KR102182685B1

KR102182685B1 - 백모 완화, 탈모 및 모발굵기 개선용 헤어 화장료 조성물과 이의 제조방법

Info

Publication number: KR102182685B1
Application number: KR1020180169534A
Authority: KR
Inventors: 권성범; 조자용
Original assignee: (주)멋있는생활; 전남도립대학교산학협력단
Priority date: 2018-12-26
Filing date: 2018-12-26
Publication date: 2020-12-08
Also published as: KR20200079878A

Abstract

본 발명은 백모 완화, 탈모 및 모발굵기 개선용 헤어 화장료 조성물백과 이의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 모발의 색상을 어둡게 변화시켜 백모를 완화시킴과 동시에 탈모와 모발 굵기를 개선할 수 있는 헤어 화장료 조성물과 이의 제조방법에 관한 것이다.

Description

백모 완화, 탈모 및 모발굵기 개선용 헤어 화장료 조성물과 이의 제조방법{cosmetic composition for hair and manufacturing method thereof}

본 발명은 백모 완화, 탈모 및 모발굵기 개선용 헤어 화장료 조성물과 이의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 모발의 색상을 어둡게 변화시켜 백모를 완화시킴과 동시에 탈모와 모발 굵기를 개선할 수 있는 백모 완화, 탈모 및 모발굵기 개선용 헤어 화장료 조성물과 이의 제조방법에 관한 것이다.

모발은 아름다운 상태의 외모를 표현하는 수단이며, 젊고 건강한 상태를 보여주는 척도이기도 하다. 때문에 모발의 상태를 더욱 젊고, 건강하게 표현하고자 하는 사회적 관심이 증가하고 있다.

모발의 건강과 아름다운 외모의 표현은 탈모 및 흰머리의 발생이 적고, 양모의 상태가 우수한 것과 깊은 연관성이 있다. 또한, 모발은 일정한 생장주기를 가지고, 발생과 탈락의 과정을 반복하기 때문에 모발용 화장품을 통해 꾸준히 관리하는 것이 매우 중요하다.

이와 같이 생장주기를 늘려 모발의 건강함을 유지하고, 머리카락의 탈락을 방지하는 것을 양모라고 하며, 양모의 상태는 모발이 광택을 띠고, 굵기가 적절하며, 숱의 상태가 풍성할수록 좋은 상태로 평가된다.

탈모는 모발이 존재할 것으로 기대되는 부위에 모발이 없거나 숱이 부족한 상태를 말하는 것으로 외모와 직접적으로 연결되며, 미용상의 중요도가 매우 높다. 탈모의 상태는 빠지는 머리카락의 개수와 새로 나는 머리카락의 개수를 통해 확인 할 수 있다.

백모, 즉 흰머리는 모든 인종에게 공통적으로 나타나는 모발세포의 노화상태로, 개개인마다 그 발생 시기 및 정도가 매우 다르다. 통상 흰머리는 모발의 노화 또는 특정요인에 의해 멜라닌 세포 수가 감소하거나, 색소 합성에 필요한 효소의 활동성이 감소하고, 멜라닌 세포 합성능력이 떨어지는 경우에 발생한다. 특히, 새치는 젊은 사람들에게 나타나는 흰머리를 속칭하는 것으로, 주로 스트레스와 같은 요인에 의해 발생한다. 이러한 새치는 노화에 의한 흰머리가 발생하지 않는 나이대의 사람들에게 발생하여, 외모에 대한 콤플렉스를 가중시키는 문제점이 있다.

최근에는 환경오염의 심화와 현대인의 스트레스 증가로 인해 탈모 및 흰머리와 같은 문제들이 많이 발생하고 있다. 또한, 잦은 염색과 펌 등의 헤어스타일링으로 우수한 수준의 양모가 어렵다. 때문에, 탈모 및 흰머리를 개선하고, 발모 및 양모의 상태를 높이기 위한 제품의 수요가 증가하고 있다.

