에 의해서는 모발 시료 내부의 코티닌 손실이 확인되었다. 따라서, 모발 시료 세척 과정에 있어 0.1% SDS 수용액으로만 진행하는 것이 코티닌 측정이 더 정확하게 하는 것임을 확인하였다.
■ 모발시료 분석법 검증 (validation)
- 실제 모발을 이용하여 분석법 검증을 실시하였다.
① 선택성
Cotinine과 trans-3-hydroxycotinine 표준액과 표준물질을 첨가한 모발 시료를 LC-MS/MS로 분석했을 때 얻어진 크로마토그램 (정량이온의 extracted ion chromatogram)은 도 9에 도시하였다.
도 9을 참조하면, (A)는 cotinine과 trans-3-hydroxycotinine 표준용액, (B)는 표준물질을 첨가한 blank 시료를 측정한 LC-MS/MS 크로마토그램이다.
② 직선성
각 cotinine과 trans-3-hydroxycotinine의 농도 범위에서 3회씩 분석하였으며, 각 농도에서 내부표준물질과의 피크면적비로 직선성을 확인하였다. COT과 3-HCOT 직선 농도 범위는 10-9000 pg/mg (10, 30, 100, 300, 1500, 9000)으로 설정하여 분석하였고, 그 결과 도 10에 도시하였다.
도 10를 참조하면, cotinine과 trans-3-hydroxycotinine 모두 상관계수 (R2) 0.99 이상의 양호한 직선성(n=3)을 나타내고 있음을 확인할 수 있었다.
③ 정확성 및 정밀성
- 일내 정확성 및 정밀성 : 정확성은 직선성 범위 내의 최저정량한계, 저, 중, 고농도에서 각각 5번 반복 시행하여 그 평균값을 확인하였고, 그 결과, 최저정량한계에서 이론값의 ±20% 이내, 최저정량한계를 제외하고는 ±15 % 이내임을 확인하였다. 정밀성은 직선성 범위 내의 최저정량한계, 저, 중, 고 농도에서 각각 5번 반복 시행하여 변동계수를 확인하였고, 그 결과, 최저정량한계에서는 상대표준편차가 20% 이내, 최저정량한계를 제외하고는 15 % 이내임을 확인하였다.
- 일간 정확성 및 정밀성: 정확성은 직선성 범위 내의 최저정량한계, 저, 중, 고농도에서 서로 다른 2일 이상에 걸쳐 3번 반복 시행하여 그 평균값을 확인하였고, 정밀성은 직선성 범위 내의 최저정량한계, 저, 중, 고 농도에서 서로 다른 2일 이상에 걸쳐 각각 3번 반복 시행하여 변동계수를 확인하였다.
Cotinine과 trans-3-hydroxycotinine의 일내, 일간 정확성 및 정밀성 시험 결과는 하기 표 3에 도시하였다.
Spiked conc.
(pg/mg)		 Intra-day Inter-day
Calculated conc.(pg/mg) Accuracy
(%)		 RSD
(%)		 Calculated conc.(pg/mg) Accuracy
(%)		 RSD
(%)
COT 10 9.3 93.3 9.6 10.5 105.0 4.9
30 30.4 101.2 2.1 28.2 94.0 2.6
300 294.5 98.2 6.2 304.9 101.6 1.9
9000 9052.2 100.6 3.0 9083.6 100.9 1.7
3-HCOT 10 10.3 102.9 8.2 10.4 103.8 1.3
30 28.7 95.6 1.8 29.9 99.7 2.1
300 286.9 95.6 5.0 285.7 95.2 4.1
9000 9002.5 100.0 0.6 8726.5 97.0 2.4
④ 회수율
직선성 범위 내의 저, 중, 고 농도에서 각각 3회 반복 시행하여 회수율을 확인하였다. 회수율은 시료에 분석물질을 첨가한 다음 전 처리한 시료와, 시료를 전 처리한 후 분석물질을 첨가한 시료를 비교하여 구하였으며, 그 결과 71.3-87.2%의 회수율을 확인하였다. 상대표준편차가 모두 15 % 이내로 일관성과 재현성을 확인하였다.
Cotinine, trans-3-hydroxycotinine의 회수율 결과는 하기 표 4에 도시하였다.
