KR102167998B1 - 제주용암해수를 포함하는 골관절염 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

제주용암해수를 포함하는 골관절염 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 제주용암해수의 골관절염 치료 용도에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 제주용암해수 또는 이의 농축물을 유효성분으로 포함하는 조성물의 골관절염 예방, 개선 또는 치료를 위한 의약품 용도 및 의약외품 용도(입욕제)에 관한 것이다. 또한, 제주용암해수 또는 이의 농축물을 유효성분으로 포함하는 조성물의 다이클로페낙(diclofenac)의 효과를 상승시키기 위한 보조제로서의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 제주용암해수를 유효성분으로 포함하는 조성물은 용암해수에 특정 함량의 미네랄 성분을 함유함으로써 골관절염을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있는바 피부 외용제, 입욕제 또는 입욕수로 유용하게 사용될 있다. 특히, 소염진통제에 해당하는 다이클로페낙 나트륨과 함께 제주용암해수를 병용 적용하는 경우 골관절염 치료에 2배 이상 상승적인 시너지 효과를 갖는바, 제주용암해수를 유효성분으로 포함하는 조성물은 다이클로페낙 나트륨의 보조제로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

제주용암해수를 포함하는 골관절염 예방 또는 치료용 조성물{Composition for prevention or treatment of osteoarthritis comprising jeju magma seawater}
본 발명은 제주용암해수의 골관절염 치료 용도에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 제주용암해수 또는 이의 농축물을 유효성분으로 포함하는 조성물의 골관절염 예방, 개선 또는 치료를 위한 의약품 용도 및 의약외품 용도(입욕제)에 관한 것이다. 또한, 제주용암해수 또는 이의 농축물을 유효성분으로 포함하는 조성물의 다이클로페낙(diclofenac)의 효과를 상승시키기 위한 보조제로서의 용도에 관한 것이다.
골관절염(osteoarthritis)은 퇴행성 관절염으로 칭해지기도 하는 관절염의 일종으로서, 윤활 관절에서 연골과 주위골에 퇴행성 변화가 나타나서 생기는 관절염을 말한다. 즉, 골관절염은 관절 연골의 점차적인 소실과 더불어 연골 하방에 위치한 뼈의 비대, 관절 가장자리 부위의 골 생성, 및 비특이적인 활막 염증을 특징으로 하는 질환이다. 골관절염은 노화나 과도한 물리적 압박(예를 들어, 비만, 외상 등)에 의해서 연골이 손상되어 발생하는 질환이다. 따라서, 골관절염은 체중을 많이 받는 관절, 즉, 무릎(슬)관절, 엉덩이 (고)관절 등에 심한 통증과 운동 장애를 나타내며, 장기간 방치할 경우에는 관절의 변형까지 초래하게 된다.
골관절염은 연골내 수분 함량이 증가되어 부종을 일으키는 연골 변화 단계 (1 단계), 연골이 파괴되면서 연골 표면이 갈라지고 찢어지면서 손상되어 뼈가 드러나고 관절강이 좁아지는 원섬유화 (fibrillation) 단계(2 단계), 연골세포가 연골을 회복하기 위해 연골 생성을 시작하지만 연골 생성보다 연골 파괴가 더 빠르게 일어나기 때문에 전반적으로 연골이 줄어들게 되는 단계 (3 단계), 뼈가 변형되어 관절 기형 및 기능장애를 초래하는 뼈 변화 단계 (4 단계), 및 연조직 (soft tissue) 이 두꺼워지는 관절 연조직 변화 단계 (5 단계) 로 진행되게 된다.
골관절염과 다른 분류에 속하는 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis)은 활막 세포의 염증과 증식을 특징으로 하는, 만성 자가면역 질환(autoimmune diseases)으로서, 골관절염과 달리 관절 주위 뼈의 골다공증 및 골미란 등이 발생한다. 류마티스 관절염은 활막(synovial membrane)의 염증이 관절막(joint capsule)과 인대(ligament), 건(tendon)으로 퍼지는 단계(1 단계), 관절연골(joint cartilage)의 점차적인 파괴로 관절 간격이 좁아지고 관절막과 인대의 장력이 소실되는 단계(2 단계), 염증이 뼈로 침범하여 뼈의 부분적 침식이 발생하는 단계(3 단계), 및 관절기능이 소실되는 단계(4 단계)로 진행되게 된다. 따라서, 골관절염과 류미티스 관절염은 그 발병 원인 및 진행단계가 전혀 상이하며, 이에 대한 치료 방법도 상이하다.
