KR102205537B1 - 의료용 고분자의 세포독성 시험용 표준물질 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 의료용 고분자의 세포독성 시험용 표준물질 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 속슬렛법(Soxhlet Method)에 의해 HDPE(High Density Polyethylene)로부터 독성물질을 제거하여, 세포독성 시험용 표준물질로 적합하며 가공성이 우수한 HDPE를 높은 수율로 제조할 수 있다.

Description

의료용 고분자의 세포독성 시험용 표준물질 및 이의 제조방법 {REFERENCE MATERIAL FOR TESTING CYTOTOXICITY OF BIOMEDICAL POLYMER AND METHOD FOR PREPARING THE SAME}

본 발명은 의료용 고분자의 세포독성 시험용 표준물질 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

의료용 고분자는 질병을 진단 및 치료하는데 사용되고, 또한 질병이나 사고로 손상된 신체의 부위를 대체하는 목적으로 사용되는 재료이다. 따라서, 의료용 고분자는 독성이 없어야 하며, 인체 내에서 면역거부반응 없이 기능을 유지할 수 있어야 한다.

의료용 고분자는 1860년대 무균수술과 함께 사용되기 시작했다. 산업적 측면에서 의료용 고분자는 2011년 20억 달러의 판매시장을 형성했으며(Frost & Sullivan), 추후 시장의 규모가 더욱 확장될 것으로 예측되고 있다.

모든 의료용 고분자로 제조된 제품에 대해서는 반드시 독성 시험을 거쳐야 한다. 독성 시험에 대한 구체적인 시험방법은 ISO/TC 194를 통해 ISO 10993 ‘의료용구의 생물학적 안전성 평가’에 규격으로 제정되어 있으며, 우리나라에서도 근래 KOLAS의 공인시험기관인증을 통하여 보다 더 신뢰성 있는 시험결과를 유도하고 있다.

이들 시험결과의 신뢰성은 제품의 안전성으로 직결되는 아주 중요한 요소이다. 시험은 결과의 신뢰성을 위하여 매 실험마다 음성 표준물질과 양성 표준물질을 동시에 확인하도록 되어 있으며, 이들 표준물질의 결과와 비교하여 시험결과를 도출하게 된다. 그리나 현재 이들 표준물질은 국내 생산자가 없으며, 수입되는 제품 또한 단순한 표준물질 수준으로 제품에 대한 신뢰성을 담보하기 어려워 ISO Guide 34를 통한 더 높은 수준의 표준물질이 요구되고 있다.

한국공개특허 제2012-0116953호

이에 본 발명자들은, 속슬렛법(Soxhlet Method)을 이용하여 HDPE(High Density Polyethylene)를 메탄올로 12시간 이상 용출하여 독성 물질을 제거하였으며, 상기 독성 물질이 제거된 HDPE는 ISO에 따른 세포독성등급 확인 결과 상업적으로 적용 가능한 의료용 고분자의 음성 표준물질로 적합한 것을 확인 하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 의료용 고분자의 세포독성 시험용 표준물질의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 의료용 고분자의 세포독성 시험용 표준물질의 제조방법으로 제조된 표준물질을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은, (S1) 유기 용매를 이용한 속슬렛법(Soxhlet Method)에 의해 HDPE(High Density Polyethylene)를 정제하는 단계; 및

(S2) 상기 (S1) 단계에서 정제된 HDPE를 건조시키는 단계;

를 포함하는, 의료용 고분자의 세포독성 시험용 표준물질의 제조방법을 제공한다.

상기 유기 용매는 에틸아세테이트, 에테르, n-헥산, 사이클로헥산, 이소프로판올, 메탄올, 에탄올, 클로로포름, 프로판올, 1.3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 글리세린, 1,2-펜탄디올, 디-판테놀, 디프로필렌글리콜 및 아세톤으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다.

상기 유기 용매를 12시간 이상 환류시켜 HDPE를 정제하는 것일 수 있다.

상기 HDPE와 유기 용매의 중량비는 1 : 20 내지 30 인 것일 수 있다.

상기 건조는 진공 건조인 것일 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 제조방법에 의해 정제된 HDPE를 포함하는 의료용 고분자의 세포독성 시험용 표준물질을 제공한다.

본 발명에 따른 의료용 고분자의 세포독성 시험용 표준물질의 제조방법에 의하면, HDPE에 포함되어 있는 독성 물질을 효과적으로 제거하면서도, PE 올리고머는 과다하게 제거되지 않도록 하여, 수율 저하 및 가공성 저하와 같은 문제를 방지할 수 있다.