Spiked conc. (pg/mg) Recovery (%) RSD (%)
COT 30 85.1 2.1
300 87.2 0.7
9000 86.5 1.6
3-HCOT 30 83.8 8.9
300 71.3 8.0
9000 72.8 2.5
⑤ 최저정량한계(LLOQ)
최저정량한계는 LC-MS/MS 크로마토그램 (extracted ion chromatogram) 상에서 신호 대 잡음비 (S/N ratio)가 5 이상인 농도로 구하였다. 그 결과 cotinine과 trans-3-hydroxycotinine의 최저정량한계를 10 pg/mg으로 설정하였다.
■ 모니터링 결과
- 4명의 비흡연자 샘플을 평가한 결과, 모든 성분이 유의미한 농도로 검출되지 않았다.
■ 손톱시료 전처리 과정의 최적화
모발 시료에서 최적화한 전처리 방법을 동일하게 적용하였다.
■ 손톱시료 분석법 검증 (validation)
- 실제 모발을 이용하여 분석법 검증을 실시하였다.
① 선택성
Cotinine과 trans-3-hydroxycotinine 표준액과 표준물질을 첨가한 모발 시료를 LC-MS/MS로 분석했을 때 얻어진 크로마토그램 (정량이온의 extracted ion chromatogram)은 도 11에 도시하였다.
도 11을 참조하면, (A)는 cotinine과 trans-3-hydroxycotinine 표준용액, (B)는 표준물질을 첨가한 blank 시료를 측정한 LC-MS/MS 크로마토그램이다.
② 직선성
각 cotinine과 trans-3-hydroxycotinine의 농도 범위에서 3회씩 분석하였으며, 각 농도에서 내부표준물질과의 피크면적비로 직선성을 확인하였다. COT과 3-HCOT 직선 농도 범위는 10-9000 pg/mg (10, 30, 100, 300, 1500, 9000)으로 설정하여 분석하였고, 그 결과 도 12에 도시하였다.
도 12를 참조하면, cotinine과 trans-3-hydroxycotinine 모두 상관계수 (R2) 0.99 이상의 양호한 직선성(n=3)을 나타내고 있음을 확인할 수 있었다.
③ 정확성 및 정밀성
- 일내 정확성 및 정밀성 : 정확성은 직선성 범위 내의 최저정량한계, 저, 중, 고농도에서 각각 5번 반복 시행하여 그 평균값을 확인하였고, 그 결과, 최저정량한계에서 이론값의 ±20% 이내, 최저정량한계를 제외하고는 ±15 % 이내임을 확인하였다. 정밀성은 직선성 범위 내의 최저정량한계, 저, 중, 고 농도에서 각각 5번 반복 시행하여 변동계수를 확인하였고, 그 결과, 최저정량한계에서는 상대표준편차가 20% 이내, 최저정량한계를 제외하고는 15 % 이내임을 확인하였다.
- 일간 정확성 및 정밀성: 정확성은 직선성 범위 내의 최저정량한계, 저, 중, 고농도에서 서로 다른 2일 이상에 걸쳐 3번 반복 시행하여 그 평균값을 확인하였고, 정밀성은 직선성 범위 내의 최저정량한계, 저, 중, 고 농도에서 서로 다른 2일 이상에 걸쳐 각각 3번 반복 시행하여 변동계수를 확인하였다.
Cotinine과 trans-3-hydroxycotinine의 일내, 일간 정확성 및 정밀성 시험 결과는 하기 표 5에 도시하였다.
Spiked conc.
(pg/mg)		 Intra-day Inter-day
Calculated conc.(pg/mg) Accuracy
(%)		 RSD
(%)		 Calculated conc.(pg/mg) Accuracy
(%)		 RSD
(%)
COT 10 10.3 102.9 2.9 10.0 100.3 3.6
30 30.1 100.3 3.1 30.2 100.5 12.3
300 297.1 99.0 1.1 290.1 96.7 0.3
9000 8733.9 97.0 1.6 8976.9 99.7 0.9
3-HCOT 10 10.4 104.2 2.6 10.0 99.9 2.1
30 29.3 97.7 4.3 90.8 102.7 6.7
300 296.3 98.8 3.0 290.9 97.0 9.7
9000 9127.3 101.4 1.3 9000.5 100.0 1.0
④ 회수율
직선성 범위 내의 저, 중, 고 농도에서 각각 3회 반복 시행하여 회수율을 확인하였다. 회수율은 시료에 분석물질을 첨가한 다음 전 처리한 시료와, 시료를 전 처리한 후 분석물질을 첨가한 시료를 비교하여 구하였으며, 그 결과 57.1-78.2%의 회수율을 확인하였다. 상대표준편차가 모두 15 % 이내로 일관성과 재현성을 확인하였다.