그러나, 흰머리의 발생을 억제하거나 이를 다시 원래의 색상으로 되돌리는 제품의 개발은 아직 미흡한 실정이다. 예를 들면, 흰머리의 해결을 위해 모발을 팽윤 및 변성시키고 염료를 착색시키는 염모제, 산화발색제, 헤어매니큐어(유색 코팅제) 등의 제품이 널리 사용되고 있다. 이러한 제품들은 과산화수소, 암모니아, 파라페닐아민, 디아미노토루엔스, 디아미노아이솔 등의 강한 산성 또는 강한 염기성을 갖는 성분들을 포함하기 때문에, 피부에 자극을 일으켜 모발의 손상 및 탈모로 이어지는 문제점이 있다. 또한, 상기의 유자극 성분들이 비교적 적게 포함된 모발용 착색제, 헤어매니큐어 등은 발색의 효과가 매우 일시적이며, 영구염색제, 영구염모제 등은 새로 성장하는 모발의 뿌리는 착색할 수 없어 지속성이 떨어지는 문제점이 있다.

이에 따라 부작용은 최소화하면서도 흰머리를 원래의 색상으로 복원하고, 새로운 모발의 생성을 촉진하며, 동시에 탈모방지 및 양모의 효과를 모두 극대화할 수 있는 제품의 개발이 요구되고 있다. 또한, 피부자극, 세포 독성 등의 위해 요소가 적어 제한 없이 지속적으로 사용할 수 있는 특성도 요구되고 있다.

1. 대한민국 특허공개 제10-2010-0110407호: 탈모 방지 및 발모 촉진효과를 갖는 복합 생약 추출물을 함유하는 화장료 조성물 2. 대한민국 특허공개 제10-2006-0010035호: 한약재를 이용한 발모제 조성물

본 발명은 상기의 문제점을 개선하고자 창출된 것으로서, 모발의 색상을 어둡게 변화시켜 백모를 완화시킴과 동시에 탈모와 모발 굵기를 개선할 수 있는 헤어 화장료 조성물과 이의 제조방법을 제공하는 데 그 목적이 있다.

상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명의 백모 완화, 탈모 및 모발굵기 개선용 헤어 화장료 조성물은 동백나무씨오일과 벌왕두추출물을 함유한다.

그리고 씨실트추출물, 풀러린, 토르마린, 황칠나무추출물, 대나무 추출물, 함초 추출물, 허브수 중 적어도 어느 하나를 더 함유한다.

또한, 헤어 화장료 조성물은 헤어 세럼인 것을 특징으로 한다.

그리고 상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명의 백모 완화, 탈모 및 모발굵기 개선용 헤어 화장료 조성물의 제조방법은 벌왕두 추출물을 추출하는 추출단계와; 동백나무씨오일과 상기 벌왕두 추출물을 조성물 총 중량에 0.01 내지 10중량%로 첨가하여 제형화시키는 제형단계;를 포함한다.

본 발명은 백모완화, 탈모완화, 모발굵기 개선에 효과가 있는 것으로 실험적으로 입증되었다. 또한, 본 발명은 사용기간 동안 특별한 이상반응이 관찰되지 않아 안전한 것으로 확인되었다.

따라서 본 발명은 백모완화, 탈모완화, 모발굵기 개선에 유효한 헤어 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

도 1은 모발의 색상의 변화를 측정한 결과를 나타낸 그래프이고,
도 2는 모발의 색상의 변화를 통해 백모 완화율을 계산하여 나타낸 그래프이고,
도 3은 모발의 수를 측정한 결과를 나타낸 그래프이고,
도 4는 모발 수를 통해 탈모 개선율을 계산하여 나타낸 그래프이고,
도 5는 모발의 직경을 측정한 결과를 나타낸 그래프이고,
도 6은 모발 직경을 통해 모발굵기 개선율을 계산하여 나타낸 그래프이고,
도 7 및 도 8은 세포내 독성 실험결과를 나타낸 그래프이고,
도 9는 세포내 Tyrosinase 활성 실험결과를 나타낸 그래프이고,
도 10은 세포내 멜라닌 생합성 실험결과를 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시 예에 따른 백모 완화, 탈모 및 모발굵기 개선용 헤어 화장료 조성물과 이의 제조방법에 대하여 구체적으로 설명한다.

본 발명의 일 예에 따른 헤어 화장료 조성물은 동백나무씨오일과 벌왕두추출물을 함유한다.