또한, 상기 의료용 고분자의 세포독성 시험용 표준물질의 제조방법에 의해 정제된 HDPE는 ISO 9001, ISO 17025 및 ISO Guide 34(세포독성시험방법에 따른 독성 등급)를 만족하므로, 상업화된 제품 및 이를 생산하기 위한 공정의 신뢰성을 확보할 수 있다.

도 1은 실험예 1에 따라 시편으로 제조된 실시예 1,5 및 비교예 2,3에서 제조되어 독성물질이 제거된 HDPE의 사진을 나타낸 것이다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 본 명세서에 한정되지 않는다.

의료용 고분자의 세포독성 시험용 표준물질의 제조방법

본 발명은, 의료용 고분자의 세포독성 시험용 표준물질의 제조방법에 관한 것으로, (S1) 유기 용매를 이용한 속슬렛법(Soxhlet Method)에 의해 HDPE(High Density Polyethylene)를 정제하는 단계; 및 (S2) 상기 (S1) 단계에서 정제된 HDPE를 건조시키는 단계;를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 의료용 고분자의 세포독성 시험용 표준물질의 제조방법에 있어서, (S1) 단계에서는 유기 용매를 이용한 속슬렛법(Soxhlet Method)에 의해 HDPE(High Density Polyethylene)를 정제할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 속슬렛법은 속슬렛 장비 또는 이와 유사한 장비를 사용하여 연속적으로 용출하는 방법이다.

구체적으로, 상기 (S1) 단계에서는, 상기 HDPE의 중량을 측정한 후, 정제하고자 하는 중량만큼의 HDPE를 상기 속슬렛 장치에 구비된 용기(팀블)에 담아 세팅한다. 그 후, 유기 용매를 환류시켜 상기 HDPE로부터 독성물질, 불순물 등을 용출시켜 제거함으로써 상기 HDPE를 정제할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 유기 용매는 에틸아세테이트, 에테르, n-헥산, 사이클로헥산, 이소프로판올, 메탄올, 에탄올, 클로로포름, 프로판올, 1.3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 글리세린, 1,2-펜탄디올, 디-판테놀, 디프로필렌글리콜 및 아세톤로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 상기 속슬렛법에 적용할 수 있는 유기 용매라면 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는, 상기 유기 용매는 메탄올일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 유기 용매를 이용한 정제 시간은 6시간 이상, 또는 12 시간 이상, 바람직하게는 12 내지 30 시간, 보다 바람직하게는 20 내지 30 시간일 수 있다. 이때, 상기 유기 용매를 이용한 정제 시간이란, 구체적으로는 상기 유기 용매를 환류시키는 시간을 의미하는 것일 수 있다. 상기 유기 용매를 이용한 정제 시간인 12 시간 미만이면, 상기 HDPE가 충분히 정제되지 않아 세포독성 시험용 표준물질로서 적합하지 않을 수 있고, 30 시간 초과이면 상기 HDPE로부터 PE 올리고머가 과다하게 빠져나가 가공성이 저하될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 HDPE와 유기 용매의 중량비는 1 : 15 내지 40, 바람직하게는 1 : 20 내지 35, 보다 바람직하게는 1 : 20 내지 30 일 수 있다. 상기 HDPE에 대한 유기 용매의 중량비가 15 미만이면 속슬렛 장비의 팀블(thimble)을 충분하게 채울 수 없어서 연속 공정이 불가능하고, 40 초과이면 장비가 비효율적으로 커지게 된다.

본 발명에 따른 의료용 고분자의 세포독성 시험용 표준물질의 제조방법에 있어서, (S2) 단계에서는, 상기 (S1) 단계에서 정제된 HDPE를 건조시킬 수 있다.

상기 건조 온도는 20 내지 60℃, 바람직하게는 30 내지 50℃, 보다 바람직하게는 35 내지 45℃일 수 있다. 상기 건조 온도가 20℃ 미만이면 정제된 HDPE가 충분히 건조되지 않고, 60℃ 초과이면 정제된 HDPE에 변형이 일어날 가능성이 있다.

또한, 상기 건조 방식은 특별히 제한되지 않지만, 바람직하게는 진공 건조일 수 있다. 상기 진공 건조에 의해 정제된 HDPE은 의료용 고분자의 세포독성 시험용 표준물질로 적합한 물성을 나타낼 수 있다.