Cotinine, trans-3-hydroxycotinine의 회수율 결과는 하기 표 6에 도시하였다.
Spiked conc. (pg/mg) Recovery (%) RSD (%)
COT 30 78.2 12.3
300 70.4 0.3
9000 78.2 1.1
3-HCOT 30 65.3 6.7
300 57.1 9.7
9000 68.5 1.0
⑤ 최저정량한계(LLOQ)
최저정량한계는 LC-MS/MS 크로마토그램 (extracted ion chromatogram) 상에서 신호 대 잡음비 (S/N ratio)가 5 이상인 농도로 구하였다. 그 결과 cotinine과 trans-3-hydroxycotinine의 최저정량한계를 10 pg/mg으로 설정하였다.
■ 모니터링 결과
- 3명의 비흡연자와 1명의 흡연자 샘플을 평가한 결과, 흡연자 샘플에서 cotinine 169.3 pg/mg, trans-3-hydroxycotinine 28.5 pg/mg의 농도로 검출되었다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1.
(1) 시료 준비
미리 준비한 손톱을 0.1% SDS 용액 25 mL가 담긴 50 mL polypropylene conical tube에 넣고 30 분간 진탕하여 세척한다. 세척 후 용액을 최대한 버리고 시료를 건져 호일 위에 두고, 상온에서 overnight 동안 건조한다. 건조한 시료를 멸균한 손톱깎이로 최대한 고르게 자른 다음, 10 mg을 취하여 15 mL polypropylene conical tube에 담는다.
(2) 시험용액의 조제
① 1 M NaOH 1 mL를 시료가 담긴 polypropylene conical tube에 넣고 상온에서 overnight 동안 가수분해 한다. 이후 300 pg/mg 농도의 내부표준물질 용액 10 μL와 acetonitrile 5 mL를 넣고 15 분간 진탕한다. 진탕 후 magnesium sulfate 0.8 g과 sodium chloride 0.2 g을 가하여 추가로 20 분간 더 진탕하고, 2,800 g에서 10 분간 원심분리한다. 분리된 상징액을 primary secondary amine (PSA) 0.15 g이 담긴 conical tube에 옮겨 담고 15 분간 진탕하여 dSPE (dispersive solid-phase extraction)를 수행한 후, 2,800 g에서 10 분간 원심분리한다. 분리된 상징액 5 mL를 25°C 질소 기류 하에서 건조시킨 후, water/methanol/acetonitrile (7/1.5/1.5, v/v/v) 혼합용액 0.3 mL로 재분산한다. 0.2 μm membrane filter (PTFE, polytetrafluoroethylene)로 여과하여 시험용액으로 준비한다.
실시예 2.
(1) 시료 준비
미리 준비한 머리카락을 0.1% SDS 용액 25 mL가 담긴 50 mL polypropylene conical tube에 넣고 30 분간 진탕하여 세척한다. 세척 후 용액을 최대한 버리고 시료를 건져 호일 위에 두고, 상온에서 overnight 동안 건조한다. 건조한 시료를 20 mL glass vial에 담고 안과용 수술 가위로 최대한 고르게 자른다. 자른 머리카락 10 mg을 15 mL polypropylene conical tube에 담는다.
(2) 시험용액의 조제
1 M NaOH 1 mL를 시료가 담긴 polypropylene conical tube에 넣고 상온에서 overnight 동안 가수분해 한다. 이후 내부표준물질인 cotinine-d3, trans- 3-hydroxycotinine-d3를 메탄올로 희석한 300 pg/mg 용액 10 uL와 acetonitrile 5 mL를 넣고 15 분간 진탕한다. 진탕 후 magnesium sulfate 0.8 g과 sodium chloride 0.2 g을 가하여 추가로 20 분간 더 진탕하고, 2,800 g에서 10 분간 원심분리한다. 분리된 상징액을 primary secondary amine (PSA) 0.15 g 담긴 conical tube에 옮겨 담고 15 분간 진탕하여, dSPE (dispersive solid-phase extraction)를 수행한 후, 2,800 g에서 10 분간 원심분리한다. 분리된 상징액 5 mL를 25°C 질소 기류 하에서 건조시킨 후, water/methanol/acetonitrile (7/1.5/1.5, v/v/v) 혼합용액 0.3 mL로 재분산한다. 0.2 μm membrane filter (PTFE, polytetrafluoroethylene)로 여과하여 시험용액으로 준비한다.
