KR102205473B1 - 세포 내 pH 측정방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 세포 내 pH 측정방법에 관한 것으로, 구체적으로는 세포 내 pH 측정시 사용되는 세포 내에서 형광을 나타낼 수 있는 염료의 농도를 pH 측정 대상 세포 수를 기준으로 조절하여 처리함으로써, 세포 내 pH 측정의 정확도를 개선하기 위한 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 세포 내 pH 측정방법에 관한 것으로, 구체적으로는 세포 내 pH 측정시 사용되는 세포 내에서 형광을 나타낼 수 있는 염료의 농도를 pH 측정 대상 세포 수를 기준으로 조절하여 처리함으로써, 세포 내 pH 측정의 정확도를 개선하기 위한 방법에 관한 것이다.
세포는 플라스틱 재질의 용기, 유리 접시(dish) 또는 플라스크(flask) 등에 파종되어 배양될 수 있다. 세포 배양에 적당한 산도 (pH)를 유지하기 위하여 배양액의 교환이 이루어진다. 생명 유지와 관련된 중요성으로 인해, 세포내 환경의 pH는 알칼리 양이온-H+ 교환기, 중탄산염 및 산 부하 전달체와 같은 다양한 이온 채널 및 세포 내 약산 및 염기를 통해 엄격하게 조절된다.
세포에서의 pH는 암 세포 등의 변화 등을 파악하는데 중요한 마커로 판단될 수 있다. pH는 종양에서의 다중-약물 내성, 단백질 처리, 엔도사이토시스 및 세포 사멸과 같은 수많은 세포 활동을 개시하고 조절하는 데 중요한 역할을 하는 요소 중 하나이다.
포유류 세포에서 특정 대사 작용을 위한 최적의 작동 조건을 유지하기 위해 각각 별도의 pH 값들을 유지하게 된다. 정상 생리 조건에서 포유류 세포의 휴식 세포 내 pH는 6.8 내지 7.3에서 유지될 수 있다. 반면에, 세포외 pH 값은 7.2 내지 7.4의 범위에서 유지되어 약알칼리성을 나타내게 된다.
세포 내 pH의 조절 장애는 종종 세포 기능의 변화, 증식 및 약물 내성과 관련이 있으며, 암 또는 종양에서 관찰될 수 있다. 또한, 세포 내 pH 조절에 장애가 발생하는 경우 종양 성장과 암세포 이동에 큰 영향을 미치므로, 암 전이의 가능성이 있다.
국부적으로 활성화된 신진 대사에 의해 세포외 pH 수준이 6.0 미만으로 감소되는 혐기성 신진 대사가 유발되기도 하고, 이산화탄소(CO2)의 세포내 농도를 증가시켜 국부적인 pH 수준을 감소시키는 호기성 신진 대사가 발생하기도 한다.
이와 같은 세포내 pH 변화가 각종 종양세포 또는 암세포의 발생, 성장 및 이동 등에 영향을 미치고, 암 연구에서 이러한 세포내 pH 변화 여부를 확인하는 과정이 필수적일 수 있다.
또한, 다수의 신약 스크리닝, 신약 전달 시스템 등이 pH 민감성 고분자 또는 pH 민감성 고분자 나노입자를 사용하여 수행됨에 따라, 세포내 pH 데이터의 보다 정밀한 측정 및 분석은 신규 약물 또는 담체의 개발에 영향을 미칠 수 있고, 약물이 질병의 치료에 어느 정도 효과적으로 작동하는지 여부를 확인할 수 있는 마커로 작용할 수 있다.
이에, 세포내 pH를 정량적으로 측정하고, pH 측정의 정확도를 개선하는 것은 중요할 수 있다.
한편, 세포 내 다양한 pH 조건은 형광을 통해 측정될 수 있다. 형광은 비파괴적으로 생물학적 분자를 추적 또는 분석하는데 가장 일반적으로 사용되는 기법이다. 단순한 발광특성이나, 발광 특성 변화를 이용한 영상화, 에너지 트렌스퍼, 주변 환경 변화에 따른 발광 특성 변화, 화학 반응에 따른 구조 변화에 의한 발광 특성 변화 등 다양한 화학적 광학적 특성들의 변화를 분석함으로써, 생명 과학 분야에 유용한 정보를 얻을 수 있다.
다만, 형광 강도는 직접 정량화하기 어려우므로 염료의 위치 측정, 여기 파장 등을 통해 간접적으로 확인할 수 있으나, 세포 흡수 및 방출 속도 등에 따른 세포에 의한 실험적 요인들로 인해 영향을 받아 정확한 측정이 어려울 수 있다는 문제가 있다.