동백나무씨오일은 동백나무의 씨를 압착하여 추출한 기름을 의미한다. 이러한 동백나무씨오일은 상업화된 제품을 구입하여 이용하거나, 동백나무의 씨로부터 직접 추출하여 이용할 수 있다.

동백나무씨오일은 올레인산을 많이 함유하고 있어 피부를 진정시키는 효과가 있다. 또한, 동백나무씨오일은 피부건조를 방지하고 가려움증을 완화시킨다. 또한, 동백나무씨오일은 탈모는 완화시키는 효과를 갖는다.

벌왕두추출물은 벌왕두의 잎, 꽃, 뿌리, 줄기, 가지, 껍질 및 종자 등과 같은 다양한 기관 또는 부분으로부터 추출할 수 있다.

벌왕두(Vicia pallida var. pratensis NAKAI)는 덩굴성 여러해살이풀이다.

발왕두추출물은 벌왕두에 추출용매를 가해 다양한 방법으로 추출이 가능하다. 가령, 추출용매를 가하여 열수추출, 냉침 또는 온침 추출할 수 있다. 이 경우 벌왕두에 대하여 추출용매를 중량비로 2 내지 20배를 가하여 혼합한 후 10 내지 150℃에서 1 내지 24시간 동안 추출할 수 있다.

여기서 추출용매로 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 다가 알코올 또는 이들의 혼합물로부터 선택된 적어도 어느 하나를 이용할 수 있다. 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올로 메탄올, 에탄올 등을 이용할 수 있고, 다가 알코올로 부틸렌글리콜 및 프로필렌글리콜, 펜틸렌글리콜 등을 이용할 수 있다. 그리고 혼합물로는 물 및 저급 알코올의 혼합물, 물 및 다가 알코올의 혼합물, 저급 알코올 및 다가 알코올의 혼합물, 또는 물 및 저급알코올 및 다가 알코올의 혼합물을 이용할 수 있다.

벌왕두추출물은 모발의 색상을 어둡게 변화시켜 백모를 완화시키는데 효과적이다. 또한, 벌왕두추출물은 탈모를 방지하고 모발의 굵기를 개선시킨다.

본 발명의 헤어 화장료 조성물은 동백나무씨오일과 벌왕두추출물에 각종 공지의 성분 등을 추가하여 제형화시킬 수 있다. 제형의 종류로 화장수, 로션, 크림, 에센스, 세럼, 파우더 중에서 선택된 어느 하나를 들 수 있다. 특히, 바람직한 제형은 헤어 세럼이다.

본 발명은 동백나무씨오일과 벌왕두추출물을 조성물 총 중량에 대하여 0.01 내지 10중량%로 함유할 수 있다. 함량이 0.01중량% 미만이면 효과가 미미하고, 10중량%를 초과하게 되면 함량에 비해 상승된 효과를 가지기 어렵다.

본 발명의 헤어 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔, 팩인 경우 공지의 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 셀롤로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 헤어 화장료 조성물의 제형이 파우더인 경우 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 헤어 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 또는 소르비탄의 비방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 헤어 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화이소스테아릴알코올, 폴리옥시에틸렌 스르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀롤로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라가칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 헤어 화장료 조성물의 제형이 계면활성제 함유 세정제인 경우 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

이 외에도 본 발명의 헤어 화장료 조성물은 통상적인 공지된 성분인 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 천연 향료 등이 이용할 수 있으며, 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있고, 사용 대상에 따라 적절하게 선택될 수 있다.

한편, 본 발명은 동백나무씨오일과 벌왕두추출물 외에 씨실트추출물, 풀러린, 토르마린, 황칠나무추출물, 대나무 추출물, 함초 추출물, 허브수 중 적어도 어느 하나를 더 함유할 수 있다.

씨실트추출물은 씨실트(sea silt) 즉, 바다에서 채취한 머드로부터 추출한 추출물이다. 이러한 씨실트추출물은 상업화된 제품을 구입하여 이용하거나, 씨실트 분말로부터 추출하여 이용할 수 있다. 가령, 씨실트 분말을 정제수와 1:10의 중량비로 혼합하여 1 내지 3시간 동안 교반한 다음 실온에서 24시간 정치시킨 후 여과지로 여과하여 씨실트추출물을 얻을 수 있다.

