KR102168181B1 - 인공 재조합 염색체 및 이의 이용 - Google Patents

인공 재조합 염색체 및 이의 이용 Download PDF

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박순익
강호진
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Abstract

본 명세서에 의해 개시되는 내용은 내용은 인공 재조합 염색체 (artificial recombinant chromosome) 및 이의 이용에 관한 것이다. 본 명세서에 의해 개시되는 내용에 따른 인공 재조합 염색체(artificial recombinant chromosome)는 제1 프래그먼트(a first fragment) 및 제2 프래그먼트(a second fragment)를 포함하고, 상기 제1 프래그먼트는 제1 종(a first species) 생물로부터 유래한 염색사 결합 단백질(chromatin binding protein)을 포함하고, 상기 제2 프래그먼트는 제2 종(a second species) 생물로부터 유래한 염색사 결합 단백질(chromatin binding protein)을 포함한다.

Description

인공 재조합 염색체 및 이의 이용 {artificial recombinant chromosome and the use thereof}
본 명세서에 의해 개시되는 내용은 인공 재조합 염색체 (artificial recombinant chromosome) 및 이의 이용에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 상기 인공 재조합 염색체는 제1 프래그먼트(a first fragment) 및 제2 프래그먼트(a second fragment)를 포함하고, 상기 제1 프래그먼트는 제1 종(a first species) 생물로부터 유래한 염색사 결합 단백질(chromatin binding protein)을 포함하고, 상기 제2 프래그먼트는 제2 종(a second species) 생물로부터 유래한 염색사 결합 단백질(chromatin binding protein)을 포함하는 인공 재조합 염색체에 관한 것이다.
트랜스제닉 동물은 외인성 단백질을 코딩하는 DNA를 발현하게 하거나, 내인성 유전자를 불활성화로써 유전 공학적 발전에 기여할 수 있다. 또한, 트랜스제닉 배아로부터 태어난 동물의 조직에 기여할 수 있고, 생성된 동물의 트랜스제닉 자손의 게놈에도 기여할 수 있는 능력을 갖는다.
거대 이식유전자가 세포의 게놈 내로 통합될 수 있게 하거나, 게놈에 부위 특이 변화를 도입할 수 있도록 하는데 있어서, 표적 세포와 이식유전자로서 사용된 특이 구성체에 따라 달라지는 수개의 상이한 기법에 의해 임의 단백질의 조직 특이 발현을 코딩하는 이식유전자는 트랜스제닉 유기체로 전이될 수 있다. 아울러, 불활성화된 내인성 유전자를 갖는 유기체를 영속시키는데 동일 기법이 사용될 수 있다.
트랜스제닉 동물을 제조하기 위하여, 전체 게놈(whole genome), 온전한 염색체(whole chromosome), 서브염색체 분절(subchromosomal segments) 또는 킬로베이스 범위의 DNA 단편(DNA fragments in the kilobase range)이 표적 세포로 도입될 수 있다.
상기 전체 게놈(whole genome)은 세포 융합에 의해 전이될 수 있는 것이 공지되어 있다.
상기 온전한 염색체(whole chromosome)는 마이크로세포 매개 염색체 전이(MMCT: microcell-mediated chromosome transfer)에 의해 전이될 수 있는 것이 공지되어 있다(문헌[Fournier, R.E. and F.H. Ruddle, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 74: 319-323, 1977]).
상기 서브염색체 분절(subchromosomal segments)은 염색체 매개 유전자 전이에 의해 전이될 수 있는 것이 공지되어 있다(문헌[Klobutcher, L.A. and F.H. Ruddle, Annu. Rev. Biochem., 50: 533-554, 1981]).
아울러, 상기 킬로베이스 범위의 DNA 단편(DNA fragments in the kilobase range)은 DNA 매개 유전자 전이에 의해서 전이될 수 있는 것이 공지되어 있다(문헌[Scangos G, Ruddle FH, Gene. Jun-Jul;14(1-2):1-10, 1981]).
다만, 수 십 킬로베이스 내지 수 백 킬로베이스 범위, 수 백 킬로베이스 내지 수 천 킬로베이스 범위의 외인성 DNA를 제공하는 방법이 당업계에 요구되는 바, 본 출원에 의해 개시되는 내용은 큰 크기의 외인성 DNA 분절을 표적 세포 및/또는 표적 염색체에 제공하는 방법을 제공한다
본 출원에 의해 개시되는 내용은 새로운 인공 재조합 염색체(artificial recombinant chromosome)를 제공한다.
본 출원에 의해 개시되는 내용은 새로운 인공 재조합 염색체(artificial recombinant chromosome)의 제작 방법을 제공한다.
본 출원에 의해 개시되는 내용은 새로운 인공 재조합 염색체 (artificial recombinant chromosome) 및/또는 이들의 생산 방법의 용도를 제공한다.
본 출원에 의해 개시되는 기술의 일 양태에 따르면, 새로운 인공 재조합 염색체 (artificial recombinant chromosome)를 적어도 하나 이상 포함하는 융합 세포가 제공된다.
상기 인공 재조합 염색체를 적어도 하나 이상 포함하는 융합 세포로서,
이 때, 상기 인공 재조합 염색체는 제1 프래그먼트(a first fragment) 및 제2 프래그먼트(a second fragment)를 포함하고,
상기 제1 프래그먼트는 제1 종(a first species) 생물로부터 유래한 염색사 결합 단백질(chromatin binding protein)을 포함하고,
상기 제2 프래그먼트는 제2 종(a second species) 생물로부터 유래한 염색사 결합 단백질(chromatin binding protein)을 포함하고,
이 때, 상기 제1 종 생물 및 상기 제2 종 생물은 서로 다른 것인,
융합 세포이다.
본 출원에 의해 개시되는 기술의 다른 양태에 따르면, 새로운 인공 재조합 염색체를 적어도 하나이상 포함하는 융합 세포의 생산 방법이 제공된다.
상기 인공 재조합 염색체를 적어도 하나이상 포함하는 융합 세포의 생산 방법은
a) 제1 표적화된 염색체(a first targeted chromosome)를 포함하는 제1 세포 및 제2 표적화된 염색체(a second targeted chromosome)를 포함하는 제2 세포를 융합함; 및
이 때, 상기 제1 표적화된 염색체는 제1 RRS(recombinase recognition sequence)를 포함하고,
이 때, 제1 표적화된 염색체는 제2 RRS를 포함하고,
이 때, 상기 제1 RRS는 상기 제2 RRS와 페어링 가능하고,
이 때, 상기 제1 세포는 마이크로세포이고,
b) SSR (site specific recombinase) 을 처리함
을 포함하고,
이 때, 상기 인공 재조합 염색체는 제1 프래그먼트(a first fragment) 및 제2 프래그먼트(a second fragment)를 포함하고,
이 때, 상기 제1 프래그먼트는 제1 표적화된 염색체로부터 제공되고, 및 상기 제2 프래그먼트는 제2 표적화된 염색체로부터 제공되는 것인,
융합 세포의 생산 방법이다.
본 명세서에 의해 개시되는 기술에 따르면, 다음과 같은 효과가 발생한다.
첫째, 새로운 인공 재조합 염색체 (artificial recombinant chromosome)를 제공할 수 있다. 나아가, 보다 큰 크기의 외인성 DNA 분절을 포함하는 인공 재조합 염색체를 제공할 수 있다.
둘째, 새로운 인공 재조합 염색체 (artificial recombinant chromosome)의 제작 방법을 제공할 수 있다. 나아가, 보다 큰 크기의 외인성 DNA 분절을 표적 염색체에 제공하여, 인공 재조합 염색체를 제조하는 방법을 제공할 수 있다.
도 1은 일 실시예에 따른 흐름도를 나타낸다.
도 2 내지 도 9는 표적화된 염색체로부터 인공 재조합 염색체를 제조하는 것에 대한 모식도이다.
도 10은 제1 원염색체에 제1 DNA 공여체 및 제2 DNA 공여체를 제공하여 제1 표적화된 염색체를 제조하는 것에 대한 모식도이다.
도 11은 제2 원염색체에 제3 DNA 공여체 및 제4 DNA 공여체를 제공하여 제2 표적화된 염색체를 제조하는 것에 대한 모식도이다.
도 12는 제1 표적화된 염색체 및 제2 표적화된 염색체로부터 제1 인공 재조합 염색체 및 제2 인공 재조합 염색체를 제조하는 것에 대한 모식도이다.
도 13은 제1 인공 재조합 염색체로부터 제3 인공 재조합 염색체를 제조하는 것에 대한 모식도이다.
도 14는 제1 원염색체에 제1 DNA 공여체 및 제2 DNA 공여체를 제공하여 제1 표적화된 염색체를 제조하는 것에 대한 모식도이다.
도 15는 제1 표적화된 염색체의 목적 유전자를 역위시키는 것에 대한 모식도이다.
도 16은 제2 원염색체에 제3 DNA 공여체 및 제4 DNA 공여체를 제공하여 제2 표적화된 염색체를 제조하는 것에 대한 간략도이다.
도 17은 제2 표적화된 염색체의 목적 유전자를 역위시키는 것에 대한 모식도이다.
도 18은 제1 표적화된 염색체 및 제2 표적화된 염색체로부터 제1 인공 재조합 염색체 및 제2 인공 재조합 염색체를 제조하는 것에 대한 모식도이다.
도 19는 제1 인공 재조합 염색체로부터 제3 인공 재조합 염색체를 제조하는 것에 대한 모식도이다.
도 20 내지 도 23은 일 실시예에 따른 표적화된 염색체의 DNA 구조에 대한 모식도이다.
도 24 및 도 25는 일 실시예에 따른 표적화 세포의 선별 결과를 나타낸다.
도 26은 일 실시예에 따른 마이크로세포를 나타낸다.
도 27은 일 실시예에 따른 융합 세포의 제조 과정을 나타낸다.
도 28은 일 실시예에 따른 표적화된 염색체를 포함하는 융합 세포를 나타낸다.
도 29은 일 실시예에 따른 인공 재조합 염색체를 포함하는 융합 세포를 나타낸다.
도 30 내지 도 32는 일 실시예에 따른 융합 세포에 있어서, 인공 재조합 염색체를 포함하는 융합 세포 및 표적화된 염색체를 포함하는 융합 세포의 비교를 나타낸다.
본 출원에 의해 개시되는 내용에 의하면, “인공 재조합 염색체(artificial recombinant chromosome)”가 제공된다.
용어 “인공 재조합 염색체(artificial recombinant chromosome)”는 2 이상의 원세포(source cell)로부터 제공된 2 이상의 염색체 간 일부가 재조합된 염색체이다. 일 예로, 제1 원세포(a first source cell) 로부터 제공된 염색체 및 제2 원세포(a second source cell)로부터 제공된 염색체 간 일부가 재조합된 염색체이다. 상기 제1 원세포(a first source cell)는 제1 원염색체(a first source chromosome)를 포함한다. 상기 제2 원세포(a second source cell)는 제2 원염색체(a second source chromosome)를 포함한다.
용어 “원염색체(source chromosome)”는 하기에서 기술할 표적화된 염색체를 제조하기 위하여 제공되는 염색체를 의미한다. 상기 원염색체는 자연계에 존재하는 염색체를 포함할 뿐 아니라, 하기에서 기술할 표적화된 염색체 제조를 위한 목적의 유전자 조작 외의 기타 인위적인 유전자 조작을 가한 인위적인 염색체를 포함한다. 이 때, 상기 조작은 인위적 교체를 포함한다. 이 때, 상기 조작은 인위적 변형을 포함한다.
상기 인공 재조합 염색체는 상기 제1 원염색체로부터 제공된 염색체 서열 일부 및 상기 제2 원염색체로부터 제공된 염색체 서열 일체가 재조합된 염색체이다. 상기 인공 재조합 염색체는 상기 제1 원염색체로부터 제공된 염색체 서열 일체 및 상기 제2 원염색체로부터 제공된 염색체 서열 일부가 재조합된 염색체이다. 상기 인공 재조합 염색체는 상기 제1 원염색체로부터 제공된 염색체 서열 일체 및 상기 제2 원염색체로부터 제공된 염색체 서열 일체가 재조합된 염색체이다.
용어 “원세포(source cell)”는 상기 원염색체를 포함하는 세포를 의미한다. 상기 원세포는 자연계에 존재하는 세포를 포함할 뿐 아니라, 하기에서 기술할 표적화된 염색체 제조를 위한 조작 외의 기타 인위적인 유전자 조작을 가한 인위적인 염색체를 포함하는 세포를 포함한다. 상기 원세포는 하기에서 기술할 표적화된 염색체 제조를 위한 조작 외의 기타 조작을 가한 인위적인 세포를 포함한다. 일 예로, 세포막 단백질을 인위적인 표적단백질로 변경한 세포라도, 인공 재조합 염색체 제조를 위한 조작을 가한 염색체를 포함하지 않는다면, 본원에서 원세포로 지칭할 수 있다. 즉, 원염색체만을 포함한다면 본원에서 원세포로 지칭할 수 있다.
상기 제1 원세포 및 상기 제2 원세포는 동일 개체 유래일 수 있다. 상기 제1 원세포 및 상기 제2 원세포는 다른 개체 유래일 수 있다. 상기 다른 개체는 동종 및 이종을 모두 포함한다.
상기 원세포는 인간 세포(human cell) 유래일 수 있다. 상기 원세포는 비인간 세포(non-human cell) 유래일 수 있다. 예를 들어, 상기 비인간 세포(non-human cell)는 마우스 세포(mouse cell), 래트 세포(rat cell), 설치류 세포(rodent cell), 양 세포(goral cell), 소 세포(cattle cell) 또는 유제류 세포(ungulate cell) 유래일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 원세포는 체세포(somatic cell) 유래일 수 있다. 예를 들어, 상기 체세포(somatic cell)는 예를들어, 섬유아세포(fibroblast cell)일 수 있다.
상기 원세포는 면역세포(immune cell) 유래일 수 있다. 예를 들어, 상기 면역세포(immune cell)는 B-세포(B-cell), T-세포(T-cell), NK세포(NK cell), 대식세포, 호중구, 호염기구 또는 호산구 일 수 있다.
상기 원세포는 생식세포(germ cell)유래일 수 있다. 예를 들어, 정자, 정모세포, 정원줄기세포, 난자, 난모세포, 난원줄기세포 또는 수정란 일 수 있다.
상기 원세포는 줄기세포(stem cell) 유래일 수 있다. 예를 들어, 상기 줄기세포(stem cell)는 배아줄기세포(ES cell; embryonic stem cell), 성체줄기세포, 제대혈 줄기세포, 정원줄기세포 또는 난원줄기세포 유래일 수 있다.
상기 인공 재조합 염색체는 표적화된 염색체(targeted chromosome)로부터 제조될 수 있다.
상기 표적화된 염색체(targeted chromosome)는 상기 원염색체로부터 제조될 수 있다.
용어 “표적화된 염색체(targeted chromosome)”는 상기 원염색체에 일 또는 복수 개의 RRS(Recombinase recognition site)를 더 가지는 것일 수 있다. 상기 표적화된 염색체는 상기 원염색체에 일 또는 복수 개의 ASCE(Artificial Sequence for Chromosome Exchange)를 더 가지는 것일 수 있다.
일 예로, 제1 원염색체로부터 제1 표적화된 염색체(a first targeted chromosome)를 제작할 수 있다. 상기 제1 표적화된 염색체는 상기 제1 원염색체에 일 또는 복수 개의 RRS(Recombinase recognition site)를 가지는 것일 수 있다. 상기 제1 표적화된 염색체는 상기 제1 원염색체에 일 또는 복수 개의 ASCE(Artificial Sequence for Chromosome Exchange)를 가지는 것일 수 있다.
일 예로, 제2 원염색체로부터 제2 표적화된 염색체(a second targeted chromosome)을 제작할 수 있다. 상기 제2 표적화된 염색체는 상기 제2 원염색체에 일 또는 복수 개의 RRS(Recombinase recognition site)를 가지는 것일 수 있다. 상기 제2 표적화된 염색체는 상기 제2 원염색체에 일 또는 복수 개의 ASCE(Artificial Sequence for Chromosome Exchange)를 가지는 것일 수 있다.
용어 “RRS(Recombinase recognition site)”는 부위 특이적 재조합 효소에 의한 재조합 부위를 제공할 수 있는 핵산 서열을 의미한다. 상기 RRS는 loxP 부위 또는 그의 변이체일 수 있다. 상기 RRS는 FRT 부위 또는 그의 변이체일 수 있다. 상기 RRS는 attP/attB 또는 그의 변이체일 수 있다. 상기 RRS는 하나 이상의 트랜스포존(transposon)에 의해 인지되는 ITR (inverted terminal repeat; 역위 말단 반복) 서열 또는 그의 변이체일 수 있다. 다만, RRS는 기재된 것에 제한되는 것은 아니다.
용어 “ASCE”는 상동성 재조합(Homologous Recombination; HR)에 의한 재조합 부위를 제공하는 핵산 서열을 의미한다. 상기 ASCE는 인위적인 서열일 수 있다. 상기 ASCE는 표적화된 염색체에 포함된 인위적인 서열일 수 있다.
일 예로, 제1 표적화된 세포(a first targeted cell)로부터 제공된 제1 표적화된 염색체(a first targeted chromosome)에 포함된 Artificial Sequence일 수 있다. 일 예로, 제2 표적화된 세포(a second targeted cell)로부터 제공된 제2 표적화된 염색체(a second targeted chromosome)에 포함된 Artificial Sequence일 수 있다. 상기 제1 표적화된 염색체에 포함된 Artificial Sequence 및 상기 제2 표적화된 염색체에 포함된 Artificial Sequence는 추후 Homologous Recombination에 이용될 수 있다.
상기 원염색체로부터 상기 표적화된 염색체를 제작하기 위하여, 상동성 재조합(Homologous recombination)이 이용될 수 있다. 상기 상동성 재조합(Homologous recombination)은 염색체의 DSB(double strand breaking) 및/또는 SSB(single strand breaking)에 의해 진행될 수 있다. 상기 SSB 및/또는 DSB는 자연적으로 발생할 수 있다. 상기 SSB 및/또는 DSB는 클라스토젠(clastogen; 염색체이상유발물질)에 의해 발생할 수 있다. 상기 클라스토젠은 이온화 방사선, UV, X선, γ선, 활성산소종, 특정 케미컬일 수 있다. 상기 특정 케미컬은, 예를 들어, 블레오마이신(bleomycin), 하이드록시요소(Hydroxyurea), 캄프토테신(Camptothecin), 4-NQO(4-nitroquinoline 1-oxide), 시스플라틴(Cisplatin), EMS 또는 MMS 등의 메틸화 시약(methylating agent) 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 SSB 및/또는 DSB는 유전자 가위에 의해 발생할 수 있다. 예를 들어, 상기 SSB 및/또는 DSB는 ZFN(Zinc-finger nucleases), TALEN(Transcription activator-like effector nucleases) 및 CRISPR/Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein) 중 어느 하나 이상에 의해 발생할 수 있다.
본 출원에 개시된 내용에 따르면, 상기 표적화된 염색체를 포함하는 표적화 세포(targeted cell)가 제공될 수 있다.
용어 “표적화 세포(targeted cell)”는 상기 표적화된 염색체(targeted chromosome)를 포함하는 세포를 의미한다. 상기 표적화된 염색체는 상기 표적화 세포 내에 하나 또는 그 이상 존재할 수 있다.
상기 표적화 세포는 하나 이상의 표적화된 염색체를 포함할 수 있다. 상기 표적화 세포는 하나 이상의 원염색체를 더 포함할 수 있다. 상기 원염색체는 전술하였다.
상기 표적화 세포는 원세포로부터 제작될 수 있다.
상기 원세포는 전술하였다.
상기 표적화 세포는 인간 세포(human cell) 유래일 수 있다. 상기 표적화 세포는 비인간 세포(non-human cell) 유래일 수 있다. 예를 들어, 상기 비인간 세포(non-human cell)는 마우스 세포(mouse cell), 래트 세포(rat cell), 설치류 세포(rodent cell), 양 세포(goral cell), 소 세포(cattle cell) 또는 유제류 세포(ungulate cell) 유래일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 표적화 세포는 체세포(somatic cell) 유래일 수 있다. 예를 들어, 상기 체세포(somatic cell)는 예를들어, 섬유아세포(fibroblast cell)일 수 있다.
상기 표적화 세포는 면역세포(immune cell) 유래일 수 있다. 예를 들어, 상기 면역세포(immune cell)는 B-세포(B-cell), T-세포(T-cell), NK세포(NK cell), 대식세포, 호중구, 호염기구 또는 호산구 일 수 있다.
상기 표적화 세포는 생식세포(germ cell)유래일 수 있다. 예를 들어, 정자, 정모세포, 정원줄기세포, 난자, 난모세포, 난원줄기세포 또는 수정란 일 수 있다.
상기 표적화 세포는 줄기세포(stem cell) 유래일 수 있다. 예를 들어, 상기 줄기세포(stem cell)는 배아줄기세포(ES cell; embryonic stem cell), 성체줄기세포, 제대혈 줄기세포, 정원줄기세포 또는 난원줄기세포 유래일 수 있다.
상기 표적화된 세포로부터 마이크로세포(microcell)을 제작할 있다.
용어 “마이크로세포(microcell)”는 하나의 세포가 인위적 조작, 특정 시약 또는 특정 조건에 노출되는 것에 의하여 두 개 이상으로 분리된 부분들 중 어느 하나를 의미한다. 일 예로, 하나의 원세포가 두 개 이상의 세포로 분리된 것일 수 있다. 일 예로, 하나의 표적화된 세포가 두 개 이상의 세포로 분리된 것일 수 있다.
상기 마이크로세포는 상기 세포의 세포질의 일부를 가지고 있을 수 있다.
상기 마이크로세포는 상기 세포의 세포막의 일부를 가지고 있을 수 있다.
상기 마이크로세포는 상기 세포의 핵질의 일부를 가지고 있을 수 있다.
일 실시예에 의하면, 상기 마이크로세포는 상기 표적화된 세포가 두 개 이상의 세포로 분리된 것일 수 있다. 이 때, 상기 마이크로세포는 상기 표적화된 세포에 포함되어 있던 표적화된 염색체 포함할 수 있다. 상기 마이크로세포는 상기 표적화된 세포에 포함되어 있던 원염색체를 포함할 수 있다. 상기 마이크로세포는 상기 표적화된 세포에 포함되어 있던 표적화된 염색체 및 원염색체를 포함할 수 있다.
상기 마이크로세포에 포함된 염색체의 개수는 무작위적일 수 있다. 즉, 하나의 마이크로세포 내 포함된 염색체의 개수는 하나 또는 그 이상일 수 있다.
일 예로, 상기 제1 표적화 세포를 마이크로셀화 하여 제1 표적 마이크로세포(a first target microcell) 및/또는 제1 비표적 마이크로세포(a first non-target microcell)를 제작할 수 있다. 상기 제1 표적 마이크로세포는 제1 표적화된 염색체를 포함하는 것이다. 다만 상기 제1 표적 마이크로세포는 원염색체를 더 포함할 수 있다. 상기 제1 비표적 마이크로세포는 원염색체를 포함하는 것이다.
일 예로, 상기 제2 표적화 세포를 마이크로셀화 하여 제2 표적 마이크로세포(a second target microcell) 및/또는 제2 비표적 마이크로세포(a second non-target microcell)를 제작할 수 있다. 상기 제2 표적 마이크로세포는 제2 표적화된 염색체를 포함하는 것이다. 다만 상기 제2 표적 마이크로세포는 원염색체를 더 포함할 수 있다. 상기 제2 비표적 마이크로세포는 원염색체를 포함하는 것이다.
상기 제1 표적 마이크로세포 및 상기 제2 표적화 세포를 융합하여, 제1 융합 세포(a first fusion cell)를 제작할 수 있다 상기 제1 융합 세포는 제1 표적화된 염색체 및 제2 표적화된 염색체를 포함할 수 있다.
상기 제1 표적화된 염색체 및/또는 제2 표적화된 염색체로부터 제1 인공 재조합 염색체(a first artificial recombinant chromosome) 및/또는 제2 인공 재조합 염색체(a second artificial recombinant chromosome)를 제작할 수 있다. 상기 제1 인공 재조합 염색체는 제1 표적화된 염색체의 일 영역 및 제2 표적화된 염색체의 일 영역이 재조합된 염색체일 수 있다. 상기 재조합은 RRS에 작용하는 SSR(site specific recombinase)에 의한 것일 수 있다. 상기 재조합은 상기 ASCE(Artificial Sequence for Chromosome Exchange)간 상동성 재조합(Homologous Recombination; HR)에 의한 것일 수 있다.
상기 RRS에 작용하는 SSR의 부위 특이적 재조합 시스템은 당업계에 공지되어 있다. 상기 부위 특이적 재조합 시스템은 Cre-lox을 포함할 수 있다. 상기 부위 특이적 재조합 시스템은 FLP/FRT을 포함할 수 있다. 상기 부위 특이적 재조합 시스템은 φ31 인테그레이즈-attP/attB(φ31 integrase-attP/attB)를 포함할 수 있다. 상기 부위 특이적 재조합 시스템은 트랜스포존(transposon)-ITR을 포함할 수 있다. 다만, RRS 및 SSR에 의한 부위 특이적 재조합 시스템이 기재된 것에 제한되는 것은 아니다.
일 실시예에 의하면, 상기 부위 특이적 재조합 시스템은 본원에 개시된 인공 재조합 염색체를 제조하는 데 이용될 수 있다.
일 구현예에 의하면, 상기 부위 특이적 재조합 시스템은 제2 표적화된 염색체의 RRS에 제1 표적화된 염색체의 일 영역을 삽입(insertion)하기 위하여 사용될 수 있다. 상기 삽입을 위하여, 제2 표적화된 염색체는 하나 또는 그 이상의 RRS를 포함할 수 있다. 상기 삽입을 위하여, 제1 표적화된 염색체는 하나 또는 그 이상의 RRS를 포함할 수 있다.
다른 구현예에 의하면, 상기 부위 특이적 재조합 시스템은 제2 표적화된 염색체의 RRS 와 제1 표적화된 염색체의 RRS를 교환(exchange)하기 위하여 사용될 수 있다. 상기 교환을 위하여, 제2 표적화된 염색체는 하나 또는 그 이상의 RRS를 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에 의하면, 상기 부위 특이적 재조합 시스템은 제2 표적화된 염색체의 RRS를 제거(deletion)하고, 제1 표적화된 염색체의 RRS를 삽입(insertion)하기 위하여 사용될 수 있다. 상기 제거 및 상기 삽입을 위하여, 제2 표적화된 염색체는 둘 이상의 RRS를 포함할 수 있다. 상기 제거 및 상기 삽입을 위하여, 제1 표적화된 염색체는 하나 또는 그 이상의 RRS를 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 부위 특이적 재조합 시스템은 핵산 카세트(nucleic acid cassette)를 포함하는 핵산 서열을 삽입하는 데 이용될 수 있다. 상기 핵산 카세트는 유전자 재조합(genetic recombination)을 통한 DNA 조작 과정에서 만들 수 있는 합성 DNA 조각일 수 있다. 전술한 시스템은 RMCE(Recombinase Mediated Cassette Exchange)로, 이는 문헌[Langer et al 2002; Schlake and Bode 1994]에도 기재되어 있다.
상기 제2 인공 재조합 염색체는 제1 표적화된 염색체의 일 영역 및 제2 표적화된 염색체의 일 영역이 재조합된 염색체일 수 있다. 일 예로, 상기 제1 인공 재조합 염색체는 제2 표적화된 염색체의 양 텔로미어 말단 중 어느 하나 이상 및 동원체를 포함하고, 제1 표적화된 염색체의 일 영역을 포함할 수 있다. 일 예로, 상기 제1 인공 재조합 염색체는 제2 표적화된 염색체의 양 텔로미어 말단 중 어느 하나 이상을 포함하고, 제1 표적화된 염색체의 동원체를 포함하는 영역을 포함할 수 있다. 일 예로, 상기 제2 인공 재조합 염색체는 제1 표적화된 염색체의 양 텔로미어 말단 중 어느 하나 이상 및 동원체를 포함하고, 제2 표적화된 염색체의 일 영역을 포함할 수 있다. 일 예로, 상기 제2 인공 재조합 염색체는 제1 표적화된 염색체의 양 텔로미어 말단 중 어느 하나 이상을 포함하고, 제2 표적화된 염색체의 동원체를 포함하는 영역을 포함할 수 있다.
상기 제1 인공 재조합 염색체 및 제2 인공 재조합 염색체를 가지는 세포는 제2 융합 세포(a second fusion cell)이다.
상기 제2 융합 세포에서, 상기 제1 인공 재조합 염색체는 소실될 수 있다. 따라서 상기 제2 인공 재조합 염색체를 포함하나, 제1 인공 재조합 염색체는 소실된 세포를 제3 융합 세포(a third fusion cell)로 명명할 수 있다.
상기 제2 인공 재조합 염색체로부터 제4 인공 재조합 염색체(a fourth artificial recombinant chromosome)를 제조할 수 있다. 상기 제4 인공 재조합 염색체는 상기 제2 인공 재조합 염색체 중 RRS 및/또는 ASCE가 제거된 것일 수 있다. 상기 RRS 및/또는 ASCE가 제거될 때, 일부의 인트로닉 DNA가 더 제거될 수 있다. 상기 RRS 및/또는 ASCE가 제거될 때, 일부의 선발표지 유전자(selection marker gene)가 더 제거될 수 있다. 상기 선발표지 유전자(selection marker gene)는 항생제 저항성 유전자, 형광 단백질 유전자, FISH를 위한 서열 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제1 인공 재조합 염색체로부터 제3 인공 재조합 염색체(a third artificial recombinant chromosome)를 제조할 수 있다. 상기 제3 인공 재조합 염색체는 상기 제1 인공 재조합 염색체 중 RRS 및/또는 ASCE가 제거된 것일 수 있다. 상기 RRS 및/또는 ASCE가 제거될 때, 일부의 인트로닉 DNA가 더 제거될 수 있다. 상기 RRS 및/또는 ASCE가 제거될 때, 일부의 선발표지 유전자(selection marker gene)가 더 제거될 수 있다. 상기 선발표지 유전자(selection marker gene)는 항생제 저항성 유전자, 형광 단백질 유전자, FISH를 위한 서열 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제3 인공 재조합 염색체를 포함하는 세포를 제5 융합 세포(a fifth fusion cell)로 명명할 수 있다. 상기 제5 융합 세포는 상기 제4 인공 재조합 염색체를 더 포함할 수 있다.
1. 표적화된 염색체(targeted chromosome) 및 이의 제조
본 명세서에 개시된 일 양태에 의하면, 표적화된 염색체(targeted chromosome) 및 이의 제조 방법이 제공될 수 있다.
상기 표적화된 염색체는, 원 염색체(source chromosome)의 일 유전자 좌위에 RRS(Recombinase recognition site) 및/또는 ASCE(Artificial Sequence for Chromosome Exchange)가 포함된 것일 수 있다. 또는, 상기 표적화된 염색체는, 원 염색체의 일 비유전자 서열에 RRS 및/또는 ASCE가 포함된 것일 수 있다.
상기 RRS는 공지의 서열일 수 있다. 일 예로, 상기 RRS는 LoxP 또는 그 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 LoxP 변이체는 Lox m2/71, Lox m2/66, Lox71 및 Lox66 중 어느 하나 이상일 수 있다. 상기 LoxP 변이체의 DNA 서열은, 하기 표 1에 개시한다. 이하에서, 서열 번호는 SEQ ID NO:로 기재한다.
LoxP 변이체의 DNA 서열
No. Lox 변이체 DNA 서열 SEQ ID NO:
1 Lox m2/71 5'-taccgTTCGTATAtggTttcTTATACGAAGTTAT-3' 23
2 Lox m2/66 5'-ATAACTTCGTATAtggTttcTTATACGAAcggta-3' 24
3 Lox 71 5'-taccgTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT-3' 25
4 Lox 66 5'-ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAcggta-3' 26
상기 RRS는 공지의 서열일 수 있다. 다른 예로, 상기 RRS는 FRT 부위 또는 그 변이체일 수 있다.
또 다른 예로, 상기 RRS는 attP/attB 또는 그의 변이체일 수 있다. 또 다른 예로, 상기 RRS는 트랜스포존(transposon)에 의해 인지되는 ITR (inverted terminal repeat; 역위 말단 반복) 서열 또는 그의 변이체일 수 있다. 상기 RRS 및 그 변이체의 DNA 서열은, 하기 표 2에 개시한다.
RRS의 DNA 서열
No. RRS DNA 서열 SEQ ID NO:
1 FRT 5'-gaagttcctatactttctagagaataggaacttcggaataggaacttc-3' 27
2 φC31-attP 5'-cccaggtcagaagcggttttcgggagtagtgccccaactggggtaacctttgagttctctcagttgggggcgtagggtcgccgaca tgacacaaggggtt -3' 28
3 φC31-attB 5'-ctcgaagccgcggtgcgggtgccagggcgtgcccttgggctccccgggcgcgtactccacctcacccatc -3' 29
4 PiggyBac right(3') ITR 5'-ccctagaaagataatcatattgtgacgtacgttaaagataatcatgcgtaaaattgacgcatg-3' 30
5 PiggyBac left(5') ITR 5'-catgcgtcaattttacgcagactatctttctaggg-3' 31
1-1. 단일 RRS가 삽입된 염색체(single RRS inserted chromosome)
본 명세서에 개시된 일 실시예에 의하면, 단일 개수의 RRS를 포함하는 표적화된 염색체(targeted chromosome) 및 이의 제조 방법이 제공될 수 있다.
상기 단일 개수의 RRS를 포함하는 표적화된 염색체는 원염색체에 단일 RRS(Recombinase recognition site)를 더 가지는 것이다. 상기 원염색체 및 상기 RRS는 전술하였다.
상기 단일 개수의 RRS를 포함하는 표적화된 염색체를 제조하기 위하여, RRS를 포함하는 공여체 DNA(Donor DNA)가 사용될 수 있다. 상기 공여체 DNA(Donor DNA)는 단일 RRS 및 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 서열일 수 있다.
예를 들어, 상기 공여체 DNA(Donor DNA)는 단일 RRS 및 제1 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 제1 DNA 공여체(제1 Donor DNA)일 수 있다. 예를 들어, 상기 DNA 공여체는 단일 RRS 및 제2 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 제2 DNA 공여체(제2 Donor DNA) 일 수 있다.
예를 들어, 상기 공여체 DNA(Donor DNA)는 상기 표 1에 개시된 LoxP 변이체 중 어느 하나 및 제1 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 서열일 수 있다. 예를 들어, 상기 공여체 DNA(Donor DNA)는 표 1에 개시된 LoxP 변이체 중 어느 하나 및 제2 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 서열일 수 있다.
일 예로, 상기 제1 DNA 공여체(제1 Donor DNA)는 Lox m2/71를 포함할 수 있다. 상기 제2 DNA 공여체(제2 Donor DNA)는 Lox m2/66를 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 제1 DNA 공여체는 Lox m2/66를 포함할 수 있다. 상기 제2 DNA 공여체는 Lox m2/71를 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 제1 DNA 공여체는 Lox 71를 포함할 수 있다. 상기 제2 DNA 공여체는 Lox 66를 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 제1 DNA 공여체는 Lox 66를 포함할 수 있다. 상기 제2 DNA 공여체는 Lox 71를 포함할 수 있다.
상기 단일 RRS를 포함하는 DNA 공여체(Donor DNA)는 상기 원염색체의 표적 서열에 삽입될 수 있다.