이러한 기술적 배경하에서, 본 출원의 발명자들은 세포 내 pH 측정을 위해 처리하는 세포 내에서 형광을 나타내는 염료의 농도를 pH 측정 대상 세포 수를 기준으로 조절함으로써, 세포 내 pH 측정의 정확도를 개선할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
상기와 같은 문제를 해결하기 위하여, 본 발명은 세포 내 pH 측정의 정확도를 개선하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세포 내 pH 측정의 정확도를 개선하기 위한 방법으로서, pH 측정 대상 세포에 세포 내에서 형광을 나타내는 염료를 처리하는 단계를 포함하고, 상기 염료의 농도는 pH 측정 대상 세포 수를 계수하여 세포 수 기준으로 조절하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 세포 내에서 형광을 나타내는 염료를 처리하여 세포 내 pH를 측정하는 과정에서 세포수에 관계없이 동일한 양의 염료를 처리하는 경우 pH가 정확하게 측정되지 못하는 문제점을 해결하여, pH 측정 대상 세포수에 무관하게 세포 내 pH를 정확하게 측정할 수 있다.
도 1 내지 도 3은 유방암 세포주인 MDA-MB-231에서 세포 수와 비례하여 BCECF-AM을 처리하여 pH를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 도 1 내지 도 3에서 측정된 결과에 대한 통계값을 나타낸 것이다.
도 5 내지 도 7은 한국인 대장암 세포주인 SNU81에서 세포 수와 비례하여 BCECF-AM을 처리하여 pH를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 도 5 내지 도 7에서 측정된 결과에 대한 통계값을 나타낸 것이다.
도 4는 도 1 내지 도 3에서 측정된 결과에 대한 통계값을 나타낸 것이다.
도 5 내지 도 7은 한국인 대장암 세포주인 SNU81에서 세포 수와 비례하여 BCECF-AM을 처리하여 pH를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 도 5 내지 도 7에서 측정된 결과에 대한 통계값을 나타낸 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
일 관점에서, 본 발명은 세포 내 pH 측정의 정확도를 개선하기 위한 방법으로서, pH 측정 대상 세포에 세포 내에서 형광을 나타내는 염료를 처리하는 단계를 포함하고, 상기 염료의 농도는 pH 측정 대상 세포 수를 계수하여 세포 수 기준으로 조절하는 것을 특징으로 하는 방법에 관한 것이다.
상기 세포 내에서 형광을 나타내는 염료는 예를 들어 세포막을 투과하여, 세포 내에서 형광 물질로 전환되어 형광을 나타내는 물질일 수 있다. 형광 물질은 물리적 조건 변화, 화학적 처리에 의해 빛을 발생하는 물질로, 본 발명에 따르면, 세포 내 pH 변화에 따라 발생하는 빛의 강도가 달라질 수 있다.
상기 세포 내에서 형광을 나타내는 염료는 예를 들어, BCECF-AM(2',7'-bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein acetoxymethyl ester), 칼세인-AM(Calcein-acetoxymethyl ester), 푸라-2-AM(Fura-2-acetoxymethyl ester), 인도-1-AM(Indo-1-acetoxymethyl ester), 인도-5F-AM(Indo-5F-acetoxymethyl ester), 퀸-2-AM(Quin-2-acetoxymethyl ester), 5-CFDA-AM(5-Carboxyfluorescein Diacetate-acetoxymethyl ester), BAPTA-AM(bis(2-aminophenoxy)ethane tetraacetic acid-acetoxymethyl ester), 5,5'- 디플루오로 BAPTA-AM(5,5'-difluoro BAPTA-AM), 5,5'-디메틸 BAPTA-AM(5,5'-dimethyl BAPTA-AM), 5,5'-디니트로 BAPTA-AM(5,5'-dinitro BAPTA-AM), 디히드로칼세인-AM(dihydrocalcein-acetoxymethyl ester), EGTA-AM(EGTA-acetoxymethyl ester), 플루오-3-AM(Fluo-3-acetoxymethyl ester), 플루오-8-AM(Fluo-8-acetoxymethyl ester), 로드-2-AM(Rhod-2-acetoxymethyl ester), 로드-4-AM(Rhod-2-acetoxymethyl ester), 로드-5F-AM(Rhod-5F-acetoxymethyl ester), 로드-5N-AM(Rhod-5N-acetoxymethyl ester), X-로드-1-AM(X-Rhod-1-acetoxymethyl ester) 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기 세포 내에서 형광을 나타내는 염료로 BCECF-AM을 사용하였다.