씨실트추출물은 피지를 흡착하고 노폐물 제거를 도와 청정한 피부를 유지하는데 도움을 주고, 모발에 영양과 컨디셔닝을 부여한다.

풀러린(fullerenes)은 분말 또는 추출물의 형태로 이용할 수 있다. 풀러린 추출물은 풀러린 분말을 정제수와 혼합한 후 24시간 정치시킨 다음 여과지로 여과하여 얻을 수 있다.

토르마린(Tourmaline)은 분말 또는 추출물의 형태로 이용할 수 있다. 토르마린추출물은 토르마린 분말을 정제수와 혼합한 후 24시간 정치시킨 다음 여과지로 여과하여 얻을 수 있다.

황칠나무추출물은 황칠나무의 잎 또는 가지에 추출용매를 가해 추출할 수 있다. 추출용매를 가하여 열수추출, 냉침 또는 온침 추출할 수 있다. 이 경우 황칠나무에 대하여 추출용매를 중량비로 2 내지 20배를 가하여 혼합한 후 10 내지 150℃에서 1 내지 24시간 동안 추출할 수 있다.

대나무 추출물은 대나무의 잎 또는 가지, 줄기로부터 추출한 추출물로서, 상술한 황칠추출물의 추출방법과 동일한 방법으로 추출할 수 있다.

함초 추출물은 함초로부터 추출한 추출물로서, 상술한 황칠추출물의 추출방법과 동일한 방법으로 추출할 수 있다.

허브수는 로즈마리, 라벤더, 캐모마일, 레몬그라스 등과 같은 허브로부터 추출한 추출액을 의미한다. 허브수로 상업화된 제품을 구입하여 이용하거나, 초임계유체 추출법으로 추출하여 이용할 수 있다. 초임계 유체란 초임계 대상 물질 즉, 이산화탄소, 물, 알코올, 헬륨 등의 물질에 임계 압력, 임계온도를 가하여 고온 고압 상태하의 특수 상황에서 유체가 된 것을 의미한다. 초임계 유체는 액체의 밀도와 비슷한 값을 가지며, 점도는 기체에 가까우며 그 확산 계수는 액체보다 약 100배 정도의 큰 값을 가지게 된다. 그러므로, 이러한 초임계 유체를 추출 대상에 침투시켜 추출을 원하는 내용물과 반응시키면 고순도의 내용물을 추출할 수 있다.

초임계 추출의 일 예로 35 내지 100℃ 및 100 내지 500기압에서 이산화탄소를 이용하여 수행되며, 보다 바람직하게는 50 내지 70℃ 및 200 내지 400기압에서, 이산화탄소를 이용하여 수행할 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예를 통하여 구체적으로 설명한다. 이는 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 권리 범위를 하기의 실시 예로 한정하는 것은 아니다.

(실시예)

벌왕두의 잎에 물을 중량비로 10배를 가한 후 90℃에서 4시간 동안 추출한 후 여과하여 벌왕두추출물을 수득하였다.

동백나무씨오일 3.0중량%, 벌왕두추출물 5.0중량%, 글리세린 6.0중량%, 세테아릴알코올 2.0중량%, 1,2-헥산다이올 3.0중량%, 포타슘하이드록사이드 3.0중량%, 카보머 1.0 중량%, 세테아릴글루코사이드 1.5중량%, 라벤더오일 0.05중량%, 다이소듐이디티에이 2.5중량%, 로즈마리수 0.003중량%, 정제수(잔량)를 혼합하여 헤어 세럼 제형의 시험시료를 제조하였다.

(비교예)

동백나무씨오일 3.0중량%, 글리세린 6.0중량%, 세테아릴알코올 2.0중량%, 1,2-헥산다이올 3.0중량%, 포타슘하이드록사이드 3.0중량%, 카보머 1.0 중량%, 세테아릴글루코사이드 1.5중량%, 라벤더오일 0.05중량%, 다이소듐이디티에이 2.5중량%, 로즈마리수 0.003중량%, 정제수(잔량)를 혼합하여 헤어 세럼 제형의 대조시료를 제조하였다.