상기 (S1) 및 (S2) 단계 후에 얻어진 HDPE의 중량을 측정하여, 상기 정제 전에 측정된 HDPE의 중량과의 차이로부터, 용출되어 제거된 독성물질의 양을 알 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 의료용 고분자는 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리염화비닐, 폴리초산비닐, 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴레이트, 폴리이소프렌, 폴리부타디엔, 아세탈 수지, 폴리설폰, 폴리에테르에테르케톤, 폴리우레탄, 에폭시 수지 및 이들의 공중합체로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 의료용 고분자라면 이에 제한되는 것은 아니다.

예컨대, 상기 의료용 고분자로 제품화되는 예로는, 카데타, 스텐트, 관 형태의 의료제품, 수술용 봉합사, 봉합 나사못(suture anchor), 뼈 골절 치료용 플레이트(plate), 스크류, 로드(rod), 인대재건용 간섭스크류, 보강용 섬유 부직포, 재생유도형 섬유 부직포, 인공뼈 또는 충진재일 수 있다.

의료용 고분자의 세포독성 시험용 표준물질

본 발명은 또한, 상기 의료용 고분자의 세포독성 시험용 표준물질의 제조방법에 의해 정제된 HDPE를 포함하는 의료용 고분자의 세포독성 시험용 표준물질에 관한 것이다. 이때, 상기 독성물질이란 정제 전 HDPE에 포함된 각종 첨가제, 예컨대, 산화 안정제 등을 들 수 있다. 상기 HDPE의 가장 일반적인 첨가제는 산화안정제로서 부틸히드록시톨루엔 (BHT, butylhydroxytoluene) 등이 사용되며 이들이 독성 물질로 작용하는 것으로 이해된다.

또한, 상기 정제된 HDPE를 포함하는 의료용 고분자의 세포독성 시험용 표준물질은 ISO 9001, ISO 17025 및 ISO Guide 34를 만족하므로, 상업화된 제품 및 이를 생산하기 위한 공정의 신뢰성을 확보할 수 있다.

이하에서 실시예 등을 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하며, 다만 이하에 실시예 등에 의해 본 발명의 범위와 내용이 축소되거나 제한되어 해석될 수 없다. 또한, 이하의 실시예를 포함한 본 발명의 개시 내용에 기초한다면, 구체적으로 실험 결과가 제시되지 않은 본 발명을 통상의 기술자가 용이하게 실시할 수 있음은 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연하다.

실시예 1: 속슬렛법을 이용한 HDPE 정제

HDPE(LH-4100, 대림산업)을 팀블(thimble, Advantec사 제조, 33 x 120 mm)에 담아 중량을 측정한 후, 속슬렛 장비(Aldrich사)에 세팅하고, 메탄올을 사용하여 24시간 동안 환류시켜 상기 HDPE를 정제하였다. 이때, 상기 HDPE와 메탄올의 중량비는 1:24이다.

그 후, 상기 팀블에 담긴 상태의 HDPE를 진공 오븐에 넣고 40℃에서 충분히 건조시켜, 정제된 HDPE를 얻었다.

실시예 2

메탄올을 사용하여 12시간 동안 환류시킨 것을 제외하고, 실시예 1과 동일한 방법으로, 정제된 HDPE를 얻었다.

실시예 3

메탄올을 사용하여 6시간 동안 환류시킨 것을 제외하고, 실시예 1과 동일한 방법으로, 정제된 HDPE를 얻었다.

실시예 4

메탄올 대신 에탄올을 사용하여 6시간 동안 환류시킨 것을 제외하고, 실시예 1과 동일한 방법으로, 정제된 HDPE를 얻었다.

실시예 5

메탄올 대신 아세톤을 사용하여 6시간 동안 환류시킨 것을 제외하고, 실시예 1과 동일한 방법으로, 정제된 HDPE를 얻었다.

비교예 1

HDPE(LH-4100, 대림산업)을 준비하였다.

비교예 2

메탄올 대신 물을 사용한 것을 제외하고, 실시예 1과 동일한 방법으로, 정제된 HDPE를 얻었다.

비교예 3: 재침전(precipitation)을 이용한 HDPE 정제

HDPE(LH-4100, 대림산업) 25g을 자일렌 500 mL에 넣은 후, Reflux 조건 하에서 stirring하여 충분히 녹인 후 1L의 메탄올에 천천히 떨어뜨려서 침전시켰다. 침전된 HDPE를 필터를 통해 수거한 후, 진공오븐에 넣어 40℃에서 충분히 건조시켰다.