상기 표적 서열은 RRS 삽입을 위하여 제공되는 원염색체 상의 서열로, 유전자 좌위 및/또는 비유전자 서열일 수 있다. 상기 표적 서열은 in silico 고안을 통하여 결정될 수 있다.
일 예로, 상기 단일 RRS는 목적유전자의 상류(upstream)에 삽입될 수 있다. 따라서, 상기 RRS를 제공하는 DNA 공여체(Donor DNA)는 목적유전자의 상류(upstream) 중 일 영역에 대한 상동성 암(homologous arm)을 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 단일 RRS는 목적유전자의 하류(downstream)에 삽입될 수 있다. 따라서, 상기 RRS를 제공하는 DNA 공여체(Donor DNA)는 목적유전자의 하류(downstream) 중 일 영역에 대한 상동성 암(homologous arm)을 포함할 수 있다.
상기 단일 RRS 및 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 DNA 공여체(Donor DNA)는 상기 원염색체의 표적 서열에 상동성 재조합(Homologous Recombination)을 통해 삽입될 수 있다.
상기 표적 서열에 상동성 재조합(Homologous Recombination)을 일으키기 위하여, SSB(single strand breaking) 및/또는 DSB(double strand breaking)를 생성하는 단계가 포함될 수 있다. 상기 SSB 및/또는 DSB는 자연적으로 발생할 수 있다. 상기 SSB 및/또는 DSB는 클라스토젠(clastogen; 염색체이상유발물질)에 의해 발생할 수 있다. 상기 클라스토젠은 이온화 방사선, UV, X선, γ선, 활성산소종, 특정 케미컬일 수 있다. 상기 특정 케미컬은, 예를 들어, 블레오마이신(bleomycin), 하이드록시요소(Hydroxyurea), 캄프토테신(Camptothecin), 4-NQO(4-nitroquinoline 1-oxide), 시스플라틴(Cisplatin), EMS 또는 MMS 등의 메틸화 시약(methylating agent) 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 SSB 및/또는 DSB는 유전자 가위에 의해 발생할 수 있다. 예를 들어, 상기 SSB 및/또는 DSB는 ZFN(Zinc-finger nucleases), TALEN(Transcription activator-like effector nucleases) 및 CRISPR/Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein) 중 어느 하나 이상에 의해 발생할 수 있다.
상기 DNA 공여체(Donor DNA)는 선발표지 유전자(selection marker gene)을 더 포함할 수 있다. 상기 DNA 공여체(Donor DNA)에 포함된 상기 선발표지 유전자(selection marker gene)는 하나 또는 그 이상일 수 있다. 상기 선발표지 유전자(selection marker gene)는 형광 단백질 유전자, 항생제 저항성 유전자, FISH 표적 서열(FISH target sequence), 또는 이들의 역위 유전자(inversion gene)일 수 있다. 상기 형광 단백질 유전자 및 이의 역위 유전자(inversion gene)는 공지의 서열일 수 있다. 예를 들어, 상기 형광 단백질 유전자는 GFP 유전자(GFP gene), YFP 유전자(YFP gene), RFP 유전자(RFP gene) 또는 mCherry 유전자(mCherry gene) 중 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 항생제 저항성 유전자 및 이의 역위 유전자(inversion gene)는 공지의 서열일 수 있다. 예를 들어, 상기 항생제 저항성 유전자는 하이그로마이신 저항성 유전자(hygromycin resistant gene), 네오마이신 저항성 유전자(neomycin resistant gene), 카나마이신 저항성 유전자(kanamycin resistant gene), 블라스티사이딘 저항성 유전자(blasticidin resistant gene), 제오신 저항성 유전자(zeocin resistant gene) 또는 퓨로ΔTK 유전자(puroΔgene) 중 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 FISH 표적 서열(FISH target sequence) 및 이의 역위 유전자(inversion gene)는 공지의 서열일 수 있다.
상기 DNA 공여체(Donor DNA)는 트랜스포존 ITR(Transposon ITR) 서열을 더 포함할 수 있다. 상기 트랜스포존(Transposon)은 피기백(PiggyBac)일 수 있다. 예를 들어, 상기 트랜스포존 ITR(Transposon ITR) 서열은 상기 표 2에 개시한 PiggyBac right(3') ITR 서열 및/또는 PiggyBac left(5') ITR 서열일 수 있다.
예를 들어, 상기 DNA 공여체(Donor DNA)는 RRS 및 제1 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 서열일 수 있다. 상기 제1 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 DNA 공여체(Donor DNA)는 제1 DNA 공여체(제1 donor DNA) 일 수 있다. 상기 제1 DNA 공여체(제1 donor DNA)는 제1 RRS를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 DNA 공여체(Donor DNA)는 RRS 및 제2 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 서열일 수 있다. 상기 제2 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 DNA 공여체(Donor DNA)는 제2 DNA 공여체(제2 Donor DNA)일 수 있다. 상기 제2 DNA 공여체(제2 Donor DNA)는 제2 RRS를 포함할 수 있다.
상기 제1 RRS 및 상기 제2 RRS는 SSR에 의해 재조합(recombination)될 수 있다.
상기 제1 DNA 공여체(제1 donor DNA)는 제1 원염색체에 포함된 표적유전자의 상류(upstream)에 대한 상동성 암(homologous arm)을 포함할 수 있다.
상기 제2 DNA 공여체(제2 donor DNA)는 제2 원염색체에 포함된 표적유전자의 상류(upstream)에 대한 상동성 암(homologous arm)을 포함할 수 있다.
이 때, 상기 제1 DNA 공여체(제1 donor DNA)는 3' 상동성 암(3' homologous arm)에 인접한 서열에 트랜스포존 ITR(Transposon ITR) 서열을 포함할 수 있다.
이 때, 상기 제2 DNA 공여체(제2 donor DNA)는 5' 상동성 암(5' homologous arm)에 인접한 서열에 트랜스포존 ITR(Transposon ITR) 서열을 포함할 수 있다.
본 명세서에 개시된 일 구현예에 의하면, 제1 원염색체의 일 표적서열에 단일 RRS를 삽입한 제1 표적화된 염색체가 제공될 수 있다. 상기 제1 원염색체는 인간 유래 염색체일 수 있다. 또는, 상기 제1 원염색체는 비인간 유래 염색체일 수 있다.
본 명세서에 개시된 다른 구현예에 의하면, 제2 원염색체의 일 표적서열에 단일 RRS를 삽입한 제2 표적화된 염색체가 제공될 수 있다. 상기 제2 원염색체는 비인간 유래 염색체일 수 있다. 또는, 상기 제2 원염색체는 인간 유래 염색체일 수 있다.
1-2. 2개의 RRS가 삽입된 염색체(double RRS inserted chromosome)
본 명세서에 개시된 다른 실시예에 의하면, 2개의 RRS를 포함하는 표적화된 염색체(targeted chromosome) 및 이의 제조 방법이 제공될 수 있다.
상기 2개의 RRS를 포함하는 표적화된 염색체는 원염색체에 2개의 RRS(Recombinase recognition site)를 더 가지는 것이다. 상기 원염색체 및 상기 RRS는 전술하였다.
상기 RRS는 DNA 공여체(donor DNA)에 의하여 원염색체 상의 표적 서열에 삽입되어 표적화된 염색체로 제조될 수 있다.
상기 표적화된 염색체에 포함된 2개의 RRS는 제1 RRS 및 제2 RRS로 명명할 수 있다. 상기 제1 RRS 및 상기 제2 RRS는 각 RRS 사이에 비유전자 서열을 포함할 수 있다. 상기 제1 RRS 및 상기 제2 RRS는 각 RRS 사이에 유전자 서열을 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 표적화된 염색체의 상기 제1 RRS 및 상기 제2 RRS 사이에는 목적유전자가 포함될 수 있다.
이 때, 상기 제1 RRS는 목적유전자의 상류(upstream)에 삽입될 수 있다. 따라서, 상기 제1 RRS를 제공하는 DNA 공여체(donor DNA)는 목적유전자의 상류(upstream) 중 일 영역에 대한 상동성 암(homologous arm)을 포함할 수 있다.
이 때, 상기 제2 RRS는 목적유전자의 하류(downstream)에 삽입될 수 있다. 따라서, 상기 제2 RRS를 제공하는 DNA 공여체(donor DNA)는 목적유전자의 하류(downstream) 중 일 영역에 대한 상동성 암(homologous arm)을 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 표적화된 염색체의 상기 제1 RRS 및 상기 제2 RRS 사이에는 목적유전자가 포함될 수 있다.
이 때, 상기 제1 RRS는 목적 유전자의 상류(upstream) 중 일 영역에 대한 상동성 암(homologous arm)을 포함할 수 있다. 상기 제2 RRS는 목적 유전자의 하류(downstream) 중 일 영역에 대한 상동성 암(homologous arm)을 포함할 수 있다.
이 때, 상기 제1 RRS 및 상기 제2 RRS 사이에 목적유전자가 삽입된 공여체(Donor)를 사용할 수 있다.
1-2-1. 2개의 RRS가 2개의 DNA 공여체에 의하여 삽입(2 RRS inserted by 2 donor DNA)
일 구현예에 의하면,
상기 2개의 RRS를 포함하는 표적화된 염색체를 제조하기 위하여, 제1 RRS를 포함하는 제1 DNA 공여체(제1 donor DNA) 및 제2 RRS를 포함하는 제2 DNA 공여체(제2 donor DNA)가 사용될 수 있다. 상기 제1 DNA 공여체(제1 donor DNA) 및/또는 제2 DNA 공여체(제2 donor DNA)는 단일 RRS 및 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 서열일 수 있다.
일 구체예에 의하면, 상기 DNA 공여체(Donor DNA)의 일 예는 제1 RRS 및 제1 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 제1 DNA 공여체(제1 donor DNA)일 수 있다. 상기 DNA 공여체(donor DNA)의 다른 예는 제2 RRS 및 제1 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 제2 DNA 공여체(제2 donor DNA) 일 수 있다(도 12).
상기 제1 DNA 공여체(제1 donor DNA)는 제1 원염색체의 목적유전자 상류(upstream)의 표적 서열에 대한 homologous arm을 포함할 수 있다. 상기 제2 DNA 공여체(제2 donor DNA)는 제1 원염색체의 목적유전자 하류(downstream)의 표적 서열에 대한 상동성 암(homologous arm)을 포함할 수 있다.
일 구체예에 의하면, 상기 DNA 공여체(Donor DNA)의 일 예는 제3 RRS 및 제2 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 제3 DNA 공여체(제3 Donor DNA)일 수 있다. 상기 DNA 공여체(Donor DNA)의 일 예는 제4 RRS 및 제2 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 제4 공여체 DNA(제4 Donor DNA)일 수 있다(도 11).
상기 제3 공여체 DNA(제3 Donor DNA)는 제2 원염색체의 목적유전자 상류(upstream)의 표적 서열에 대한 상동성 암(homologous arm)을 포함할 수 있다. 상기 제4 공여체 DNA(제4 Donor DNA)는 제2 원염색체의 목적유전자 하류(downstream)의 표적 서열에 대한 상동성 암(homologous arm)을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 DNA 공여체(Donor DNA)는 상기 표 1에 개시된 LoxP 변이체 중 어느 하나 및 제1 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 서열일 수 있다. 상기 제1 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 DNA 공여체(Donor DNA)는 제1 공여체 DNA(제1 Donor DNA) 및 제2 공여체 DNA(제2 Donor DNA)일 수 있다.
예를 들어, 상기 DNA 공여체(Donor DNA)는 표 1에 개시된 LoxP 변이체 중 어느 하나 및 제2 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 서열일 수 있다. 상기 제2 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 DNA 공여체(Donor DNA)는 제3 공여체 DNA(제3 Donor DNA) 및 제4 공여체 DNA(제4 Donor DNA)일 수 있다.
일 예로, 상기 제1 공여체 DNA(제1 Donor DNA)는 Lox m2/71를 포함할 수 있다. 상기 제2 공여체 DNA(제2 Donor DNA)는 Lox 71를 포함할 수 있다. 상기 제3 공여체 DNA(제3 Donor DNA)는 Lox m2/66를 포함할 수 있다. 상기 제4 공여체 DNA(제4 Donor DNA)는 Lox 66을 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 제1 공여체 DNA(제1 Donor DNA)는 Lox m2/71를 포함할 수 있다. 상기 제2 공여체 DNA(제2 Donor DNA)는 Lox 66를 포함할 수 있다. 상기 제3 공여체 DNA(제3 Donor DNA)는 Lox m2/66를 포함할 수 있다. 상기 제4 공여체 DNA(제4 Donor DNA)는 Lox 71을 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 제1 공여체 DNA(제1 Donor DNA)는 Lox m2/66를 포함할 수 있다. 상기 제2 공여체 DNA(제2 Donor DNA)는 Lox 71를 포함할 수 있다. 상기 제3 공여체 DNA(제3 Donor DNA)는 Lox m2/71를 포함할 수 있다. 상기 제4 공여체 DNA(제4 Donor DNA)는 Lox 66을 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 제1 공여체 DNA(제1 Donor DNA)는 Lox m2/66를 포함할 수 있다. 상기 제2 공여체 DNA(제2 Donor DNA)는 Lox 66를 포함할 수 있다. 상기 제3 공여체 DNA(제3 Donor DNA)는 Lox m2/71를 포함할 수 있다. 상기 제4 공여체 DNA(제4 Donor DNA)는 Lox 71을 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 제1 공여체 DNA(제1 Donor DNA)는 Lox m2/71를 포함할 수 있다. 상기 제2 공여체 DNA(제2 Donor DNA)는 Lox 71를 포함할 수 있다. 상기 제3 공여체 DNA(제3 Donor DNA)는 Lox 66를 포함할 수 있다. 상기 제4 공여체 DNA(제4 Donor DNA)는 Lox m2/66을 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 제1 공여체 DNA(제1 Donor DNA)는 Lox m2/71를 포함할 수 있다. 상기 제2 공여체 DNA(제2 Donor DNA)는 Lox 66를 포함할 수 있다. 상기 제3 공여체 DNA(제3 Donor DNA)는 Lox 71을 포함할 수 있다. 상기 제4 공여체 DNA(제4 Donor DNA)는 Lox m2/66을 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 제1 공여체 DNA(제1 Donor DNA)는 Lox m2/66을 포함할 수 있다. 상기 제2 공여체 DNA(제2 Donor DNA)는 Lox 71를 포함할 수 있다. 상기 제3 공여체 DNA(제3 Donor DNA)는 Lox 66를 포함할 수 있다. 상기 제4 공여체 DNA(제4 Donor DNA)는 Lox m2/71을 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 제1 공여체 DNA(제1 Donor DNA)는 Lox m2/66를 포함할 수 있다. 상기 제2 공여체 DNA(제2 Donor DNA)는 Lox 66를 포함할 수 있다. 상기 제3 공여체 DNA(제3 Donor DNA)는 Lox 71를 포함할 수 있다. 상기 제4 공여체 DNA(제4 Donor DNA)는 Lox m2/71을 포함할 수 있다.
상기 DNA 공여체(Donor DNA)는 선발표지 유전자(selection marker gene)를 더 포함할 수 있다. 상기 DNA 공여체(Donor DNA)에 포함된 상기 선발표지 유전자(selection marker gene)는 하나 또는 그 이상일 수 있다. 상기 선발표지 유전자(selection marker gene)는 전술하였다.
상기 DNA 공여체(Donor DNA)는 트랜스포존 ITR(Transposon ITR) 서열을 더 포함할 수 있다. 상기 트랜스포존(Transposon)은 PiggyBac일 수 있다. 예를 들어, 상기 트랜스포존 ITR(Transposon ITR) 서열은 상기 표 2에 개시한 PiggyBac right(3') ITR 서열 및/또는 PiggyBac left(5') ITR 서열일 수 있다.
상기 트랜스포존 ITR(Transposon ITR) 서열은 상기 DNA 공여체(Donor DNA)의 5' 상동성 암(5' homologous arm)과 인접할 수 있다.
상기 트랜스포존 ITR(Transposon ITR) 서열은 상기 DNA 공여체(Donor DNA)의 3' 상동성 암(3' homologous arm)과 인접할 수 있다.
예를 들어, 상기 DNA 공여체(Donor DNA)는 RRS 및 제1 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 서열일 수 있다. 상기 제1 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 DNA 공여체(Donor DNA)는 제1 DNA 공여체(제1 Donor DNA) 및 제2 DNA 공여체(제2 Donor DNA) 일 수 있다. 상기 제1 DNA 공여체(제1 Donor DNA)는 제1 RRS를 포함할 수 있다. 상기 제2 DNA 공여체(제2 Donor DNA)는 제2 RRS를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 DNA 공여체(Donor DNA)는 RRS 및 제2 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 서열일 수 있다. 상기 제2 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 DNA 공여체(Donor DNA)는 제3 donor DNA 및 제4 donor DNA일 수 있다 상기 제3 donor DNA는 제3 RRS를 포함할 수 있다. 상기 제4 donor DNA는 제4 RRS를 포함할 수 있다.
상기 제1 RRS 및 상기 제3 RRS는 제1 SSR에 의해 재조합(recombination)될 수 있다.
상기 제2 RRS 및 상기 제4 RRS는 제2 SSR에 의해 재조합(recombination)될 수 있다.
상기 제1 RRS 및 상기 제4 RRS는 제1 SSR에 의해 재조합(recombination)될 수 있다.
상기 제2 RRS 및 상기 제3 RRS는 제2 SSR에 의해 재조합(recombination)될 수 있다.
상기 제1 donor DNA는 제1 원염색체에 포함된 표적유전자의 상류(upstream)에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함할 수 있다.
상기 제2 donor DNA는 제1 원염색체에 포함된 표적유전자의 하류(downstream)에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함할 수 있다.
상기 제3 donor DNA는 제2 원염색체에 포함된 표적유전자의 상류(upstream)에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함할 수 있다.
상기 제4 donor DNA는 제2 원염색체에 포함된 표적유전자의 하류(downstream)에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함할 수 있다.
이 때, 상기 제1 donor DNA는 3' 상동성 암(3' Homologous Arm)에 인접한 서열에 트랜스포존ITR(Transposon ITR) 서열을 포함할 수 있다.
이 때, 상기 제2 donor DNA는 5' 상동성 암(5' Homologous Arm)에 인접한 서열에 트랜스포존ITR(Transposon ITR) 서열을 포함할 수 있다.
이 때, 상기 제3 donor DNA는 5' 상동성 암(5'Homologous Arm)에 인접한 서열에 트랜스포존ITR(Transposon ITR) 서열을 포함할 수 있다.
이 때, 상기 제4 donor DNA는 3' 상동성 암(3'Homologous Arm)에 인접한 서열에 트랜스포존ITR(Transposon ITR) 서열을 포함할 수 있다.
1-2-2. 2개의 RRS가 1개의 DNA 공여체에 의하여 삽입(2 RRS inserted by 1 donor DNA)
다른 구현예에 의하면,
상기 2개의 RRS를 포함하는 표적화된 염색체를 제조하기 위하여, 제1 RRS 및 제2 RRS를 포함하는 단일 donor DNA가 사용될 수 있다. 상기 단일 donor DNA는 제1 RRS, 제2 RRS 및 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 서열일 수 있다.
일 구체예에 의하면, 상기 단일 Donor DNA는 제1 RRS, 제2 RRS 및 제1 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 제1 Donor DNA일 수 있다. 예를 들어, 상기 단일 Donor DNA는 제1 RRS, 제2 RRS 및 제2 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 제2 Donor DNA일 수 있다.
예를 들어, 상기 Donor DNA는 상기 표 1에 개시된 LoxP 변이체 중 어느 둘 및 제1 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 서열일 수 있다. 예를 들어, 상기 Donor DNA는 표 1에 개시된 LoxP 변이체 중 어느 둘 및 제2 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 서열일 수 있다.
일 예로, 상기 제1 Donor DNA는 Lox m2/71 및 Lox 71를 포함할 수 있다. 일 예로, 상기 제2 Donor DNA는 Lox m2/66 및 Lox 66을 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 제1 Donor DNA는 Lox m2/71 및 Lox 66를 포함할 수 있다. 일 예로, 상기 제2 Donor DNA는 Lox m2/66 및 Lox 71을 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 제1 Donor DNA는 Lox m2/66 및 Lox 71를 포함할 수 있다. 일 예로, 상기 제2 Donor DNA는 Lox m2/71 및 Lox 66을 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 제1 Donor DNA는 Lox m2/66 및 Lox 66를 포함할 수 있다. 일 예로, 상기 제2 Donor DNA는 Lox m2/71 및 Lox 71을 포함할 수 있다.
상기 DNA 공여체(Donor DNA)는 선발표지 유전자(selection marker gene)를 더 포함할 수 있다. 상기 DNA 공여체(Donor DNA)에 포함된 상기 선발표지 유전자(selection marker gene)는 하나 또는 그 이상일 수 있다. 상기 선발표지 유전자(selection marker gene)는 전술하였다.
상기 DNA 공여체(Donor DNA)는 트랜스포존 ITR(Transposon ITR) 서열을 더 포함할 수 있다. 상기 트랜스포존(Transposon)은 PiggyBac일 수 있다. 예를 들어, 상기 트랜스포존 ITR(Transposon ITR) 서열은 상기 표 2에 개시한 PiggyBac right(3') ITR 서열 및/또는 PiggyBac left(5') ITR 서열일 수 있다.
상기 트랜스포존 ITR(Transposon ITR) 서열은 상기 Donor DNA의 5' 상동성 암(5' Homologous Arm)과 인접할 수 있다.
상기 트랜스포존 ITR(Transposon ITR) 서열은 상기 Donor DNA의 3' 상동성 암(3' Homologous Arm)과 인접할 수 있다.
예를 들어, 상기 제1 Donor DNA는 제1 RRS, 제2 RRS 및 제1 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 서열일 수 있다. 상기 제2 donor DNA는 제3 RRS, 제4 RRS 및 제2 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 서열일 수 있다.
상기 제1 RRS 및 상기 제3 RRS는 제1 SSR에 의해 재조합(recombination)될 수 있다.
상기 제2 RRS 및 상기 제4 RRS는 제2 SSR에 의해 재조합(recombination)될 수 있다.
상기 제1 RRS 및 상기 제4 RRS는 제1 SSR에 의해 재조합(recombination)될 수 있다.
상기 제2 RRS 및 상기 제3 RRS는 제2 SSR에 의해 재조합(recombination)될 수 있다.
상기 제1 donor DNA는 제1 원염색체에 포함된 표적유전자의 상류(upstream)에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함할 수 있다.
상기 제2 donor DNA는 제2 원염색체에 포함된 표적유전자의 상류(upstream)에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함할 수 있다.
이 때, 상기 제1 donor DNA는 3' 상동성 암(Homologous Arm)에 인접한 서열에 트랜스포존 ITR(Transposon ITR) 서열을 포함할 수 있다.
이 때, 상기 제2 donor DNA는 5' 상동성 암(Homologous Arm)에 인접한 서열에 트랜스포존 ITR(Transposon ITR) 서열을 포함할 수 있다.
본 명세서에 개시된 일 구현예에 의하면, 제1 원염색체의 표적서열에 2개의 RRS를 삽입한 제1 표적화된 염색체가 제공될 수 있다. 상기 표적 서열은 1개 서열 또는 2개 서열일 수 있다. 상기 제1 원염색체는 인간 유래 염색체일 수 있다. 또는, 상기 제1 원염색체는 비인간 유래 염색체일 수 있다.
본 명세서에 개시된 다른 구현예에 의하면, 제2 원염색체의 표적서열에 2개의 RRS를 삽입한 제2 표적화된 염색체가 제공될 수 있다. 상기 표적 서열은 1개 서열 또는 2개 서열일 수 있다. 상기 제2 원염색체는 비인간 유래 염색체일 수 있다. 또는, 상기 제2 원염색체는 인간 유래 염색체일 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 명세서에 개시된 실시예에 의하면, 단일 RRS를 포함하는 표적화된 염색체 및 이의 제조 방법이 제공될 수 있다. 또한, 2개의 RRS를 포함하는 표적화된 염색체(targeted chromosome) 및 이의 제조 방법이 제공될 수 있다. 다만, RRS의 개수는 단일 RRS 또는 2개의 RRS로 제한되는 것이 아니라, 복수의 RRS를 포함하는 표적화된 염색체 및 이의 제조 방법이 제공될 수 있다.
상기 단일 및/또는 2개의 RRS를 포함하는 DNA donor는 상기 원염색체의 표적 서열에 삽입될 수 있다.
상기 표적 서열은 RRS 삽입을 위하여 제공되는 원염색체 상의 서열로, 유전자 좌위 및/또는 비유전자 서열일 수 있다. 상기 표적 서열은 in silico 고안을 통하여 결정될 수 있다.
상기 단일 및/또는 2개의 RRS 및 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 donor DNA는 상기 원염색체의 표적 서열에 상동성 재조합(Homologous Recombination)을 통해 삽입될 수 있다.
상기 표적 서열에 상동성 재조합(Homologous Recombination)을 일으키기 위하여, SSB(single strand breaking) 및/또는 DSB(double strand breaking)을 생성하는 단계가 포함될 수 있다. 상기 SSB 및/또는 DSB는 전술하였다.
1-3. 단일 ASCE가 삽입된 염색체(single ASCE inserted chromosome)
본 명세서에 개시된 또 다른 실시예에 의하면, 단일 개수의 ASCE를 포함하는 표적화된 염색체(targeted chromosome) 및 이의 제조 방법이 제공될 수 있다.
상기 단일 개수의 ASCE를 포함하는 표적화된 염색체는 원염색체에 단일 ASCE를 더 가지는 것이다. 상기 원염색체 및 상기 ASCE는 전술하였다.
상기 단일 개수의 ASCE를 포함하는 표적화된 염색체를 제조하기 위하여, ASCE를 포함하는 donor DNA가 사용될 수 있다. 상기 donor DNA는 단일 ASCE 및 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 서열일 수 있다.
예를 들어, 상기 Donor DNA는 단일 ASCE 및 제1 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 제1 Donor DNA일 수 있다. 예를 들어, 상기 Donor DNA는 단일 ASCE 및 제2 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 제2 Donor DNA일 수 있다.
상기 단일 ASCE를 포함하는 DNA donor는 상기 원염색체의 표적 서열에 삽입될 수 있다.
상기 표적 서열은 상기 ASCE를 삽입하기 위하여 제공되는 원염색체 상의 서열로, 유전자 좌위 및/또는 비유전자 서열일 수 있다. 상기 표적 서열은 in silico 고안을 통하여 결정될 수 있다.
일 예로, 상기 단일 ASCE는 목적유전자의 상류(upstream)에 삽입될 수 있다. 따라서, 상기 ASCE를 제공하는 donor DNA는 목적유전자의 상류(upstream) 중 일 영역에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 단일 ASCE는 목적유전자의 하류(downstream)에 삽입될 수 있다. 따라서, 상기 ASCE를 제공하는 donor DNA는 목적유전자의 하류(downstream) 중 일 영역에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함할 수 있다.
상기 단일 ASCE 및 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 DNA donor는 상기 원염색체의 표적 서열에 상동성 재조합(Homologous Recombination)을 통해 삽입될 수 있다.
상기 표적 서열에 상동성 재조합(Homologous Recombination)을 일으키기 위하여, SSB(single strand breaking) 및/또는 DSB(double strand breaking)을 생성하는 단계가 포함될 수 있다. 상기 SSB 및/또는 DSB는 전술하였다.
상기 DNA 공여체(Donor DNA)는 선발표지 유전자(selection marker gene)를 더 포함할 수 있다. 상기 DNA 공여체(Donor DNA)에 포함된 상기 선발표지 유전자(selection marker gene)는 하나 또는 그 이상일 수 있다. 상기 선발표지 유전자(selection marker gene)는 전술하였다.
상기 DNA 공여체(Donor DNA)는 트랜스포존 ITR(Transposon ITR) 서열을 더 포함할 수 있다. 상기 트랜스포존(Transposon)은 PiggyBac일 수 있다. 예를 들어, 상기 트랜스포존 ITR(Transposon ITR) 서열은 상기 표 2에 개시한 PiggyBac right(3') ITR 서열 및/또는 PiggyBac left(5') ITR 서열일 수 있다.
예를 들어, 상기 Donor DNA는 ASCE 및 제1 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 서열일 수 있다. 상기 제1 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 Donor DNA는 제1 donor DNA일 수 있다. 상기 제1 donor DNA는 제1 ASCE를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 Donor DNA는 ASCE 및 제2 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 서열일 수 있다. 상기 제2 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 Donor DNA는 제2 donor DNA일 수 있다 상기 제2 donor DNA는 제2 ASCE를 포함할 수 있다.
상기 제1 ASCE 및 상기 제2 ASCE는 상동성 재조합(Homologous Recombination)에 의해 재조합(recombination)될 수 있다.
상기 제1 donor DNA는 제1 원염색체에 포함된 표적유전자의 상류(upstream)에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함할 수 있다.
상기 제2 donor DNA는 제2 원염색체에 포함된 표적유전자의 상류(upstream)에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함할 수 있다.
이 때, 상기 제1 donor DNA는 3' 상동성 암(3' Homologous Arm)에 인접한 서열에 트랜스포존ITR(Transposon ITR) 서열을 포함할 수 있다.
이 때, 상기 제2 donor DNA는 5' 상동성 암(5' Homologous Arm)에 인접한 서열에 트랜스포존ITR(Transposon ITR) 서열을 포함할 수 있다.
본 명세서에 개시된 일 구현예에 의하면, 제1 원염색체의 일 표적서열에 단일 ASCE를 삽입한 제1 표적화된 염색체가 제공될 수 있다. 상기 제1 원염색체는 인간 유래 염색체일 수 있다. 또는, 상기 제1 원염색체는 비인간 유래 염색체일 수 있다.
본 명세서에 개시된 다른 구현예에 의하면, 제2 원염색체의 일 표적서열에 단일 ASCE를 삽입한 제2 표적화된 염색체가 제공될 수 있다. 상기 제2 원염색체는 비인간 유래 염색체일 수 있다. 또는, 상기 제2 원염색체는 인간 유래 염색체일 수 있다.
1-4. 2개의 ASCE가 삽입된 염색체(double ASCE inserted chromosome)
본 명세서에 개시된 또 다른 실시예에 의하면, 2개의 ASCE를 포함하는 표적화된 염색체(targeted chromosome) 및 이의 제조 방법이 제공될 수 있다.
상기 2개의 ASCE를 포함하는 표적화된 염색체는 원염색체에 2개의 ASCE를 더 가지는 것이다. 상기 원염색체 및 상기 ASCE는 전술하였다.
상기 ASCE는 donor DNA에 의하여 원염색체 상의 표적 서열에 삽입되어 표적화된 염색체로 제조될 수 있다.
상기 표적화된 염색체에 포함된 2개의 ASCE는 제1 ASCE 및 제2 ASCE로 명명할 수 있다. 상기 제1 ASCE 및 상기 제2 ASCE는 각 ASCE 사이에 비유전자 서열을 포함할 수 있다. 상기 제1 ASCE 및 상기 제2 ASCE는 각 ASCE 사이에 유전자 서열을 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 표적화된 염색체의 상기 제1 ASCE 및 상기 제2 ASCE 사이에는 목적유전자가 포함될 수 있다.
이 때, 상기 제1 ASCE는 목적유전자의 upstream에 삽입될 수 있다. 따라서, 상기 제1 ASCE를 제공하는 donor DNA는 목적유전자의 upstream 중 일 영역에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함할 수 있다.
이 때, 상기 제2 ASCE는 목적유전자의 downstream에 삽입될 수 있다. 따라서, 상기 제2 ASCE를 제공하는 donor DNA는 목적유전자의 downstream 중 일 영역에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 표적화된 염색체의 상기 제1 ASCE 및 상기 제2 ASCE 사이에는 목적유전자가 포함될 수 있다.
이 때, 상기 제1 ASCE는 목적 유전자의 upstream 중 일 영역에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함할 수 있다. 상기 제2 ASCE는 목적 유전자의 downstream 중 일 영역에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함할 수 있다.
이 때, 상기 제1 ASCE 및 상기 제2 ASCE 사이에 목적유전자가 삽입된 Donor를 사용할 수 있다.
1-4-1. 2개의 ASCE가 2개의 DNA 공여체에 의하여 삽입 (2 ASCE inserted by 2 donor DNA)
일 구현예에 의하면,
상기 2개의 ASCE를 포함하는 표적화된 염색체를 제조하기 위하여, 제1 ASCE를 포함하는 제1 donor DNA 및 제2 ASCE를 포함하는 제2 Donor DNA가 사용될 수 있다. 상기 제1 donor DNA 및/또는 제2 donor DNA는 단일 ASCE 및 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 서열일 수 있다.
일 구체예에 의하면, 상기 단일 Donor DNA는 제1 ASCE, 제2 ASCE 및 제1 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 제1 Donor DNA일 수 있다. 예를 들어, 상기 단일 Donor DNA는 제1 ASCE, 제2 ASCE 및 제2 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 제2 Donor DNA일 수 있다.
일 구체예에 의하면, 상기 Donor DNA의 일 예는 제1 ASCE 및 제1 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 제1 Donor DNA일 수 있다. 상기 Donor DNA의 다른 예는 제2 ASCE 제1 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 제2 Donor DNA일 수 있다.
상기 제1 donor DNA는 제1 원염색체의 목적유전자 상류(upstream)의 표적 서열에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함할 수 있다. 상기 제2 donor DNA는 제1 원염색체의 목적유전자 하류(downstream)의 표적 서열에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함할 수 있다.
일 구체예에 의하면, 상기 Donor DNA의 일 예는 제3 ASCE 및 제2 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 제3 Donor DNA일 수 있다. 상기 Donor DNA의 일 예는 제4 ASCE 및 제2 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 제4 Donor DNA일 수 있다.
상기 제3 donor DNA는 제2 원염색체의 목적유전자 상류(upstream)의 표적 서열에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함할 수 있다. 상기 제4 donor DNA는 제2 원염색체의 목적유전자 하류(downstream)의 표적 서열에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함할 수 있다.
상기 DNA 공여체(Donor DNA)는 선발표지 유전자(selection marker gene)를 더 포함할 수 있다. 상기 DNA 공여체(Donor DNA)에 포함된 상기 선발표지 유전자(selection marker gene)는 하나 또는 그 이상일 수 있다. 상기 선발표지 유전자(selection marker gene)는 전술하였다.
상기 DNA 공여체(Donor DNA)는 트랜스포존 ITR(Transposon ITR) 서열을 더 포함할 수 있다. 상기 트랜스포존(Transposon)은 PiggyBac일 수 있다. 예를 들어, 상기 트랜스포존 ITR(Transposon ITR) 서열은 상기 표 2에 개시한 PiggyBac right(3') ITR 서열 및/또는 PiggyBac left(5') ITR 서열일 수 있다.
상기 트랜스포존 ITR(Transposon ITR) 서열은 상기 Donor DNA의 5' 상동성 암(5' Homologous Arm)과 인접할 수 있다.
상기 트랜스포존 ITR(Transposon ITR) 서열은 상기 Donor DNA의 3' 상동성 암(3' Homologous Arm)과 인접할 수 있다.
예를 들어, 상기 Donor DNA는 ASCE 및 제1 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 서열일 수 있다. 상기 제1 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 Donor DNA는 제1 donor DNA 및 제2 donor DNA일 수 있다. 상기 제1 donor DNA는 제1 ASCE를 포함할 수 있다. 상기 제2 donor DNA는 제2 ASCE를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 Donor DNA는 RRS 및 제2 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 서열일 수 있다. 상기 제2 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 Donor DNA는 제3 donor DNA 및 제4 donor DNA일 수 있다 상기 제3 donor DNA는 제3 ASCE를 포함할 수 있다. 상기 제4 donor DNA는 제4 ASCE를 포함할 수 있다.