현재 골관절염의 치료를 위해서는, 아세트아미노펜(acetaminophen), 트라마돌(tramadol), 비스테로이드성 항염제(nonsteroidal antiinflammatory drugs,NSAIDs), 디아세린 (diacerin), 글루코사민 (glucosamine)등의 약물이 주로 사용되고 있으나, 이들은 근본적인 치료보다는 증상 완화 효과만 나타내고 있는 실정이며, 특히 일부 비스테로이드성 항염제의 경우 관절연골의 PG(프로스타글란딘)합성을 억제하여 오히려 골관절염 증상을 악화 시키는 경향을 나타내는 것으로 알려져 있으며, 뿐만 아니라, 위, 십이지장 궤양 등의 위장관 부작용이 문제점으로 지적되고 있다. 다이클로페낙(diclofenac)은 골관절염 치료를 위해 사용되고 있는 대표적인 비스테로이드성 항염제 중 하나로서 사이클로옥시게나제(cyclooxygenase; COX)라는 효소 억제를 주된 기작으로 하고 있다. 다만, 다이클로페낙은 작용시간이 길어 위장 장애가 올 수 있으며, 드물게 용혈성 빈혈이 초래될 수 있으므로 장기 사용시 반드시 혈액검사를 해야하는 문제점이 있다.
따라서, 관절 연골 자체를 보호하거나, 손상을 직접적으로 치료할 수 있는 대체요법의 개발이 시급한 실정이다.
본 발명자는 외과적으로 유발된 골관절염 동물모델에 다이클로페낙 나트륨 및 제주용암해수를 병용 적용하여 골관절염의 개선 및 치료에 어떠한 효과를 미치는지를 다양한 방법으로 평가하였다. 그 결과 제주용암해수의 입욕이 실제적으로 골관절염의 치료에 효과적이며, 특히, 다이클로페낙 나트륨 및 제주용암해수를 병용 적용하는 경우 골관절염 치료에 2배 이상 상승적인 시너지 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
한국등록특허 제10-1525744호 한국등록특허 제10-1337454호 한국등록특허 제10-1661757호
따라서 본 발명의 목적은 골관절염을 효과적으로 치료할 수 있는 피부 외용제 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 골관절염을 효과적으로 개선할 수 있는 입욕제 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 골관절염 치료제인 다이클로페낙(diclofenac)의 효과를 증진시킬 수 있는 보조제 조성물를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 골관절염을 효과적으로 치료하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서,
본 발명은 제주용암해수 또는 이의 농축물을 유효성분으로 포함하는 골관절염의 예방 또는 치료용 피부 외용제 조성물로서, 상기 제주용암해수는 제주특별자치도 제주시 구좌읍 한동리 2972-1번지에서 취수한 제주용암해수이며, 나트륨 10,000 내지 11,000 mg/L, 마그네슘 1,000 내지 1,500 mg/L, 칼슘 300 내지 500 mg/L, 칼륨 300 내지 500 mg/L, 브롬 60 내지 70 mg/L, 스트론듐 7 내지 8 mg/L, 아연 0.010 내지 0020 mg/L, 철 0.010 내지 0.020 mg/L, 망간 0.005 내지 0.010 mg/L, 바나듐 0.010 내지 0.020 mg/L, 셀레늄 0.010 내지 0.020 mg/L 및 게르마늄 0.001 내지 0.005 mg/L를 포함하는, 골관절염의 예방 또는 치료용 피부 외용제 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 골밀도 강화 효과; 프로스타글란딘 E2 함량 억제 효과; 5-LPO(5-lipoxygenase) 활성 억제 효과; MMP-2 및 MMP-9 활성 억제 효과; 콜라겐 타입 Ⅱ, SOX9 및 아그레칸 mRNA 발현 조절; PARP, COX-2 및 TNF-α 활성 억제 효과를 통해 골관절염 치료 효과를 가질 수 있다.