비교예 1.
검량선용 표준용액의 조제
공시료에 standard solution (cotinine, cotinine-d3, trans-3-hydroxy cotinine, trans-3-hydroxycotinine-d3)을 메탄올에 희석하여 직선성에 표기된 6가지 농도(각각 10, 30, 100, 300, 1500, 9000 pg/mg)가 되도록 표준용액을 조제하여 준비한다.
측정예 1.
실시예 2 및 비교예1 에서 준비된 시험용액 및 표준용액을 가지고 Agilent LC-MS/MS system(Agilent technologies, Santa Clara, CA, USA) 장비로 분석한다. 분석결과는 도 9, 10, 11, 12 및 상기 표 3, 4, 5, 6에 도시하였다.
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

Claims (9)

  1. 생체시료인 모발 또는 손톱을 세척 및 건조하는 단계;
    상기 세척한 생체시료를 세절하는 단계;
    상기 세절한 생체시료를 강염기로 가수분해 하는 단계;
    상기 가수 분해된 생체시료에 아세토니트릴과 캐처스(QuEChERS)를 적용하여 니코틴 대사물질을 추출하는 단계;
    상기 추출 후 dSPE (dispersive solid-phase extraction)를 적용하여 간섭물질이 제거된 시료를 정제하는 단계; 및
    상기 정제된 시료를 분석하는 단계;를 포함하고,
    상기 세척은 0.1% 황산도데실나트륨(sodium dodecyl sulfate, SDS) 수용액으로만 수행하고,
    상기 건조는 상온에서 수행하는 것을 특징으로 하는 캐처스 전처리를 이용한 니코틴 대사물질 추출방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 강염기는 1 M 수산화나트륨(NaOH) 수용액이고,
    상기 가수분해는 상기 1 M 수산화나트륨(NaOH) 수용액에 하룻 밤 동안 방치하는 것을 특징으로 하는 캐처스 전처리를 이용한 니코틴 대사물질 추출방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 캐처스(QuEChERS)는 original 캐처스, AOAC 캐처스 (association of analytical community), EN 캐처스 (european committee for standardization)로 이루어진 군에서 하나 이상을 포함하는 캐처스 전처리를 이용한 니코틴 대사물질 추출방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 original 캐처스는 황산마그네슘(magnesium sulfate, MgSO4), 염화나트륨(sodium chloride, NaCl)을 포함하고,
    상기 AOAC 캐처스는 황산마그네슘(magnesium sulfate, MgSO4), 아세트산나트륨(sodium acetate, C2H3NaO2)을 포함하고,
    상기 EN 캐처스는 황산마그네슘(magnesium sulfate, MgSO4) 염화나트륨(sodium chloride, NaCl), 소듐 시트레이트 트리베이직 디하이드레이트(sodium citrate tribasic dihydrate, 구연산), 소듐 시트레이트 디베이직 세스퀴하이드레이트 (sodium citrate dibasic sesquihydrate)을 포함하는 것을 특징으로 하는 캐처스 전처리를 이용한 니코틴 대사물질 추출방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 니코틴 대사물질은 코티닌(cotinine, COT) 또는 트랜스-3-하이드록시코티닌(trans-3-hydroxycotinine, 3-HCOT)인 것을 특징으로 하는 QuEChERS 전처리를 이용한 니코틴 대사물질 추출방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 dSPE (dispersive solid-phase extraction)는 C18 흡착제와 PSA (primary secondary amine) 흡착제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 캐처스 전처리를 이용한 니코틴 대사물질 추출방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 정제는 2,800 g에서 원심분리하여 상징액을 25℃ 질소 기류 하에 건조하는 것을 특징으로 하는 캐처스 전처리를 이용한 니코틴 대사물질 추출방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 분석은 액체 크로마토그래프(liquid chromatograph, LC)를 통해 분리된 각 성분을 트리플 4 극 탠덤 질량분석기(triple quadrupole tandem mass spectrometry, MS/MS)를 사용하여 검출하는 것을 특징으로 하는 캐처스 전처리를 이용한 니코틴 대사물질 추출방법.
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