상기 제1 ASCE 및 상기 제3 ASCE는 상동성 재조합(Homologous Recombination)에 의해 재조합(recombination)될 수 있다.
상기 제2 ASCE 및 상기 제4 ASCE는 상동성 재조합(Homologous Recombination)에 의해 재조합(recombination)될 수 있다.
상기 제1 donor DNA는 제1 원염색체에 포함된 표적유전자의 상류(upstream)에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함할 수 있다.
상기 제2 donor DNA는 제1 원염색체에 포함된 표적유전자의 하류(downstream)에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함할 수 있다.
상기 제3 donor DNA는 제2 원염색체에 포함된 표적유전자의 상류(upstream)에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함할 수 있다.
상기 제4 donor DNA는 제2 원염색체에 포함된 표적유전자의 하류(downstream)에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함할 수 있다.
이 때, 상기 제1 donor DNA는 3' 상동성 암(Homologous Arm)에 인접한 서열에 트랜스포존 ITR(Transposon ITR) 서열을 포함할 수 있다.
이 때, 상기 제2 donor DNA는 5' 상동성 암(Homologous Arm)에 인접한 서열에 트랜스포존 ITR(Transposon ITR) 서열을 포함할 수 있다.
이 때, 상기 제3 donor DNA는 5' 상동성 암(Homologous Arm)에 인접한 서열에 트랜스포존 ITR(Transposon ITR) 서열을 포함할 수 있다.
이 때, 상기 제4 donor DNA는 3' 상동성 암(Homologous Arm)에 인접한 서열에 트랜스포존 ITR(Transposon ITR) 서열을 포함할 수 있다.
1-4-2. 2개의 ASCE가 1개의 DNA 공여체에 의하여 삽입(2 ASCE inserted by 1 donor DNA)
다른 구현예에 의하면,
상기 2개의 ASCE를 포함하는 표적화된 염색체를 제조하기 위하여, 제1 ASCE를 포함하는 일 donor DNA 및 제2 ASCE를 포함하는 다른 Donor DNA가 사용될 수 있다. 상기 donor DNA는 단일 ASCE 및 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 서열일 수 있다.
다른 구체예에 의하면, 상기 일 Donor DNA는 제1 ASCE 및 제1 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 제1 Donor DNA일 수 있다. 상기 다른 Donor DNA는 제2 ASCE 제1 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 제2 Donor DNA일 수 있다.
또한, 상기 일 Donor DNA는 제3 ASCE 및 제2 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 제3 Donor DNA일 수 있다. 상기 다른 Donor DNA는 제4 ASCE 및 제2 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 제4 Donor DNA일 수 있다.
상기 단일 및/또는 2개의 ASCE를 포함하는 DNA donor는 상기 원염색체의 표적 서열에 삽입될 수 있다.
상기 표적 서열은 ASCE 삽입을 위하여 제공되는 원염색체 상의 서열로, 유전자 좌위 및/또는 비유전자 서열일 수 있다. 상기 표적 서열은 in silico 고안을 통하여 결정될 수 있다.
상기 단일 및/또는 2개의 ASCE 및 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 DNA donor는 상기 원염색체의 표적 서열에 상동성 재조합(Homologous Recombination)을 통해 삽입될 수 있다.
상기 표적 서열에 상동성 재조합(Homologous Recombination)을 일으키기 위하여, SSB(single strand breaking) 및/또는 DSB(double strand breaking)을 생성하는 단계가 포함될 수 있다. 상기 SSB 및/또는 DSB는 전술하였다.
상기 DNA 공여체(Donor DNA)는 선발표지 유전자(selection marker gene)를 더 포함할 수 있다. 상기 DNA 공여체(Donor DNA)에 포함된 상기 선발표지 유전자(selection marker gene)는 하나 또는 그 이상일 수 있다. 상기 선발표지 유전자(selection marker gene)는 전술하였다.
본 명세서에 개시된 일 구현예에 의하면, 제1 원염색체의 표적서열에 2개의 ASCE를 삽입한 제1 표적화된 염색체가 제공될 수 있다. 상기 표적 서열은 1개 서열 또는 2개 서열일 수 있다. 상기 제1 원염색체는 인간 유래 염색체일 수 있다. 또는, 상기 제1 원염색체는 비인간 유래 염색체일 수 있다.
본 명세서에 개시된 다른 구현예에 의하면, 제2 원염색체의 일 표적서열에 2개의 ASCE를 삽입한 제2 표적화된 염색체가 제공될 수 있다. 상기 표적 서열은 1개 서열 또는 2개 서열일 수 있다. 상기 제2 원염색체는 비인간 유래 염색체일 수 있다. 또는, 상기 제2 원염색체는 인간 유래 염색체일 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 명세서에 개시된 실시예에 의하면, 단일 ASCE를 포함하는 표적화된 염색체 및 이의 제조 방법이 제공될 수 있다. 또한, 2개의 ASCE를 포함하는 표적화된 염색체(targeted chromosome) 및 이의 제조 방법이 제공될 수 있다. 다만, ASCE의 개수는 단일 ASCE 또는 2개의 ASCE로 제한되는 것이 아니라, 복수의 ASCE를 포함하는 표적화된 염색체 및 이의 제조 방법이 제공될 수 있다.
상기 단일 및/또는 2개의 ASCE를 포함하는 DNA donor는 상기 원염색체의 표적 서열에 삽입될 수 있다.
상기 표적 서열은 ASCE 삽입을 위하여 제공되는 원염색체 상의 서열로, 유전자 좌위 및/또는 비유전자 서열일 수 있다. 상기 표적 서열은 in silico 고안을 통하여 결정될 수 있다.
상기 단일 및/또는 2개의 ASCE 및 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 DNA donor는 상기 원염색체의 표적 서열에 상동성 재조합(Homologous Recombination)을 통해 삽입될 수 있다.
상기 표적 서열에 상동성 재조합(Homologous Recombination)을 일으키기 위하여, SSB(single strand breaking) 및/또는 DSB(double strand breaking)을 생성하는 단계가 포함될 수 있다. 상기 SSB 및/또는 DSB는 전술하였다.
2. 표적화 세포(targeted cell) 및 이의 제조
본 명세서에 개시된 다른 양태에 의하면, 표적화 세포(targeted cell) 및 이의 제조 방법이 제공될 수 있다.
상기 표적화 세포는, 전술한 표적화된 염색체를 하나 또는 그 이상 포함하는 세포이다. 상기 표적화 세포는 전술한 원염색체를 하나 또는 그 이상 더 포함할 수 있다.
상기 표적화 세포는 표적화된 염색체를 포함할 수 있다. 상기 표적화 세포는 상기 표적화된 염색체를 단일 및/또는 2개 이상 포함될 수 있다.
상기 표적화 세포는 원세포로부터 제작될 수 있다.
예를 들어, 상기 제1 표적화 세포는 제1 원세포로부터 제작될 수 있다. 상기 제1 표적화 세포는 제1 원세포에 포함된 단일 및/또는 2개 이상의 원염색체가 표적화된 염색체로 치환된 것일 수 있다.
예를 들어, 상기 제2 표적화 세포는 제2 원세포로부터 제작될 수 있다. 상기 제2 표적화 세포는 제2 원세포에 포함된 단일 및/또는 2개 이상의 원염색체가 표적화된 염색체로 치환된 것일 수 있다.
상기 제1 원세포 및 상기 제2 원세포는 전술하였다.
2-1. 단일 RRS가 삽입된 염색체를 포함하는 세포(single RRS inserted chromosome included cell)
본 명세서에 개시된 일 실시예에 의하면, 표적화된 염색체를 포함하는 표적화 세포 및 이의 제조 방법이 제공될 수 있다. 상기 표적화된 염색체는 단일 RRS를 포함하는 것일 수 있다.
상기 RRS 및 상기 표적화된 염색체는 전술하였다.
상기 단일 RRS를 포함하는 표적화된 염색체를 포함하는 표적화 세포는 원세포에 RRS를 포함하는 donor DNA를 제공함으로써 제작될 수 있다.
상기 donor DNA는 공지된 트랜스펙션 방법(Transfection method)을 이용하여 상기 원세포에 제공될 수 있다. 예를 들어, 상기 트랜스펙션 방법(Transfection method)은 바이러스성 트랜스펙션 방법(viral transfection method), 시약 트랜스펙션 방법(reagent transfection method), 물리적 트랜스펙션 방법(physical transfection method)이 이용될 수 있다. 상기 바이러스성 트랜스펙션 방법(viral transfection method )은, 예로, 렌티바이러스(lentivirus)를 이용한 것일 수 있다. 상기 시약 트랜스펙션 방법(reagent transfection method)은, 예를 들어, 인산 칼슘(calcium phosphate), 양이온 지질(cation lipid), DEAE-덱스트란(DEAE-dextran), 폴리에틸렌이민(Polyethylenimine; PEI)을 이용한 것일 수 있다. 상기 물리적 트랜스펙션 방법(physical transfection method)은, 예를 들어, 전기 천공법(electroporation)을 이용한 것일 수 있다. 또한, 상기 트랜스펙션(transfection)은 리포솜(Liposome)을 이용한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 원세포에 제공된 donor DNA에 의하여 단일 RRS를 포함하는 표적화된 염색체를 포함하는 표적화 세포가 제조될 수 있다. 상기 원세포에 제공된 donor DNA는 원염색체의 표적 서열에 삽입되어 표적화된 염색체로 치환될 수 있다. 상기 표적화된 염색체를 포함하는 세포는 표적화 세포이다.
상기 제1 표적화 세포를 위하여, 제1 RRS를 가지는 제1 donor DNA가 원세포에 트랜스펙션(transfection)될 수 있다. 상기 제2 표적화 세포를 위하여, 제2 RRS를 가지는 제2 donor DNA가 원세포에 트랜스펙션(transfection)될 수 있다.
상기 원세포에 제공된 donor DNA는 단일 RRS 및 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함할 수 있다.
상기 제1 Donor DNA는 제1 RRS 및 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 가진 것일 수 있다.
상기 제2 Donor DNA는 제2 RRS 및 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 가진 것일 수 있다.
일 구현예에 의하면,
상기 Donor DNA는 상기 표 1에 개시된 LoxP 변이체 중 어느 하나 및 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 서열일 수 있다.
상기 제1 Donor DNA는 제1 원세포에 처리될 수 있다. 상기 제2 Donor DNA는 제1 원세포에 처리될 수 있다. 이 때, 상기 제1 Donor DNA는 제1 원세포에 포함된 제1 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 가진 것이고, 상기 제2 Donor DNA는 제1 원세포에 포함된 제2 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 가진 것일 수 있다.
다른 구현예에 의하면,
상기 Donor DNA는 상기 표 1에 개시된 LoxP 변이체 중 어느 하나 및 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 서열일 수 있다.
상기 제1 Donor DNA는 제2 원세포에 처리될 수 있다. 상기 제2 Donor DNA는 제2 원세포에 처리될 수 있다. 이 때, 상기 제1 Donor DNA는 제2 원세포에 포함된 제1 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 가진 것이고, 상기 제2 Donor DNA는 제2 원세포에 포함된 제2 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 가진 것일 수 있다.
또 다른 구현예에 의하면,
상기 Donor DNA는 상기 표 1에 개시된 LoxP 변이체 중 어느 하나 및 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 서열일 수 있다.
상기 제1 Donor DNA는 제1 원세포에 처리될 수 있다. 상기 제2 Donor DNA는 제2 원세포에 처리될 수 있다. 이 때, 상기 제1 Donor DNA는 제1 원세포에 포함된 제1 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 가진 것이고, 상기 제2 Donor DNA는 제2 원세포에 포함된 제2 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 가진 것일 수 있다.
2-2. 2개의 RRS가 삽입된 염색체를 포함하는 세포(double RRS inserted chromosome included cell)
본 명세서에 개시된 다른 실시예에 의하면, 표적화된 염색체를 포함하는 표적화 세포 및 이의 제조 방법이 제공될 수 있다. 상기 표적화된 염색체는 2개의 RRS를 포함하는 것일 수 있다.
상기 RRS 및 상기 표적화된 염색체는 전술하였다.
상기 2개의 RRS를 포함하는 표적화된 염색체를 포함하는 표적화 세포는 원세포에 RRS를 포함하는 donor DNA를 제공함으로써 제작될 수 있다.
상기 donor DNA는 공지된 트랜스펙션 방법(Transfection method)을 이용하여 상기 원세포에 제공될 수 있다. 상기 트랜스펙션 방법(Transfection method)은 전술하였다.
상기 원세포에 제공된 donor DNA에 의하여 2개 이상의 RRS를 포함하는 표적화된 염색체를 포함하는 표적화 세포가 제조될 수 있다. 상기 원세포에 제공된 donor DNA는 원염색체의 표적 서열에 삽입되어 표적화된 염색체로 치환될 수 있다. 상기 표적화된 염색체를 포함하는 세포는 표적화 세포이다.
2-2-1. 2개의 RRS가 2개의 공여체 DNA에 의하여 트랜스펙션됨(2 RRS transfected by 2 donor DNA)
일 구현예에 의하면,
상기 표적화 세포의 제조를 위하여, 제1 RRS를 가지는 제1 donor DNA 및 제2 RRS를 가지는 제2 donor DNA가 원세포에 트랜스펙션(transfection)될 수 있다.
상기 제1 Donor DNA는 제1 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 가진 것일 수 있다. 상기 제2 Donor DNA는 제1 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 가진 것일 수 있다.
상기 제3 Donor DNA는 제2 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 가진 것일 수 있다. 상기 제4 Donor DNA는 제2 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 가진 것일 수 있다.
일 구체예에 의하면,
상기 Donor DNA는 상기 표 1에 개시된 LoxP 변이체 중 어느 하나 및 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 서열일 수 있다.
상기 제1 Donor DNA는 제1 원세포에 처리될 수 있다. 상기 제2 Donor DNA는 제1 원세포에 처리될 수 있다. 이 때, 상기 제1 Donor DNA는 제1 원세포에 포함된 제1 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 가진 것이고, 상기 제2 Donor DNA는 제1 원세포에 포함된 제1 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 가진 것일 수 있다.
다른 구체예에 의하면,
상기 Donor DNA는 상기 표 1에 개시된 LoxP 변이체 중 어느 하나 및 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 서열일 수 있다.
상기 제1 Donor DNA는 제2 원세포에 처리될 수 있다. 상기 제2 Donor DNA는 제2 원세포에 처리될 수 있다. 이 때, 상기 제1 Donor DNA는 제2 원세포에 포함된 제2 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 가진 것이고, 상기 제2 Donor DNA는 제2 원세포에 포함된 제2 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 가진 것일 수 있다.
2-2-2. 2개의 RRS가 1개의 공여체 DNA에 의하여 트랜스펙션됨(2 RRS transfected by 1 donor DNA)
다른 구현예에 의하면,
상기 표적화 세포를 위하여, 제1 RRS 및 제2 RRS를 가지는 제1 donor DNA가 원세포에 트랜스펙션(transfection)될 수 있다. 상기 표적화 세포를 위하여, 제3 RRS 및 제4 RRS를 가지는 제2 donor DNA가 원세포에 트랜스펙션(transfection)될 수 있다.
상기 제1 Donor DNA는 제1 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 가진 것일 수 있다. 상기 제2 Donor DNA는 제1 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 가진 것일 수 있다.
상기 제1 Donor DNA는 제2 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 가진 것일 수 있다. 상기 제2 Donor DNA는 제2 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 가진 것일 수 있다.
상기 제1 Donor DNA는 제1 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 가진 것일 수 있다. 상기 제2 Donor DNA는 제2 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 가진 것일 수 있다
일 구체예에 의하면,
상기 Donor DNA는 상기 표 1에 개시된 LoxP 변이체 중 어느 하나 및 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 서열일 수 있다.
상기 제1 Donor DNA는 제1 원세포에 처리될 수 있다. 상기 제2 Donor DNA는 제1 원세포에 처리될 수 있다. 이 때, 상기 제1 Donor DNA는 제1 원세포에 포함된 제1 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 가진 것이고, 상기 제2 Donor DNA는 제1 원세포에 포함된 제1 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 가진 것일 수 있다. 이 때, 상기 제1 Donor DNA는 제1 원세포에 포함된 제1 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 가진 것이고, 상기 제2 Donor DNA는 제1 원세포에 포함된 제2 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 가진 것일 수 있다.
다른 구체예에 의하면,
상기 Donor DNA는 상기 표 1에 개시된 LoxP 변이체 중 어느 하나 및 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 서열일 수 있다.
상기 제1 Donor DNA는 제1 원세포에 처리될 수 있다. 상기 제2 Donor DNA는 제2 원세포에 처리될 수 있다. 이 때, 상기 제1 Donor DNA는 제1 원세포에 포함된 제1 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 가진 것이고, 상기 제2 Donor DNA는 제2 원세포에 포함된 제2 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 가진 것일 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 명세서에 개시된 실시예에 의하면, 단일 RRS를 포함하는 표적화된 염색체 및 이의 제조 방법이 제공될 수 있다. 또한, 2개의 RRS를 포함하는 표적화된 염색체(targeted chromosome) 및 이의 제조 방법이 제공될 수 있다. 다만, RRS의 개수는 단일 RRS 또는 2개의 RRS로 제한되는 것이 아니라, 복수의 RRS를 포함하는 표적화된 염색체 및 이의 제조 방법이 제공될 수 있다.
2-3. 단일 ASCE가 삽입된 염색체를 포함하는 세포(single ASCE inserted chromosome included cell)
본 명세서에 개시된 또 다른 실시예에 의하면, 표적화된 염색체를 포함하는 표적화 세포 및 이의 제조 방법이 제공될 수 있다. 상기 표적화된 염색체는 단일 ASCE를 포함하는 것일 수 있다.
상기 ASCE 및 상기 표적화된 염색체는 전술하였다.
상기 단일 ASCE를 포함하는 표적화된 염색체를 포함하는 표적화 세포는 원세포에 ASCE를 포함하는 donor DNA를 제공함으로써 제작될 수 있다.
상기 donor DNA는 공지된 트랜스펙션 방법(Transfection method)을 이용하여 상기 원세포에 제공될 수 있다. 상기 트랜스펙션 방법(Transfection method)은 전술하였다.
상기 원세포에 제공된 donor DNA에 의하여 단일 ASCE를 포함하는 표적화된 염색체를 포함하는 표적화 세포가 제조될 수 있다. 상기 원세포에 제공된 donor DNA는 원염색체의 표적 서열에 삽입되어 표적화된 염색체로 치환될 수 있다. 상기 표적화된 염색체를 포함하는 세포는 표적화 세포이다.
상기 제1 표적화 세포를 위하여, 제1 ASCE를 가지는 제1 donor DNA가 원세포에 transfection될 수 있다. 상기 제2 표적화 세포를 위하여, 제2 ASCE를 가지는 제2 donor DNA가 원세포에 트랜스펙션(transfection)될 수 있다.
상기 원세포에 제공된 donor DNA는 단일 ASCE 및 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함할 수 있다.
상기 제1 Donor DNA는 제1 ASCE 및 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 가진 것일 수 있다.
상기 제2 Donor DNA는 제2 ASCE 및 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 가진 것일 수 있다.
일 구현예에 의하면,
상기 Donor DNA는 상기 ASCE 및 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 서열일 수 있다. 상기 제1 Donor DNA는 제1 원세포에 처리될 수 있다. 상기 제2 Donor DNA는 제1 원세포에 처리될 수 있다. 이 때, 상기 제1 Donor DNA는 제1 원세포에 포함된 제1 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 가진 것이고, 상기 제2 Donor DNA는 제1 원세포에 포함된 제2 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 가진 것일 수 있다.
다른 구현예에 의하면,
상기 제1 Donor DNA는 제2 원세포에 처리될 수 있다. 상기 제2 Donor DNA는 제2 원세포에 처리될 수 있다. 이 때, 상기 제1 Donor DNA는 제2 원세포에 포함된 제1 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 가진 것이고, 상기 제2 Donor DNA는 제2 원세포에 포함된 제2 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 가진 것일 수 있다.
또 다른 구현예에 의하면,
상기 제1 Donor DNA는 제1 원세포에 처리될 수 있다. 상기 제2 Donor DNA는 제2 원세포에 처리될 수 있다. 이 때, 상기 제1 Donor DNA는 제1 원세포에 포함된 제1 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 가진 것이고, 상기 제2 Donor DNA는 제2 원세포에 포함된 제2 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 가진 것일 수 있다.
2-4. 2개의 ASCE가 삽입된 염색체를 포함하는 세포(double ASCE inserted chromosome included cell)
본 명세서에 개시된 또 다른 실시예에 의하면, 표적화된 염색체를 포함하는 표적화 세포 및 이의 제조 방법이 제공될 수 있다. 상기 표적화된 염색체는 2개의 ASCE를 포함하는 것일 수 있다.
상기 ASCE 및 상기 표적화된 염색체는 전술하였다.
상기 2개의 ASCE를 포함하는 표적화된 염색체를 포함하는 표적화 세포는 원세포에 ASCE를 포함하는 donor DNA를 제공함으로써 제작될 수 있다.
상기 donor DNA는 공지된 트랜스펙션 방법(Transfection method)을 이용하여 상기 원세포에 제공될 수 있다. 상기 트랜스펙션 방법(Transfection method)은 전술하였다.
상기 원세포에 제공된 donor DNA에 의하여 2개 이상의 ASCE를 포함하는 표적화된 염색체를 포함하는 표적화 세포가 제조될 수 있다. 상기 원세포에 제공된 donor DNA는 원염색체의 표적 서열에 삽입되어 표적화된 염색체로 치환될 수 있다. 상기 표적화된 염색체를 포함하는 세포는 표적화 세포이다.
2-4-1. 2개의 ASCE가 2개의 공여체 DNA에 의하여 트랜스펙션 됨(2 ASCE transfected by 2 donor DNA)
일 구현예에 의하면,
상기 표적화 세포의 제조를 위하여, 제1 ASCE를 가지는 제1 donor DNA 및 제2 ASCE를 가지는 제2 donor DNA가 원세포에 트랜스펙션(transfection)될 수 있다.
상기 제1 Donor DNA는 제1 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 가진 것일 수 있다. 상기 제2 Donor DNA는 제1 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 가진 것일 수 있다.
상기 제3 Donor DNA는 제2 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 가진 것일 수 있다. 상기 제4 Donor DNA는 제2 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 가진 것일 수 있다.
일 구체예에 의하면,
상기 Donor DNA는 상기 ASCE 및 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 서열일 수 있다.
상기 제1 Donor DNA는 제1 원세포에 처리될 수 있다. 상기 제2 Donor DNA는 제1 원세포에 처리될 수 있다. 이 때, 상기 제1 Donor DNA는 제1 원세포에 포함된 제1 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 가진 것이고, 상기 제2 Donor DNA는 제1 원세포에 포함된 제1 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 가진 것일 수 있다.
다른 구체예에 의하면,
상기 Donor DNA는 상기 ASCE 및 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 서열일 수 있다.
상기 제1 Donor DNA는 제2 원세포에 처리될 수 있다. 상기 제2 Donor DNA는 제2 원세포에 처리될 수 있다. 이 때, 상기 제1 Donor DNA는 제2 원세포에 포함된 제2 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 가진 것이고, 상기 제2 Donor DNA는 제2 원세포에 포함된 제2 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 가진 것일 수 있다.
2-4-2. 2개의 ASCE가 1개의 공여체 DNA에 의하여 트랜스펙션 됨(2 ASCE transfected by 1 donor DNA)
다른 구현예에 의하면,
상기 표적화 세포를 위하여, 제1 ASCE 및 제2 ASCE를 가지는 제1 donor DNA가 원세포에 transfection될 수 있다. 상기 표적화 세포를 위하여, 제3 ASCE 및 제4 ASCE를 가지는 제2 donor DNA가 원세포에 트랜스펙션(transfection)될 수 있다.
상기 제1 Donor DNA는 제1 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 가진 것일 수 있다. 상기 제2 Donor DNA는 제1 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 가진 것일 수 있다.
상기 제1 Donor DNA는 제2 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 가진 것일 수 있다. 상기 제2 Donor DNA는 제2 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 가진 것일 수 있다.
상기 제1 Donor DNA는 제1 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 가진 것일 수 있다. 상기 제2 Donor DNA는 제2 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 가진 것일 수 있다
일 구체예에 의하면,
상기 Donor DNA는 상기 ASCE 및 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 서열일 수 있다.
상기 제1 Donor DNA는 제1 원세포에 처리될 수 있다. 상기 제2 Donor DNA는 제1 원세포에 처리될 수 있다. 이 때, 상기 제1 Donor DNA는 제1 원세포에 포함된 제1 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 가진 것이고, 상기 제2 Donor DNA는 제1 원세포에 포함된 제1 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 가진 것일 수 있다. 이 때, 상기 제1 Donor DNA는 제1 원세포에 포함된 제1 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 가진 것이고, 상기 제2 Donor DNA는 제1 원세포에 포함된 제2 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 가진 것일 수 있다.
다른 구체예에 의하면,
상기 Donor DNA는 상기 ASCE 및 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 포함하는 서열일 수 있다.
상기 제1 Donor DNA는 제1 원세포에 처리될 수 있다. 상기 제2 Donor DNA는 제2 원세포에 처리될 수 있다. 이 때, 상기 제1 Donor DNA는 제1 원세포에 포함된 제1 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 가진 것이고, 상기 제2 Donor DNA는 제2 원세포에 포함된 제2 원염색체에 대한 상동성 암(Homologous Arm)을 가진 것일 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 명세서에 개시된 실시예에 의하면, 단일 ASCE를 포함하는 표적화된 염색체 및 이의 제조 방법이 제공될 수 있다. 또한, 2개의 ASCE를 포함하는 표적화된 염색체(targeted chromosome) 및 이의 제조 방법이 제공될 수 있다. 다만, ASCE의 개수는 단일 ASCE 또는 2개의 ASCE로 제한되는 것이 아니라, 복수의 ASCE를 포함하는 표적화된 염색체 및 이의 제조 방법이 제공될 수 있다.
2-5. 표적화 세포 선별 방법
본 명세서에 개시된 또 다른 실시예에 의하면, 표적화된 염색체를 포함하는 표적화 세포의 선별 방법이 제공될 수 있다.
상기 표적화된 염색체는 RRS 및/또는 ASCE를 포함하는 것일 수 있다.
상기 RRS, 상기 ASCE, 상기 표적화된 염색체 및 상기 표적화 세포는 전술하였다.
2-5-1. 표적화 세포 선별 방법: selection marker
일 구현예에 의하면,
상기 표적화 세포는 형광 단백질 검출에 의하여 선별될 수 있다.
상기 형광 단백질 검출을 위하여, 상기 표적화 세포에 포함된 표적화된 염색체는 형광 단백질 유전자를 포함할 수 있다.
상기 형광 단백질 유전자는 donor DNA에 의하여 원염색체의 표적 서열에 삽입된 것일 수 있다. 상기 원염색체 및 상기 표적 서열은 전술하였다.
상기 형광 단백질 유전자는 GFP 유전자(GFP gene), YFP 유전자(YFP gene), RFP 유전자(RFP gene) 또는 mCherry 유전자(mCherry gene) 중 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체예에 의하면,
표적화 세포 및 원세포가 혼합된 배지(media)에서, 형광 단백질의 검출에 의하여 상기 표적화 세포를 선별할 수 있다.
예를 들어, 상기 표적화 세포는 GFP 유전자 (GFP gene)가 삽입된 표적화된 염색체를 포함할 수 있다. 이 때, 녹색 형광(green fluorescence)의 검출을 통하여 원세포로부터 표적화 세포를 선별할 수 있다.
예를 들어, 상기 표적화 세포는 mCherry 유전자(mCherry gene)가 삽입된 표적화된 염색체를 포함할 수 있다. 이 때, mCherry 형광(mCherry fluorescence)의 검출을 통하여 원세포로부터 표적화 세포를 선별할 수 있다.
다른 구현예에 의하면,
상기 표적화 세포는 항생제 저항성에 의하여 선별될 수 있다.
상기 항생제 저항성 검출을 위하여, 상기 표적화된 세포에 포함된 표적화된 염색체는 항생제 저항성 유전자를 포함할 수 있다.
상기 항생제 저항성 유전자는 donor DNA에 의하여 원염색체의 표적 서열에 삽입된 것일 수 있다. 상기 원염색체 및 상기 표적 서열은 전술하였다.
상기 항생제 저항성 유전자는 하이그로마이신 저항성 유전자(hygromycin resistant gene), 네오마이신 저항성 유전자(neomycin resistant gene), 카나마이신 저항성 유전자(kanamycin resistant gene), 블라스티사이딘 저항성 유전자(blasticidin resistant gene), 제오신 저항성 유전자(zeocin resistant gene) 또는 퓨로ΔTK 유전자(puroΔgene) 중 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체예에 의하면,
표적화 세포 및 원세포가 혼합된 배지(media)에서, 항생제 저항성 검출에 의하여 상기 표적화 세포를 선별할 수 있다.
예를 들어, 상기 표적화 세포는 하이그로마이신 저항성 유전자(hygromycin resistant gene)가 삽입된 표적화된 염색체를 포함할 수 있다. 이 때, 하이그로마이신(hygromycin)에 대한 항생제 저항성 검출을 통하여 원세포로부터 표적화 세포를 선별할 수 있다.
예를 들어, 상기 표적화 세포는 네오마이신 저항성 유전자(neomycin resistant gene)가 삽입된 표적화된 염색체를 포함할 수 있다. 이 때, 네오마이신(neomycin)에 대한 항생제 저항성 검출을 통하여 원세포로부터 표적화 세포를 선별할 수 있다.
예를 들어, 상기 표적화 세포는 카나마이신 저항성 유전자(kanamycin resistant gene)가 삽입된 표적화된 염색체를 포함할 수 있다. 이 때, 카나마이신(kanamycin)에 대한 항생제 저항성 검출을 통하여 원세포로부터 표적화 세포를 선별할 수 있다.
또 다른 구현예에 의하면,
상기 표적화 세포는 dCas9-리포터(deadCas9-Reporter; dCas9-Reporter)에 의하여 선별될 수 있다. 상기 리포터(Reporter)는 표지자를 포함할 수 있다. 상기 Reporter는, 예를 들어, 형광 표지자를 포함할 수 있다. 상기 리포터(Reporter)는 압타머(Aptamer) 및/또는 작용제(agent)를 더 포함할 수 있다. 상기 압타머(Aptamer) 및/또는 작용제(agent)는 특정 물질에 결합력(binding affinity)을 제공할 수 있다.
상기 압타머(Aptamer)는, 예를 들어, dCas9에 결합력(binding affinity)을 가지는 것일 수 있다.
상기 작용제(agent)는, 예를 들어, dCas9에 결합력(binding affinity)을 가지는 것일 수 있다. 상기 Agent는, 예를 들어, 항-dCas9 항체(anti-dCas9 antibody) 또는 항체 변이체(antibody variant)일 수 있다. 상기 항체 변이체(antibody variant)는, 예를 들어, Fab(antigen-binding fragment), F(ab)'2, 단일특이성 Fab2(Monospecific Fab2), 이중특이성 Fab2(Bispecific Fab2), 삼중특이성 Fab2(Trispecific Fab2), 1가 Ig(Monovalent Ig), scFv(single-chain variable fragment), 이중특이성 이중체(Bispecific Diabody), scFv-Fc(single-chain variable fragment-fragment crystallizable), Minibody, IgNAR(immunoglobulin new antigen receptor), V-NAR(Variable-New Antigen Receptor), hcIgG(heavy chain Immunoglobulin G), 및 VhH(variable domain of heavy chain antibody) 중 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 dCas9-리포터 검출을 위하여, 상기 표적화 세포에 gRNA 또는 이를 암호화하는 핵산을 처리할 수 있다.
상기 gRNA은 gRNA 표적 서열(gRNA target sequence)에 결합하는 것일 수 있다. 상기 gRNA 표적 서열(gRNA target sequence)은 gRNA에 대한 센스(sense) 서열을 포함할 수 있다. 상기 gRNA 표적 서열(gRNA target sequence)은 gRNA에 대한 안티센스(antisense) 서열을 포함할 수 있다. 상기 gRNA 표적 서열(gRNA target sequence)은 원염색체에는 존재하지 않으나, 표적화된 염색체에는 존재하는 서열 중 선택될 수 있다. 상기 gRNA 표적 서열(gRNA target sequence)은 donor DNA에 의하여 원염색체의 표적 서열에 삽입된 것일 수 있다. 상기 원염색체 및 상기 표적 서열은 전술하였다.
상기 gRNA 표적 서열 및/또는 gRNA의 후보군은 in silico 고안을 통하여 추출할 수 있다.
일 구체예에 의하면,
표적화 세포 및 원세포가 혼합된 배지(media)에서, dCas9-리포터(dCas9-Reporter) 검출에 의하여 상기 표적화 세포를 선별할 수 있다.
예를 들어, 상기 표적화 세포는 gRNA 표적 서열을 포함하는 표적화된 염색체를 포함할 수 있다. 이 때, gRNA, dCas9 및 리포터 압타머(Reporter Aptamer)를 처리하고, 상기 리포터 압타머(Reporter Aptamer)에 포함된 표지자 검출을 통하여 원세포로부터 표적화 세포를 선별할 수 있다.
2-5-2. 표적화 세포 선별 방법: inversion
본 명세서에 개시된 일 구현예에 의하면,
본 명세서에 개시된 2개의 donor DNA가 하나의 원염색체, 즉 하나의 대립 형질 유전자(allele)에 삽입되었는지 여부를 확인할 수 있는 방법이 제공된다.
일 예로, 제1 donor DNA 및 제2 donor DNA가 제1 원염색체, 즉 하나의 대립 형질 유전자(allele)에 삽입되었는지 여부를 확인할 수 있는 방법이 제공된다.
일 예로, 제3 donor DNA 및 제4 donor DNA가 제2 원염색체, 즉 하나의 대립 형질 유전자(allele)에 삽입되었는지 여부를 확인할 수 있는 방법이 제공된다.
상기 삽입 여부를 확인하기 위하여, 선발표지 유전자(selection marker gene)가 사용될 수 있다. 상기 선발표지 유전자(selection marker gene)는 donor DNA에 의하여 원염색체의 표적 서열에 삽입된 것일 수 있다. 상기 원염색체 및 상기 표적 서열은 전술하였다.
상기 삽입 여부를 확인하기 위하여, 상기 제1 donor DNA 및/또는 제2 donor DNA를 삽입 시, 선발표지 유전자(selection marker gene)를 역위 유전자 서열(inversion gene sequence)로 제공할 수 있다. 상기 제3 donor DNA 및/또는 제4 donor DNA를 삽입 시, 선발표지 유전자(selection marker gene)를 역위 유전자 서열(inversion gene sequence)로 제공할 수 있다.
상기 삽입 여부를 확인하기 위하여, 상기 제1 donor DNA 및 제2 donor DNA를 삽입 시, 역위(inversion)를 일으키는 RRS를 삽입할 수 있다. 상기 제3 donor DNA 및 제4 donor DNA를 삽입 시, 역위(inversion)를 일으키는 RRS를 삽입할 수 있다(도 16 내지 도 19).
상기 선발표지 유전자(selection marker gene)는 donor DNA에 의한 삽입 시 역위 유전자 서열 (inversion gene sequence)일 수 있다. 이 때, 상기 선발표지 유전자(selection marker gene)는 발현되지 않을 수 있다.
상기 선발표지 유전자(selection marker gene)는 RRS에 처리된 SSR에 의해 inversion될 수 있다. 이 때, 상기 RRS 및 SSR은 역위(inversion) 기작을 제공한다. 이 때, 상기 선발표지 유전자(selection marker gene)는 발현될 수 있다.