비교예 4

메탄올 대신 에탄올을 사용한 것을 제외하고, 비교예 3과 동일한 방법으로, 정제된 HDPE를 얻었다.

실험예 1 :

실시예 및 비교예에서 얻은, 정제된 HDPE의 시편을 제조하여, 이의 가공성을 확인하였다.

1. 시편 제조

190℃ 프레스에 PET(polyethylene terephthalate) 필름을 깔고 그 위에 1 mm 두께의 몰드를 놓고, HDPE 샘플(실시예 및 비교예에서 얻은, 정제된 HDPE)을 넣고, 다시 그 위에 PET 필름을 얹어놓고 10분 동안 140 kg/㎠ 의 압력으로 프레싱(pressing)한 후 냉동실에서 1분간 냉각하여 HDPE 필름을 제조하였다. 단 HDPE 샘플들의 점도 등의 특성을 고려하여 프레싱을 170℃에서 210℃까지 변화시키면서 필름을 제조하였다.

제조된 HDPE 필름은 가공성이 현저하게 떨어져서 제대로 된 필름이 만들어지지 않은 경우가 있다. 이는 정제 과정 중에 불순물은 물론이고, 분자량이 작은 올리고머도 과다하게 제거되었기 때문으로 판단되며, 이는 DSC(differential scanning calorimetry)에 측정한 융해열량(Hm) 값으로 부터도 예측이 된다. 즉, 일반적인 HDPE는 120 내지 121 J/g 정도의 열량을 나타내는데 비해, 정제 과정이 지나쳐서 올리고머가 과다하게 제거된 샘플들에서는 Hm 값이 급격하게 상승하는 것을 알 수 있다. 즉, 이와 같이 가공성이 떨어지는 시편들은 상업적 가치가 없다.

2. DSC(differential scanning calorimetry) 측정

DSC 측정장치(Shimadzu사의 DSC60 plus)를 이용하여, 각 시편의 융점(Tm) 및 융해열량(ΔHm)을 측정하여, 그 결과를 표 2 및 표 3에 나타내었다.

3. 세포독성시험

세포독성 시험은 다음과 같은 표준 공정에 따라 한국기계전기전자시험연구원(KTC)에서 측정한 후, 그 결과를 표 2 및 표 3에 나타내었다.

(1) 시험기준

① ISO 0993: 009, iological Evaluation of Medical Devices-Part 5 : Tests for in vitro Cytotoxicity, 8.2 Test on extracts

② USP 41: 2018, <87> Biological reactivity tests, in vitro, Elution Test

③ 식품의약품안정처 고시 제2019-4호, 의료기기의 생물학적 안전에 관한 공통기준규격

(2) 검액제조

① 용출용매 : MEM(MInimum Essential Medium) 배지 (10 % FBS(Fetal Bovine Serum) 첨가)

② 용출기준 : 시료 4 g 당 용출 용매 20mL의 비율, (37 ± 1)℃에서 (24 ± 2)시간 용출

③ 용출기간 : 2019. 06. 18 ~ 2019. 06. 19

④ 음성대조군 : HDPE Film 2 g 당 MEM 배지 20 mL의 비율로 (37 ± 1)℃ 에서 (24 ± 2) 시간 용출하였다.

⑤ 양성대조군 : ZDBC(zinc dibuthyldithiocarbamate) Polyurethane Film 2 g당 MEM 배지 20 mL의 비율로 (37 ± 1)℃ 에서 (24 ± 2) 시간 용출하였다.

⑥ 용매대조군 : 시료를 넣지 않은 용출용매를 (37 ± 1)℃ 에서 (24 ± 2) 시간 용출하였다.

(3) 시험방법

American Type Culture Collection CCL1. NCTC Clone 929 (connective tissue mouse), clone of Strain L (referred to here after as L-929 cells)을 10 % FBS을 포함한 MEM 배양액을 사용하여 3~4 일 계대배양한 후 사용하였다. L-929 세포를 1Х 개의 농도로 분주하여 MEM 배양액으로 단층배양한 후, 배지를 제거하고 시험군, 용매대조군, 음성대조군, 그리고 양성대조군 용출액을 처리하고 5 % CO, 37℃ 배양기에서 48시간 배양한 후 현미경 (100Х)으로 세포를 관찰하였다.

(4) 판정기준: 결과를 하기 표 1에 따라 관찰하였다.