<백모완화시험>

1. 피험자 선정

선정기준에 부합하고 제외기준에 해당되지 않는 피험자 22명 선정(평균연령 50세, 남 2명, 여 20명)

2. 도포방법

매일 1회 두피 및 모발 부위에 피험자 자가 도포.

3. 평가

a. 기기평가: chromameter를 이용한 모발 색상(모발 밝기) 측정

b. 피부과 전문의에 의한 안전성 평가

4. 시험결과

(1)모발색상

시험 전과 시험 후 6주차 및 12주차에 모발 색상을 측정하여 표 1 및 도 1, 도 2에 나타내었다. 백모완화율은 하기와 같이 계산하였다.

백모완화율(%)={(시료사용 전 측정치-시료사용 후 측정치)/시료사용 전 측정치}×100

구분		모발색상 (모발밝기, L-value)	백모완화율
시험군	시험전	20.95	-
	6주차	19.87	5.15%
	12주차	19.24	8.18%
대조군	시험전	20.65	-
	6주차	20.63	0.09%
	12주차	20.72	-0.35%

상기 표 1의 결과를 참조하면, 총 12주 동안 시험시료를 사용한 시험부위는 사용 6주 후부터 시험 전에 비해 통계적으로 유의한 수준으로 모발 색상이 어둡게 변하였다. 반면에 대조시료를 사용한 대조부위는 시험전과 비교해 색상변화를 확인할 수 없었다.

(2)안정성평가

시험시료와 대조시료를 사용한 모든 피험자들에게 시험기간 중 주관적 자극감(가려움, 바늘로찌르는느낌, 화끈거림, 따끔거림, 뻣뻣함, 기타 이상감각) 및 객과적 자극 반응(홍반, 부종, 구진, 기타 이상증)과 같은 특별한 이상반응을 관찰할 수 없었다.

<탈모시험>

1. 피험자 선정

2. 도포방법

매일 1회 두피 및 모발 부위에 피험자 자가 도포.

3. 평가

a. 기기평가: phototrichogram을 이용한 모발 수 분석

b. 피부과 전문의에 의한 안전성 평가

4. 시험결과

(1)모발 수 분석

시험 전과 시험 후 6주차 및 12주차에 1cm²당 모발 수를 측정하여 표 2 및 도 3, 도 4에 나타내었다.

구분	0주	6주차	12주차
시험군	82.55±20.78	88.45±19.39	92.36±15.44
대조군	89.27±21.00	78.55±18.07	85.27±12.56

상기 표 2의 결과를 참조하면, 시험시료를 사용한 시험 부위는 평가지표인 모발수(N/cm²)가 시험 전에 비해 통계적으로 유의한 수준으로 증가하였으며, 대조군에서는 통계적으로 유의한 수준의 변화가 나타나지 않았다.

(2)안정성평가

<모발굵기시험>

1. 피험자 선정

2. 도포방법

매일 1회 두피 및 모발 부위에 피험자 자가 도포.

3. 평가

a. 기기평가: phototrichogram을 이용한 모발 직경 분석

b. 피부과 전문의에 의한 안전성 평가

4. 시험결과

(1)모발 직경 분석

시험 전과 시험 후 6주차 및 12주차에 모발의 직경(㎛)을 측정하여 표 3 및 도 5, 도 6에 나타내었다.

구분		모발직경(㎛)	모발굵기 개선율
시험군	시험전	60.49	-
	6주차	69.09	14.22%
	12주차	71.47	18.15%
대조군	시험전	76.18	-
	6주차	69.20	-9.16%
	12주차	69.95	-8.19%

상기 표 3의 결과를 참조하면, 총 12주 동안 시험시료를 사용한 시험부위는 사용 6주 후부터 시험 전에 비해 통계적으로 유의한 수준으로 모발 직경이 증가하였다. 반면에 대조시료를 사용한 대조부위는 사용 6주 후부터 모발 직경이 감소하였다.