일 구현예에 의하면,
상기 2개의 donor DNA가 하나의 원염색체에 삽입된 표적화된 염색체를 포함하는 표적화 세포는 형광 단백질 검출에 의하여 선별될 수 있다.
상기 형광 단백질 유전자는 GFP 유전자(GFP gene), YFP 유전자(YFP gene), RFP 유전자(RFP gene) 또는 mCherry 유전자(mCherry gene) 중 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 구현예에 의하면,
상기 2개의 donor DNA가 하나의 원염색체에 삽입된 표적화된 염색체를 포함하는 표적화 세포는 항생제 저항성에 의하여 선별될 수 있다.
상기 항생제 저항성 유전자는 하이그로마이신 저항성 유전자(hygromycin resistant gene), 네오마이신 저항성 유전자(neomycin resistant gene), 카나마이신 저항성 유전자(kanamycin resistant gene), 블라스티사이딘 저항성 유전자(blasticidin resistant gene), 제오신 저항성 유전자(zeocin resistant gene) 또는 퓨로ΔTK 유전자(puroΔgene) 중 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
3. 마이크로세포(microcell) 및 이의 제조
본 명세서에 개시된 또 다른 양태에 의하면, 마이크로세포(microcell) 및 이의 제조 방법이 제공될 수 있다.
상기 마이크로세포는, 전술한 표적화된 염색체를 하나 또는 그 이상 포함할 수 있다. 상기 마이크로세포은 전술한 원염색체를 하나 또는 그 이상 더 포함할 수 있다.
상기 마이크로세포은 전술한 원염색체를 하나 또는 그 이상 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 마이크로세포는 제1 표적화된 염색체를 포함할 수 있다. 이 경우, 제1 표적 마이크로세포로 지칭하기로 한다. 상기 제1 표적 마이크로세포는 전술한 제1 표적화 세포로부터 제조될 수 있다. 상기 제1 표적화 세포로부터 마이크로셀화 되었으나, 제1 표적화된 염색체를 포함하지 않고, 원염색체만을 포함하는 마이크로세포를 제1 비표적 마이크로세포로 지칭하기로 한다. 상기 제1 비표적 마이크로세포는 전술한 원염색체를 하나 또는 그 이상 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 제1 표적 마이크로세포는 제1 표적화된 염색체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 제1 표적 마이크로세포는 제1 표적화된 염색체 및 원염색체를 포함할 수 있다. 상기 원염색체는 하나 또는 그 이상일 수 있다.
예를 들어, 상기 제1 비표적 마이크로세포는 하나의 원염색체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 제1 비표적 마이크로세포는 2 이상의 원염색체를 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 마이크로세포는 제2 표적화된 염색체를 포함할 수 있다. 이 경우, 제2 표적 마이크로세포로 지칭하기로 한다. 상기 제2 표적 마이크로세포는 전술한 제2 표적화 세포로부터 제조될 수 있다. 상기 제2 표적화 세포로부터 마이크로셀화 되었으나, 제2 표적화된 염색체를 포함하지 않고, 원염색체만을 포함하는 마이크로세포를 제2 비표적 마이크로세포로 지칭하기로 한다. 상기 제2 비표적 마이크로세포는 전술한 원염색체를 하나 또는 그 이상 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 제2 표적 마이크로세포는 제2 표적화된 염색체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 제2 표적 마이크로세포는 제2 표적화된 염색체 및 원염색체를 포함할 수 있다. 상기 원염색체는 하나 또는 그 이상일 수 있다.
예를 들어, 상기 제2 비표적 마이크로세포는 하나의 원염색체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 제2 비표적 마이크로세포는 2 이상의 원염색체를 포함할 수 있다.
세포로부터 마이크로세포를 제조하는 방법은 공지의 방법을 이용할 수 있고, 이는 문헌[Thorfinn Ege et al 1974; Thorfinn Ege et al 1977]에도 기재되어 있다.
일 구현예에 의하면,
상기 마이크로세포는 표적화 세포로부터 제조될 수 있다. 상기 표적화 세포는 전술하였다.
상기 마이크로세포는
표적화 세포에 미세소관 저해제를 처리하여 소핵 세포(micronucleated cell)를 제조하는 마이크로뉴클레이션(micronucleation); 및
상기 소핵 세포(micronucleated cell)에 미세섬유 저해제 처리 후 원심분리(centrifugation)하여 마이크로세포를 제조하는 이뉴클레이션(enucleation);
에 의해 제조될 수 있다.
이 때, 상기 미세소관 저해제는 미세소관의 신장을 저해하는 물질일 수 있다. 예를 들어, 상기 미세소관 저해제는 콜히친, 노코다졸 및 콜세미드(colcemid) 중 어느 하나 이상일 수 있다.
이 때, 상기 미세섬유 저해제는 미세섬유의 신장을 저해하는 물질일 수 있다. 예를 들어, 상기 미세섬유 저해제는 시토칼라신 B(cytochalasin B) 일 수 있다.
이 때, 상기 원심분리(centrifugation)는 페르콜 그래디언트(percoll gradient) 하에서 진행되는 것일 수 있다.
상기 마이크로뉴클레이션(micronucleation)에 의하여 상기 표적화 세포의 핵막은 2개 이상의 소낭으로 분리될 수 있다.
상기 이뉴클레이션(enucleation)에 의하여 상기 표적화 세포의 세포막은 2개 이상의 소낭으로 분리될 수 있다.
3-1. RRS가 삽입된 염색체를 포함하는 마이크로세포(RRS inserted chromosome included Microcell)
본 명세서에 개시된 일 실시예에 의하면, 표적화된 염색체를 포함하는 마이크로세포 및 이의 제조 방법이 제공될 수 있다. 상기 표적화된 염색체는 단일 RRS를 포함하는 것일 수 있다. 상기 표적화된 염색체는 2개 이상의 RRS를 포함하는 것일 수 있다.
상기 RRS 및 상기 표적화된 염색체는 전술하였다.
상기 RRS를 포함하는 표적화된 염색체를 포함하는 마이크로세포는 표적화 세포로부터 제조될 수 있다. 상기 표적화 세포는 RRS를 포함하는 표적화된 염색체를 포함하는 표적화 세포일 수 있다. 상기 RRS를 포함하는 표적화된 염색체는 전술하였다.
일 구현예에 의하면,
상기 마이크로세포는 표적화 세포로부터 제조될 수 있다. 상기 표적화 세포는 RRS를 포함하는 표적화된 염색체를 포함할 수 있다.
상기 마이크로세포는
RRS를 포함하는 표적화된 염색체를 포함하는 표적화 세포에 미세소관 저해제를 처리하여 소핵 세포(micronucleated cell)를 제조하는 마이크로뉴클레이션(micronucleation); 및
상기 소핵 세포(micronucleated cell)에 미세섬유 저해제 처리 후 원심분리(centrifugation)하여 마이크로세포를 제조하는 이뉴클레이션(enucleation);
에 의해 제조될 수 있다.
이 때, 상기 미세소관 저해제는 미세소관의 신장을 저해하는 물질일 수 있다. 예를 들어, 상기 미세소관 저해제는 콜히친, 노코다졸 및 콜세미드(colcemid) 중 어느 하나 이상일 수 있다.
이 때, 상기 미세섬유 저해제는 미세섬유의 신장을 저해하는 물질일 수 있다. 예를 들어, 상기 미세섬유 저해제는 시토칼라신 B(cytochalasin B)일 수 있다.
이 때, 상기 원심분리(centrifugation)는 페르콜 그래디언트(percoll gradient) 하에서 진행되는 것일 수 있다.
일 구체예에 의하면,
상기 RRS를 포함하는 표적화된 염색체는 상기 표 1에 개시된 LoxP 변이체 중 어느 하나를 포함한 것일 수 있다.
다른 구현예에 의하면,
상기 마이크로세포는 하나의 염색체를 포함하는 마이크로세포로 제조될 수 있다. 상기 하나의 염색체는 RRS를 포함하는 표적화된 염색체일 수 있다. 상기 하나의 염색체는 원염색체일 수 있다.
상기 하나의 염색체를 포함하는 마이크로세포는
RRS를 포함하는 표적화된 염색체를 포함하는 표적화 세포에 미세소관 저해제를 처리하여 소핵 세포(micronucleated cell)를 제조하는 마이크로뉴클레이션(micronucleation);
상기 소핵 세포(micronucleated cell)에 미세섬유 저해제 처리 후 원심분리(centrifugation)하여 마이크로세포를 제조하는 이뉴클레이션(enucleation); 및
상기 마이크로세포(microcell)의 여과(filtration);
에 의해 제조될 수 있다.
이 때, 상기 미세소관 저해제는 미세소관의 신장을 저해하는 물질일 수 있다. 예를 들어, 상기 미세소관 저해제는 콜히친, 노코다졸 및 콜세미드(colcemid) 중 어느 하나 이상일 수 있다.
이 때, 상기 미세섬유 저해제는 미세섬유의 신장을 저해하는 물질일 수 있다. 예를 들어, 상기 미세섬유 저해제는 시토칼라신 B(cytochalasin B)일 수 있다.
이 때, 상기 원심분리(centrifugation)은 페르콜 그래디언트(percoll gradient) 하에서 진행되는 것일 수 있다.
이 때, 상기 여과(filtration)는 막 여과(membrane filter)에 의한 것일 수 있다.
상기 막 여과(membrane filter)의 공극 크기(pore size)는 3 내지 10μm일 수 있다.
상기 막여과(membrane filter)의 공극 크기(pore size)는 5 내지 8μm일 수 있다.
또 다른 구현예에 의하면,
상기 마이크로세포는 두 개의 염색체를 포함하는 마이크로세포로 제조될 수 있다. 상기 두 개 염색체는 RRS를 포함하는 표적화된 염색체 및/또는 원염색체일 수 있다.
상기 두 개의 염색체를 포함하는 마이크로세포는
RRS를 포함하는 표적화된 염색체를 두 개 이상 포함하는 표적화 세포에 미세소관 저해제를 처리하여 소핵 세포(micronucleated cell)를 제조하는 마이크로뉴클레이션(micronucleation);
상기 소핵 세포(micronucleated cell)에 미세섬유 저해제 처리 후 원심분리(centrifugation)하여 마이크로세포를 제조하는 이뉴클레이션(enucleation); 및
상기 마이크로세포(microcell)의 여과(filtration);
에 의해 제조될 수 있다.
이 때, 상기 미세소관 저해제는 미세소관의 신장을 저해하는 물질일 수 있다. 예를 들어, 상기 미세소관 저해제는 콜히친, 노코다졸 및 콜세미드(colcemid) 중 어느 하나 이상일 수 있다.
이 때, 상기 미세섬유 저해제는 미세섬유의 신장을 저해하는 물질일 수 있다. 예를 들어, 상기 미세섬유 저해제는 시토칼라신 B(cytochalasin B)일 수 있다.
이 때, 상기 원심분리(centrifugation)는 페르콜 그래디언트(percoll gradient) 하에서 진행되는 것일 수 있다.
이 때, 상기 여과(filtration)는 막 여과(membrane filter)에 의한 것일 수 있다.
상기 막 여과(membrane filter)의 공극 크기(pore size)는 8 내지 15μm일 수 있다.
또 다른 구현예에 의하면,
상기 마이크로세포는 세 개의 염색체를 포함하는 마이크로세포로 제조될 수 있다. 상기 세 개의염색 염색체는 RRS를 포함하는 표적화된 염색체 및/또는 원염색체일 수 있다.
상기 세 개의 염색체를 포함하는 마이크로세포는
RRS를 포함하는 표적화된 염색체를 두 개 이상 포함하는 표적화 세포에 미세소관 저해제를 처리하여 소핵 세포(micronucleated cell)를 제조하는 마이크로뉴클레이션(micronucleation);
상기 소핵 세포(micronucleated cell)에 미세섬유 저해제 처리 후 원심분리(centrifugation)하여 마이크로세포를 제조하는 이뉴클레이션(enucleation); 및
상기 마이크로세포(microcell)의 여과(filtration);
에 의해 제조될 수 있다.
이 때, 상기 미세소관 저해제는 미세소관의 신장을 저해하는 물질일 수 있다. 예를 들어, 상기 미세소관 저해제는 콜히친, 노코다졸 및 콜세미드(colcemid) 중 어느 하나 이상일 수 있다.
이 때, 상기 미세섬유 저해제는 미세섬유의 신장을 저해하는 물질일 수 있다. 예를 들어, 상기 미세섬유 저해제는 시토칼라신 B(cytochalasin B) 일 수 있다.
이 때, 상기 원심분리(centrifugation)는 페르콜 그래디언트(percoll gradient) 하에서 진행되는 것일 수 있다.
이 때, 상기 여과(filtration)는 막 여과(membrane filter)에 의한 것일 수 있다.
상기 막 여과(membrane filter)의 공극 크기(pore size)는 12 내지 20μm일 수 있다.
상기 마이크로세포에 포함된 염색체의 개수는 개시된 구현예에 제한되는 것은 아니다. 상기 마이크로세포에 포함된 염색체의 개수는 막 여과 공극 크기(membrane filter pore size)에 의하여 선별될 수 있다.
3-2. ASCE가 삽입된 염색체를 포함하는 마이크로세포(ASCE inserted chromosome included Microcell)
본 명세서에 개시된 또 다른 실시예에 의하면, 표적화된 염색체를 포함하는 마이크로세포 및 이의 제조 방법이 제공될 수 있다. 상기 표적화된 염색체는 단일 ASCE를 포함하는 것일 수 있다. 상기 표적화된 염색체는 2 이상의 ASCE를 포함하는 것일 수 있다.
상기 ASCE 및 상기 표적화된 염색체는 전술하였다.
상기 ASCE를 포함하는 표적화된 염색체를 포함하는 마이크로세포는 표적화 세포로부터 제조될 수 있다. 상기 표적화 세포는 ASCE를 포함하는 표적화된 염색체를 포함하는 표적화 세포일 수 있다. 상기 ASCE를 포함하는 표적화된 염색체는 전술하였다.
일 구현예에 의하면,
상기 마이크로세포는 표적화 세포로부터 제조될 수 있다. 상기 표적화 세포는 ASCE를 포함하는 표적화된 염색체를 포함할수 있다.
상기 마이크로세포는
ASCE를 포함하는 표적화된 염색체를 포함하는 표적화 세포에 미세소관 저해제를 처리하여 소핵 세포(micronucleated cell)를 제조하는 마이크로뉴클레이션(micronucleation); 및
상기 소핵 세포(micronucleated cell)에 미세섬유 저해제 처리 후 원심분리(centrifugation)하여 마이크로세포를 제조하는 이뉴클레이션(enucleation);
에 의해 제조될 수 있다.
이 때, 상기 미세소관 저해제는 미세소관의 신장을 저해하는 물질일 수 있다. 예를 들어, 상기 미세소관 저해제는 콜히친, 노코다졸 및 콜세미드(colcemid) 중 어느 하나 이상일 수 있다.
이 때, 상기 미세섬유 저해제는 미세섬유의 신장을 저해하는 물질일 수 있다. 예를 들어, 상기 미세섬유 저해제는 시토칼라신 B(cytochalasin B) 일 수 있다.
이 때, 상기 원심분리(centrifugation)는 페르콜 그래디언트(percoll gradient)하에서 진행되는 것일 수 있다.
다른 구현예에 의하면,
상기 마이크로세포는 하나의 염색체를 포함하는 마이크로세포로 제조될 수 있다. 상기 하나의 염색체는 ASCE를 포함하는 표적화된 염색체일 수 있다. 상기 하나의 염색체는 원염색체일 수 있다.
상기 하나의 염색체를 포함하는 마이크로세포는
ASCE를 포함하는 표적화된 염색체를 포함하는 표적화 세포에 미세소관 저해제를 처리하여 소핵 세포(micronucleated cell)를 제조하는 마이크로뉴클레이션(micronucleation);
상기 소핵 세포(micronucleated cell)에 미세섬유 저해제 처리 후 원심분리(centrifugation)하여 마이크로세포를 제조하는 이뉴클레이션(enucleation); 및
상기 마이크로세포(microcell)의 여과(filtration);
에 의해 제조될 수 있다.
이 때, 상기 미세소관 저해제는 미세소관의 신장을 저해하는 물질일 수 있다. 예를 들어, 상기 미세소관 저해제는 콜히친, 노코다졸 및 콜세미드(colcemid) 중 어느 하나 이상일 수 있다.
이 때, 상기 미세섬유 저해제는 미세섬유의 신장을 저해하는 물질일 수 있다. 예를 들어, 상기 미세섬유 저해제는 시토칼라신 B(cytochalasin B)일 수 있다.
이 때, 상기 원심분리(centrifugation)는 페르콜 그래디언트(percoll gradient) 하에서 진행되는 것일 수 있다.
이 때, 상기 여과(filtration)는 막 여과(membrane filter)에 의한 것일 수 있다.
상기 막 여과(membrane filter)의 공극 크기(pore size)는 3 내지 10μm일 수 있다. 상기 막여과(membrane filter)의 공극 크기(pore size)는 5 내지 8μm일 수 있다.
또 다른 구현예에 의하면,
상기 마이크로세포는 두 개의 염색체를 포함하는 마이크로세포로 제조될 수 있다. 상기 두 개의염색 염색체는 ASCE를 포함하는 표적화된 염색체 및/또는 원염색체일 수 있다.
상기 두 개의 염색체를 포함하는 마이크로세포는
ASCE를 포함하는 표적화된 염색체를 두 개 이상 포함하는 표적화 세포에 미세소관 저해제를 처리하여 소핵 세포(micronucleated cell)를 제조하는 마이크로뉴클레이션(micronucleation);
상기 소핵 세포(micronucleated cell)에 미세섬유 저해제 처리 후 원심분리(centrifugation)하여 마이크로세포를 제조하는 이뉴클레이션(enucleation); 및
상기 마이크로세포(microcell)의 여과(filtration);
에 의해 제조될 수 있다.
이 때, 상기 미세소관 저해제는 미세소관의 신장을 저해하는 물질일 수 있다. 예를 들어, 상기 미세소관 저해제는 콜히친, 노코다졸 및 콜세미드(colcemid) 중 어느 하나 이상일 수 있다.
이 때, 상기 미세섬유 저해제는 미세섬유의 신장을 저해하는 물질일 수 있다. 예를 들어, 상기 미세섬유 저해제는 시토칼라신 B(cytochalasin B) 일 수 있다.
이 때, 상기 원심분리(centrifugation)는 페르콜 그래디언트(percoll gradient) 하에서 진행되는 것일 수 있다.
이 때, 상기 여과(filtration)는 막 여과(membrane filter)에 의한 것일 수 있다.
상기 막 여과(membrane filter)의 공극 크기(pore size)는 8 내지 15μm일 수 있다.
또 다른 구현예에 의하면,
상기 마이크로세포는 세 개의 염색체를 포함하는 마이크로세포로 제조될 수 있다. 상기 세 개의염색 염색체는 ASCE를 포함하는 표적화된 염색체 및/또는 원염색체일 수 있다.
상기 세 개의 염색체를 포함하는 마이크로세포는
ASCE를 포함하는 표적화된 염색체를 두 개 이상 포함하는 표적화 세포에 미세소관 저해제를 처리하여 소핵 세포(micronucleated cell)를 제조하는 마이크로뉴클레이션(micronucleation);
상기 소핵 세포(micronucleated cell)에 미세섬유 저해제 처리 후 원심분리(centrifugation)하여 마이크로세포를 제조하는 이뉴클레이션(enucleation); 및
상기 마이크로세포(microcell)의 여과(filtration);
에 의해 제조될 수 있다.
이 때, 상기 미세소관 저해제는 미세소관의 신장을 저해하는 물질일 수 있다. 예를 들어, 상기 미세소관 저해제는 콜히친, 노코다졸 및 콜세미드(colcemid) 중 어느 하나 이상일 수 있다.
이 때, 상기 미세섬유 저해제는 미세섬유의 신장을 저해하는 물질일 수 있다. 예를 들어, 상기 미세섬유 저해제는 시토칼라신 B(cytochalasin B) 일 수 있다.
이 때, 상기 원심분리(centrifugation)는 페르콜 그래디언트(percoll gradient) 하에서 진행되는 것일 수 있다.
이 때, 상기 여과(filtration)는 막 여과(membrane filter)에 의한 것일 수 있다.
상기 막 여과(membrane filter)의 공극 크기(pore size)는 12 내지 20μm일 수 있다.
상기 마이크로세포에 포함된 염색체의 개수는 개시된 구현예에 제한되는 것은 아니다. 상기 마이크로세포에 포함된 염색체의 개수는 막 여과 공극 크기(membrane filter pore size)에 의하여 선별될 수 있다.
3-3. 마이크로세포 선별 방법(microcell selection method)
본 명세서에 개시된 또 다른 실시예에 의하면, 표적화된 염색체를 포함하는 표적 마이크로세포의 선별 방법이 제공될 수 있다.
상기 표적 마이크로세포는, 전술한 표적화된 염색체를 하나 또는 그 이상 포함할 수 있다. 상기 표적 마이크로세포은 전술한 원염색체를 하나 또는 그 이상 더 포함할 수 있다.
상기 비표적 마이크로세포은 전술한 원염색체를 하나 또는 그 이상 포함할 수 있다.
상기 표적화된 염색체는 RRS 및/또는 ASCE를 포함하는 것일 수 있다.
상기 RRS, 상기 ASCE, 상기 표적화된 염색체, 상기 원염색체, 상기 표적 마이크로세포 및 상기 비표적 마이크로세포는 전술하였다.
일 구현예에 의하면,
상기 표적 마이크로세포는 dCas9-리포터(dead Cas9-Reporter; dCas9-Reporter)에 의하여 선별될 수 있다. 상기 dCas9-리포터는 전술하였다.
상기 dCas9-리포터 검출을 위하여, 상기 표적 마이크로세포 및 비표적 마이크로세포에 gRNA 또는 이를 암호화하는 핵산을 처리할 수 있다.
상기 gRNA은 gRNA 표적 서열(gRNA target sequence)에 결합하는 것일 수 있다. 상기 gRNA 표적 서열(gRNA target sequence)은 gRNA에 대한 센스(sense) 서열을 포함할 수 있다. 상기 gRNA 표적 서열(gRNA target sequence)은 gRNA에 대한 안티센스(antisense) 서열을 포함할 수 있다. 상기 gRNA 표적 서열(gRNA target sequence)은 원염색체에는 존재하지 않으나, 표적화된 염색체에는 존재하는 서열 중 선택될 수 있다. 상기 gRNA 표적 서열(gRNA target sequence)은 donor DNA에 의하여 원염색체의 표적 서열에 삽입된 것일 수 있다. 상기 원염색체 및 상기 표적 서열은 전술하였다.
상기 gRNA 표적 서열 및/또는 gRNA의 후보군은 in silico 고안을 통하여 추출할 수 있다.
일 구체예에 의하면,
표적 마이크로세포 및 비표적 마이크로세포가 혼합된 배지(media)에서, dCas9-리포터 검출에 의하여 상기 표적 마이크로세포를 선별할 수 있다.
예를 들어, 상기 표적 마이크로세포는 gRNA 표적 서열을 포함하는 표적화된 염색체를 포함할 수 있다. 이 때, gRNA, dCas9 및 리포터를 처리하고, 상기 리포터에 포함된 표지자 검출을 통하여 비표적 마이크로세포로부터 표적 마이크로세포를 선별할 수 있다.
4. 제1 융합 세포(a first fusion cell) 및 이의 제조
본 명세서에 개시된 또 다른 양태에 의하면, 제1 융합 세포(a first fusion cell) 및 이의 제조 방법이 제공될 수 있다.
상기 제1 융합 세포는, 전술한 표적화된 염색체를 2개 또는 그 이상 포함할 수 있다. 상기 제1 융합 세포는 전술한 원염색체를 하나 또는 그 이상 더 포함할 수 있다.
상기 제1 융합 세포는, 전술한 제1 표적화된 염색체 및 제2 표적화된 염색체를 가질 수 있다. 상기 제1 융합 세포는 전술한 원염색체를 하나 또는 그 이상 더 포함할 수 있다.
상기 제1 융합 세포는, 전술한 표적화된 염색체를 3개 또는 그 이상 포함할 수 있다. 상기 제1 융합 세포는 전술한 원염색체를 하나 또는 그 이상 더 포함할 수 있다.
상기 제1 융합 세포는, 상기 마이크로세포 및 상기 표적화 세포를 융합하여 제조할 수 있다. 상기 마이크로세포 및 상기 표적화 세포는 전술하였다.
상기 마이크로세포 및 상기 표적화 세포를 융합하여 제1 융합 세포를 제조하는 방법은 공지의 방법을 이용할 수 있고, 이는 문헌[Fournier RE et al 1977; McNeill CA et al 1980]에도 기재되어 있다. 예로써, Tomizuka et al., Nature Genetics, 16: 133 (1997)을 참조한다.
일 구현예에 의하면,
상기 제1 융합 세포는 상기 표적 마이크로세포 및 상기 표적화 세포를 융합하여 제조할 수 있다.
상기 제1 융합 세포는
표적 마이크로세포 및 표적화 세포를 인접시키고; 및
상기 표적 마이크로세포 및 표적화 세포에 양전하성 표면활성물질을 처리;
하여 제조할 수 있다.
이 때, 상기 양전하성 표면활성물질은 PEG(polyethylene glycol)일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 제1 융합 세포를 제작하기 위하여 제공되는 상기 표적 마이크로세포는 제1 표적 마이크로세포일 수 있다. 상기 제1 표적 마이크로세포는 1개일 수 있다. 상기 제1 표적 마이크로세포는 복수개일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 제1 융합 세포를 제작하기 위하여 제공되는 상기 표적 마이크로세포는 제1 표적 마이크로세포 및 제2 표적 마이크로세포일 수 있다. 상기 제1 표적 마이크로세포 및 상기 제2 마이크로세포는 각각 하나 또는 그 이상일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 제1 융합 세포를 제작하기 위하여 제공되는 상기 표적 마이크로세포는 복수의 표적 마이크로세포일 수 있다. 상기 표적 마이크로세포는 제1 마이크로세포, 제2 마이크로세포, 제3 마이크로세포 내지 제n 마이크로세포일 수 있다. 상기 제1 마이크로세포, 제2 마이크로세포, 제3 마이크로세포 내지 제n 마이크로세포는 순차적으로 제공될 수 있다. 상기 제1 마이크로세포, 제2 마이크로세포, 제3 마이크로세포 내지 제n 마이크로세포는 무작위적으로 제공될 수 있다.
다른 구현예에 의하면,
상기 제1 융합 세포는 표적 마이크로세포 및 상기 표적화 세포를 융합하여 제조할 수 있다.
상기 제1 융합 세포는
표적 마이크로세포 및 표적화 세포를 인접시키고; 및
상기 표적 마이크로세포 및 상기 표적화 세포에 미토겐(Mitogen) 및 양전하성 표면활성물질을 처리;
하여 제조할 수 있다.
이 때, 상기 미토겐(Mitogen)은 PHA-P(phytohemagglutinin-P)일 수 있다.
이 때, 상기 양전하성 표면활성물질은 PEG(polyethylene glycol)일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 제1 융합 세포를 제작하기 위하여 제공되는 상기 표적 마이크로세포는 제1 표적 마이크로세포일 수 있다. 상기 제1 표적 마이크로세포는 1개일 수 있다. 상기 제1 표적 마이크로세포는 복수개일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 제1 융합 세포를 제작하기 위하여 제공되는 상기 표적 마이크로세포는 제1 표적 마이크로세포 및 제2 표적 마이크로세포일 수 있다. 상기 제1 표적 마이크로세포 및 상기 제2 마이크로세포는 각각 하나 또는 그 이상일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 제1 융합 세포를 제작하기 위하여 제공되는 상기 표적 마이크로세포는 복수의 표적 마이크로세포일 수 있다. 상기 표적 마이크로세포는 제1 마이크로세포, 제2 마이크로세포, 제3 마이크로세포 내지 제n 마이크로세포일 수 있다. 상기 제1 마이크로세포, 제2 마이크로세포, 제3 마이크로세포 내지 제n 마이크로세포는 순차적으로 제공될 수 있다. 상기 제1 마이크로세포, 제2 마이크로세포, 제3 마이크로세포 내지 제n 마이크로세포는 무작위적으로 제공될 수 있다.
4-1. RRS가 삽입된 염색체를 포함하는 제1 융합 세포(RRS inserted chromosome included a first fusion cell)
본 명세서에 개시된 일 실시예에 의하면, RRS를 포함하는 표적화된 염색체를 2개 또는 그 이상 포함하는 제1 융합 세포(a first fusion cell) 및 이의 제조 방법이 제공될 수 있다.
상기 제1 융합 세포는 전술한 원염색체를 하나 또는 그 이상 더 포함할 수 있다.
상기 RRS를 포함하는 표적화된 염색체는 제1 표적화된 염색체일 수 있다.
상기 RRS를 포함하는 표적화된 염색체는 제2 표적화된 염색체일 수 있다.
상기 제1 표적화된 염색체는 제1 표적화 세포로부터 제공된 것일 수 있다. 상기 제1 표적화된 염색체는 제1 표적 마이크로세포로부터 제공된 것일 수 있다.
상기 제2 표적화된 염색체는 제2 표적화 세포로부터 제공된 것일 수 있다.
일 구체예에 의하면,
상기 RRS를 포함하는 제1 표적화된 염색체 및/또는 상기 RRS를 포함하는 제2 표적화된 염색체는 상기 표 1에 개시된 LoxP 변이체 중 어느 하나 이상을 포함한 것일 수 있다.
4-2. ASCE가 삽입된 염색체를 포함하는 제1 융합 세포(ASCE inserted chromosome included a first fusion cell)
본 명세서에 개시된 다른 실시예에 의하면, ASCE를 포함하는 표적화된 염색체를 2개 또는 그 이상 포함하는 제1 융합 세포(a first fusion cell) 및 이의 제조 방법이 제공될 수 있다.
상기 제1 융합 세포는 전술한 원염색체를 하나 또는 그 이상 더 포함할 수 있다.
상기 단일 ASCE를 포함하는 표적화된 염색체는 제1 표적화된 염색체일 수 있다.
상기 단일 ASCE를 포함하는 표적화된 염색체는 제2 표적화된 염색체일 수 있다.
상기 제1 표적화된 염색체는 제1 표적화 세포로부터 제공된 것일 수 있다. 상기 제1 표적화된 염색체는 제1 표적 마이크로세포로부터 제공된 것일 수 있다.
상기 제2 표적화된 염색체는 제2 표적화 세포로부터 제공된 것일 수 있다.
4-3. 제1 융합 세포 선별 방법(a first fusion cell selection method)
본 명세서에 개시된 또 다른 실시예에 의하면, 2개의 표적화된 염색체를 포함하는 제1 융합 세포의 선별 방법이 제공될 수 있다. 상기 제1 융합 세포는 원염색체를 더 포함할 수 있다.
상기 표적화된 염색체는 RRS 및/또는 ASCE를 포함하는 것일 수 있다.
상기 2개의 표적화된 염색체 중 하나는 표적 마이크로세포로부터 제공된 것일 수 있다.
상기 2개의 표적화된 염색체 중 하나는 표적화 세포로부터 제공된 것일 수 있다.
상기 RRS, 상기 ASCE, 상기 표적화된 염색체 및 상기 마이크로세포는 전술하였다.
일 구현예에 의하면,
상기 제1 융합 세포는 형광 단백질 검출에 의하여 선별될 수 있다.
상기 형광 단백질 검출을 위하여, 상기 제1 융합 세포에 포함된 표적화된 염색체는 형광 단백질 유전자를 포함할 수 있다.
상기 형광 단백질 유전자는 GFP 유전자(GFP gene), YFP 유전자(YFP gene), RFP 유전자(RFP gene) 또는 mCherry 유전자(mCherry gene) 중 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체예에 의하면,
상기 제1 융합 세포 및 상기 제2 표적화 세포가 혼합된 media에서, 형광 단백질의 검출에 의하여 상기 제1 융합 세포를 선별할 수 있다.
예를 들어, 상기 제2 표적화 세포는 mCherry 유전자(mCherry gene)이 삽입된 제2 표적화된 염색체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 제1 융합 세포는 GFP 유전자(GFP gene)가 삽입된 제1 표적화된 염색체 및 mCherry 유전자(mCherry gene)가 삽입된 제2 표적화된 염색체를 포함할 수 있다. 상기 제1 표적화된 염색체는 제1 표적 마이크로세포로부터 제공된 것일 수 있다. 상기 제1 표적 마이크로세포는 제1 표적화 세포로부터 제공된 것일 수 있다. 상기 제2 표적화된 염색체는 제2 표적화 세포로부터 제공된 것일 수 있다.
이 때, mCherry 형광(mCherry fluorescence)의 검출을 통하여 제1 융합 세포로부터 제2 표적화 세포를 선별할 수 있다.
이 때, 황색 형광(Yellow fluorescence)의 검출을 통하여 제2 표적화 세포로부터 제1 융합 세포를 선별할 수 있다. 상기 황색 형광(Yellow fluorescence)은 녹색 형광(Green fluorescence) 및 mCherry 형광(mCherry fluorescence)이 혼합되어 육안 및/또는 기기에 황색(Yellow)으로 검출 되는 것이다.
다른 구체예에 의하면,
상기 제1 융합 세포 및 상기 제1 표적화 세포가 혼합된 배지(media)에서, 형광 단백질의 검출에 의하여 상기 제1 융합 세포를 선별할 수 있다.
예를 들어, 상기 제1 표적화 세포는 GFP 유전자(GFP gene)가 삽입된 제1 표적화된 염색체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 제1 융합 세포는 GFP 유전자(GFP gene)가 삽입된 제1 표적화된 염색체 및 mCherry 유전자(mCherry gene)가 삽입된 제2 표적화된 염색체를 포함할 수 있다. 상기 제2 표적화된 염색체는 제1 마이크로세포로부터 제공된 것일 수 있다. 상기 제1 마이크로세포는 제2 표적화 세포로부터 제공된 것일 수 있다. 상기 제1 표적화된 염색체는 제1 표적화 세포로부터 제공된 것일 수 있다.
이 때, 녹색 형광(Green fluorescence)의 검출을 통하여 제1 융합 세포로부터 제1 표적화 세포를 선별할 수 있다.
이 때, 황색 형광(Yellow fluorescence)의 검출을 통하여 제1 표적화 세포로부터 제1 융합 세포를 선별할 수 있다. 상기 황색 형광(Yellow fluorescence)은 녹색 형광(Green fluorescence) 및 mCherry 형광(mCherry fluorescence)이 혼합되어 육안 및/또는 기기에 황색(Yellow)으로 검출 되는 것이다.
또 다른 구체예에 의하면,
상기 제1 융합 세포 및 대조군 융합 세포가 혼합된 배지(media)에서, 형광 단백질의 검출에 의하여 상기 제1 융합 세포를 선별할 수 있다.
상기 대조군 융합 세포는 원염색체만을 포함하는 비표적 마이크로세포 및 표적화 세포의 융합 세포이다.
일 예로, 상기 대조군 융합 세포는 제1 비표적 마이크로세포 및 제2 표적화 세포의 융합 세포일 수 있다.
예를 들어, 상기 대조군 융합 세포는 mCherry 유전자(mCherry gene)가 삽입된 제2 표적화된 염색체를 포함할 수 있다. 상기 제2 표적화된 염색체는 제2 표적화 세포로부터 제공된 것일 수 있다. 상기 대조군 융합 세포에 포함된 원염색체는 제1 비표적 마이크로세포 및/또는 상기 제2 표적화 세포로부터 제공된 것일 수 있다. 상기 제1 비표적 마이크로세포는 제1 표적화 세포로부터 제조된 것일 수 있다.