상기 세포 내에서 형광 물질로 전환은 세포 내 효소에 의해 수행될 수 있으며, 예를 들어 효소는 에스터라제일 수 있다.
BCECF-AM을 측정하고자 하는 대상 세포에 처리하면, BCECF-AM이 세포막을 투과하여 확산에 의해 세포 내로 유입되고, 세포 내 효소 예를 들어, 에스터라제에 의해 BCECF 및 AM으로 분리되면서 세포 내 pH에 따라 BCECF에 의해 형광의 양이 달라지게 되며, 형광의 양은 pH와 비례하는데 이를 통해 세포내 pH를 측정할 수 있다.
본 발명에 따르면 일정한 양의 BCECF-AM을 처리하는 경우 동일한 pH에서도 세포 개수에 따라서 BCECF의 형광값이 달리 측정되는 문제가 있었던 종래의 세포 내 pH 측정방법의 문제점을 개선할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 염료의 농도는 세포 수에 비례하여 증가하도록 세포에 처리할 수 있다. 본 출원의 발명자들은 세포 수에 비례하여 pH 측정 대상 세포에 처리되는 염료의 농도를 조절함으로써, 이를 통해 염료가 처리되는 세포 수에 무관하게 정확한 pH를 측정할 수 있음을 확인하였다.
구체적으로, 세포내 pH 측정을 위해 처리되는 염료의 농도(양)은 다음 식에 따라 결정될 수 있다.
적용될 염료 농도(양) = 기준 염료 농도(양) X (측정 대상 세포 개수/기준 세포 개수)
상기 식에서 기준 세포 개수는 pH 측정 직전에 세포가 디쉬나 플레이트의 60 내지 70%가 되도록 시딩 (seeding)된 경우를 기준으로 계수된 세포 수를 의미한다.
상기 기준 염료 농도(양)은 염료가 포화되지 않는 농도로 정하는 것이 바람직하다. 기준 염료 농도(양)는 임의의 양 예를 들어, BCECF-AM 0.5mg/세포배양액L을 기준으로 유세포 분석법을 통해 형광값을 측정하여 도출할 수 있으며, 복수의 농도로 처리하였을 때 형광값을 나타내는 피크가 좌측으로 shift 된 경우 염료의 양을 늘리고, 형광값을 나타내는 피크가 우측으로 shift 된 경우 염료의 양을 줄여, 형광값을 나타내는 피크의 평균값과 중간값의 비율이 1일 때의 농도를 염료의 양을 기준 염료 농도(양)으로 할 수 있다.
이후, 측정 대상 세포 수를 계수하고, 기준 세포 개수에 대한 측정 대상 세포 개수의 비율을 정한 다음 기준 염료 농도(양)를 곱하여, 적용될 염료 농도(양)를 결정할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 염료는 1.5 X 105 내지 6.0 X 105 세포수 당 1mg/ml의 농도를 기준으로, 계수된 세포 수에 비례하여 계산된 농도로 처리될 수 있다. MDA-MB-231 세포에서의 pH 측정시 6.0 X 105 세포수 당 BCECF-AM 농도가 1mg/ml임을 기준으로, pH 측정 대상 세포 수가 3.0 X 105인 경우 0.5mg/ml의 농도로 BCECF-AM 처리하면, 세포 수에 무관하게 정확한 pH를 측정할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, SNU81 세포에서의 pH 측정시 1.5 X 105 세포수 당 BCECF-AM 농도가 1mg/ml임을 기준으로, pH 측정 대상 세포 수가 3 X 105인 경우 2mg/ml의 농도로 BCECF-AM 처리하면, 세포 수에 무관하게 정확한 pH를 측정할 수 있음을 확인하였다.
상기 염료는 세포 수에 비례 예를 들어, 정비례하여 계산된 농도로 세포에 처리할 수 있다. 본 발명에 따른 일 실시예에서, 1.5 X 105 내지 6.0 X 105 세포수 당 1mg/ml의 염료 농도를 기준으로 세포 수가 2배로 증가하는 경우 처리되는 염료의 농도 역시 2배로 증가하여 처리하였으며, 그 결과 염료가 처리되는 세포 수에 무관하게 정확한 pH를 측정할 수 있음을 확인하였다.