(2)안정성평가

상술한 시험결과들을 통해 본 발명은 백모완화, 탈모완화, 모발굵기 개선에 효과가 있는 것으로 실험적으로 입증되었다. 또한, 본 발명은 사용기간 동안 특별한 이상반응이 관찰되지 않아 안전한 것으로 확인되었다. 따라서 본 발명은 백모완화, 탈모완화, 모발굵기 개선에 유효한 헤어 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

<세포내 티로시나아제 억제활성 및 멜라민 생합성 억제효능 평가>

인종별로 피부색이 다른 이유는 주로 피부에 존재하는 멜라닌(Melanin) 색소의 차이에 기인한 것으로 아프리카의 흑인들은 하루 종일 햇빛을 쬐여도 화상을 입지 않으나 백인들은 심한 화상을 입게 되는 원인이 되기도 한다. 멜라닌이 갖는 기능은 매우 다양하여 산화환원 반응에 있어 전자를 주거나 받는 역할을 하고, 빛을 흡수하여 열에너지로 변환시키는 기능이 있어 자외선에 의한 단백질이나 핵산의 손상을 방지하여 세포를 보호하며 중금속이온 등의 강한 이온성 물질과 결합하여 킬레이트로도 작용하고 자유라디칼과 결합하는 항산화제로도 작용한다.

한편, 멜라닌은 표피의 기저층에 위치한 피부세포의 한 종류인 흑화세포(Melanocyte)에 의해 합성되어 다른 피부세포인 각질형성세포(Keratinocyte)로 이동되어 이 세포가 각질형성과정을 통해 피부 밖으로 나와 피부로부터 분리될 때까지 지속적으로 존재하여 피부색을 결정하게 되는 요인이 된다. 흑화세포는 성숙되면서 돌기를 형성하게 되고 이 돌기를 통해 주변의 각질형성세포에 멜라닌을 전달하게 되며 피부색뿐만 아니라 머리카락등의 색깔도 결정하게 된다. 멜라닌은 검정 또는 갈색계열의 색소인 유멜라닌(eumlenin)과 붉거나 노란 계열의 색소인 페오 멜라닌(pheomelanin) 두 종류가 존재하여 이 두 색소의 다양한 조합으로 은발, 금발, 붉은색, 갈색, 및 검정색의 머리색깔을 만들게 된다.

본 실험은 멜라닌형성 세포 내 시료에 의한 멜라닌 관련 인자인 Tyrosinae의 활성과 Melanin synthesis inhibition assay(멜라닌 생합성 억제능)을 평가하기 위한 것이다.

1. 실험재료 및 방법

(1) 세포배양(MNT-1, HS27)

DMEM(Dublbecco'S Modified Eagle Medium) 1L에 FBS(fetal bovine serum) 100ml을 첨가하여 10% FBS를 사용하였으며, 100X Penicillin/Streptomycine(LONZA사)을 100배 희석한 10ml/L를 첨가 후 37℃ CO₂ 세포 배양기에서 세포주를 배양하였다. 12 well cell culture plate에 1 × 10⁶(MNT-1), 2 ×10⁶(HS27) 세포를 Seeding 배양 후 시료를 처리하였다.

(2)농도별 독성평가

시료의 서로 다른 농도별로 세포주에 처리하였다. 시간으로는 48hr 경과 후 CCK-8 assay solution을 전체 배양액 볼륨의 1/10(v/v) 50ul씩 넣은 후 37℃ CO₂ incubator에서 1~3hr 반응하였다. 처리조건은 무혈청 조건에서 진행하였다. ELISA Leader로 OD480nm에서 값을 확인하였다. 살아있는 세포의 경우 NAD-NADH 합성을 통해 CCK-8 solution과 반응하여 orange color로 변색이 되며 OD450nm에서 본 값을 읽게 된다. 죽은 세포의 경우 NAD-NADH의 양이 적게 나오며 OD450nm의 값도 적어지게 된다. 또한 negative control로 세포와 CCK-8 solution과 반응시킨 OD값과 시료 및 CCK-8 assay solution이 들어간(농도별로) OD값을 blank값으로 사용하여 실험하였다. 위 실험은 3반복 진행하였다.

Survival rate(%) = {(A sample - A blank)/(A control - A blank)}×100

실험에 사용되는 시료로 실시예의 시험시료를 이용하였다. 시료는 0.2um syringe filter로 멸균하여 세포에 농도별로 처리하였다.