상기 제1 융합 세포는 GFP gene이 삽입된 제1 표적화된 염색체 및 mCherry 유전자(mCherry gene)가 삽입된 제2 표적화된 염색체를 포함할 수 있다. 상기 제1 표적화된 염색체는 제1 표적 마이크로세포로부터 제공된 것일 수 있다. 상기 제1 표적 마이크로세포는 제1 표적화 세포로부터 제공된 것일 수 있다. 상기 제2 표적화된 염색체는 제2 표적화 세포로부터 제공된 것일 수 있다.
이 때, mCherry 형광(mCherry fluorescence)의 검출을 통하여 제1 융합 세포로부터 대조군 융합 세포를 선별할 수 있다.
이 때, 황색 형광(Yellow fluorescence)의 검출을 통하여 대조군 융합 세포로부터 제1 융합 세포를 선별할 수 있다. 상기 황색 형광(Yellow fluorescence)는 녹색 형광(Green fluorescence) 및 mCherry 형광(mCherry fluorescence)이 혼합되어 육안 및/또는 기기에 황색(Yellow)으로 검출 되는 것이다.
일 예로, 상기 대조군 융합 세포는 제2 비표적 마이크로세포 및 제1 표적화 세포의 융합 세포일 수 있다.
예를 들어, 상기 대조군 융합 세포는 GFP 유전자(GFP gene)가 삽입된 제1 표적화된 염색체를 포함할 수 있다. 상기 제1 표적화된 염색체는 제1 표적화 세포로부터 제공된 것일 수 있다. 상기 대조군 융합 세포에 포함된 원염색체는 제2 비표적 마이크로세포 및/또는 상기 제1 표적화 세포로부터 제공된 것일 수 있다. 상기 제2 비표적 마이크로세포는 제2 표적화 세포로부터 제조된 것일 수 있다.
상기 제1 융합 세포는 GFP 유전자(GFP gene)가 삽입된 제1 표적화된 염색체 및 mCherry 유전자(mCherry gene)가 삽입된 제2 표적화된 염색체를 포함할 수 있다. 상기 제1 표적화된 염색체는 제1 표적화 세포로부터 제공된 것일 수 있다. 상기 제2 표적화된 염색체는 제1 표적 마이크로세포로부터 제공된 것일 수 있다. 상기 제1 마이크로세포는 제2 표적화 세포로부터 제공된 것일 수 있다.
이 때, 녹색 형광(Green fluorescence)의 검출을 통하여 제1 융합 세포로부터 대조군 융합 세포를 선별할 수 있다.
이 때, 황색 형광(Yellow fluorescence)의 검출을 통하여 대조군 융합 세포로부터 제1 융합 세포를 선별할 수 있다. 상기 황색 형광(Yellow fluorescence)는 녹색 형광(Green fluorescence) 및 mCherry 형광(mCherry fluorescence)이 혼합되어 육안 및/또는 기기에 황색(Yellow)으로 검출 되는 것이다.
다른 구현예에 의하면,
상기 제1 융합 세포는 항생제 저항성에 의하여 선별될 수 있다.
상기 항생제 저항성 검출을 위하여, 상기 제1 융합 세포에 포함된 표적화된 염색체는 항생제 저항성 유전자를 포함할 수 있다.
상기 항생제 저항성 유전자는 하이그로마이신 저항성 유전자(hygromycin resistant gene), 네오마이신 저항성 유전자(neomycin resistant gene), 카나마이신 저항성 유전자(kanamycin resistant gene), 블라스티사이딘 저항성 유전자(blasticidin resistant gene), 제오신 저항성 유전자(zeocin resistant gene) 또는 퓨로ΔTK 유전자(puroΔgene) 중 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체예에 의하면,
상기 제1 융합 세포 및 상기 제2 표적화 세포가 혼합된 배지(media)에서, 항생제 저항성 검출에 의하여 상기 제1 융합 세포를 선별할 수 있다.
예를 들어, 상기 제2 표적화 세포는 하이그로마이신 저항성 유전자(hygromycin resistant gene)가 삽입된 제2 표적화된 염색체를 포함할 수 있다.
상기 제1 융합 세포는 네오마이신 저항성 유전자(neomycin resistant gene)가 삽입된 제1 표적화된 염색체 및 하이그로마이신 저항성 유전자(hygromycin resistant gene)가 삽입된 제2 표적화된 염색체를 포함할 수 있다. 상기 제1 표적화된 염색체는 제1 표적 마이크로세포로부터 제공된 것일 수 있다. 상기 제1 표적 마이크로세포는 제1 표적화 세포로부터 제공된 것일 수 있다. 상기 제2 표적화된 염색체는 제2 표적화 세포로부터 제공된 것일 수 있다.
이 때, 네오마이신(neomycin)에 대한 항생제 저항성 검출을 통하여 제2 표적화 세포로부터 제1 융합 세포를 선별할 수 있다.
예를 들어, 상기 제2 표적화 세포는 하이그로마이신 저항성 유전자(hygromycin resistant gene)가 삽입된 제2 표적화된 염색체를 포함할 수 있다.
상기 제1 융합 세포는 카나마이신 저항성 유전자(kanamycin resistant gene)가 삽입된 제1 표적화된 염색체 및 하이그로마이신 저항성 유전자(hygromycin resistant gene)가 삽입된 제2 표적화된 염색체를 포함할 수 있다. 상기 제1 표적화된 염색체는 제1 표적 마이크로세포로부터 제공된 것일 수 있다. 상기 제1 표적 마이크로세포는 제1 표적화 세포로부터 제공된 것일 수 있다. 상기 제2 표적화된 염색체는 제2 표적화 세포로부터 제공된 것일 수 있다.
이 때, 카나마이신(kanamycin)에 대한 항생제 저항성 검출을 통하여 제2 표적화 세포로부터 제1 융합 세포를 선별할 수 있다.
다른 구체예에 의하면,
상기 제1 융합 세포 및 상기 제1 표적화 세포가 혼합된 배지(media)에서, 항생제 저항성 검출에 의하여 상기 제1 융합 세포를 선별할 수 있다.
예를 들어, 상기 제1 표적화 세포는 네오마이신 저항성 유전자(neomycin resistant gene)가 삽입된 제1 표적화된 염색체를 포함할 수 있다.
상기 제1 융합 세포는 네오마이신 저항성 유전자(neomycin resistant gene)가 삽입된 제1 표적화된 염색체 및 하이그로마이신 저항성 유전자(hygromycin resistant gene)가 삽입된 제2 표적화된 염색체를 포함할 수 있다. 상기 제2 표적화된 염색체는 제2 표적 마이크로세포로부터 제공된 것일 수 있다. 상기 제2 표적 마이크로세포는 제2 표적화 세포로부터 제공된 것일 수 있다. 상기 제2 표적화된 염색체는 제2 표적화 세포로부터 제공된 것일 수 있다.
이 때, 하이그로마이신(hygromycin)에 대한 항생제 저항성 검출을 통하여 제1 표적화 세포로부터 제1 융합 세포를 선별할 수 있다.
예를 들어, 상기 제1 표적화 세포는 카나마이신 저항성 유전자(kanamycin resistant gene)가 삽입된 제2 표적화된 염색체를 포함할 수 있다.
상기 제1 융합 세포는 카나마이신 저항성 유전자(kanamycin resistant gene)가 삽입된 제1 표적화된 염색체 및 하이그로마이신 저항성 유전자(hygromycin resistant gene)가 삽입된 제2 표적화된 염색체를 포함할 수 있다. 상기 제1 표적화된 염색체는 제1 표적 마이크로세포로부터 제공된 것일 수 있다. 상기 제1 표적 마이크로세포는 제1 표적화 세포로부터 제공된 것일 수 있다. 상기 제2 표적화된 염색체는 제2 표적화 세포로부터 제공된 것일 수 있다.
이 때, 하이그로마이신(hygromycin)에 대한 항생제 저항성 검출을 통하여 제1 표적화 세포로부터 제1 융합 세포를 선별할 수 있다.
또 다른 구체예에 의하면,
상기 제1 융합 세포 및 대조군 융합 세포가 혼합된 배지(media)에서, 항생제 저항성의 검출에 의하여 상기 제1 융합 세포를 선별할 수 있다.
상기 대조군 융합 세포는 원염색체만을 포함하는 비표적 마이크로세포 및 표적화 세포의 융합 세포이다.
일 예로, 상기 대조군 융합 세포는 제1 비표적 마이크로세포 및 제2 표적화 세포의 융합 세포일 수 있다.
예를 들어, 상기 대조군 융합 세포는 하이그로마이신 저항성 유전자(hygromycin resistant gene)가 삽입된 제2 표적화된 염색체를 포함할 수 있다. 상기 제2 표적화된 염색체는 제2 표적화 세포로부터 제공된 것일 수 있다. 상기 대조군 융합 세포에 포함된 원염색체는 제1 비표적 마이크로세포 및/또는 상기 제2 표적화 세포로부터 제공된 것일 수 있다. 상기 제1 비표적 마이크로세포는 제1 표적화 세포로부터 제조된 것일 수 있다.
상기 제1 융합 세포는 네오마이신 저항성 유전자(neomycin resistant gene)가 삽입된 제1 표적화된 염색체 및 하이그로마이신 저항성 유전자(hygromycin resistant gene)가 삽입된 제2 표적화된 염색체를 포함할 수 있다. 상기 제1 표적화된 염색체는 제1 마이크로세포로부터 제공된 것일 수 있다. 상기 제1 표적 마이크로세포는 제1 표적화 세포로부터 제공된 것일 수 있다. 상기 제2 표적화된 염색체는 제2 표적화 세포로부터 제공된 것일 수 있다.
이 때, 네오마이신(neomycin)에 대한 항생제 저항성 검출을 통하여 제1 융합 세포로부터 대조군 융합 세포를 선별할 수 있다.
예를 들어, 상기 대조군 융합 세포는 하이그로마이신 저항성 유전자(hygromycin resistant gene)가 삽입된 제2 표적화된 염색체를 포함할 수 있다. 상기 제2 표적화된 염색체는 제2 표적화 세포로부터 제공된 것일 수 있다. 상기 대조군 융합 세포에 포함된 원염색체는 제1 비표적 마이크로세포 및/또는 상기 제2 표적화 세포로부터 제공된 것일 수 있다. 상기 제1 비표적 마이크로세포는 제1 표적화 세포로부터 제조된 것일 수 있다.
상기 제1 융합 세포는 카나마이신 저항성 유전자(kanamycin resistant gene)가 삽입된 제1 표적화된 염색체 및 하이그로마이신 저항성 유전자(hygromycin resistant gene)가 삽입된 제2 표적화된 염색체를 포함할 수 있다. 상기 제1 표적화된 염색체는 제1 표적 마이크로세포로부터 제공된 것일 수 있다. 상기 제1 표적 마이크로세포는 제1 표적화 세포로부터 제공된 것일 수 있다. 상기 제2 표적화된 염색체는 제2 표적화 세포로부터 제공된 것일 수 있다.
이 때, 카나마이신(kanamycin)에 대한 항생제 저항성 검출을 통하여 제1 융합 세포로부터 대조군 융합 세포를 선별할 수 있다.
일 예로, 상기 대조군 융합 세포는 제2 비표적 마이크로세포 및 제1 표적화 세포의 융합 세포일 수 있다.
예를 들어, 상기 대조군 융합 세포는 네오마이신 저항성 유전자(neomycin resistant gene)가 삽입된 제1 표적화된 염색체를 포함할 수 있다. 상기 제1 표적화된 염색체는 제1 표적화 세포로부터 제공된 것일 수 있다. 상기 대조군 융합 세포에 포함된 원염색체는 제2 비표적 마이크로세포 및/또는 상기 제1 표적화 세포로부터 제공된 것일 수 있다. 상기 제2 비표적 마이크로세포는 제2 표적화 세포로부터 제조된 것일 수 있다.
상기 제1 융합 세포는 네오마이신 저항성 유전자(neomycin resistant gene)가 삽입된 제1 표적화된 염색체 및 하이그로마이신 저항성 유전자(hygromycin resistant gene)가 삽입된 제2 표적화된 염색체를 포함할 수 있다. 상기 제1 표적화된 염색체는 제1 표적화 세포로부터 제공된 것일 수 있다. 상기 제2 표적화된 염색체는 제2 표적 마이크로세포로부터 제공된 것일 수 있다. 상기 제2 표적 마이크로세포는 제2 표적화 세포로부터 제공된 것일 수 있다.
이 때, 하이그로마이신(hygromycin)에 대한 항생제 저항성 검출을 통하여 제1 융합 세포로부터 대조군 융합 세포를 선별할 수 있다.
예를 들어, 상기 대조군 융합 세포는 카나마이신 저항성 유전자(kanamycin resistant gene)가 삽입된 제1 표적화된 염색체를 포함할 수 있다. 상기 제1 표적화된 염색체는 제1 표적화 세포로부터 제공된 것일 수 있다. 상기 대조군 융합 세포에 포함된 원염색체는 제2 비표적 마이크로세포 및/또는 상기 제1 표적화 세포로부터 제공된 것일 수 있다. 상기 제2 비표적 마이크로세포는 제2 표적화 세포로부터 제조된 것일 수 있다.
상기 제1 융합 세포는 카나마이신 저항성 유전자(kanamycin resistant gene)가 삽입된 제1 표적화된 염색체 및 하이그로마이신 저항성 유전자(hygromycin resistant gene)가 삽입된 제2 표적화된 염색체를 포함할 수 있다. 상기 제1 표적화된 염색체는 제1 표적화 세포로부터 제공된 것일 수 있다. 상기 제2 표적화된 염색체는 제2 표적 마이크로세포로부터 제공된 것일 수 있다. 상기 제2 표적 마이크로세포는 제2 표적화 세포로부터 제공된 것일 수 있다.
이 때, 하이그로마이신(hygromycin)에 대한 항생제 저항성 검출을 통하여 제1 융합 세포로부터 대조군 융합 세포를 선별할 수 있다.
또 다른 구현예에 의하면,
상기 제1 융합 세포는 dCas9-리포터(dead Cas9-Reporter; dCas9-Reporter)에 의하여 선별될 수 있다. 상기 dCas9-리포터는 전술하였다.
상기 dCas9-리포터 검출을 위하여, 상기 제1 융합 세포에 gRNA 또는 이를 암호화하는 핵산을 처리할 수 있다.
상기 gRNA은 gRNA 표적 서열(gRNA target sequence)에 결합하는 것일 수 있다. 상기 gRNA 표적 서열(gRNA target sequence)은 gRNA에 대한 센스(sense) 서열을 포함할 수 있다. 상기 gRNA 표적 서열(gRNA target sequence)은 gRNA에 대한 안티센스(antisense) 서열을 포함할 수 있다. 상기 gRNA 표적 서열(gRNA target sequence)은 원염색체에는 존재하지 않으나, 표적화된 염색체에는 존재하는 서열 중 선택될 수 있다. 상기 gRNA 표적 서열(gRNA target sequence)은 제1 표적 마이크로세포로부터 제공된 표적화된 염색체의 표적 서열에 삽입된 것일 수 있다. 상기 원염색체 및 상기 표적 서열은 전술하였다.
상기 gRNA 표적 서열 및/또는 gRNA의 후보군은 in silico 고안을 통하여 추출할 수 있다.
일 구체예에 의하면,
제1 융합 세포 및 제2 표적화 세포가 혼합된 배지(media)에서, dCas9-리포터 검출에 의하여 상기 제1 융합 세포를 선별할 수 있다.
예를 들어, 상기 제1 융합 세포는 gRNA 표적 서열을 포함하는 제1 표적화된 염색체를 포함할 수 있다. 상기 제1 융합 세포는 gRNA 표적 서열을 포함하는 제2 표적화된 염색체를 포함할 수 있다. 상기 제2 표적화 세포는 gRNA 표적 서열을 포함하는 제2 표적화된 염색체를 포함할 수 있다.
이 때, gRNA, dCas9 및 리포터를 처리하고, 상기 리포터에 포함된 표지자 검출을 통하여 제2 표적화 세포로부터 제1 융합 세포를 선별할 수 있다. 상기 gRNA은 gRNA 표적 서열(gRNA target sequence)에 결합하는 것일 수 있다. 상기 gRNA 표적 서열은 상기 제1 표적화된 염색체의 일 영역이다.
다른 구체예에 의하면,
제1 융합 세포 및 제1 표적화 세포가 혼합된 배지(media)에서, dCas9-리포터 검출에 의하여 상기 제1 융합 세포를 선별할 수 있다.
예를 들어, 상기 제1 융합 세포는 gRNA 표적 서열을 포함하는 제2 표적화된 염색체를 포함할 수 있다. 상기 제1 융합 세포는 gRNA 표적 서열을 포함하는 제1 표적화된 염색체를 포함할 수 있다. 상기 제1 표적화 세포는 gRNA 표적 서열을 포함하는 제1 표적화된 염색체를 포함할 수 있다.
이 때, gRNA, dCas9 및 리포터를 처리하고, 상기 리포터에 포함된 표지자 검출을 통하여 제1 표적화 세포로부터 제1 융합 세포를 선별할 수 있다. 상기 gRNA은 gRNA 표적 서열(gRNA target sequence)에 결합하는 것일 수 있다. 상기 gRNA 표적 서열은 상기 제2 표적화된 염색체의 일 영역이다.
5. 인공 재조합 염색체(artificial recombinant chromosome) 및 이의 제조
본 명세서에 개시된 또 다른 양태에 의하면, 인공 재조합 염색체(artificial recombinant chromosome) 및 이의 제조 방법이 제공될 수 있다.
상기 인공 재조합 염색체는, 제1 원세포(a first source cell) 로부터 제공된 염색체 및 제2 원세포(a second source cell)로부터 제공된 염색체 간 일부가 재조합된 염색체이다(도 2 내지 도 9).
상기 인공 재조합 염색체는, 하나의 원 염색체(source chromosome)의 일부 DNA 서열 및 다른 하나의 원 염색체의 일부 DNA 서열이 재조합된 염색체이다.
일 예로, 상기 인공 재조합 염색체는, 제1 표적화된 염색체로부터 제공된 일부 DNA 서열 및 제2표적화된 염색체로부터 제공된 DNA 서열이 재조합된 염색체이다. 이 때, 상기 제1 표적화된 염색체로부터 제공된 일부 DNA는 제1 표적화된 염색체로부터 제공된 히스톤 단백질과 함께 뉴클레오솜을 형성한 것이다. 따라서, 상기 인공 재조합 염색체에 포함된 제1 표적화된 염색체로부터 제공된 일부 DNA 서열은 및 제1 표적화된 염색체로부터 제공된 히스톤 단백질을 포함한다.
상기 인공 재조합 염색체는 RRS 및/또는 ASCE를 더 포함할 수 있다.
5-1. RRS-SSR 매개 염색체 교환(RRS-SSR mediated chromosome exchange)
본 명세서에 개시된 일 실시예에 의하면, RRS을 포함하는 인공 재조합 염색체 및 이의 제조 방법이 제공될 수 있다(도 12 및 도 18).
상기 RRS는 공지의 서열일 수 있다. 일 예로, 상기 RRS는 LoxP 페어의 SSR에 의한 반응체일 수 있다. 일 예로, 상기 LoxP 변이체 페어의 SSR에 의한 반응체일 수 있다.
일 예로, 상기 LoxP 페어는 Lox 71 및 Lox 66일 수 있다.
일 예로, 상기 LoxP 변이체 페어는 Lox m2/71 및 Lox m2/66일 수 있다.
일 예로, 상기 RRS는 Lox m2/71 및 Lox m2/66의 SSR에 의한 반응체일 수 있다.
일 예로, 상기 RRS는 Lox 71 및 Lox 66의 SSR에 의한 반응체일 수 있다.
상기 RRS을 포함하는 인공 재조합 염색체는
제1 표적화된 염색체 및 제2 표적화된 염색체를 포함하는 제1 융합 세포에 SSR을 처리하여 제조할 수 있다. 이 때, 상기 제1 표적화된 염색체는 제1 RRS를 포함할 수 있다. 이 때, 상기 제2 표적화된 염색체는 제2 RRS를 포함할 수 있다.
상기 SSR은 염색체 교환(chromosome exchange)을 유발할 수 있다.
상기 SSR의 일 예로서, Cre 재조합 효소(Cre Recombinase) 아미노산 서열은, 하기 표 3에 개시한다. 다만, 하기 표 3에 개시된 Cre 재조합 효소는 Lox 71 및 Lox 66에 대한 Cre 재조합 효소의 일 예로서, 이에 제한되는 것은 아니다. 다만, 하기 표 3에 개시된 Cre 재조합 효소는 Lox m2/71 및 Lox m2/66에 대한 Cre 재조합 효소의 일 예로서, 이에 제한되는 것은 아니다.
Cre 재조합 효소(Cre Recombinase) 아미노산 서열
No. Target Cre recombinase 아미노산 서열
1 Lox 71,Lox 66 SNLLTVHQNLPALPVDATSDEVRKNLMDMFRDRQAFSEHTWKMLLSVCRSWAAWCKLNNRKWFPAEPEDVRDYLLYLQARGLAVKTIQQHLGQLNMLHRRSGLPRPSDSNAVSLVMRRIRKENVDAGERAKQALAFERTDFDQVRSLMENSDRCQDIRNLAFLGIAYNTLLRIAEIARIRVKDISRTDGGRMLIHIGRTKTLVSTAGVEKALSLGVTKLVERWISVSGVADDPNNYLFCRVRKNGVAAPSATSQLSTRALEGIFEATHRLIYGAKDDSGQRYLAWSGHSARVGAARDMARAGVSIPEIMQAGGWTNVNIVMNYIRNLDSETGAMVRLLEDGD(SEQ ID NO: 32)
2 Lox m2/71,Lox m2/66 SNLLTVHQNLPALPVDATSDEVRKNLMDMFRDRQAFSEHTWKMLLSVCRSWAAWCKLNNRKWFPAEPEDVRDYLLYLQARGLAVKTIQQHLGQLNMLHRRSGLPRPSDSNAVSLVMRRIRKENVDAGERAKQALAFERTDFDQVRSLMENSDRCQDIRNLAFLGIAYNTLLRIAEIARIRVKDISRTDGGRMLIHIGRTKTLVSTAGVEKALSLGVTKLVERWISVSGVADDPNNYLFCRVRKNGVAAPSATSQLSTRALEGIFEATHRLIYGAKDDSGQRYLAWSGHSARVGAARDMARAGVSIPEIMQAGGWTNVNIVMNYIRNLDSETGAMVRLLEDGD(SEQ ID NO: 32)
5-2. ASCE-HR 매개 염색체 교환(ASCE-HR mediated chromosome exchange)
본 명세서에 개시된 다른 실시예에 의하면, ASCE를 포함하는 인공 재조합 염색체 및 이의 제조 방법이 제공될 수 있다.
상기 ASCE를 포함하는 인공 재조합 염색체는
제1 표적화된 염색체 및 제2 표적화된 염색체를 포함하는 제1 융합 세포에 교차 유발하여 제조할 수 있다. 이 때, 상기 제1 표적화된 염색체는 제1 ASCE를 포함할 수 있다. 이 때, 상기 제2 표적화된 염색체는 제2 ASCE를 포함할 수 있다.
상기 제1 ASCE 및 상기 제2 ASCE는 적어도 80% 또는 그 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산일 수 있다.
본 출원에 의해 개시되는 인공 재조합 염색체 제조 방법은, AiCE (Artificial interspecies chromosoeme segment exchange) 기술로 명명될 수 있다. 상기 AiCE는 인공 재조합 염색체를 제조하기 위하여, 제1 표적화된 염색체의 제1 프래그먼트가 제2 염색체의 프래그먼트와 교체되는 것이다. 상기 AiCE는 인공 재조합 염색체를 제조하기 위하여, 제2 표적화된 염색체의 제2 프래그먼트가 제1 염색체의 프래그먼트와 교체되는 것이다. 이 때, 상기 인공 재조합 염색체 제조는 프래그먼트의 갯수에 제한되지 않는다. 예를 들어, 제1 표적화된 염색체의 제1 프래그먼트, 제2 표적화된 염색체의 제2 프래그먼트, 제3 표적화된 염색체의 제3 프래그먼트가 상기 인공 재조합 염색체의 제조에 이용될 수 있다. 예를 들어, 제1 표적화된 염색체의 제1 프래그먼트, 제2 표적화된 염색체의 제2 프래그먼트, 제3 표적화된 염색체의 제3 프래그먼트, 제n 표적화된 염색체의 제n 프래그먼트가 상기 인공 재조합 염색체의 제조에 이용될 수 있다.
6. 제2 융합 세포(a second fusion cell) 및 이의 제조
본 명세서에 개시된 또 다른 양태에 의하면, 제2 융합 세포(a second fusion cell) 및 이의 제조 방법이 제공될 수 있다.
상기 제2 융합 세포는, 전술한 인공 재조합 염색체를 하나 또는 그 이상 포함하는 세포이다. 상기 제2 융합 세포는 전술한 원염색체를 하나 또는 그 이상 더 포함할 수 있다.
상기 제2 융합 세포는 인공 재조합 염색체를 포함할 수 있다. 상기 제2 융합 세포는 상기 인공 재조합 염색체를 단일 및/또는 2개 이상 포함될 수 있다.
상기 제2 융합 세포는 제1 융합 세포로부터 제작될 수 있다.
예를 들어, 상기 제2 융합 세포는 제1 융합 세포로부터 제작될 수 있다. 상기 제2 융합 세포는 제1 융합 세포에 포함된 2개 이상의 표적화된 염색체가 2개 이상의 인공 재조합 염색체로 치환된 것일 수 있다.
상기 제1 융합 세포, 상기 표적화된 염색체 및 상기 인공 재조합 염색체는 전술하였다.
상기 표적화된 염색체는 제1 표적화된 염색체 및 제2 표적화된 염색체를 포함할 수 있다.
상기 인공 재조합 염색체는 제1 인공 재조합 염색체 및 제2 인공 재조합 염색체를 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 제1 인공 재조합 염색제는 제2 표적화된 염색체의 동원체를 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 제2 인공 재조합 염색체는 제1 표적화된 염색체의 동원체를 포함할 수 있다.
6-1. RRS-SSR 매개 염색체 교환에 의해 제작된 인공 재조합 염색체를 포함하는 세포(a cell comprising artificial recombinant chromosome which produced RRS-SSR mediated chromosome exchange)
본 명세서에 개시된 일 실시예에 의하면, SSR을 포함하는 인공 재조합 염색체를 포함하는 제2 융합 세포(a second fusion cell) 및 이의 제조 방법이 제공될 수 있다.
상기 RRS는 공지의 서열일 수 있다. 일 예로, 상기 RRS는 LoxP 페어의 SSR에 의한 반응체일 수 있다. 일 예로, 상기 LoxP 변이체 페어의 SSR에 의한 반응체일 수 있다. 상기 RRS 및 상기 SSR은 전술하였다.
상기 SSR을 포함하는 인공 재조합 염색체를 포함하는 제2 융합 세포는
제1 표적화된 염색체 및 제2 표적화된 염색체를 포함하는 제1 융합 세포에 SSR 또는 이를 암호화하는 핵산을 처리하여 제조할 수 있다. 이 때, 상기 제1 표적화된 염색체는 제1 RRS를 포함할 수 있다. 이 때, 상기 제2 표적화된 염색체는 제2 RRS를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서는, SSR을 암호화하는 핵산을 제1 융합 세포에 도입한다. 상기 도입은 형질감염, 전기천공법, 미세주입법, 핵산 서열을 포함하는 바이러스 또는 박테리오파아지 벡터를 이용한 감염, 세포융합, 염색체-매개 유전자 전달(chromosome-mediated gene transfer), 마이크로셀-매개 유전자 전달(microcell-mediated gene transfer), 스페로플라스트 융합(spheroplast fusion) 등과 같은 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용하여 수행할 수 있으나, 이에 제한 되지 않는다.
6-2. ASCE-HR 매개 염색체 교환에 의해 제작된 인공 재조합 염색체를 포함하는 세포(a cell comprising artificial recombinant chromosome which produced ASCE-HR mediated chromosome exchange)
본 명세서에 개시된 다른 실시예에 의하면, ASCE를 포함하는 인공 재조합 염색체를 포함하는 제2 융합 세포(a second fusion cell) 및 이의 제조 방법이 제공될 수 있다.
상기 ASCE는 전술하였다.
상기 ASCE를 포함하는 인공 재조합 염색체를 포함하는 제2 융합 세포는
제1 표적화된 염색체 및 제2 표적화된 염색체를 포함하는 제1 융합 세포에 상동성 재조합(Homologous Recombination)을 유발하여 제조할 수 있다. 이 때, 상기 제1 표적화된 염색체는 제1 ASCE를 포함할 수 있다. 이 때, 상기 제2 표적화된 염색체는 제2 ASCE를 포함할 수 있다.
상기 상동성 재조합(Homologous Recombination)은 염색체의 SSB(single strand breaking) 및/또는 DSB(double strand breaking)에 의해 진행될 수 있다. 상기 SSB 및/또는 DSB는 자연적으로 발생할 수 있다. 상기 SSB 및/또는 DSB는 클라스토젠(clastogen; 염색체이상유발물질)에 의해 발생할 수 있다. 상기 클라스토젠은 이온화 방사선, UV, X선, γ선, 활성산소종, 특정 케미컬일 수 있다. 상기 특정 케미컬은, 예를 들어, 블레오마이신(bleomycin), 하이드록시요소(Hydroxyurea), 캄프토테신(Camptothecin), 4-NQO(4-nitroquinoline 1-oxide), 시스플라틴(Cisplatin), EMS 또는 MMS 등의 메틸화 시약(methylating agent) 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 SSB 및/또는 DSB는 유전자 가위에 의해 발생할 수 있다. 예를 들어, 상기 SSB 및/또는 DSB는 ZFN(Zinc-finger nucleases), TALEN(Transcription activator-like effector nucleases) 및 CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9) 중 어느 하나 이상에 의해 발생할 수 있다.
6-3. 제2 융합 세포의 선별 방법 (a second fusion cell selection methods)
본 명세서에 개시된 또 다른 실시예에 의하면, 2개 이상의 인공 재조합 염색체를 포함하는 제2 융합 세포(a second fusion cell)의 선별 방법이 제공될 수 있다. 상기 제2 융합 세포는 원염색체를 더 포함할 수 있다.
상기 인공 재조합 염색체는 RRS 및/또는 ASCE를 포함할 수 있다.
상기 인공 재조합 염색체는 제1 인공 재조합 염색체 및 제2 인공 재조합 염색체일 수 있다.
상기 RRS, 상기 ASCE, 상기 인공 재조합 염색체, 상기 제1 인공 재조합 염색체, 상기 제2 인공 재조합 염색체 및 상기 제2 융합 세포는 전술하였다.
일 구현예에 의하면,
상기 제2 융합 세포는 dCas9-리포터(deadCas9-Reporter; dCas9-Reporter)에 의하여 선별될 수 있다. 상기 dCas9-리포터는 전술하였다.
상기 dCas9-리포터 검출을 위하여, 상기 제1 융합 세포에 gRNA 또는 이를 암호화하는 핵산을 처리할 수 있다.
상기 gRNA은 gRNA 표적 서열(gRNA target sequence)에 결합하는 것일 수 있다. 상기 gRNA 표적 서열(gRNA target sequence)은 gRNA에 대한 sense 서열을 포함할 수 있다. 상기 gRNA 표적 서열(gRNA target sequence)은 gRNA에 대한 antisense 서열을 포함할 수 있다. 상기 gRNA 표적 서열(gRNA target sequence)은 원염색체에는 존재하지 않으나, 표적화된 염색체에는 존재하는 서열 중 선택될 수 있다. 상기 gRNA 표적 서열(gRNA target sequence)은 제1 표적 마이크로세포로부터 제공된 표적화된 염색체의 표적 서열에 삽입된 것일 수 있다. 상기 원염색체 및 상기 표적 서열은 전술하였다.
상기 gRNA 표적 서열 및/또는 gRNA의 후보군은 in silico 고안을 통하여 추출할 수 있다.
일 구체예에 의하면,
제2 융합 세포 및 제1 융합 세포가 혼합된 배지(media)에서, dCas9-리포터 검출에 의하여 상기 제2 융합 세포를 선별할 수 있다.
예를 들어, 상기 제2 융합 세포는 gRNA 표적 서열을 포함하는 제1 인공 재조합 염색체를 포함할 수 있다. 상기 제2 융합 세포는 gRNA 표적 서열을 포함하는 제2 인공 재조합 염색체를 포함할 수 있다. 상기 제1 융합 세포는 제1 표적화된 염색체 및 제2 표적화된 염색체를 포함하므로, gRNA 표적 서열을 포함하지 않는다.
이 때, gRNA, dCas9 및 리포터를 처리하고, 상기 Reporter에 포함된 표지자 검출을 통하여 제1 융합 세포로부터 제2 융합 세포를 선별할 수 있다. 상기 gRNA은 gRNA 표적 서열(gRNA target sequence)에 결합하는 것일 수 있다. 상기 gRNA 표적 서열은 상기 제1 인공 재조합 염색체 및/또는 제2 인공 재조합 염색체의 일 영역이다.
다른 구체예에 의하면,
제2 융합 세포 및 제2 표적화 세포가 혼합된 배지(media)에서, dCas9-리포터 검출에 의하여 상기 제2 융합 세포를 선별할 수 있다.
예를 들어, 상기 제2 융합 세포는 gRNA 표적 서열을 포함하는 제1 인공 재조합 염색체를 포함할 수 있다. 상기 제2 융합 세포는 gRNA 표적 서열을 포함하는 제2 인공 재조합 염색체를 포함할 수 있다. 상기 제2 표적화 세포는 제2 표적화된 염색체를 포함하므로, gRNA 표적 서열을 포함하지 않는다.
이 때, gRNA, dCas9 및 리포터를 처리하고, 상기 Reporter에 포함된 표지자 검출을 통하여 제2 표적화 세포로부터 제2 융합 세포를 선별할 수 있다. 상기 gRNA은 gRNA 표적 서열(gRNA target sequence)에 결합하는 것일 수 있다. 상기 gRNA 표적 서열은 상기 제1 인공 재조합 염색체 및/또는 제2 인공 재조합 염색체의 일 영역이다.
또 다른 구체예에 의하면,
제2 융합 세포 및 대조군 융합 세포가 혼합된 배지(media)에서, dCas9-리포터 검출에 의하여 상기 제2 융합 세포를 선별할 수 있다.
상기 대조군 융합 세포는, 원염색체만을 포함하는 비표적 마이크로세포 및 표적화 세포의 융합 세포이다.
일 예로, 상기 대조군 융합 세포는 제1 비표적 마이크로세포 및 제2 표적화 세포의 융합 세포일 수 있다.
예를 들어, 상기 제2 융합 세포는 gRNA 표적 서열을 포함하는 제1 인공 재조합 염색체를 포함할 수 있다. 상기 제2 융합 세포는 gRNA 표적 서열을 포함하는 제2 인공 재조합 염색체를 포함할 수 있다. 상기 대조군 융합 세포는 제2 표적화된 염색체를 포함하므로, gRNA 표적 서열을 포함하지 않는다.
이 때, gRNA, dCas9 및 리포터를 처리하고, 상기 리포터에 포함된 표지자 검출을 통하여 대조군 융합 세포로부터 제2 융합 세포를 선별할 수 있다. 상기 gRNA은 gRNA 표적 서열(gRNA target sequence)에 결합하는 것일 수 있다. 상기 gRNA 표적 서열은 상기 제1 인공 재조합 염색체 및/또는 제2 인공 재조합 염색체의 일 영역이다.