상기 세포는 예를 들어, 유방암 세포주 MDA-MB-231 세포 또는 한국인 대장암 세포주 SNU81 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
[실시예]
이하, 본 발명을 구체적인 실시예에 의해 보다 상세히 설명하고자 한다. 하지만, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 아이디어와 범위 내에서 여러 가지 변형 또는 수정될 수 있음은 통상의 기술자에게는 자명한 것이다.
실시예 1: 유방암 세포주에서 pH 측정
BCECF-AM (2',7'-Bis-(2-Carboxyethyl)-5-(and-6)-Carboxyfluorescein, Acetoxymethyl Ester) 는 가장 널리 사용되는 세포 내 pH probe 이다. BCECF-AM은 세포 안으로 쉽게 침투될 수 있으며 세포 내로 침투 후에는 세포질에 있는 에스터 가수분해효소의 작용으로 AM을 잘라 BCECF는 중성 pH에서 4내지 5개의 음전하를 가지고 고도의 수용성으로써 세포 밖으로 배출되기 힘들다. 이 원리를 토대로 BCECF 은 초록색 형광을 나타내는 pH 의존성 측정 dye이다. Excitation 과 Emission 파장은 각각 535 nm 와 490 nm을 사용했다.
BCECF-AM은 세포 개수에 따라 포화 정도의 차이를 보여 예비실험을 진행하여 MDA-MB-231 세포에서는 0.5 mg/L, SNU-81 세포에서는 0.125 mg/L 로 농도를 선택하였으며, 처리 시간은 1시간으로 하였다.
서로 다른 개수의 세포 그룹별로 pH를 측정할 때, 세포당 BCECF-AM의 흡수량의 차이가 발생하게 되어 형광 밀도에 따른 pH 측정값이 정확하지 않다.
따라서 세포내 BCECF-AM의 흡수량을 맞추기 위해 그룹을 나눠서 진행하였다. 세포 개수에 따라 BCECF-AM의 정확도를 평가하기 위해서 다양한 세포 개수로 분주 후 BCECF-AM의 형광 발현을 비교하는 방법과 세포 개수에 따라 BCECF-AM 농도를 조절하며 형광 발현을 비교하는 방법을 이용했다. 한 그룹은 30만, 60만, 120만, 180만, 240만개의 세포 수에 관계 없이 BCECF-AM 양을 동일하게 처리하고, 다른 그룹은 세포 별로 BCECF-AM의 농도를 차등하게 처리하여 차후 약물 처리에 따라 세포 개수 변화에 의한 BCECF-AM 흡수량의 차이를 대비하였다.
10% FBS를 섞은 RPMI1640 성장배지에서 자라고 있는 MDA-MB-231 세포를 PBS (Phosphate buffered saline, 2.7 mM KCl, 1.5 mM KH2PO4, 1.8 mM Na2HPO4, pH 7.4)를 이용하여 세척 후 트립신 처리에 의해 세포를 단세포화해서 수확한 뒤, hematocytometer를 이용해 생존 세포 개수를 세어 한 그룹은 30만, 60만, 120만, 180만, 240만개의 세포를 모두 2 ml 의 양으로 세포 배양용 6 well 혹은 24 well 페트리디쉬로 FBS가 첨가 되지 않은 RPMI1640 유지배지로 분주하였고, 다른 그룹은 30만, 60만, 120만, 180만, 240만개의 세포를 60만개 세포/배지 ml 의 양으로 분주하였다. 이때 BCECF-AM의 농도는 0.5mg/배지L로 37℃ 에서 1시간 처리하였다. 그 후 PBS를 이용하여 세척 과정을 2회 진행하고 60만세포당 1ml의 PBS로 분주하였다. 이 과정은 모두 4℃ (on ice)를 유지하도록 하였다. 준비한 샘플은 유세포 분석법 (Flowcytometry; BD AccuriTM C6 plus)를 이용해서 형광값을 측정하여 세포내 pH를 알아보았다.
BD AccuriTM C6 plus 소프트웨어를 통해 FSC/SSC 그래프로 세포의 크기와 모양을 토대로 살아있는 세포를 선별하여 FL-1 채널을 통해 형광값을 획득한다. FL-1 채널의 히스토그램에서 중간값을 비교하였다.