알부틴(Arbutin)은 미백기능성 고시 원료로 본 실험에 양성대조군으로 사용하였다. a-MSH(Alpha melanin stimulation hormone)은 멜라닌 형성을 유도하는 호르몬으로 음성대조군으로 사용하였다. 알부틴과 a-MSH는 모두 멸균수로 녹인 후 0.2um syringe filter 후 세포에 처리하였다.

(3) MNT-1 세포내 Tyrosinase 억제활성 효능평가

① 시료의 처리농도는 독성이 없는 다양한 농도로 진행하였으며 양성대조군으로 250nM a-MSH(Melalin stimulation hormone) 사용하였으며 음성대조군으로 1㎎/㎖의 알부틴(Arbutin)을 사용하였다.

② 세포를 1 × 10⁶ 으로 세포수를 측정한 후 12 well에 seeding하였다. 80% 이상의 멜라닌세포 부착 확인 후(16시간) 무혈청배지로 바꿔주었다. 6시간 후 시료를 농도별로 처리한 후 48시간 배양하였다.

③ 배양이 끝난 후 차가운 PBS(Phosphated buffer saline) 버퍼로 2번 세척 후 protease inhibitor를 첨가한 RIPA buffer(50nM Tris-HCl, 150nM NaCl, 2% NP-40, 0.5% Sodium deo×ycholate, 0.1% SDS, pH74)를 200㎕ 처리하여 세포를 파쇄하였다.

④ 회수한 파쇄용액을 4℃ 조건에서 13,000rpm의 속도로 30분간 원심분리를 수행하여 단백질이 존재하는 상층액만 회수하였다.

⑤ 회수한 상층액은 bradford assay를 통하여 단백질을 정량하였다. 정량곡선은 BSA(2㎎/㎖)를 serial dilution하여 검량곡선을 그렸고 측정된 시료의 OD값을 넣어 단백질 함량을 계산하였다. blank로는 RIPA buffer를 측정하였다.

⑥ 200㎍/㎖의 단백질 198㎕ 와 2㎎/㎖ L-DOPA 2㎕와 반응 후 빛이 차단된 쿠킹호일로 감싸 37℃ CO₂ 인큐베이터에서 1시간 반응을 시켰다. 이후 405nm에서 흡광도값을 측정하였다.

⑦ 세포내 타이로시나제 활성율(%) = 시료군/대조군(시료 무처리)X100 으로

계산하였다.

(4) MNT-1 세포내 멜라닌 생합성 억제효능 평가

① 세포독성이 없는 농도범위에서 처리농도를 결정한다. 시료처리 농도는 세포독성이 나타나지 않는 구간을 결정하여 처리하였으며 양성대조군으로 250nM a-MSH를 처리하였다. 음성대조군으로 알부틴(Arbutin)을 1 ㎎/㎖의 농도로 처리하여 비교하였다.

② MNT-1 세포주는 멜라닌을 합성하는 세포주이다. 멜라닌 세포주를 1 X 10⁶ 으로 세포수를 측정한 후 seeding하였다. 80% 이상의 멜라닌세포가 부착된 것을 확인 후(16시간) 시료를 무혈청 상태의 배지조건에서 농도별로 48시간 처리하였다. 배양이 끝난 후 배지를 제거하고 Ice-cold PBS(Phosphated buffer saline)으로 세척하고 트립신을 처리하여 세포를 회수한 후 hematocytometer를 이용하여 세포수를 측정한 후 5,000 ~ 10,000rpm으로 10분간 원심분리 후 상등액을 제거하여 펠렛을 얻었다. 1N NaOH(10% DMSO 포함) 200㎕를 첨가 후 80℃에서 1시간 방치하여 멜라닌을 완전히 녹인 후 405nm 흡광도값을 구한 후 멜라닌 생성량을 비교하였다. 본 실험은 3반복 수행하였다.

2. 결과

(1)농도별 독성평가

시료의 농도별 독성평가를 도 7 및 도 8에 나타내었다.

도 7 및 도 8을 참조하면, 농도 의존적으로 세포내 독성이 증가하였으며 10% ~ 30% 농도에서 60% ~ 10%의 세포 생존율이 나타났다.

5% 이상의 농도구간부터 강한 독성이 나타났으며, 5% 농도구간까지 재조정하여 독성평가를 다시 수행한 결과(도 8) 5% 농도구간까지 무처리군 대비 독성이 나타나지 않았다.