또한, 본 발명은 제주용암해수 또는 이의 농축물을 유효성분으로 포함하는 골관절염의 예방 또는 개선용 입욕제 조성물로서, 상기 제주용암해수는 제주특별자치도 제주시 구좌읍 한동리 2972-1번지에서 취수한 제주용암해수이며, 나트륨 10000 내지 11000 mg/L, 마그네슘 1000 내지 1500 mg/L, 칼슘 300 내지 500 mg/L, 칼륨 300 내지 500 mg/L, 브롬 60 내지 70 mg/L, 스트론듐 7 내지 8 mg/L, 아연 0.010 내지 0020 mg/L, 철 0.010 내지 0.020 mg/L, 망간 0.005 내지 0.010 mg/L, 바나듐 0.010 내지 0.020 mg/L, 셀레늄 0.010 내지 0.020 mg/L 및 게르마늄 0.001 내지 0.005 mg/L를 포함하는, 골관절염의 예방 또는 개선용 입욕제 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 골밀도 강화 효과; 프로스타글란딘 E2 함량 억제 효과; 5-LPO(5-lipoxygenase) 활성 억제 효과; MMP-2 및 MMP-9 활성 억제 효과; 콜라겐 타입 Ⅱ, SOX9 및 아그레칸 mRNA 발현 조절; PARP, COX-2 및 TNF-α 활성 억제 효과를 통해 골관절염 개선 효과를 가질 수 있다.
또한, 본 발명은 다이클로페낙(diclofenac)의 골관절염 치료 효과를 개선시키기 위한 보조제 조성물로서, 상기 조성물은 제주용암해수 또는 이의 농축물을 유효성분으로 포함하며, 상기 제주용암해수는 제주특별자치도 제주시 구좌읍 한동리 2972-1번지에서 취수한 용암해수이며, 상기 조성물은 외용제 제형의 보조제 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 제주용암해수는 나트륨 10,000 내지 11,000 mg/L, 마그네슘 1,000 내지 1,500 mg/L, 칼슘 300 내지 500 mg/L, 칼륨 300 내지 500 mg/L, 브롬 60 내지 70 mg/L, 스트론듐 7 내지 8 mg/L, 아연 0.010 내지 0020 mg/L, 철 0.010 내지 0.020 mg/L, 망간 0.005 내지 0.010 mg/L, 바나듐 0.010 내지 0.020 mg/L, 셀레늄 0.010 내지 0.020 mg/L 및 게르마늄 0.001 내지 0.005 mg/L를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 인간을 제외한 개체에 다이클로페낙(diclofenac)을 투여하고, 이와 병행하여 제주용암해수에 입욕을 하는 단계를 포함하는, 골관절염의 치료방법을 제공한다.
본 발명에 따른 제주용암해수를 유효성분으로 포함하는 조성물은 용암해수에 특정 함량의 미네랄 성분을 함유함으로써 골관절염을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있는바 피부 외용제, 입욕제 또는 입욕수로 유용하게 사용될 수 있다. 특히, 소염진통제에 해당하는 다이클로페낙 나트륨과 함께 제주용암해수를 병용 적용하는 경우 골관절염 치료에 2배 이상 상승적인 시너지 효과를 갖는바, 제주용암해수를 유효성분으로 포함하는 조성물은 다이클로페낙 나트륨의 보조제로서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 골관절염을 유발한 과정을 포함한 동물 실험 과정을 간략하게 나타내는 모식도이다.
도 2는 각 실험군별 실험물질 처리 후 기간 경과에 따른 체중을 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 3은 각 실험군별 실험물질 처리 후 기간 경과에 따른 슬관절 두께를 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 4는 각 실험군별 캡슐 노출 후 슬관절 두께를 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 5는 각 실험군별 슬관절 최대 신장 각도를 나타내는 대표 이미지 사진이다. (A)는 Sham control(모의처치 대조군), (B)는 OA control(골관절염 대조군), (C)는 D2 그룹, (D)는 JMSwB 그룹, (E)는 D1+JMSwB 그룹, (F)는 D2+JMSwB 그룹을 나타낸다.