다른 구현예에 의하면,
상기 제2 융합 세포는 FISH(Fluorescence in situ hybridization)에 의하여 선별될 수 있다. 상기 FISH의 일 예로, 항체-리포터를 이용할 수 있다. 상기 항체-Reporter는 염색체의 특이 응축 구조 및/또는 염색체의 특정 서열에 대한 항체의 결합력을 이용하여 표적 서열을 검출하는 것이다. 상기 항체-리포터를 이용한 FISH는 공지의 방법을 이용할 수 있다.
상기 FISH 검출을 위하여, 상기 제2 융합 세포에 항체-리포터를 처리할 수 있다. 상기 항체-리포터는 1차 항체 및 Reporter의 연결된 구조체를 의미할 수 있다. 뿐만 아니라, 상기 항체-리포터는 1차 항체의 일 영역에 결합력을 가지는 2차 항체 및 리포터의 연결된 구조체를 의미할 수 있다. 이 경우, 항체-리포터의 처리는 1차 항체 처리 이후, 2차 항체-Reporter 구조체를 시계열적으로 제공해주는 것을 포함할 수 있다.
상기 항체는 염색체 상의 항체 표적 서열(antibody target sequence)에 결합하는 것일 수 있다. 상기 항체 표적 서열(antibody target sequence)은 제1 인공 재조합 염색체의 일 영역일 수 있다. 상기 염색체 상의 항체 표적 서열은 제2 인공 재조합 일 영역일 수 있다. 상기 염색체상의 항체 표적 서열은 원염색체 및/또는 표적화된 염색체에는 존재하지 않으나, 인공 재조합 염색체에는 존재하는 서열 중 선택될 수 있다. 상기 원염색체 및 상기 표적화된 염색체는 전술하였다.
상기 항체 표적 서열 및/또는 항체의 후보군은 in silico 고안을 통하여 추출할 수 있다.
일 구체예에 의하면,
제2 융합 세포 및 제1 융합 세포가 혼합된 배지(media)에서, FISH 검출에 의하여 상기 제2 융합 세포를 선별할 수 있다.
예를 들어, 상기 제2 융합 세포는 염색체 상의 항체 표적 서열을 포함하는 제1 인공 재조합 염색체를 포함할 수 있다. 상기 제2 융합 세포는 염색체 상의 항체 표적 서열을 포함하는 제2 인공 재조합 염색체를 포함할 수 있다. 상기 제1 융합 세포는 제1 표적화된 염색체 및 제2 표적화된 염색체를 포함하므로, 항체 표적 서열을 포함하지 않는다.
이 때, 항체-Reporter를 처리하고, 상기 Reporter에 포함된 표지자 검출을 통하여 제1 융합 세포로부터 제2 융합 세포를 선별할 수 있다. 상기 항체는 항체 표적 서열(antibody target sequence)에 결합하는 것일 수 있다. 상기 항체 표적 서열은 상기 제1 인공 재조합 염색체 및/또는 제2 인공 재조합 염색체의 일 영역이다.
이 때, 1차 항체를 처리하고, 2차 항체로서 항체-리포터를 처리하여, 상기 리포터에 포함된 표지자 검출을 통하여 제1 융합 세포로부터 제2 융합 세포를 선별할 수 있다. 상기 1차 항체는 항체 표적 서열(antibody target sequence)에 결합하는 것일 수 있다. 상기 2차 항체는 상기 1차 항체의 일 영역에 결합하는 것일 수 있다. 상기 항체 표적 서열은 상기 제1 인공 재조합 염색체 및/또는 제2 인공 재조합 염색체의 일 영역이다.
다른 구체예에 의하면,
제2 융합 세포 및 제2 표적화 세포가 혼합된 배지(media)에서, FISH 검출에 의하여 상기 제2 융합 세포를 선별할 수 있다.
예를 들어, 상기 제2 융합 세포는 염색체 상의 표적 서열을 포함하는 제1 인공 재조합 염색체를 포함할 수 있다. 상기 제2 융합 세포는 염색체 상의 항체 표적 서열을 포함하는 제2 인공 재조합 염색체를 포함할 수 있다. 상기 제2 표적화 세포는 제2 표적화된 염색체를 포함하므로, 항체 표적 서열을 포함하지 않는다.
이 때, 항체-리포터를 처리하고, 상기 리포터에 포함된 표지자 검출을 통하여 제2 표적화 세포로부터 제2 융합 세포를 선별할 수 있다. 상기 항체는 항체 표적 서열(antibody target sequence)에 결합하는 것일 수 있다. 상기 항체 표적 서열은 상기 제1 인공 재조합 염색체 및/또는 제2 인공 재조합 염색체의 일 영역이다.
이 때, 1차 항체를 처리하고, 2차 항체로서 항체-리포터를 처리하여, 상기 리포터에 포함된 표지자 검출을 통하여 제2 표적화 세포로부터 제2 융합 세포를 선별할 수 있다. 상기 1차 항체는 항체 표적 서열(antibody target sequence)에 결합하는 것일 수 있다. 상기 2차 항체는 상기 1차 항체의 일 영역에 결합하는 것일 수 있다. 상기 항체 표적 서열은 상기 제1 인공 재조합 염색체 및/또는 제2 인공 재조합 염색체의 일 영역이다.
또 다른 구체예에 의하면,
제2 융합 세포 및 대조군 융합 세포가 혼합된 배지(media)에서, FISH 검출에 의하여 상기 제2 융합 세포를 선별할 수 있다.
상기 대조군 융합 세포는, 원염색체만을 포함하는 비표적 마이크로세포 및 표적화 세포의 융합 세포이다.
일 예로, 상기 대조군 융합 세포는 제1 비표적 마이크로세포 및 제2 표적화 세포의 융합 세포일 수 있다.
예를 들어, 상기 제2 융합 세포는 염색체 상의 표적 서열을 포함하는 제1 인공 재조합 염색체를 포함할 수 있다. 상기 제2 융합 세포는 염색체 상의 항체 표적 서열을 포함하는 제2 인공 재조합 염색체를 포함할 수 있다. 상기 대조군 융합 세포는 제2 표적화된 염색체를 포함하므로, 항체 표적 서열을 포함하지 않는다.
이 때, 항체-리포터를 처리하고, 상기 리포터에 포함된 표지자 검출을 통하여 대조군 융합 세포로부터 제2 융합 세포를 선별할 수 있다. 상기 항체는 항체 표적 서열(antibody target sequence)에 결합하는 것일 수 있다. 상기 항체 표적 서열은 상기 제1 인공 재조합 염색체 및/또는 제2 인공 재조합 염색체의 일 영역이다.
이 때, 1차 항체를 처리하고, 2차 항체로서 항체-리포터를 처리하여, 상기 리포터에 포함된 표지자 검출을 통하여 대조군 융합 세포로부터 제2 융합 세포를 선별할 수 있다. 상기 1차 항체는 항체 표적 서열(antibody target sequence)에 결합하는 것일 수 있다. 상기 2차 항체는 상기 1차 항체의 일 영역에 결합하는 것일 수 있다. 상기 항체 표적 서열은 상기 제1 인공 재조합 염색체 및/또는 제2 인공 재조합 염색체의 일 영역이다.
7. 제3 융합 세포(a third fusion cell) 및 이의 제조
본 명세서에 개시된 또 다른 양태에 의하면, 제3 융합 세포(a third fusion cell) 및 이의 제조 방법이 제공될 수 있다.
상기 제3 융합 세포는, 전술한 인공 재조합 염색체를 하나 또는 그 이상 포함하는 세포이다. 다만, 제1 인공 재조합 염색체는 포함하되, 제2 인공 재조합 염색체는 소실한 것일 수 있다. 상기 제3 융합 세포는 전술한 원염색체를 하나 또는 그 이상 더 포함할 수 있다.
상기 제3 융합 세포는 인공 재조합 염색체를 포함할 수 있다. 상기 제3 융합 세포는 상기 인공 재조합 염색체를 단일 및/또는 2개 이상 포함될 수 있다.
7-1. 제3 융합 세포
본 명세서에 개시된 일 실시예에 의하면, 제1 인공 재조합 염색체를 포함하나, 제2 인공 재조합 염색체를 소실한 제3 융합 세포 및 이의 제조 방법이 제공될 수 있다.
상기 제3 융합 세포는 제2 융합 세포로부터 제작될 수 있다.
예를 들어, 상기 제3 융합 세포는 제2 융합 세포로부터 제작될 수 있다. 상기 제3 융합 세포는 제2 융합 세포에 포함된 제1 인공 재조합 염색체 및 제2 인공 재조합 염색체 중 제2 인공 재조합 염색체가 소실된 것일 수 있다.
상기 제2 융합 세포, 상기 제1 인공 재조합 염색체 및 상기 제2 인공 재조합 염색체는 전술하였다.
일 예로, 상기 제1 인공 재조합 염색제는 제2 표적화된 염색체의 동원체를 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 제2 인공 재조합 염색체는 제1 표적화된 염색체의 동원체를 포함할 수 있다.
상기 제2 융합 세포로부터 상기 제3 융합 세포의 제작은, 공지의 시간을 처리하는 방법일 수 있다. 상기 공지의 시간은 세포주의 유래, 세포의 종류 및 배양 조건 중 어느 하나 이상에 따라 결정될 수 있다.
상기 제2 융합 세포로부터 상기 제3 융합 세포의 제작은, 공지의 세포분열 횟수를 처리하는 방법일 수 있다. 상기 공지의 세포분열 횟수는 세포주의 유래, 세포의 종류 및 배양 조건 중 어느 하나 이상에 따라 결정될 수 있다.
7-2. 제3 융합 세포의 선별 방법 (a third fusion cell selection methods)
본 명세서에 개시된 다른 실시예에 의하면, 제1 인공 재조합 염색체를 포함하나, 제2 인공 재조합염색체를 소실한 제3 융합 세포의 선별 방법이 제공될 수 있다. 상기 제3 융합 세포는 원염색체를 더 포함할 수 있다.
상기 제1 인공 재조합 염색체 및/또는 제2 인공 재조합 염색체 RRS 및/또는 ASCE를 포함하는 것일 수 있다.
상기 제1 인공 재조합 염색체 및/또는 제2 인공 재조합 염색체 RRS 및/또는 ASCE를 제거한 것일 수 있다.
상기 RRS, 상기 ASCE, 상기 제1 인공 재조합 염색체 및 상기 제2 인공 재조합 염색체는 전술하였다.
일 구현예에 의하면,
상기 제3 융합 세포는 형광 단백질 검출에 의하여 선별될 수 있다.
상기 형광 단백질 검출을 위하여, 상기 제3 융합 세포에 포함된 제1 인공 재조합 염색체는 형광 단백질 유전자를 포함할 수 있다.
상기 형광 단백질 유전자는 GFP 유전자(GFP gene), YFP 유전자(YFP gene), RFP 유전자(RFP gene) 또는 mCherry 유전자(mCherry gene) 중 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체예에 의하면,
상기 제3 융합 세포 및 상기 제2 융합 세포가 혼합된 배지(media)에서, 형광 단백질의 검출에 의하여 상기 제3 융합 세포를 선별할 수 있다.
예를 들어, 상기 제3 융합 세포는 GFP 유전자(GFP gene)가 삽입된 제1 인공 재조합 염색체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 제2 융합 세포는 GFP 유전자(GFP gene)가 삽입된 제1 인공 재조합 염색체를 및 mCherry 유전자(mCherry gene)가 삽입된 제2 인공 재조합 염색체를 포함할 수 있다.
이 때, 녹색 형광(Green fluorescence)의 검출을 통하여 제2 융합 세포로부터 제3 융합 세포를 선별할 수 있다.
이 때, 황색 형광(Yellow fluorescence)의 검출을 통하여 제3 융합 세포로부터 제2 융합 세포를 선별할 수 있다. 상기 황색 형광(Yellow fluorescence)은 녹색 형광(Green fluorescence) 및 mCherry 형광(mCherry fluorescence)이 혼합되어 육안 및/또는 기기에 황색(Yellow)으로 검출 되는 것이다.
다른 구체예에 의하면,
상기 제3 융합 세포 및 상기 제1 융합 세포가 혼합된 배지(media)에서, 형광 단백질의 검출에 의하여 상기 제1 융합 세포를 선별할 수 있다.
예를 들어, 상기 제3 융합 세포는 GFP 유전자(GFP gene)가 삽입된 제1 인공 재조합 염색체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 제1 융합 세포는 GFP 유전자(GFP gene)가 삽입된 제1 표적화된 염색체를 및 mCherry 유전자(mCherry gene)가 삽입된 제2 표적화된 염색체를 포함할 수 있다.
이 때, 녹색 형광(Green fluorescence)의 검출을 통하여 제1 융합 세포로부터 제3 융합 세포를 선별할 수 있다.
이 때, 황색 형광(Yellow fluorescence)의 검출을 통하여 제3 융합 세포로부터 제1 융합 세포를 선별할 수 있다. 상기 황색 형광(Yellow fluorescence)은 녹색 형광(Green fluorescence) 및 mCherry 형광(mCherry fluorescence)이 혼합되어 육안 및/또는 기기에 황색(Yellow)으로 검출 되는 것이다.
또 다른 구체예에 의하면,
상기 제3 융합 세포 및 대조군 융합 세포가 혼합된 배지(media)에서, 형광 단백질의 검출에 의하여 상기 제3 융합 세포를 선별할 수 있다.
상기 대조군 융합 세포는 원염색체만을 포함하는 비표적 마이크로세포 및 표적화 세포의 융합 세포이다.
일 예로, 상기 대조군 융합 세포는 제1 비표적 마이크로세포 및 제2 표적화 세포의 융합 세포일 수 있다.
예를 들어, 상기 대조군 융합 세포는 mCherry 유전자(mCherry gene)가 삽입된 제2 표적화된 염색체를 포함할 수 있다. 상기 제2 표적화된 염색체는 제2 표적화 세포로부터 제공된 것일 수 있다. 상기 대조군 융합 세포에 포함된 원염색체는 제1 비표적 마이크로세포 및/또는 상기 제2 표적화 세포로부터 제공된 것일 수 있다. 상기 제1 비표적 마이크로세포는 제1 표적화 세포로부터 제조된 것일 수 있다.
상기 제3 융합 세포는 GFP 유전자(GFP gene)가 삽입된 제1 인공 재조합 염색체를 포함할 수 있다.
이 때, 녹색 형광(Green fluorescence)의 검출을 통하여 대조군 융합 세포로부터 제3 융합 세포를 선별할 수 있다.
이 때, mCherry 형광(mCherry fluorescence)의 검출을 통하여 제1 융합 세포로부터 대조군 융합 세포를 선별할 수 있다.
다른 구현예에 의하면,
상기 제3 융합 세포는 항생제 저항성에 의하여 선별될 수 있다.
상기 항생제 저항성 검출을 위하여, 상기 제3 융합 세포에 포함된 제1 인공 재조합 염색체는 항생제 저항성 유전자를 포함할 수 있다.
상기 항생제 저항성 유전자는 하이그로마이신 저항성 유전자(hygromycin resistant gene), 네오마이신 저항성 유전자(neomycin resistant gene), 카나마이신 저항성 유전자(kanamycin resistant gene), 블라스티사이딘 저항성 유전자(blasticidin resistant gene), 제오신 저항성 유전자(zeocin resistant gene) 또는 퓨로ΔTK 유전자(puroΔ gene) 중 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체예에 의하면,
상기 제3 융합 세포 및 상기 제2 융합 세포가 혼합된 배지(media)에서, 항생제 저항성 검출에 의하여 상기 제3 융합 세포를 선별할 수 있다.
예를 들어, 상기 제3 융합 세포는 네오마이신 저항성 유전자(neomycin resistant gene)가 삽입된 제1 인공 재조합 염색체를 포함할 수 있다.
상기 제2 융합 세포는 네오마이신 저항성 유전자(neomycin resistant gene)가 삽입된 제1 인공 재조합 염색체 및 하이그로마이신 저항성 유전자(hygromycin resistant gene)가 삽입된 제2 인공 재조합 염색체를 포함할 수 있다.
이 때, 하이그로마이신(hygromycin)에 대한 항생제 저항성 검출을 통하여 제3 융합 세포로부터 제2 융합 세포를 선별할 수 있다.
따라서, 상기 제3 융합 세포 및 상기 제2 융합 세포가 혼합된 배지(media)에서, 하이그로마이신(hygromycin)에 대한 저항성을 가지지 않으나, 네오마이신(neomycin)에 대한 저항성을 가지는 세포를 제3 융합 세포로 선별할 수 있다.
다른 구체예에 의하면,
상기 제3 융합 세포 및 상기 제1 융합 세포가 혼합된 배지(media)에서, 항생제 저항성 검출에 의하여 상기 제3 융합 세포를 선별할 수 있다.
예를 들어, 상기 제3 융합 세포는 네오마이신 저항성 유전자(neomycin resistant gene)가 삽입된 제1 인공 재조합 염색체를 포함할 수 있다.
상기 제1 융합 세포는 네오마이신 저항성 유전자(neomycin resistant gene)가 삽입된 제1 표적화된 염색체 및 하이그로마이신 저항성 유전자(hygromycin resistant gene)가 삽입된 제2 표적화된 염색체를 포함할 수 있다.
이 때, 하이그로마이신(hygromycin)에 대한 항생제 저항성 검출을 통하여 제3 융합 세포로부터 제1 융합 세포를 선별할 수 있다.
따라서, 상기 제3 융합 세포 및 상기 제1 융합 세포가 혼합된 배지(media)에서, 하이그로마이신(hygromycin)에 대한 저항성을 가지지 않으나, 네오마이신(neomycin)에 대한 저항성을 가지는 세포를 제3 융합 세포로 선별할 수 있다.
또 다른 구체예에 의하면,
상기 제3 융합 세포 및 대조군 융합 세포가 혼합된 배지(media)에서, 항생제 저항성의 검출에 의하여 상기 제3 융합 세포를 선별할 수 있다.
상기 대조군 융합 세포는 원염색체만을 포함하는 비표적 마이크로세포 및 표적화 세포의 융합 세포이다.
일 예로, 상기 대조군 융합 세포는 제1 비표적 마이크로세포 및 제2 표적화 세포의 융합 세포일 수 있다.
예를 들어, 상기 대조군 융합 세포는 하이그로마이신 저항성 유전자(hygromycin resistant gene)가 삽입된 제2 표적화된 염색체를 포함할 수 있다. 상기 제2 표적화된 염색체는 제2 표적화 세포로부터 제공된 것일 수 있다. 상기 대조군 융합 세포에 포함된 원염색체는 제1 비표적 마이크로세포 및/또는 상기 제2 표적화 세포로부터 제공된 것일 수 있다. 상기 제1 비표적 마이크로세포는 제1 표적화 세포로부터 제조된 것일 수 있다.
상기 제3 융합 세포는 네오마이신 저항성 유전자(neomycin resistant gene)가 삽입된 제1 인공 재조합 염색체를 포함할 수 있다.
이 때, 하이그로마이신(hygromycin)에 대한 항생제 저항성 검출을 통하여 제3 융합 세포로부터 대조군 융합 세포를 선별할 수 있다.
이 때, 네오마이신(neomycin)에 대한 항생제 저항성 검출을 통하여 대조군 융합 세포로부터 제3 융합 세포를 선별할 수 있다.
또 다른 구현예에 의하면,
상기 제3 융합 세포는 dCas9-리포터(dead Cas9-Reporter; dCas9-Reporter)에 의하여 선별될 수 있다. 상기 dCas9-리포터는 전술하였다.
상기 dCas9-리포터 검출을 위하여, 상기 제3 융합 세포에 gRNA 또는 이를 암호화하는 핵산을 처리할 수 있다.
상기 gRNA은 gRNA 표적 서열(gRNA target sequence)에 결합하는 것일 수 있다. 상기 gRNA 표적 서열(gRNA target sequence)은 gRNA에 대한 센스(sense) 서열을 포함할 수 있다. 상기 gRNA 표적 서열(gRNA target sequence)은 gRNA에 대한 안티센스(antisense) 서열을 포함할 수 있다. 상기 gRNA 표적 서열(gRNA target sequence)은 표적화된 염색체 및/또는 제2 인공 재조합 염색체에는 존재하지 않으나, 제1 인공 재조합 염색체에는 존재하는 서열 중 선택될 수 있다. 상기 표적화된 염색체, 상기 제1 인공 재조합 염색체, 상기 제2 인공 재조합 염색체 및 상기 표적 서열은 전술하였다.
상기 gRNA 표적 서열 및/또는 gRNA의 후보군은 in silico 고안을 통하여 추출할 수 있다.
일 구체예에 의하면,
제3 융합 세포 및 제2 융합 세포가 혼합된 배지(media)에서, dCas9-리포터 검출에 의하여 상기 제3 융합 세포를 선별할 수 있다.
예를 들어, 상기 제3 융합 세포는 제1 인공 재조합 염색체를 포함할 수 있다. 상기 제1 인공 재조합 염색체는 gRNA 표적 서열을 포함하지 않을 수 있다. 상기 제2 융합 세포는 gRNA 표적 서열을 포함하는 제2 인공 재조합 염색체를 포함할 수 있다. 상기 제2 융합 세포는 제1 인공 재조합 염색체를 포함할 수 있다. 상기 제1 인공 재조합 염색체는 gRNA 표적 서열을 포함하지 않을 수 있다.
이 때, gRNA, dCas9 및 리포터를 처리하고, 상기 Reporter에 포함된 표지자 검출을 통하여 제3 융합 세포로부터 제2 융합 세포를 선별할 수 있다. 상기 gRNA은 gRNA 표적 서열(gRNA target sequence)에 결합하는 것일 수 있다. 상기 gRNA 표적 서열은 상기 제2 인공 재조합 염색체의 일 영역이다.
따라서, 상기 제3 융합 세포 및 상기 제2 융합 세포가 혼합된 배지(media)에서, dCas9-리포터에 의해 검출되지 않는 세포를 제3 융합 세포로 선별할 수 있다.
다른 구체예에 의하면,
제3 융합 세포 및 제1 융합 세포가 혼합된 배지(media)에서, dCas9-리포터 검출에 의하여 상기 제3 융합 세포를 선별할 수 있다.
예를 들어, 상기 제3 융합 세포는 gRNA 표적 서열을 포함하는 제1 인공 재조합 염색체를 포함할 수 있다. 상기 제1 융합 세포는 제1 표적화된 염색체 및 제2 표적화된 염색체를 포함할 수 있다. 상기 제1 표적화된 염색체 및 상기 제2 표적화된 염색체는 gRNA 표적 서열을 포함하지 않는다.
이 때, gRNA, dCas9 및 리포터를 처리하고, 상기 리포터에 포함된 표지자 검출을 통하여 제1 융합 세포로부터 제3 융합 세포를 선별할 수 있다. 상기 gRNA은 gRNA 표적 서열(gRNA target sequence)에 결합하는 것일 수 있다. 상기 gRNA 표적 서열은 상기 제1 인공 재조합 염색체의 일 영역이다.
또 다른 구체예에 의하면,
상기 제3 융합 세포 및 대조군 융합 세포가 혼합된 배지(media)에서, dCas9-리포터 검출에 의하여 상기 제3 융합 세포를 선별할 수 있다.
상기 대조군 융합 세포는 원염색체만을 포함하는 비표적 마이크로세포 및 표적화 세포의 융합 세포이다.
일 예로, 상기 대조군 융합 세포는 제1 비표적 마이크로세포 및 제2 표적화 세포의 융합 세포일 수 있다.
예를 들어, 상기 대조군 융합 세포는 제2 표적화된 염색체를 포함할 수 있다. 상기 제2 표적화된 염색체는 제2 표적화 세포로부터 제공된 것일 수 있다. 상기 대조군 융합 세포에 포함된 원염색체는 제1 비표적 마이크로세포 및/또는 상기 제2 표적화 세포로부터 제공된 것일 수 있다. 상기 제1 비표적 마이크로세포는 제1 표적화 세포로부터 제조된 것일 수 있다.
상기 제3 융합 세포는 gRNA 표적 서열을 포함하는 제1 인공 재조합 염색체를 포함할 수 있다.
이 때, gRNA, dCas9 및 리포터를 처리하고, 상기 리포터에 포함된 표지자 검출을 통하여 대조군 융합 세포로부터 제3 융합 세포를 선별할 수 있다. 상기 gRNA은 gRNA 표적 서열(gRNA target sequence)에 결합하는 것일 수 있다. 상기 gRNA 표적 서열은 상기 제1 인공 재조합 염색체의 일 영역이다.
또 다른 구현예에 의하면,
상기 제3 융합 세포는 FISH(Fluorescence in situ hybridization)에 의하여 선별될 수 있다. 상기 FISH의 일 예로, 항체-리포터를 이용할 수 있다. 상기 항체-리포터는 염색체의 특이 응축 구조 및/또는 염색체의 특정 서열에 대한 항체의 결합력을 이용하여 표적 서열을 검출하는 것이다. 상기 항체-리포터를 이용한 FISH는 공지의 방법을 이용할 수 있다.
상기 FISH 검출을 위하여, 상기 제3 융합 세포에 항체-리포터를 처리할 수 있다. 상기 항체-리포터는 1차 항체 및 리포터의 연결된 구조체를 의미할 수 있다. 뿐만 아니라, 상기 항체-리포터는 1차 항체의 일 영역에 결합력을 가지는 2차 항체 및 리포터의 연결된 구조체를 의미할 수 있다. 이 경우, 항체-리포터의 처리는 1차 항체 처리 이후, 2차 항체-리포터 구조체를 시계열적으로 제공해주는 것을 포함할 수 있다.
상기 항체는 염색체 상의 항체 표적 서열(antibody target sequence)에 결합하는 것일 수 있다.
상기 항체 표적 서열 및/또는 항체의 후보군은 in silico 고안을 통하여 추출할 수 있다.
일 구체예에 의하면,
제3 융합 세포 및 제2 융합 세포가 혼합된 배지(media)에서, FISH 검출에 의하여 상기 제3 융합 세포를 선별할 수 있다.
예를 들어, 상기 제3 융합 세포는 제1 인공 재조합 염색체를 포함할 수 있다. 상기 제2 융합 세포는 염색체 상의 항체 표적 서열을 포함하는 제2 인공 재조합 염색체를 포함할 수 있다. 상기 제2 융합 세포는 제1 인공 재조합 염색체를 포함할 수 있다.
이 때, 항체-리포터를 처리하고, 상기 리포터에 포함된 표지자 검출을 통하여 제3 융합 세포로부터 제2 융합 세포를 선별할 수 있다. 상기 항체는 항체 표적 서열(antibody target sequence)에 결합하는 것일 수 있다. 상기 항체 표적 서열은 상기 제2 인공 재조합 염색체의 일 영역이다.
이 때, 1차 항체를 처리하고, 2차 항체로서 항체-Reporter를 처리하여, 상기 리포터에 포함된 표지자 검출을 통하여 제3 융합 세포로부터 제2 융합 세포를 선별할 수 있다. 상기 1차 항체는 항체 표적 서열(antibody target sequence)에 결합하는 것일 수 있다. 상기 2차 항체는 상기 1차 항체의 일 영역에 결합하는 것일 수 있다. 상기 항체 표적 서열은 상기 제2 인공 재조합 염색체의 일 영역이다.
따라서, 상기 제3 융합 세포 및 상기 제2 융합 세포가 혼합된 배지(media)에서, FISH에 의해 검출되지 않는 세포를 제3 융합 세포로 선별할 수 있다.
다른 구체예에 의하면,
제3 융합 세포 및 제1 융합 세포가 혼합된 배지(media)에서, FISH 검출에 의하여 상기 제3 융합 세포를 선별할 수 있다.
예를 들어, 상기 제3 융합 세포는 염색체 상의 항체 표적 서열을 포함하는 제1 인공 재조합 염색체를 포함할 수 있다. 상기 제1 융합 제1 표적화된 염색체 및 제2 표적화된 염색체를 포함할 수 있다. 상기 제1 표적화된 염색체 및 상기 제2 표적화된 염색체는 항체 표적 서열을 포함하지 않는다.
이 때, 항체-리포터를 처리하고, 상기 리포터에 포함된 표지자 검출을 통하여 제1 융합 세포로부터 제3 융합 세포를 선별할 수 있다. 상기 항체는 항체 표적 서열(antibody target sequence)에 결합하는 것일 수 있다. 상기 항체 표적 서열은 상기 제1 인공 재조합 염색체의 일 영역이다.
이 때, 1차 항체를 처리하고, 2차 항체로서 항체-리포터를 처리하여, 상기 리포터에 포함된 표지자 검출을 통하여 제1 융합 세포로부터 제3 융합 세포를 선별할 수 있다. 상기 1차 항체는 항체 표적 서열(antibody target sequence)에 결합하는 것일 수 있다. 상기 2차 항체는 상기 1차 항체의 일 영역에 결합하는 것일 수 있다. 상기 항체 표적 서열은 상기 제1 인공 재조합 염색체의 일 영역이다.
또 다른 구체예에 의하면,
제3 융합 세포 및 대조군 융합 세포가 혼합된 배지(media)에서, FISH 검출에 의하여 상기 제3 융합 세포를 선별할 수 있다.
상기 대조군 융합 세포는, 원염색체만을 포함하는 비표적 마이크로세포 및 표적화 세포의 융합 세포이다.
일 예로, 상기 대조군 융합 세포는 제1 비표적 마이크로세포 및 제2 표적화 세포의 융합 세포일 수 있다.
예를 들어, 상기 제3 융합 세포는 염색체 상의 항체 표적 서열을 포함하는 제1 인공 재조합 염색체를 포함할 수 있다. 상기 대조군 융합 세포는 제2 표적화된 염색체를 포함하므로, 항체 표적 서열을 포함하지 않는다.
이 때, 항체-리포터를 처리하고, 상기 리포터에 포함된 표지자 검출을 통하여 대조군 융합 세포로부터 제3 융합 세포를 선별할 수 있다. 상기 항체는 항체 표적 서열(antibody target sequence)에 결합하는 것일 수 있다. 상기 항체 표적 서열은 상기 제1 인공 재조합 염색체의 일 영역이다.
이 때, 1차 항체를 처리하고, 2차 항체로서 항체-리포터를 처리하여, 상기 리포터에 포함된 표지자 검출을 통하여 대조군 융합 세포로부터 제3 융합 세포를 선별할 수 있다. 상기 1차 항체는 항체 표적 서열(antibody target sequence)에 결합하는 것일 수 있다. 상기 2차 항체는 상기 1차 항체의 일 영역에 결합하는 것일 수 있다. 상기 항체 표적 서열은 상기 제1 인공 재조합 염색체의 일 영역이다.
8. 제4 융합 세포(a fourth fusion cell) 및 이의 제조
본 명세서에 개시된 또 다른 양태에 의하면, 제4 융합 세포(a third fusion cell) 및 이의 제조 방법이 제공될 수 있다.
상기 제4 융합 세포는, 제3 인공 재조합 염색체를 포함하는 세포이다.
상기 제3 인공 재조합 염색체는, 상기 제1 인공 재조합 염색체 중 RRS 및/또는 ASCE가 제거된 염색체이다(도 13 및 도 19).
상기 제4 융합 세포는, 전술한 제3 융합세포로부터 제공된 제1 인공 재조합 염색체의 일부가 제거된 것일 수 있다.
또는, 상기 제4 융합 세포는 전술한 제2 융합세포로부터 제공된 제1 인공 재조합 염색체 및 제2 인공 재조합 염색체의 일부가 제거된 후 제작된 것일 수 있다.
상기 제2 융합세포로부터 제공된 제2 인공 재조합 염색체로부터 제4 인공 재조합 염색체가 제조될 수 있다.
상기 제4 인공 재조합 염색체는, 상기 제2 인공 재조합 염색체 중 RRS 및/또는 ASCE가 제거된 염색체이다.
따라서, 제3 인공 재조합 염색체 및 제4 인공 재조합 염색체를 포함하는 세포를 제5 융합세포라 칭할 수 있다.
상기 제4 융합 세포는, 상기 제5 융합세포로부터 제4 인공 재조합 염색체가 소실됨으로써 제작될 수 있다.
상기 제4 융합 세포는 제3 인공 재조합 염색체는 포함하되, 제4 인공 재조합 염색체는 소실한 것일 수 있다. 상기 제4 융합 세포는 전술한 원염색체를 하나 또는 그 이상 더 포함할 수 있다.
상기 제4 융합 세포는 인공 재조합 염색체를 포함할 수 있다. 상기 제4 융합 세포는 상기 인공 재조합 염색체를 단일 및/또는 2개 이상 포함될 수 있다.
8-1. 제4 융합 세포
본 명세서에 개시된 일 실시예에 의하면, 제3 인공 재조합 염색체를 포함하는 제4 융합 세포 및 이의 제조 방법이 제공될 수 있다.
일 예로, 상기 제4 융합 세포는 제3 융합 세포로부터 제작될 수 있다.
다른 예로, 상기 제4 융합 세포는 제2 융합 세포로부터 제작될 수 있다. 상기 제2 융합세포로부터 상기 제5 융합 세포를 제조 한 이후, 상기 제4 융합 세포를 제조할 수 있다.
일 구현예에 의하면,
제4 융합 세포는
제3 융합 세포에 트랜스포세이즈(Transpoase) 또는 이를 암호화하는 핵산을 처리하여 제조할 수 있다.
이 때, 상기 제3 융합 세포는 제1 인공 재조합 염색체를 포함한 것일 수 있다.
이 때, 상기 제4 융합 세포는 제3 인공 재조합 염색체를 포함한 것일 수 있다.
이 때, 상기 트랜스포세이즈(Transpoase)는 Piggy Bac일 수 있다.
일 구현예에 의하면,
제4 융합 세포는
제2 융합 세포에 트랜스포세이즈(Transpoase) 또는 이를 암호화하는 핵산을 처리하여 제조할 수 있다.
이 때, 상기 제2 융합 세포는 제1 인공 재조합 염색체 및 제2 인공 재조합 염색체를 포함한 것일 수 있다.
상기 트랜스포세이즈(Transpoase) 또는 이를 암호화하는 핵산에 의하여 제3 인공 재조합 염색체 및 제4 인공 재조합 염색체가 제작될 수 있다.
상기 제4 인공 재조합 염색체는 소실될 수 있다.
이 때, 상기 트랜스포세이즈(Transpoase)는 Piggy Bac일 수 있다.
상기 제3 융합 세포, 상기 제2 융합 세포, 상기 제1 인공 재조합 염색체 및 상기 제2 인공 재조합 염색체는 전술하였다.
상기 Piggy Bac Transposase의 아미노산 서열은, 하기 표 4에 개시한다. 다만, 하기 표 4에 개시된 Piggy Bac Transposase는 일 예로서, 이에 제한되는 것은 아니다.
Piggy Bac Transposase 아미노산 서열
No. Piggy Bac Transposase 아미노산 서열
1 MGSSLDDEHILSALLQSDDELVGEDSDSEISDHVSEDDVQSDTEEAFIDEVHEVQPTSSGSEILDEQNVIEQPGSSLASNRILTLPQRTIRGKNKHCWSTSKSTRRSRVSALNIVRSQRGPTRMCRNIYDPLLCFKLFFTDEIISEIVKWTNAEISLKRRESMTGATFRDTNEDEIYAFFGILVMTAVRKDNHMSTDDLFDRSLSMVYVSVMSRDRFDFLIRCLRMDDKSIRPTLRENDVFTPVRKIWDLFIHQCIQNYTPGAHLTIDEQLLGFRGRCPFRMYIPNKPSKYGIKILMMCDSGTKYMINGMPYLGRGTQTNGVPLGEYYVKELSKPVHGSCRNITCDNWFTSIPLAKNLLQEPYKLTIVGTVRSNKREIPEVLKNSRSRPVGTSMFCFDGPLTLVSYKPKPAKMVYLLSSCDEDASINESTGKPQMVMYYNQTKGGVDTLDQMCSVMTCSRKTNRWPMALLYGMINIACINSFIIYSHNVSSKGEKVQSRKKFMRNLYMSLTSSFMRKRLEAPTLKRYLRDNISNILPNEVPGTSDDSTEEPVMKKRTYCTYCPSKIRRKANASCKKCKKVICREHNIDMCQSCF(SEQ ID NO: 33)
8-2. 제4 융합 세포의 선별 방법(a fourth fusion cell selection methods)
본 명세서에 개시된 다른 실시예에 의하면, 제3 인공 재조합 염색체 및/또는 제4 인공 재조합염색체를 포함하는 제4 융합 세포의 선별 방법이 제공될 수 있다. 상기 제4 융합 세포는 원염색체를 더 포함할 수 있다.