(2)멜라닌형성 세포내 Tyrosinase 활성 평가

멜라닌을 형성시키는 세포(MNT-1)에 독성이 미비하거니 20% 이하로 나타나는 평가구간(~5%)의 농도로 처리하여 세포 내 Tyrosinase의 활성을 평가하였다. 본 실험은 멜라닌을 합성하는데 중요한 인자로 알려진 Tyrosinase의 활성을 평가함으로써 멜라닌 형성의 정도를 평가하는 지표로 사용되고 있다.

본 실험에서는 멜라닌형성 세포내 Tyrosianse의 활성 정도를 평가하여 백모완화에 평가지표로 보고자 하였다.

도 9를 참조하면, 멜라닌형성을 유도시키는 Tyrosinase의 활성이 농도 의존적으로 증가하는 경향을 보이고 있다. 양성대조군인 a-MSH(멜라닌형성유도호르몬)의 경우 무처리군 대비 40%의 활성을 보이고 있으며 음성대조군인 Arbutin(알부틴)은 20% 억제활성을 보이고 있다.

(3)멜라닌형성 세포내 멜라닌생합성 평가

본 실험에서는 멜라닌을 형성시키는 세포(MNT-1)에 독성이 미비하거니 20% 이하로 나타나는 평가구간(~5%)의 농도로 처리하여 세포 내 멜라닌의 함량을 평가하였다. 멜라닌은 피부색뿐만 아니라 머리카락 등의 색깔도 결정하게 된다. 멜라닌은 검정 또는 갈색계열의 색소인 유멜라닌(eumlenin)과 붉거나 노란 계열의 색소인 페오멜라닌(pheomelanin) 두 종류가 존재하여 이 두 색소의 다양한 조합으로 은발, 금발, 붉은색, 갈색, 및 검정색의 머리색깔을 만들게 된다. 본 실험에서는 머리색에 중요한 인자인 멜라닌의 생합성 평가를 통해 백모완화 효과를 in-vitro 세포평가를 통해 간접적으로 확인하고자 하였다.

멜라닌함량을 평가하기 위해 멜라닌 지표성분(Sigma사) 멜라닌 제품을 구매하여 0, 5, 10, 20, 40, 80 ug/ml의 농도구간으로 검량곡선을 이용하여 멜라닌함량을 평가하였다.

도 10을 참조하면, 농도 의존적으로 멜라닌의 함량이 증가함을 확인하였다. 양성대조군인 a-MSH(멜라닌형성유도호르몬)의 경우 무처리군 대비 멜라닌함량이 2배이상 증가하였으며 음성대조군인 Arbutin(알부틴)의 경우 멜라닌형성을 억제하는 것으로 나타났다.

상술한 실험결과를 통해 본 발명은 MNT-1(사람멜닌형성세포) 세포 내 Tyrosinase 활성과 Melanin 합성을 유도하는 것으로 확인되었다. 따라서 백모를 완화시키는데 효과가 있을 것으로 기대된다.

이상, 본 발명은 일 실시 예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 실시 예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 보호 범위는 첨부된 청구범위에 의해서만 정해져야 할 것이다.

Claims

동백나무씨오일과 벌왕두추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 백모 완화, 탈모 및 모발굵기 개선용 헤어 화장료 조성물..
제 1항에 있어서, 씨실트추출물, 풀러린, 토르마린, 황칠나무추출물, 대나무 추출물, 함초 추출물, 허브수 중 적어도 어느 하나를 더 함유하는 것을 특징으로 하는 백모 완화, 탈모 및 모발굵기 개선용 헤어 화장료 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 헤어 화장료 조성물은 헤어 세럼인 것을 특징으로 하는 백모 완화, 탈모 및 모발굵기 개선용 헤어 화장료 조성물.
벌왕두 추출물을 추출하는 추출단계와;
동백나무씨오일과 상기 벌왕두 추출물을 조성물 총 중량에 0.01 내지 10중량%로 첨가하여 제형화시키는 제형단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 백모 완화, 탈모 및 모발굵기 개선용 헤어 화장료 조성물의 제조방법.