도 1의 결과값을 하나의 예로 들어 설명하면 BCECF-AM을 세포 개수에 관계없이 2ml 처리할 경우 동일한 pH의 세포임에도 불구하고 유세포분석 결과 (A02) 세포 그룹별 그래프가 일정하게 모여있지 않고 세포 개수가 적어질수록 우측으로 치우치는 현상을 볼 수 있다 (30만개 세포에서 맨 우측 보라색 그래프). 또한 표에서 mean 혹은 median FL1-A값을 보면 꺾은선 그래프의 검정색 양상과 동일하게 나타남을 확인할 수 있다. 이는 세포 개수가 적어질수록 세포 1개당 차지하는 BCECF-AM의 양이 많아진다는 것을 의미한다. 그러나, 세포 개수에 따라 BCECF-AM의 양을 달리 처리할 경우 유세포분석 결과 (B01)에서 모든 그룹의 그래프가 동일하게 겹쳐있는 것을 확인할 수 있었다. 표에서도 mean과 median FL1-A 값이 거의 동일하여 꺾은선그래프의 빨간색 양상처럼 일정하게 유지됨을 확인할 수 있다.
도 4의 결과는 위 실험법을 독립적으로 세 번 수행하여 평균값을 구한 그래프로 실험을 반복적으로 진행해도 값에 큰 차이가 없이 안정적인 결과를 얻을 수 있음을 알 수 있다.
실시예 2: 대장암 세포주에서 pH 측정
SNU-81 세포의 경우 10% FBS가 포함된 RPMI1640 성장배지에서 자라고 있는 SNU-81 세포를 PBS (2.7 mM KCl, 1.5 mM KH2PO4, 1.8 mM Na2HPO4, pH 7.4)를 이용하여 세척 후 트립신 처리에 의해 세포를 단세포화해서 수확한 뒤, hematocytometer를 이용해 생존 세포 개수를 세어 한 그룹은 30만, 60만, 120만, 180만, 240만 수의 세포를 모두 8 ml 의 볼륨으로 세포 배양용 60 mm 혹은 100 mm 페트리디쉬로 FBS가 첨가 되지 않은 RPMI1640 유지배지로 분주하고, 다른 그룹은 30만, 60만, 120만, 180만, 240만 수의 세포를 60만개 세포/배지 ml의 볼륨으로 분주한다. 이때 BCECF-AM의 농도는 0.5 mg/배지 L로 37℃ 에서 1시간 처리한다. 그 후 PBS를 이용하여 세척 과정을 2회 진행하였고 60만세포당 1 ml의 PBS로 분주 후 분석방법은 실시예 1과 동일하게 진행하였다.
그 결과 역시, 실시예 1에서와 동일하였다. 세포 개수에 따라 BCECF-AM의 양을 달리 처리할 경우 유세포분석 결과 (B01)에서 모든 그룹의 그래프가 동일하게 겹쳐있는 것을 확인할 수 있었다. 표에서도 mean과 median FL1-A 값이 거의 동일하여 꺾은선그래프의 빨간색 양상처럼 일정하게 유지됨을 확인할 수 있다.
도 8의 결과는 위의 실험법을 독립적으로 세 번 수행하여 평균값을 구한 그래프로 실험을 반복적으로 진행해도 값에 큰 차이가 없이 안정적인 결과를 얻을 수 있음을 알 수 있다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (5)
- 세포 내 pH 측정의 정확도를 개선하기 위한 방법으로서,
pH 측정 대상 세포에 세포 내에서 형광을 나타내는 염료를 처리하는 단계를 포함하고,
상기 염료의 농도는 pH 측정 대상 세포 수를 계수하여 세포 수 기준으로 조절하고, 상기 염료의 농도는 기준 염료 농도(양) X (측정 대상 세포 개수/기준 세포 개수)의 식에 따라 결정되고,
상기 기준 염료 농도(양)은 형광값을 나타내는 피크의 평균값과 중간값의 비율이 1일 때의 농도이며,
상기 기준 세포 개수는 pH 측정 직전에 세포가 디쉬나 플레이트의 60 내지 70%가 되도록 시딩 (seeding)된 경우를 기준으로 계수된 세포 수인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 세포 내에서 형광을 나타내는 염료는 BCECF-AM인 것을 특징으로 하는 방법.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 염료는 1.5 X 105 내지 6.0 X 105 세포수 당 1mg/ml의 농도를 기준으로, 계수된 측정 대상 세포 수에 비례하여 계산된 농도로 처리되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 염료1.5 X 105 내지 6.0 X 105 세포수 당 1mg/ml의 농도를 기준으로, 계수된 측정 대상 세포 수에 정비례하여 계산된 농도로 처리되는 것을 특징으로 하는 방법.
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| JP2015517656A (ja) * | 2012-05-02 | 2015-06-22 | チャールズ リバー ラボラトリーズ， インコーポレイテッド | 細胞サンプル中の生存細胞を検出する方法 |
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2018
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