상기 제3 인공 재조합 염색체는 제1 인공 재조합 염색체 중 RRS 및/또는 ASCE가 제거된 것일 수 있다.
상기 제4 인공 재조합 염색체는 제2 인공 재조합 염색체 중 RRS 및/또는 ASCE가 제거된 것일 수 있다.
상기 RRS, 상기 ASCE, 상기 제1 인공 재조합 염색체 및 상기 제2 인공 재조합 염색체는 전술하였다.
일 구현예에 의하면,
상기 제4 융합 세포는 형광 단백질 검출에 의하여 선별될 수 있다.
상기 제4 융합 세포에 포함된 제3 인공 재조합 염색체 및/또는 제4 인공 재조합 염색체는 형광 단백질 유전자를 소실한 것일 수 있다.
상기 형광 단백질 유전자는 GFP 유전자(GFP gene), YFP 유전자(YFP gene), RFP 유전자(RFP gene) 또는 mCherry 유전자(mCherry gene) 중 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체예에 의하면,
상기 제4 융합 세포 및 상기 제3 융합 세포가 혼합된 배지(media)에서, 형광 단백질의 검출에 의하여 상기 제4 융합 세포를 선별할 수 있다.
예를 들어, 상기 제3 융합 세포는 GFP 유전자(GFP gene)가 삽입된 제1 인공 재조합 염색체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 제4 융합 세포는 제3 인공 재조합 염색체를 포함할 수 있다.
이 때, 녹색 형광(Green fluorescence)의 검출을 통하여 제4 융합 세포로부터 제3 융합 세포를 선별할 수 있다.
따라서, 상기 제4 융합 세포 및 상기 제3 융합 세포가 혼합된 배지(media)에서, 녹색 형광(Green fluorescence)에 의해 검출되지 않는 세포를 제4 융합 세포로 선별할 수 있다.
다른 구체예에 의하면,
상기 제4 융합 세포 및 상기 제2 융합 세포가 혼합된 배지(media)에서, 형광 단백질의 검출에 의하여 상기 제4 융합 세포를 선별할 수 있다.
예를 들어, 상기 제2 융합 세포는 GFP gene이 삽입된 제1 인공 재조합 염색체 및 mCherry 유전자(mCherry gene)가 삽입된 제2 인공 재조합 염색체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 제4 융합 세포는 제3 인공 재조합 염색체 및 제4 인공 재조합 염색체를 포함할 수 있다. 상기 제3 인공 재조합 염색체는 상기 제1 인공 재조합 염색체 중 GFP gene이 소실된 것이다. 상기 제4 인공 재조합 염색체는 상기 제2 인공 재조합 염색체 중 mCherry gene이 소실된 것이다.
이 때, 황색 형광(Yellow fluorescence)의 검출을 통하여 제4 융합 세포로부터 제2 융합 세포를 선별할 수 있다. 상기 황색 형광(Yellow fluorescence)은 녹색 형광(Green fluorescence) 및 mCherry 형광(mCherry fluorescence)이 혼합되어 육안 및/또는 기기에 황색(Yellow)으로 검출 되는 것이다.
따라서, 상기 제4 융합 세포 및 상기 제2 융합 세포가 혼합된 배지(media)에서, 황성 형광(Yellow fluorescence)에 의해 검출되지 않는 세포를 제4 융합 세포로 선별할 수 있다.
다른 구현예에 의하면,
상기 제4 융합 세포는 항생제 저항성에 의하여 선별될 수 있다.
상기 제4 융합 세포에 포함된 제3 인공 재조합 염색체 및/또는 제4 인공 재조합 염색체는 항생제 저항성 유전자를 소실한 것일 수 있다.
상기 항생제 저항성 유전자는 하이그로마이신 저항성 유전자(hygromycin resistant gene), 네오마이신 저항성 유전자(neomycin resistant gene), 카나마이신 저항성 유전자(kanamycin resistant gene), 블라스티사이딘 저항성 유전자(blasticidin resistant gene), 제오신 저항성 유전자(zeocin resistant gene) 또는 퓨로ΔTK 유전자(puroΔgene) 중 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체예에 의하면,
상기 제4 융합 세포 및 상기 제3 융합 세포가 혼합된 배지(media)에서, 항생제 저항성 검출에 의하여 상기 제4 융합 세포를 선별할 수 있다.
예를 들어, 상기 제3 융합 세포는 네오마이신 저항성 유전자(neomycin resistant gene)가 삽입된 제1 인공 재조합 염색체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 제4 융합 세포는 제3 인공 재조합 염색체를 포함할 수 있다.
이 때, 네오마이신(neomycin)에 대한 항생제 저항성 검출을 통하여 제4 융합 세포로부터 제3 융합 세포를 선별할 수 있다.
따라서, 상기 제4 융합 세포 및 상기 제3 융합 세포가 혼합된 배지(media)에서, 네오마이신(neomycin)에 대한 항생제 저항성이 검출되지 않는 세포를 제4 융합 세포로 선별할 수 있다.
다른 구체예에 의하면,
상기 제4 융합 세포 및 상기 제2 융합 세포가 혼합된 배지(media)에서, 항생제 저항성 검출에 의하여 상기 제4 융합 세포를 선별할 수 있다.
예를 들어, 상기 제2 융합 세포는 네오마이신 저항성 유전자(neomycin resistant gene)가 삽입된 제1 인공 재조합 염색체 및 하이그로마이신 저항성 유전자(hygromycin resistant gene)가 삽입된 제2 인공 재조합 염색체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 제4 융합 세포는 제3 인공 재조합 염색체 및 제4 인공 재조합 염색체를 포함할 수 있다. 상기 제3 인공 재조합 염색체는 상기 제1 인공 재조합 염색체 중 네오마이신 저항성 유전자(neomycin resistant gene)가 소실된 것이다. 상기 제4 인공 재조합 염색체는 상기 제2 인공 재조합 염색체 중 하이그로마이신 저항성 유전자(hygromycin resistant gene)가 소실된 것이다.
이 때, 네오마이신(neomycin)에 대한 항생제 저항성 검출을 통하여 제4 융합 세포로부터 제2 융합 세포를 선별할 수 있다.
이 때, 하이그로마이신(hygromycin)에 대한 항생제 저항성 검출을 통하여 제4 융합 세포로부터 제2 융합 세포를 선별할 수 있다.
따라서, 상기 제4 융합 세포 및 상기 제2 융합 세포가 혼합된 배지(media)에서, 네오마이신(neomycin) 및/또는 하이그로마이신(hygromycin)에 대한 항생제 저항성이 검출되지 않는 세포를 제4 융합 세포로 선별할 수 있다.
또 다른 구현예에 의하면,
상기 제4 융합 세포는 dCas9-리포터(dead Cas9-Reporter; dCas9-Reporter)에 의하여 선별될 수 있다. 상기 dCas9-리포터는 전술하였다.
상기 dCas9-리포터 검출을 위하여, 상기 제4 융합 세포에 gRNA 또는 이를 암호화하는 핵산을 처리할 수 있다.
상기 gRNA은 gRNA 표적 서열(gRNA target sequence)에 결합하는 것일 수 있다. 상기 gRNA 표적 서열(gRNA target sequence)은 gRNA에 대한 센스(sense) 서열을 포함할 수 있다. 상기 gRNA 표적 서열(gRNA target sequence)은 gRNA에 대한 안티센스(antisense) 서열을 포함할 수 있다. 상기 gRNA 표적 서열(gRNA target sequence)은 제1 인공 재조합 염색체 및/또는 제2 인공 재조합 염색체에는 존재하지 않으나, 제3 인공 재조합 염색체 및/또는 제4 인공 재조합 염색체에는 존재하는 서열 중 선택될 수 있다. 상기 제1 인공 재조합 염색체, 상기 제2 인공 재조합 염색체, 상기 제3 인공 재조합 염색체, 상기 제4 인공 재조합 염색체 및 상기 표적 서열은 전술하였다.
상기 gRNA 표적 서열 및/또는 gRNA의 후보군은 in silico 고안을 통하여 추출할 수 있다.
일 구체예에 의하면,
제4 융합 세포 및 제3 융합 세포가 혼합된 배지(media)에서, dCas9-리포터 검출에 의하여 상기 제4 융합 세포를 선별할 수 있다.
예를 들어, 상기 제4 융합 세포는 제3 인공 재조합 염색체를 포함할 수 있다. 상기 제3 인공 재조합 염색체는 gRNA 표적 서열을 포함할 수 있다. 상기 제3 융합 세포는 제1 인공 재조합 염색체를 포함할 수 있다. 상기 제1 인공 재조합 염색체는 gRNA 표적 서열을 포함하지 않을 수 있다.
이 때, gRNA, dCas9 및 리포터를 처리하고, 상기 리포터에 포함된 표지자 검출을 통하여 제3 융합 세포로부터 제4 융합 세포를 선별할 수 있다. 상기 gRNA은 gRNA 표적 서열(gRNA target sequence)에 결합하는 것일 수 있다. 상기 gRNA 표적 서열은 상기 제3 인공 재조합 염색체의 일 영역이다.
다른 구체예에 의하면,
제4 융합 세포 및 제3 융합 세포가 혼합된 배지(media)에서, dCas9-리포터 검출에 의하여 상기 제4 융합 세포를 선별할 수 있다.
예를 들어, 상기 제4 융합 세포는 제3 인공 재조합 염색체를 포함할 수 있다. 상기 제3 인공 재조합 염색체는 gRNA 표적 서열을 포함하지 않을 수 있다. 상기 제3 융합 세포는 제1 인공 재조합 염색체를 포함할 수 있다. 상기 제1 인공 재조합 염색체는 gRNA 표적 서열을 포함할 수 있다.
이 때, gRNA, dCas9 및 리포터를 처리하고, 상기 리포터에 포함된 표지자 검출을 통하여 제4 융합 세포로부터 제3 융합 세포를 선별할 수 있다. 상기 gRNA은 gRNA 표적 서열(gRNA target sequence)에 결합하는 것일 수 있다. 상기 gRNA 표적 서열은 상기 제1 인공 재조합 염색체의 일 영역이다.
따라서, 상기 제4 융합 세포 및 상기 제3 융합 세포가 혼합된 배지(media)에서, dCas9-리포터에 의해 검출되지 않는 세포를 제4 융합 세포로 선별할 수 있다.
또 다른 구체예에 의하면,
제4 융합 세포 및 제2 융합 세포가 혼합된 베지(media)에서, dCas9-리포터 검출에 의하여 상기 제4 융합 세포를 선별할 수 있다.
예를 들어, 상기 제4 융합 세포는 제3 인공 재조합 염색체 및 제4 인공 재조합 염색체를 포함할 수 있다. 상기 제3 인공 재조합 염색체 및/또는 상기 제4 인공 재조합 염색체는 gRNA 표적 서열을 포함할 수 있다. 상기 제2 융합 세포는 제1 인공 재조합 염색체 및 제2 인공 재조합 염색체를 포함할 수 있다. 상기 제1 인공 재조합 염색체 및 상기 제2 인공 재조합 염색체는 gRNA 표적 서열을 포함하지 않을 수 있다.
이 때, gRNA, dCas9 및 리포터를 처리하고, 상기 리포터에 포함된 표지자 검출을 통하여 제2 융합 세포로부터 제4 융합 세포를 선별할 수 있다. 상기 gRNA은 gRNA 표적 서열(gRNA target sequence)에 결합하는 것일 수 있다. 상기 gRNA 표적 서열은 상기 제3 인공 재조합 염색체 및/또는 상기 제4 인공 재조합 염색체의 일 영역이다.
또 다른 구체예에 의하면,
제4 융합 세포 및 제2 융합 세포가 혼합된 배지(media)에서, dCas9-리포터 검출에 의하여 상기 제4 융합 세포를 선별할 수 있다.
예를 들어, 상기 제4 융합 세포는 제3 인공 재조합 염색체 및 제4 인공 재조합 염색체를 포함할 수 있다. 상기 제3 인공 재조합 염색체 및/또는 상기 제4 인공 재조합 염색체는 gRNA 표적 서열을 포함하지 않을 수 있다. 상기 제2 융합 세포는 제1 인공 재조합 염색체 및/또는 제2 인공 재조합 염색체를 포함할 수 있다. 상기 제1 인공 재조합 염색체 및/또는 상기 제2 인공 재조합 염색체는 gRNA 표적 서열을 포함할 수 있다.
이 때, gRNA, dCas9 및 리포터를 처리하고, 상기 Reporter에 포함된 표지자 검출을 통하여 제4 융합 세포로부터 제2 융합 세포를 선별할 수 있다. 상기 gRNA은 gRNA 표적 서열(gRNA target sequence)에 결합하는 것일 수 있다. 상기 gRNA 표적 서열은 상기 제1 인공 재조합 염색체 및/또는 제2 인공 재조합 염색체의 일 영역이다.
따라서, 상기 제4 융합 세포 및 상기 제2 융합 세포가 혼합된 배지(media)에서, dCas9-리포터에 의해 검출되지 않는 세포를 제4 융합 세포로 선별할 수 있다.
또 다른 구현예에 의하면,
상기 제4 융합 세포는 FISH(Fluorescence in situ hybridization)에 의하여 선별될 수 있다. 상기 FISH의 일 예로, 항체-리포터를 이용할 수 있다. 상기 항체-Reporter는 염색체의 특이 응축 구조 및/또는 염색체의 특정 서열에 대한 항체의 결합력을 이용하여 표적 서열을 검출하는 것이다. 상기 항체-리포터를 이용한 FISH는 공지의 방법을 이용할 수 있다.
상기 FISH 검출을 위하여, 상기 제4 융합 세포에 항체-Reporter을 처리할 수 있다. 상기 항체-리포터는 1차 항체 및 리포터의 연결된 구조체를 의미할 수 있다. 뿐만 아니라, 상기 항체-리포터는 1차 항체의 일 영역에 결합력을 가지는 2차 항체 및 리포터의 연결된 구조체를 의미할 수 있다. 이 경우, 항체-리포터의 처리는 1차 항체 처리 이후, 2차 항체-리포터 구조체를 시계열적으로 제공해주는 것을 포함할 수 있다.
상기 항체는 염색체 상의 항체 표적 서열(antibody target sequence)에 결합하는 것일 수 있다
상기 항체 표적 서열 및/또는 항체의 후보군은 in silico 고안을 통하여 추출할 수 있다.
일 구체예에 의하면,
제4 융합 세포 및 제3 융합 세포가 혼합된 배지(media)에서, FISH 검출에 의하여 상기 제4 융합 세포를 선별할 수 있다.
예를 들어, 상기 제4 융합 세포는 제3 인공 재조합 염색체를 포함할 수 있다. 상기 제3 인공 재조합 염색체는 항체 표적 서열을 포함할 수 있다. 상기 제3 융합 세포는 제1 인공 재조합 염색체를 포함할 수 있다. 상기 제1 인공 재조합 염색체는 항체 표적 서열을 포함하지 않을 수 있다.
이 때, 항체-리포터를 처리하고, 상기 리포터에 포함된 표지자 검출을 통하여 제3 융합 세포로부터 제4 융합 세포를 선별할 수 있다. 상기 항체는 항체 표적 서열(antibody target sequence)에 결합하는 것일 수 있다. 상기 항체 표적 서열은 상기 제3 인공 재조합 염색체의 일 영역이다.
이 때, 1차 항체를 처리하고, 2차 항체로서 항체-리포터를 처리하여, 상기 리포터에 포함된 표지자 검출을 통하여 제3 융합 세포로부터 제4 융합 세포를 선별할 수 있다. 상기 1차 항체는 항체 표적 서열(antibody target sequence)에 결합하는 것일 수 있다. 상기 2차 항체는 상기 1차 항체의 일 영역에 결합하는 것일 수 있다. 상기 항체 표적 서열은 상기 제3 인공 재조합 염색체의 일 영역이다.
다른 구체예에 의하면,
제4 융합 세포 및 제3 융합 세포가 혼합된 배지(media)에서, FISH 검출에 의하여 상기 제4 융합 세포를 선별할 수 있다.
예를 들어, 상기 제4 융합 세포는 제3 인공 재조합 염색체를 포함할 수 있다. 상기 제3 인공 재조합 염색체는 항체 표적 서열을 포함하지 않을 수 있다. 상기 제3 융합 세포는 제1 인공 재조합 염색체를 포함할 수 있다. 상기 제1 인공 재조합 염색체는 항체 표적 서열을 포함할 수 있다.
이 때, 항체-리포터를 처리하고, 상기 리포터에 포함된 표지자 검출을 통하여 제4 융합 세포로부터 제3 융합 세포를 선별할 수 있다. 상기 항체는 항체 표적 서열(antibody target sequence)에 결합하는 것일 수 있다. 상기 항체 표적 서열은 상기 제1 인공 재조합 염색체의 일 영역이다.
이 때, 1차 항체를 처리하고, 2차 항체로서 항체-리포터를 처리하여, 상기 리포터에 포함된 표지자 검출을 통하여 제4 융합 세포로부터 제3 융합 세포를 선별할 수 있다. 상기 1차 항체는 항체 표적 서열(antibody target sequence)에 결합하는 것일 수 있다. 상기 2차 항체는 상기 1차 항체의 일 영역에 결합하는 것일 수 있다. 상기 항체 표적 서열은 상기 제1 인공 재조합 염색체의 일 영역이다.
따라서, 상기 제4 융합 세포 및 상기 제3 융합 세포가 혼합된 배지(media)에서, FISH에 의해 검출되지 않는 세포를 제4 융합 세포로 선별할 수 있다.
또 다른 구체예에 의하면,
제4 융합 세포 및 제2 융합 세포가 혼합된 배지(media)에서, FISH 검출에 의하여 상기 제4 융합 세포를 선별할 수 있다.
예를 들어, 상기 제4 융합 세포는 제3 인공 재조합 염색체 및 제4 인공 재조합 염색체를 포함할 수 있다. 상기 제3 인공 재조합 염색체 및/또는 제4 인공 재조합 염색체는 항체 표적 서열을 포함할 수 있다. 상기 제2 융합 세포는 제1 인공 재조합 염색체 및 제2 인공 재조합 염색체를 포함할 수 있다. 상기 제1 인공 재조합 염색체 및 제2 인공 재조합 염색체는 항체 표적 서열을 포함하지 않을 수 있다.
이 때, 항체-리포터를 처리하고, 상기 리포터에 포함된 표지자 검출을 통하여 제2 융합 세포로부터 제4 융합 세포를 선별할 수 있다. 상기 항체는 항체 표적 서열(antibody target sequence)에 결합하는 것일 수 있다. 상기 항체 표적 서열은 상기 제3 인공 재조합 염색체 및/또는 제4 인공 재조합 염색체의 일 영역이다.
이 때, 1차 항체를 처리하고, 2차 항체로서 항체-리포터를 처리하여, 상기 리포터에 포함된 표지자 검출을 통하여 제2 융합 세포로부터 제4 융합 세포를 선별할 수 있다. 상기 1차 항체는 항체 표적 서열(antibody target sequence)에 결합하는 것일 수 있다. 상기 2차 항체는 상기 1차 항체의 일 영역에 결합하는 것일 수 있다. 상기 항체 표적 서열은 상기 제3 인공 재조합 염색체 및/또는 제4 인공 재조합 염색체의 일 영역이다.
또 다른 구체예에 의하면,
제4 융합 세포 및 제2 융합 세포가 혼합된 배지(media)에서, FISH 검출에 의하여 상기 제4 융합 세포를 선별할 수 있다.
예를 들어, 상기 제4 융합 세포는 제3 인공 재조합 염색체 및 제4 인공 재조합 염색체를 포함할 수 있다. 상기 제3 인공 재조합 염색체 및 제4 인공 재조합 염색체는 항체 표적 서열을 포함하지 않을 수 있다. 상기 제2 융합 세포는 제1 인공 재조합 염색체 및 제2 인공 재조합 염색체를 포함할 수 있다. 상기 제1 인공 재조합 염색체 및/또는 제2 인공 재조합 염색체는 항체 표적 서열을 포함할 수 있다.
이 때, 항체-리포터를 처리하고, 상기 리포터에 포함된 표지자 검출을 통하여 제4 융합 세포로부터 제2 융합 세포를 선별할 수 있다. 상기 항체는 항체 표적 서열(antibody target sequence)에 결합하는 것일 수 있다. 상기 항체 표적 서열은 상기 제1 인공 재조합 염색체 및/또는 제2 인공 재조합 염색체의 일 영역이다.
이 때, 1차 항체를 처리하고, 2차 항체로서 항체-리포터를 처리하여, 상기 리포터에 포함된 표지자 검출을 통하여 제2 융합 세포로부터 제4 융합 세포를 선별할 수 있다. 상기 1차 항체는 항체 표적 서열(antibody target sequence)에 결합하는 것일 수 있다. 상기 2차 항체는 상기 1차 항체의 일 영역에 결합하는 것일 수 있다. 상기 항체 표적 서열은 상기 제1 인공 재조합 염색체 및/또는 제2 인공 재조합 염색체의 일 영역이다.
따라서, 상기 제4 융합 세포 및 상기 제2 융합 세포가 혼합된 배지(media)에서, FISH에 의해 검출되지 않는 세포를 제4 융합 세포로 선별할 수 있다.
9. 산자 제작 방법
본 명세서 개시된 또 다른 양태에 의하면, 제3 인공 재조합 염색체를 포함하는 제4 융합 세포로부터 제작된 산자를 제공한다.
본 명세서 개시된 또 다른 양태에 의하면, 제3 인공 재조합 염색체를 포함하는 제4 융합 세포로부터 산자 제작 방법을 제공한다.
본 명세서에 개시된 또 다른 양태에 의하면, 제3 융합 세포로부터 제작된 산자를 제공한다.
본 명세서에 개시된 또 다른 양태에 의하면, 제3 융합 세포로부터 산자 제작 방법을 제공한다.
상기 제3 융합 세포, 상기 제4 융합 세포 및 상기 제3 인공 재조합 염색체는 전술하였다.
9-1. 체세포 핵 이식(Somatic cell nuclear transfer; SCNT)
본 명세서에 개시된 일 실시예에 의하면, 제3 인공 재조합 염색체를 포함하는 제4 융합 세포로부터 제작된 산자를 제공한다.
본 명세서에 개시된 다른 실시예에 의하면, 제3 인공 재조합 염색체를 포함하는 제4 융합 세포로부터 산자 제작 방법을 제공한다.
상기 제4 융합 세포로부터 제작된 산자는 SCNT를 통해 제작될 수 있다. 상기 SCNT는 제4 융합 세포로부터 공여 핵을 제조하고, 탈핵 난자에 상기 공여 핵을 이식하여 복제란을 제작하고, 상기 복제란을 대리모의 자궁에 이식하여 산자를 발생시키는 것으로, 상기 SCNT는 공지의 방법을 이용한 것일 수 있다.
본 명세서에 개시된 또 다른 실시예에 의하면, 제3 융합 세포로부터 제작된 산자를 제공한다.
본 명세서에 개시된 또 다른 실시예에 의하면, 제3 융합 세포로부터 산자 제작 방법을 제공한다.
상기 제3 융합 세포로부터 제작된 산자는 SCNT를 통해 제작될 수 있다. 상기 SCNT는 제3 융합 세포로부터 공여 핵을 제조하고, 탈핵 난자에 상기 공여 핵을 이식하여 복제란을 제작하고, 상기 복제란을 대리모의 자궁에 이식하여 산자를 발생시키는 것으로, 상기 SCNT는 공지의 방법을 이용한 것일 수 있다.
이 때, 상기 제3 융합 세포 및/또는 상기 제4 융합 세포는 체세포(somatic cell), 줄기세포(stem cell), 배아 줄기세포(embryonic stem cell; ES cell) 및 배아(embryo) 중 어느 하나로부터 제작된 것일 수 있다. 상기 체세포(somatic cell)는, 예를 들어, 섬유아세포(fibroblast cell)일 수 있다.
9-2. 배아(embryo)로부터 발생
본 명세서에 개시된 일 실시예에 의하면, 제3 인공 재조합 염색체를 포함하는 제4 융합 세포로부터 제작된 산자를 제공한다.
본 명세서에 개시된 다른 실시예에 의하면, 제3 인공 재조합 염색체를 포함하는 제4 융합 세포로부터 산자 제작 방법을 제공한다.
상기 4 융합 세포로부터 제작된 산자는 배아(embryo)의 발생을 통해 제작될 수 있다. 상기 배아(embryo)의 발생은 배아(embryo)를 대리모의 자궁에 착상시켜 상기 배아(embryo)로부터 산자를 발생시키는 것으로, 공지의 방법을 이용한 것일 수 있다.
본 명세서에 개시된 또 다른 실시예에 의하면, 제3 융합 세포로부터 제작된 산자를 제공한다.
본 명세서에 개시된 또 다른 실시예에 의하면, 제3 융합 세포로부터 산자 제작 방법을 제공한다.
상기 3 융합 세포로부터 제작된 산자는 배아(embryo)의 발생을 통해 제작될 수 있다. 상기 배아(embryo)의 발생은 배아(embryo)를 대리모의 자궁에 착상시켜 상기 배아(embryo)로부터 산자를 발생시키는 것으로, 공지의 방법을 이용한 것일 수 있다.
이 때, 상기 제3 융합 세포 및/또는 상기 제4 융합 세포는 배아(embryo)로부터 제작된 것일 수 있다.
9-3. 배반포 주입 (Blastocyst Injection)
본 명세서에 개시된 일 실시예에 의하면, 제3 인공 재조합 염색체를 포함하는 제4 융합 세포로부터 제작된 산자를 제공한다.
본 명세서에 개시된 다른 실시예에 의하면, 제3 인공 재조합 염색체를 포함하는 제4 융합 세포로부터 산자 제작 방법을 제공한다.
상기 제4 융합 세포로부터 제작된 산자는 배반포 주입 (Blastocyst Injection)을 통해 제작될 수 있다. 상기 배반포 주입(Blastocyst Injection)은 유전자 조작된 배아 줄기세포(embryonic stem cell; ES cell)를 포배에 이식하여 키메릭 배반포(Chimeric Blastocyst)를 제작하고, 상기 키메릭 배반포(Chimeric Blastocyst)를 대리모의 자궁에 착상시켜 산자를 발생시키는 것으로, 공지의 방법을 이용한 것일 수 있다.
본 명세서에 개시된 또 다른 실시예에 의하면, 제3 융합 세포로부터 제작된 산자를 제공한다.
본 명세서에 개시된 또 다른 실시예에 의하면, 제3 융합 세포로부터 산자 제작 방법을 제공한다.
상기 제3 융합 세포로부터 제작된 산자는 배반포 주입(Blastocyst Injection)을 통해 제작될 수 있다. 상기 배반포 주입(Blastocyst Injection)은 유전자 조작된 ES cell을 포배에 이식하여 키메릭 배반포(Chimeric Blastocyst)를 제작하고, 상기 키메릭 배반포(Chimeric Blastocyst)를 대리모의 자궁에 착상시켜 산자를 발생시키는 것으로, 공지의 방법을 이용한 것일 수 있다.
이 때, 상기 제3 융합 세포 및/또는 상기 제4 융합 세포는 배아 줄기세포(embryonic stem cell; ES cell)로부터 제작된 것일 수 있다.
실시예 1. 벡터 설계(Vector Construction)
실시예 1-1. 1차 POC 벡터(1 st POC vector)
PCR reaction에 사용된 taq은 general PCR taq으로 GoTaq G2 green (Promega, USA) 그리고 blunt-end 생산용 taq은 PrimeSTAR (Takara, Japan)을 사용하였으며 thermocycler는 SimpliAmp (Thermo Fisher Scientific, USA)를 사용하였다. 클론 생산 및 DNA 염기서열 분석에 사용된 T-vector는 T-blunt vector (Solgent, Korea)를 사용하였으며 Competent cell은 HIT Competent Cells (RBC Bioscience, USA)를 사용하였다. DNA 재조합에 사용된 모든 제한 효소는 New England Biolabs (NEB) 사 제품을 사용하였으며, DNA ligation에 사용된 ligase는 T4 DNA ligase (Takara, Japan)를 사용하였다.
Mouse embryonic stem cell (ESC) 타게팅에 사용될 POC vector(1st mPOC vector)는 mouse의 IgHV 5'말단 타게팅에 사용될 flanking region sequence (M002), neomycin 저항성 유전자(NeoR), loxp, mouse의 IgHV 5'말단 타게팅에 사용될 flanking region sequence (M001), negative selection에 사용될 TK 유전자, 박테리아 positive selection에 사용될 ampicillin 저항성 유전자(AmpR) 그리고 replication origin으로 구성된다. NeoR의 경우 EcoRI site 포함하는 SV40 promoter forward gene specific primer (GSP) (표 5. SEQ ID NO: 1) 그리고 loxp 서열과 SalI site를 포함하는 bridge, reverse primers (표 5. SEQ ID NO: 2, 3)를 이용하여 overhang-PCR 방법으로 pCMV6-AC-GFP vector를 주형으로 증폭하였다. M001은 SalI과 XhoI site를 포함하는 GSP (표 5. SEQ ID NO: 4, 5), 그리고 M002는 BamHI과 EcoRI을 포함하는 GSP (표 5. SEQ ID NO: 6, 7)를 이용하여 J1 mouse genomic DNA를 주형으로 PCR 증폭하였다. 모든 PCR product는 T-blunt vector에 ligation 후 클로닝하여 DNA 염기서열을 확인 하였다. 모든 클론으로부터 얻은 플라스미드는 양말단 제한효소 site에 작용하는 제한효소를 이용하여 잘라내고 BamHI과 XhoI이 처리된 pOSdupdel vector에 T4 DNA ligase를 이용하여 연결하였다(도 20).
Human fibroblast 타게팅에 사용될 POC vector(1st hPOC vector)는 human의 IgHV5' 말단 타게팅에 사용될 flanking region sequence (H002), turboGFP-NeoR, loxp, human의 IgHV5' 말단 타게팅에 사용될 flanking region sequence (H001), negative selection에 사용될 TK 유전자, 박테리아 positive selection에 사용될 AmpR 그리고 replication origin으로 구성된다. TurboGFP-NeoR의 경우 주형vector(pCMV6-AC-GFP)의 multi cloning site (MCS)를 제거하기 위하여 CMV promoter와 turboGFP-NeoR의 PCR products를 blunt end ligation 하였다. CMV promoter는 HindIII site를 포함하는 forward GSP (표 5. SEQ ID NO: 8)와 reverse GSP (표 5. SEQ ID NO: 9)로 PrimeSTAR를 이용하여 overhang-PCR 하였고, turboGFP-NeoR는 forward GSP (표 5. SEQ ID NO: 10) 와 loxp 서열 그리고 SalI site를 포함하는 reverse primers (표 5. SEQ ID NO: 2, 3)로 PrimeSTAR를 이용하여 overhang-PCR하였다. H001은 SalI과 XhoI site를 포함하는 GSP (표 5. SEQ ID NO: 11, 12), 그리고 H002는 BamHI과 HindIII를 포함하는 GSP (표 5. SEQ ID NO: 13, 14)를 이용하여 human fibroblast genomic DNA를 주형으로 PCR 증폭하였다. 모든 PCR products는 T-blunt vector에 ligation 후 클로닝하여 DNA 염기서열을 확인 하였다. 모든 클론으로부터 얻은 플라스미드는 양말단 제한 효소 site에 작용하는 제한효소를 이용하여 잘라내고 BamHI과 XhoI 처리된 pOSdupdel vector에 T4 DNA ligase를 이용하여 연결하였다 (도 21).
실시예 1-2. 2차 POC 벡터(2nd POC vector)
Mouse embryonic stem cell (ESC) 타게팅에 사용될 POC vector (2nd mPOC vector)는 M002, CMV promoter, Loxm2/71, hygromycin 저항성 유전자 (HygroR), lox66, M001, negative selection에 사용될 TK 유전자, 박테리아 positive selection에 사용될 AmpR 그리고 replication origin으로 구성된다. CMV promoter의 경우 XhoI site를 포함하는 forward GSP (표 5. SEQ ID NO: 15)와 KpnI site를 포함하는 reverse GSP (표 5. SEQ ID NO: 16)를 이용하여 pCMV6-AC-GFP vector를 주형으로 overhang-PCR하였다. HygroR의 경우 KpnI site 그리고 loxm2/71를 포함하는 forward GSP (표 5. SEQ ID NO: 17)와 lox66 그리고 SalI site를 포함하는 reverse GSP (표 5. SEQ ID NO: 18)를 이용하여 pSecTag2-hygroA vector를 주형으로 overhang-PCR 하였다. CMV promoter와 HygroR PCR product는 T-blunt vector에 ligation 후 클로닝하여 DNA 염기서열을 확인 하였다. 두 클론으로부터 얻은 플라스미드는 양말단 제한효소 site에 작용하는 제한효소를 이용하여 잘라내고 XhoI과 SalI이 처리된 1st mPOC vector에 T4 DNA ligase를 이용하여 연결하였다(도 22).
Human fibroblast 타게팅에 사용될 POC vector(2nd hPOC vector)는 H002, lox71, inverted puroΔTK, loxm2/66, NeoR, H001, negative selection에 사용될 TK 유전자, 박테리아 positive selection에 사용될 AmpR 그리고 replication origin으로 구성된다. Inverted puroΔTK의 경우 XhoI site 그리고 lox71을 포함하는 forward GSP (표 5. SEQ ID NO: 19)와 loxm2/66그리고 HindIII를 포함하는 reverse GSP (표 5. SEQ ID NO: 20)를 이용하여 합성DNA를 주형으로 overhang-PCR하였다. NeoR의 경우 HindIII를 포함하는 forward GSP (표 5. SEQ ID NO: 21)와 SalI을 포함하는 reverse GSP (표 5. SEQ ID NO: 22)를 이용하여 pCMV6-AC-GFP vector를 주형으로 overhang-PCR하였다. Lox71-Inverted puroΔTK-loxm2/66과 NeoR PCR product는 T-blunt vector에 ligation 후 클로닝하여 DNA 염기서열을 확인 하였다. 두 클론으로부터 얻은 플라스미드를 양말단 제한 효소 site에 작용하는 제한 효소를 이용하여 잘라내고 XhoI과 SalI이 처리된 1st hPOC vector에 T4 DNA ligase를 이용하여 연결하였다(도 23).