등급 (grade)	반응 (reactivity)	배양액의 상태 (Conditions of all Cultures)
0	None	세포질내 과립이 선명하게 관찰되고 세포용혈이 나타나지 않는 경우
1	Slight	원형세포, 약하게 부착되었거나 세포질내 과립이 없는 세포가 20 % 이하인 경우 ; 용해된 세포가 부분적으로 관찰되는 경우
2	Mild	원형으로 세포질내 과립이 없는 세포가 50 % 이하인 경우; 세포용혈 및 세포간 빈공간이 넓지 않은 경우
3	Moderate	원형세포 또는 용혈된 세포층이 70 % 이하인 경우
4	Severe	세포층이 완전히 파괴된 경우

	Soxhlet		수율 (%)	DSC 측정		가공성	세포독성등급
	용매	시간(hr)		Tm(℃)	ΔHm(J/g)
실시예 1	메탄올	24	98.2	124.8	120.8	○	1
실시예 2	메탄올	12	99.2	123.9	120.5	○	2
실시예 3	메탄올	6	99.1	124.1	121.1	○	2
실시예 4	에탄올	6	96.2	124.7	148.8	X	-
실시예 5	아세톤	6	93.0	125.1	160.4	X	-
비교예 1	-	-	-	124.5	120.7	○	3
비교예 2	물	24	99.4	123.6	120.1	○	3

	침전 용매	수율(%)	DSC 측정		가공성	세포독성등급
			Tm(℃)	ΔHm(J/g)
비교예 3	메탄올	93.3	123.5	166.4	X	-
비교예 4	에탄올	91.1	125.8	170.8	X	-

도 1은 실험예 1에 따라 시편으로 제조된 실시예 1,5 및 비교예 2,3에서 제조되어 독성물질이 제거된 HDPE의 사진을 나타낸 것이다.

도 1을 참조하면, 실시예 1의 경우 가공성이 우수하여 원하는 형태로 시편이 형성된 것을 알 수 있다.

상기 표 2 및 표 3을 참조하면, 속슬렛법에 의해 메탄올을 사용하여 24 시간 동안 환류시킨 실시예 1의 경우 수율, 가공성 및 세포독성등급 모두 우수한 것을 알 수 있다.

실시예 2 및 3의 경우, 실시예 1에 비해 환류 시간이 상대적으로 짧은 12 시간 및 6시간으로 세포독성등급이 다소 저하되는 것을 알 수 있다.

실시예 4 및 실시예 5는 메탄올에 비해 HDPE에 대한 용해도가 높은 에탄올과 아세톤을 각각 용매로 사용한 경우로서, 수율이 낮아지고 가공성이 좋지 않고 세포독성등급도 측정할 수 없을 정도였다.

비교예 1은 정제하지 않은 HDPE로서 세포독성등급이 나쁘고, 비교예 2는 메탄올 대신 물을 사용한 경우로서 역시 세포독성등급이 나쁜 것을 알 수 있다.

비교예 3 및 비교예 4는 속슬렛법이 아닌 재침전법(precipitation)에 의해 HDPE를 정제한 경우로서, 가공성이 떨어져서 원하는 형상의 시편을 제작할 수 없었다.

상기 실험 결과로부터, 속슬렛법에 의해 메탄올을 적어도 12 시간 이상 환류시켜 HDPE를 정제할 경우 수율이 우수하고, 가공성과 세포독성등급이 우수한 것을 알 수 있다.

이상과 같이 본 발명에서는 특정된 사항들과 한정된 실시예에 의해 설명되었으나, 이는 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐, 본 발명은 상기의 실시예에 한정되는 것이 아니며, 본 발명이 속하는 분야에서 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다.

Claims (8)

1. (S1) 메탄올을 이용한 속슬렛법(Soxhlet Method)에 의해 HDPE(High Density Polyethylene)를 정제하는 단계; 및
   (S2) 상기 (S1) 단계에서 정제된 HDPE를 건조시키는 단계;를 포함하되,
   상기 메탄올을 20 내지 30 시간 동안 환류시켜 HDPE를 정제하고,
   상기 HDPE와 메탄올의 중량비는 1 : 20 내지 30 인, 의료용 고분자의 세포독성 시험용 표준물질의 제조방법.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 제1항에 있어서,
   상기 건조는 진공 건조인, 의료용 고분자의 세포독성 시험용 표준물질의 제조방법.
   
7. 삭제
8. 삭제

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