벡터 제조에 이용된 프라이머 및 그의 DNA 서열
SEQ ID NO: 프라이머 DNA 서열
1 NeoR-EcoRI-forward gaattcGGCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTG
2 NeoR-loxp-bridge CTTATCATGTCTGTATACCGTCGcgccaccataacttcgtatagcatacattatacgaagttatcggtcgacgtcgg
3 NeoR-SalI-reverse CCGACGTCGACCGATAACTT
4 M001-SalI-forward ACGCgtcgacAGGATTTGGACCTGAGCATACT
5 M001-XhoI-reverse CCGctcgagGAGGCCAAGAGAGGCTAAAGCC
6 M002-BamHI-forward CGCggatccCATTCTCCCATCTCCAATTTAT
7 M002-EcoRI-reverse GgaattcTTTTGTAACCCCTAGACAGATG
8 CMV-HindIII-forward aagcttCCGCCATGTTGACATTG
9 CMV-reverse CGGCCGCCCTATAGTG (5'-phosphorylated)
10 GFP-Neo-forward AGATGGAGAGCGACGAGAGCGGCCT (5'-phosphorylated)
11 H001-SalI-forward ACGCgtcgacTGCGTGAGATCTTTTCTTGGGG
12 H001-XhoI-reverse CCGctcgagTCCACACACCCAAGTCATTCGA
13 H002-BamHI-forward CGCggatccCTGAAGCCAACCAAGTTTAGGA
14 H002-HindIII-reverse CCCaagcttCACATGGTGAACCCAAACACTC
15 CMV-XhoI-forward ATCctcgagGACATTGATTATTGACTAG
16 CMV-KpnI-reverse ATTggtaccCTCGGCCGCCCTATAG
17 Hygro-loxm2/71-KpnI-forward ATAggtaccTACCGTTCGTATATGGTTTCTTATACGAAGTTATGAATTCCACCATGAAAAAGCCTGAACTCAC
18 Hygro-lox66-SalI-reverse ATCgtcgacTACCGTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGGATCCTAAGATACATTGATG
19 PuroΔTK-lox71-XhoI-forward ATTctcgagATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAACGGTAATCGATCCCCAGCATGCCTGCTATTGTCTTC
20 PuroΔTK-loxm2/66-HindIII-reverse CTCaagcttATAACTTCGTATATGGTTTCTTATACGAACGGTACTTAAGCACCATGGGGACCGAGTACAAGCCCAC
21 Neo-HindIII-forward CGCaagcttGTGTGTCAGTTAGGGTGTG
22 Neo-SalI-reverse ATCgtcgacTAAGATACATTGATGAGTTTG
실시예 2. 염색체 타겟팅(Chromosome targeting)
실시예 2-1. 단일 loxP를 포함하는 1개의 벡터(1 vector-single loxP)
실시예 2-1-1. loxP가 삽입된 인간 염색체를 포함하는 세포 제조 과정
사용된 human dermal fibroblast(hDF)는 세포바이오(Seoul, Korea)에서 구매하였다. 이 세포의 증식 및 유지를 위한 기본 배양액으로 10% fetal bovine serum (FBS; Corning, Mannasas, VA, USA), 1% penicillin-streptomycin (Corning, Mannasas, VA, USA)가 포함하는 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM; Corning, Mannasas, VA, USA)배지를 사용하였으며, 5% CO2, 37℃의 95% 습윤 상태가 유지되는 배양기에서 배양하였다. Transient transfection은 lipofectamine 3000(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 수행하였다. 세포수를 1x106 cells로 하여 FBS와 항생제가 들어가지 않은 DMEM배지를 첨가하였다. 여기에 NotI(New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) enzyme으로 single cut한 human targeting vector 10ug을 첨가한 후 lipofectamin 3000 reagent를 섞어준 후 상온에서 5분간 정치 시킨 후 transfection 하였다. 세포는 5% CO2, 37℃의 95% 습윤 상태가 유지되는 배양기에서 24시간 내지 48시간동안 배양하였다(도 24).
실시예 2-1-2. loxP가 삽입된 마우스 염색체를 포함하는 세포 제조 과정
사용된 J1 mouse embryonic stem cell(J1 mESC)은 macrogen(Seoul, Korea)에서 기증 받았다. J1 mESC은 0.1% gelatin이 coating 된 dish를 사용하였으며, 이 세포의 증식 및 유지를 위한 기본 배양액 2i 배지를 사용하였는데, 이 배양액은 FBS가 없는 N2B27배지에 MEK inhibitor PD0325901 (1 μM) and GSK3 inhibitor CHIR99021 (3 μM) (both from Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA), 1,000 U/ml LIF (Milliphore, Billerica, MA, USA)을 첨가하여 만들었다, 세포는 5% CO2, 37℃의 95% 습윤 상태가 유지되는 배양기에서 배양하였다. Transient transfection은 lipofectamine 3000을 사용하여 수행하였다. 세포 수를 1x106 cells로 하여 FBS와 항생제가 들어가지 않은 Opti-MEM (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) 배지를 첨가하였다. 여기에 NotI으로 single cut한 mouse targeting vector 10ug을 첨가한 후 lipofectamine 3000 reagent를 섞어 준 후 상온에서 5분간 정치 시킨 후 transfection 하였다. 세포는 5% CO2, 37℃의 95% 습윤 상태가 유지되는 배양기에서 24시간 내지 48시간동안 배양하였다(도 25).
실시예 2-1-3. 선별 과정 및 결과
human DF와 mouse ESC의 각 targeting vector내에 존재하는 antibiotics resistance gene을 사용하여 세포를 선별하였다. human DF에 삽입된 targeting vector내에 존재하는Neomycin resistance gene의 발현을 통해 세포를 선별하였다. 약물은 G418(Life technologies, NY, USA)을 사용하였으며, G418의 세포 선별 농도는 Cell counting kit-8(CCK-8; Dogindo, Kumamoto, Japan)로 측정하였다. hDF에 Targeting vector를 Transfection시키고, 48시간 후에 G418을 400ug/ml으로 처리하였다. 세포의 선별 과정은 4 내지 6주간 진행되었으며, 형성된 Loxp inserted clone을 fulling하여 배양하였다. 선별된 hDF는 형광 현미경(Olympus Corporation, Tokyo, Japan)을 통해 GFP발현을 통해 확인하였다(도 24).
mESC에 삽입된 targeting vector 내에 존재하는 Neomycin resistance gene의 발현을 통해 세포를 선별하였다. 약물은 G418(Life technologies, Grand island, NY, USA)을 사용하였으며, G418의 세포 선별 농도는 Cell counting kit-8(CCK-8; Dogindo, Kumamoto, JAPAN)로 측정하였다. mESC에 Targeting vector를 Transfection 하고 48시간 후에 G418을 150ug/ml으로 처리하였다. 세포의 선별 과정은 4 내지 6주간 진행되었으며, 형성된 Loxp inserted clone을 fulling하여 배양하였다. 선별된 mESC는 형광현미경을 통해 mCherry발현을 통해 확인하였다(도 25).
그 결과, 선별한 human dermal fibroblast와 mES Cell 에서 각각 Tatgeting vector에 tagging 된 GFP와 mCherry의 발현이 확인되었다. 이를 바탕으로 targeting vector가 세포내 삽입되어 있다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 2-2. 2개의 loxP를 포함하는 1개의 벡터(1 vector-double loxP)
실시예 2-2-1. loxP가 삽입된 인간 염색체를 포함하는 세포 제조 과정
사용된 human normal foreskin fibroblast cell line(BJ)은 ATCC에서 구매하였다. 이 세포의 증식 및 유지를 위한 기본 배양액으로 10% fetal bovine serum (FBS; Corning, Mannasas, VA, USA), 1% penicillin-streptomycin (Corning, Mannasas, VA, USA)가 포함하는 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM; Corning, Mannasas, VA, USA)배지를 사용하였으며, 5% CO2, 37℃의 95% 습윤 상태가 유지되는 배양기에서 배양하였다. Transient transfection은 Nepa21(NEPAGENE Co., Ltd., Chiba, Japan) electroporator을 사용하여 수행하였다. 세포 수를 1x106 cells로 하여 FBS와 항생제가 들어가지 않은 opti-MEM배지 100ul를 첨가하였다. 여기에 NotI으로 single cut한 human targeting vector 10ug을 첨가하여 150V, 7.5ms, 2 pulse로 transfection 하였다. 10% FBS가 첨가된 배지를 300ul 첨가하여 세포를 잘 섞어 준 후 100mm dish에 세포를 넣어 준 후 5% CO2, 37℃의 95% 습윤 상태가 유지되는 배양기에서 24시간 내지 48시간동안 배양하였다.
실시예 2-2-2. loxP가 삽입된 마우스 염색체를 포함하는 세포 제조 과정
사용된 J1 mouse embryonic stem cell(J1 mESC)은 macrogen(Seoul, Korea)에서 기증 받았다. J1 mESC은 0.1% gelatin이 coating 된 dish를 사용하였으며, 이 세포의 증식 및 유지를 위한 기본 배양액 2i 배지를 사용하였는데, 이 배양액은 FBS가 없는 N2B27배지에 MEK inhibitor PD0325901 (1 μM) and GSK3 inhibitor CHIR99021 (3 μM) (both from Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA), 1,000 U/ml LIF (Milliphore, Billerica, MA, USA)을 첨가하여 만들었다. 세포는 5% CO2, 37℃의 95% 습윤 상태가 유지되는 배양기에서 배양하였다. Transient transfection은 Nepa21(NEPAGENE Co., Ltd., Chiba, Japan) electroporator을 사용하여 수행하였다. 세포 수를 1x106 cells로 하여 FBS와 항생제가 들어가지 않은 opti-MEM배지 100ul를 첨가하였다. 여기에 NotI으로 single cut한 human targeting vector 10ug을 첨가하여 125V, 5ms, 2 pulse로 transfection하였다. 2i배지 300ul 첨가하여 세포를 잘 섞어 준 후 100mm dish에 세포를 넣어 준 후 5% CO2, 37℃의 95% 습윤 상태가 유지되는 배양기에서 24시간 내지 48시간동안 배양하였다.
실시예 2-2-3. 선별 과정 및 결과
human 세포주인 BJ와 mouse ESC의 각 targeting vector내에 존재하는 antibiotics resistance gene을 사용하여 세포를 선별하였다. BJ세포주는 삽입된 targeting vector내에 존재하는Neomycin resistance gene의 발현을 통해 세포를 선별하였다. 약물은 G418(Life technologies, NY, USA)을 사용하였으며, G418의 세포 선별 농도는 Cell counting kit-8(CCK-8; Dogindo, Kumamoto, JAPAN)로 측정하였다. BJ세포에 Targeting vector를 Transfection시키고 48시간 후에 G418을 300ug/ml으로 처리하였다. 세포의 선별 과정은 4 내지 6주간 진행되었으며, 형성된 Loxp inserted clone을 fulling하여 배양하였다.
mESC에 삽입된 targeting vector내에 존재하는 Hygromycin resistance gene의 발현을 통해 세포를 선별하였다. 약물은 hygromycin B(Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation, Osaka, JAPAN)을 사용하였으며, hygromycin의 세포 선별 농도는 Cell counting kit-8(CCK-8; Dogindo, Kumamoto, JAPAN)로 측정하였다. mESC에 Targeting vector를 Transfection 하고 48시간 후에 hygromycin을 32ug/ml으로 처리하였다. 세포의 선별 과정은 4 내지 6주간 진행되었으며, 형성된 Loxp inserted clone을 fulling하여 배양하였다.
그 결과, targeting vector에 삽입되어 있는 antibiotic-resistance gene의 발현을 확인함으로써, control 그룹은 모두 선별기간동안 세포가 모두 사멸 되었으나, targenting vector를 삽입한 그룹에서는 선별 기간 동안 colony가 확인되었다. 지속적인 antibiotic의 첨가에 의해서도 세포의 증식과 유지가 지속되는 것으로 보아 targeting vector의 발현이 지속으로 일어나고 있음을 알 수 있었다.
실시예 3. 마이크로세포 제조 과정 및 결과
Micronuclei의 형성은 colcemid(Life technologies, Grand island, NY, USA)를 사용하여 진행하였다. G418을 사용하여 선별이 끝난 Human cell을 100mm dish에 1X106개를 넣어 준 후, 다음날 20% FBS가 담긴 DMEM으로 배지를 교환해 준 후 colcemid 0.1ug/ml로 처리하고, 5% CO2, 37℃의 95% 습윤 상태가 유지되는 배양기에서 48시간 동안 배양하였다. Micronucleation이 유도된 Human세포를 tryLE(Life technologies, Grand island, NY, USA)을 사용하여 떼어준 후, Serum-free DMEM로 씻어준 후 1000rpm, 5분간 원심분리(LABOGENE CO., Ltd, KOREA) 하였다. 원심분리가 끝난 세포는 미리 데워 둔 serum-free DME : percoll ((Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) (1:1 (v:v))에 부유하고, cytochalsin B(Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)의 최종 농도가 10ug/ml이 되도록 처리하였다. 16000g, 34℃ 내지 37℃에서 1시간 내지 1시간 30분 동안 원심분리(LABOGENE) 하여 whole cell과 microcell을 분리하였다. 분리된 whole cell과 microcell을 50ml tube로 옮기고 serum-free DMEM을 넣어 준 후, 500g에서 10분간 원심분리 한다. 상등액은 조심스레 제거하고 tube표면에 붙은 pellet을 serum-free DMEM 10ml을 넣어주고 8um filter(GE healthcare, CHICAGO, IL, USA)를 이용하여 8um 이하 크기의 microcell을 분리한다. 분리한 microcell이 포함된 상등액은 다시 400g에서 10분간 원심분리한다. 원심분리된 microcell은 8μm filter 사용 방법과 동일한 방법으로 5μm filter를 사용하였다. 최종 분리된 microcell은 Nicon eclipse TS100 광학 현미경(Nicon Instruments, Melville, NY, USA)을 통해 counting하였다.
그 결과, human 세포에 colcemid 처리 후 micronuclei가 형성됨을 광학현미경으로 확인하였으며, 이것은 기존 논문에 기재된 모습과 동일함을 확인하였다. 또한 형성된 micronuclei를 cytochalasin B을 통해 Enuclelation 시키고 microcell의 크기 별 분리 과정 시 광학 현미경 관찰을 통해 사이즈 별로 분리됨을 확인하였다. 이를 통해서 human microcell의 분리가 잘 되었음을 확인하였다(도 26).
실시예 4. 마이크로세포-ES 세포의 융합 세포 제조 과정 및 결과
분리한 human microcell과 recipient cell로 사용할 mESC를 준비한다. Mesc는 TryLE를 처리하고 원심분리 한다. 원심분리된 mESC를 1Xdpbs로 Washing하여 주고 Hemacytometer를 사용하여 세포 수를 계산한다. Human microcell과 mESC의 융합은 HVJ-E protein(Cosmo Bio Co., Ltd., Tokyo, Japan)을 사용하였으며, suspension method 방법으로 진행하였다. 계산된 human microcell과 mESC의 비율은 1:4가 되도록 사용하였다. 각각 준비된 human microcell과 mESC는 차가운 1x cell fusion buffer 500ul을 이용하여 washing 하여 준다. Buffer에 담긴 microcell과 mESC를 300g로 5분간 4℃에서 원심분리 한다. mESC의2x105 당 1x cell fusion buffer를 25ul씩 넣어주고, human microcell에도 동일한 volume의 1x cell fusion buffer를 넣어준다. mESC와 human microcell을 섞어주고 HVJ-E protein을 5 내지 10ul을 넣어준 후 얼음에서 5분간 방치한다. Mixture를 37℃water bath에서 15분간 방치한다. 이때 5분 간격으로 tapping해 준다. Human microcell과 mESC의 세포 융합이 끝난 후 300g에서 5분간 원심분리하여 남아있는 HVJ-E protein을 제거한다. 융합된 세포는 mESC의 배양 배지가 담긴 dish에 넣어 준 후, 5% CO2, 37℃의 95% 습윤 상태가 유지되는 배양기에서 48시간 동안 배양하였다.
그 결과, human microcell과 mESC의 세포 융합 과정 후 배양 배지에 넣어준 후 현미경 관찰 시, mESC와 microcell과 융합되는 모습을 관찰할 수 있었다. HVJ-E protein을 사용한 방법이 suspension method(mESC의 세포 증식 모양이 colony 형태이기 때문에 single 세포로 실험을 진행하기 위해 수행)라, 실시간 융합 과정은 확인할 수 없으나, 간접적으로 확인할 수 있다 (도 27).
실시예 5. 융합 세포로부터 인공 재조합 염색체를 포함하는 세포 제조
실시예 5-1. 인공 재조합 염색체를 포함하는 세포 제조 (1)
실시예 5-1-1. 인공 재조합 염색체를 포함한 세포 제조 과정
Human microcell과 mESC을 융합 시키고 48시간 동안 융합된 세포를 안정화 시켰다. 세포 수를 1x106 cells로 하여 FBS와 항생제가 들어가지 않은 opti-MEM배지 100ul를 첨가하였다. 여기에 pCMV-Cre(System Biosciences, LLC, Palo Alto, CA, USA) vector 10ug을 첨가하여 125V, 5ms, 2 pulse로 transfection 하였다. 2i배지 300ul 첨가하여 세포를 잘 섞어 준 후 100mm dish에 세포를 넣어 준 후, 5% CO2, 37℃의 95% 습윤 상태가 유지되는 배양기에서 48시간동안 배양하였다.
실시예 5-1-2. 인공 재조합 염색체를 포함한 세포 선별 과정 및 결과
mESC에 human microcell이 융합된 세포에 CMV-Cre vector를 transfection 시키고 48시간 동안 세포를 배양하였다. 48시간 후, Human microcell과 mESC를 융합한 세포에 pCMV-Cre vector를 transfection 하지 않은 그룹(-Cre)과 pCMV-Cre vector를 transfection 해 준 그룹(+Cre) 모두 G418 150ug/ml을 처리하였다. 10일 내지 14일동안 세포를 선별 하였으며, 2일 내지 3일 간격으로 배지 교환 시 G418 150ug/ml을 함께 처리하였다. 선별된 세포의 관찰은 형광 현미경(Olymphus)을 통해 확인하였다.
그 결과, human microcell과 mESC의 세포 융합 후 Cre recombinase에 의해 loxp site의 specific한 transloction에 의해 mcherry의 발현이 이루어지던 mESC에서 단독으로 human targeting vector에 존재하던 GFP의 발현이 일어남을 확인하였다. 이를 통해 human microcell을 통한 chromosome의 transfer가 가능함을 알 수 있었다 (도 28 내지 도 30).
실시예 5-2. 인공 재조합 염색체를 포함하는 세포 제조 (2)
실시예 5-2-1. 인공 재조합 염색체를 포함한 세포 제조 과정
Human microcell과 mESC을 융합 시키고 48시간 동안 융합된 세포를 안정화 시켰다. 48시간 후, 세포 수를 1x106 cells로 하여 FBS와 항생제가 들어가지 않은 opti-MEM배지 100ul를 첨가하였다. 여기에 pCMV-Cre(System Biosciences, LLC, Palo Alto, CA, USA) vector 10ug을 첨가하여 125V, 5ms, 2 pulse로 transfection 하였다. 2i배지 300ul 첨가하여 세포를 잘 섞어 준 후 100mm dish에 세포를 넣어 준 후, 5% CO2, 37℃의 95% 습윤 상태가 유지되는 배양기에서 48시간동안 배양하였다.
실시예 5-2-2. 인공 재조합 염색체를 포함한 세포 선별 과정 및 결과
mESC에 human microcell이 융합된 세포에 pCMV-Cre vector를 transfection 시키고 48시간 동안 세포를 배양하였다. 이렇게 배양된 세포를 6well plate에 5x104개의 세포를 넣어준 후, puromycin 0.6ug/ml을 처리하였다. Puromycin의 농도는 Cell counting kit-8(CCK-8; Dogindo, Kumamoto, Japan)을 사용하여 적정 농도를 결정하였다. 세포는 일주일 동안 배양하였으며, 2일 내지 3일 간격으로 새로운 배지와 puromycin을 함께 처리하였다. 세포의 고정과 염색은 Crystal violet(Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 사용하였으며, 대략 70μm크기의 mESC의 colony를 counting하였다. 그래프는 GraphPad PRISM(version 5.01)을 이용하여 그렸으며, 3 그룹간의 통계적 유의성은 one-way ANOVA을 통해 산출되었다.
그 결과, 2nd POC cell selection의 과정은 vector에서도 설명이 되었지만, human microcell과 mESC의세포 융합 후 Cre recombinase에 의해 뒤집혀 있던 puromycin-resistance gene의 발현이 정상적으로 이루어지게 된다. 각 그룹에 puromycin을 처리하여 세포의 생존을 확인하였다. 그 결과 Cre recombinase의 발현이 이루어진 그룹에서 mESC의 증식이 일어남을 확인할 수 있었다. 이를 통해 2nd POC의 system이 정상적으로 발현됨을 알 수 있다 (도 31 및 도 32).
이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기의 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다. 그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 특허청구범위의 범위에 속한다.
1: 제1 표적화된 염색체
2: 제2 표적화된 염색체
3: 제1 인공 재조합 염색체
4: 제2 인공 재조합 염색체
11: 제1 표적화된 염색체의 프래그먼트
12: 제1 표적화된 염색체로부터 제공된 제1 프래그먼트
21: 제2 표적화된 염색체로부터 제공된 제2 프래그먼트
22: 제2 표적화된 염색체의 프래그먼트
<110> Humab Co., Ltd. <120> artificial recombinant chromosome and the use thereof <130> CP19-086 <160> 33 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 1 gaattcggct gtggaatgtg tgtcagttag ggtg 34 <210> 2 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 cttatcatgt ctgtataccg tcgcgccacc ataacttcgt atagcataca ttatacgaag 60 ttatcggtcg acgtcgg 77 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 ccgacgtcga ccgataactt 20 <210> 4 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 acgcgtcgac aggatttgga cctgagcata ct 32 <210> 5 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 ccgctcgagg aggccaagag aggctaaagc c 31 <210> 6 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 cgcggatccc attctcccat ctccaattta t 31 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 ggaattcttt tgtaacccct agacagatg 29 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 aagcttccgc catgttgaca ttg 23 <210> 9 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 cggccgccct atagtg 16 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 agatggagag cgacgagagc ggcct 25 <210> 11 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 11 acgcgtcgac tgcgtgagat cttttcttgg gg 32 <210> 12 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 12 ccgctcgagt ccacacaccc aagtcattcg a 31 <210> 13 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 13 cgcggatccc tgaagccaac caagtttagg a 31 <210> 14 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 14 cccaagcttc acatggtgaa cccaaacact c 31 <210> 15 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 15 atcctcgagg acattgatta ttgactag 28 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 16 attggtaccc tcggccgccc tatag 25 <210> 17 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 17 ataggtacct accgttcgta tatggtttct tatacgaagt tatgaattcc accatgaaaa 60 agcctgaact cac 73 <210> 18 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 18 atcgtcgact accgttcgta taatgtatgc tatacgaagt tatggatcct aagatacatt 60 gatg 64 <210> 19 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 19 attctcgaga taacttcgta taatgtatgc tatacgaacg gtaatcgatc cccagcatgc 60 ctgctattgt cttc 74 <210> 20 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 20 ctcaagctta taacttcgta tatggtttct tatacgaacg gtacttaagc accatgggga 60 ccgagtacaa gcccac 76 <210> 21 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 21 cgcaagcttg tgtgtcagtt agggtgtg 28 <210> 22 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 22 atcgtcgact aagatacatt gatgagtttg 30 <210> 23 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> loxp variant <400> 23 taccgttcgt atatggtttc ttatacgaag ttat 34 <210> 24 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> loxp variant <400> 24 ataacttcgt atatggtttc ttatacgaac ggta 34 <210> 25 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> loxp variant <400> 25 taccgttcgt atagcataca ttatacgaag ttat 34 <210> 26 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> loxp variant <400> 26 ataacttcgt atagcataca ttatacgaac ggta 34 <210> 27 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinase recognition site <400> 27 gaagttccta tactttctag agaataggaa cttcggaata ggaacttc 48 <210> 28 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinase recognition site <400> 28 cccaggtcag aagcggtttt cgggagtagt gccccaactg gggtaacctt tgagttctct 60 cagttggggg cgtagggtcg ccgacatgac acaaggggtt 100 <210> 29 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinase recognition site <400> 29 ctcgaagccg cggtgcgggt gccagggcgt gcccttgggc tccccgggcg cgtactccac 60 ctcacccatc 70 <210> 30 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinase recognition site <400> 30 ccctagaaag ataatcatat tgtgacgtac gttaaagata atcatgcgta aaattgacgc 60 atg 63 <210> 31 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinase recognition site <400> 31 catgcgtcaa ttttacgcag actatctttc taggg 35 <210> 32 <211> 342 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cre recombinase <400> 32 Ser Asn Leu Leu Thr Val His Gln Asn Leu Pro Ala Leu Pro Val Asp 1 5 10 15 Ala Thr Ser Asp Glu Val Arg Lys Asn Leu Met Asp Met Phe Arg Asp 20 25 30 Arg Gln Ala Phe Ser Glu His Thr Trp Lys Met Leu Leu Ser Val Cys 35 40 45 Arg Ser Trp Ala Ala Trp Cys Lys Leu Asn Asn Arg Lys Trp Phe Pro 50 55 60 Ala Glu Pro Glu Asp Val Arg Asp Tyr Leu Leu Tyr Leu Gln Ala Arg 65 70 75 80 Gly Leu Ala Val Lys Thr Ile Gln Gln His Leu Gly Gln Leu Asn Met 85 90 95 Leu His Arg Arg Ser Gly Leu Pro Arg Pro Ser Asp Ser Asn Ala Val 100 105 110 Ser Leu Val Met Arg Arg Ile Arg Lys Glu Asn Val Asp Ala Gly Glu 115 120 125 Arg Ala Lys Gln Ala Leu Ala Phe Glu Arg Thr Asp Phe Asp Gln Val 130 135 140 Arg Ser Leu Met Glu Asn Ser Asp Arg Cys Gln Asp Ile Arg Asn Leu 145 150 155 160 Ala Phe Leu Gly Ile Ala Tyr Asn Thr Leu Leu Arg Ile Ala Glu Ile 165 170 175 Ala Arg Ile Arg Val Lys Asp Ile Ser Arg Thr Asp Gly Gly Arg Met 180 185 190 Leu Ile His Ile Gly Arg Thr Lys Thr Leu Val Ser Thr Ala Gly Val 195 200 205 Glu Lys Ala Leu Ser Leu Gly Val Thr Lys Leu Val Glu Arg Trp Ile 210 215 220 Ser Val Ser Gly Val Ala Asp Asp Pro Asn Asn Tyr Leu Phe Cys Arg 225 230 235 240 Val Arg Lys Asn Gly Val Ala Ala Pro Ser Ala Thr Ser Gln Leu Ser 245 250 255 Thr Arg Ala Leu Glu Gly Ile Phe Glu Ala Thr His Arg Leu Ile Tyr 260 265 270 Gly Ala Lys Asp Asp Ser Gly Gln Arg Tyr Leu Ala Trp Ser Gly His 275 280 285 Ser Ala Arg Val Gly Ala Ala Arg Asp Met Ala Arg Ala Gly Val Ser 290 295 300 Ile Pro Glu Ile Met Gln Ala Gly Gly Trp Thr Asn Val Asn Ile Val 305 310 315 320 Met Asn Tyr Ile Arg Asn Leu Asp Ser Glu Thr Gly Ala Met Val Arg 325 330 335 Leu Leu Glu Asp Gly Asp 340 <210> 33 <211> 594 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Piggy Bac Transposase <400> 33 Met Gly Ser Ser Leu Asp Asp Glu His Ile Leu Ser Ala Leu Leu Gln 1 5 10 15 Ser Asp Asp Glu Leu Val Gly Glu Asp Ser Asp Ser Glu Ile Ser Asp 20 25 30 His Val Ser Glu Asp Asp Val Gln Ser Asp Thr Glu Glu Ala Phe Ile 35 40 45 Asp Glu Val His Glu Val Gln Pro Thr Ser Ser Gly Ser Glu Ile Leu 50 55 60 Asp Glu Gln Asn Val Ile Glu Gln Pro Gly Ser Ser Leu Ala Ser Asn 65 70 75 80 Arg Ile Leu Thr Leu Pro Gln Arg Thr Ile Arg Gly Lys Asn Lys His 85 90 95 Cys Trp Ser Thr Ser Lys Ser Thr Arg Arg Ser Arg Val Ser Ala Leu 100 105 110 Asn Ile Val Arg Ser Gln Arg Gly Pro Thr Arg Met Cys Arg Asn Ile 115 120 125 Tyr Asp Pro Leu Leu Cys Phe Lys Leu Phe Phe Thr Asp Glu Ile Ile 130 135 140 Ser Glu Ile Val Lys Trp Thr Asn Ala Glu Ile Ser Leu Lys Arg Arg 145 150 155 160 Glu Ser Met Thr Gly Ala Thr Phe Arg Asp Thr Asn Glu Asp Glu Ile 165 170 175 Tyr Ala Phe Phe Gly Ile Leu Val Met Thr Ala Val Arg Lys Asp Asn 180 185 190 His Met Ser Thr Asp Asp Leu Phe Asp Arg Ser Leu Ser Met Val Tyr 195 200 205 Val Ser Val Met Ser Arg Asp Arg Phe Asp Phe Leu Ile Arg Cys Leu 210 215 220 Arg Met Asp Asp Lys Ser Ile Arg Pro Thr Leu Arg Glu Asn Asp Val 225 230 235 240 Phe Thr Pro Val Arg Lys Ile Trp Asp Leu Phe Ile His Gln Cys Ile 245 250 255 Gln Asn Tyr Thr Pro Gly Ala His Leu Thr Ile Asp Glu Gln Leu Leu 260 265 270 Gly Phe Arg Gly Arg Cys Pro Phe Arg Met Tyr Ile Pro Asn Lys Pro 275 280 285 Ser Lys Tyr Gly Ile Lys Ile Leu Met Met Cys Asp Ser Gly Thr Lys 290 295 300 Tyr Met Ile Asn Gly Met Pro Tyr Leu Gly Arg Gly Thr Gln Thr Asn 305 310 315 320 Gly Val Pro Leu Gly Glu Tyr Tyr Val Lys Glu Leu Ser Lys Pro Val 325 330 335 His Gly Ser Cys Arg Asn Ile Thr Cys Asp Asn Trp Phe Thr Ser Ile 340 345 350 Pro Leu Ala Lys Asn Leu Leu Gln Glu Pro Tyr Lys Leu Thr Ile Val 355 360 365 Gly Thr Val Arg Ser Asn Lys Arg Glu Ile Pro Glu Val Leu Lys Asn 370 375 380 Ser Arg Ser Arg Pro Val Gly Thr Ser Met Phe Cys Phe Asp Gly Pro 385 390 395 400 Leu Thr Leu Val Ser Tyr Lys Pro Lys Pro Ala Lys Met Val Tyr Leu 405 410 415 Leu Ser Ser Cys Asp Glu Asp Ala Ser Ile Asn Glu Ser Thr Gly Lys 420 425 430 Pro Gln Met Val Met Tyr Tyr Asn Gln Thr Lys Gly Gly Val Asp Thr 435 440 445 Leu Asp Gln Met Cys Ser Val Met Thr Cys Ser Arg Lys Thr Asn Arg 450 455 460 Trp Pro Met Ala Leu Leu Tyr Gly Met Ile Asn Ile Ala Cys Ile Asn 465 470 475 480 Ser Phe Ile Ile Tyr Ser His Asn Val Ser Ser Lys Gly Glu Lys Val 485 490 495 Gln Ser Arg Lys Lys Phe Met Arg Asn Leu Tyr Met Ser Leu Thr Ser 500 505 510 Ser Phe Met Arg Lys Arg Leu Glu Ala Pro Thr Leu Lys Arg Tyr Leu 515 520 525 Arg Asp Asn Ile Ser Asn Ile Leu Pro Asn Glu Val Pro Gly Thr Ser 530 535 540 Asp Asp Ser Thr Glu Glu Pro Val Met Lys Lys Arg Thr Tyr Cys Thr 545 550 555 560 Tyr Cys Pro Ser Lys Ile Arg Arg Lys Ala Asn Ala Ser Cys Lys Lys 565 570 575 Cys Lys Lys Val Ile Cys Arg Glu His Asn Ile Asp Met Cys Gln Ser 580 585 590 Cys Phe

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  17. 인공 재조합 염색체(an artificially recombinant chromosome)를 포함하는 형질전환 동물 세포(a transgenic animal cell)의 제조방법으로,
    (a) 제1 RRS(a first recombinase recognition site)와 제2 RRS(a second recombinase recognition site) 사이에 위치한 제1 유전자(a first gene)를 포함하는 인위적으로 조작된 제1 염색체(a first engineered chromosome)를 포함하는 제1 원세포(a first source cell)를 준비함,
    - 이 때, 상기 제1 원세포 및 상기 인위적으로 조작된 제1 염색체는 제1 종(a first species) 유래이며,
    이 때, 상기 제1 RRS와 상기 제2 RRS는 각각 상기 인위적으로 조작된 제1 염색체의 조작되지 않은 동원체 및 조작되지 않은 텔로미어 사이에 위치함 -;　
    (b) 상기 인위적으로 조작된 제1 염색체를 포함하는 제1 마이크로세포(a first microcell)를 제조하기 위하여 상기 제1 원세포를 복수의 마이크로세포(a plurality of mirocells)가 되도록 유도함;
    　
    (c) 제3 RRS(a third recombinase recognition site)와 제4 RRS(a fourth recombinase recognition site) 사이에 위치한 제2 유전자(a second gene)를 포함하는 인위적으로 조작된 제2 염색체(a second engineered chromosome)를 포함하는 제2 원세포(a second source cell)를 준비함,
    - 이 때, 상기 제2 원세포 및 상기 인위적으로 조작된 제2 염색체는 상기 제1 종과 다른 제2 종 유래이며,
    이 때, 상기 제3 RRS와 상기 제4 RRS는 각각 상기 인위적으로 조작된 제2 염색체의 조작되지 않은 동원체 및 조작되지 않은 텔로미어 사이에 위치하고,
    이 때, 상기 제1 RRS는 상기 제3 RRS와 페어이고, 및 상기 제2 RRS는 상기 제4 RRS와 페어임 -;
    　
    (d) 상기 인위적으로 조작된 제1 염색체를 포함하는 상기 제1 마이크로세포와 상기 인위적으로 조작된 제2 염색체(a second engineered chromosome)를 포함하는 상기 제2 원세포를 융합하기 위하여 서로 인접시킴으로써 상기 인위적으로 조작된 제1 염색체 및 상기 인위적으로 조작된 제2 염색체를 포함하는 융합세포(a fused cell)를 제공함;
    　
    (e) 상기 융합세포 내에서 상기 인위적으로 조작된 제1 염색체의 상기 제1 유전자와 상기 인위적으로 조작된 제2 염색체의 상기 제2 유전자 사이의 교환(exchange)을 야기하기 위하여 SSR(a site specific recombinase)을 처리함,
    - 이 때, 상기 인위적으로 조작된 제1 염색체의 상기 제1 유전자와 상기 인위적으로 조작된 제2 염색체의 상기 제2 유전자 사이의 교환(exchange)으로써, 상기 인위적으로 조작된 제2 염색체는 상기 인공 재조합 염색체로 전환되고,
    이 때, 상기 인공 재조합 염색체 내에서 상기 인위적으로 조작된 제2 염색체의 조작되지 않은 동원체 및 조작되지 않은 텔로미어는 유지되며,
    이 때, 상기 인공 재조합 염색체 내에서, 상기 제1 유전자는 상기 유지된 동원체 및 유지된 텔로미어의 사이에 삽입됨 -;
    을 포함하는,
    인공 재조합 염색체를 포함하는 형질전환 동물 세포의 제조방법.　
  18. 제17항에 있어서,
    상기 제1 원세포는 인간의 세포이며,
    상기 인위적으로 조작된 제1 염색체는 인간의 염색체인 것을 특징으로 하는,
    인공 재조합 염색체를 포함하는 형질전환 동물 세포의 제조방법.


  19. 삭제
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