도 6은 각 실험군별 슬관절 최대 신장 각도를 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 7은 각 실험군별 무릎 관절 전체, 대퇴골과 경골 관절면의 대표적인 DEXA 이미지 사진이다. (A)는 Sham control(모의처치 대조군), (B)는 OA control(골관절염 대조군), (C)는 D2 그룹, (D)는 JMSwB 그룹, (E)는 D1+JMSwB 그룹, (F)는 D2+JMSwB 그룹을 나타낸다.
도 8은 각 실험군별 대퇴골 관절면의 압착 강도를 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 9는 각 실험군별 경골 관절면의 압착 강도를 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 10은 각 실험군별 대퇴골 및 경골 관절연골과 관절막내 BrdU-면역반응세포를 보여주는 면역조직화학 분석 결과이다. A는 Sham control(모의처치 대조군), B는 OA control(골관절염 대조군), C는 D2 그룹, D는 JMSwB 그룹, E는 D1+JMSwB 그룹, F는 D2+JMSwB 그룹을 나타낸다.
도 11은 각 실험군별 대퇴골 및 경골 관절연골과 관절막내 일반적인 조직학적 분석 이미지 결과이다. A는 Sham control(모의처치 대조군), B는 OA control(골관절염 대조군), C는 D2 그룹, D는 JMSwB 그룹, E는 D1+JMSwB 그룹, F는 D2+JMSwB 그룹을 나타낸다.
도 12는 각 실험군별 대퇴골 및 경골 관절연골과 관절막내 PARP-면역반응세포를 보여주는 면역조직화학 분석 결과이다. A는 Sham control(모의처치 대조군), B는 OA control(골관절염 대조군), C는 D2 그룹, D는 JMSwB 그룹, E는 D1+JMSwB 그룹, F는 D2+JMSwB 그룹을 나타낸다.
도 13은 각 실험군별 대퇴골 및 경골 관절연골과 관절막내 COX-2-면역반응세포를 보여주는 면역조직화학 분석 결과이다. A는 Sham control(모의처치 대조군), B는 OA control(골관절염 대조군), C는 D2 그룹, D는 JMSwB 그룹, E는 D1+JMSwB 그룹, F는 D2+JMSwB 그룹을 나타낸다.
도 14는 각 실험군별 대퇴골 및 경골 관절연골과 관절막내 TNF-α-면역반응세포를 보여주는 면역조직화학 분석 결과이다. A는 Sham control(모의처치 대조군), B는 OA control(골관절염 대조군), C는 D2 그룹, D는 JMSwB 그룹, E는 D1+JMSwB 그룹, F는 D2+JMSwB 그룹을 나타낸다.
본 발명은 제주용암해수 또는 이의 농축물을 유효성분으로 포함하는 골관절염의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물(특히, 피부 외용제 조성물); 제주용암해수 또는 이의 농축물을 유효성분으로 포함하는 골관절염 개선용 입욕제 조성물에 관한 것이다.
본 명세서에서 “용암해수”란 바닷물이 화산암반층에 의해 자연 여과되어 육지의 지하로 스며든 물로서 미네랄과 영양염류가 매우 풍부할 뿐만 아니라 유기물 및 병원균이 거의 없는 해수를 의미한다. 용암해수는 세계에서 유일하게 우리나라에서만 산업적 활용이 가능한 해양자원이다.
본 명세서에서 “제주용암해수”는 제주특별자치도 제주시 구좌읍 한동리 2972-1번지 지하 70m 이하에서 취수한 용암해수로서, 평균 17~18℃ 수온, 33psu 염분 및 pH 7.6이 연중 일정하게 유지되는 특징을 가진다.
상기 제주용암해수는 현무암층에 의해 여과된 청정하고 유용한 미넬랄을 함유하고 있는 제주만의 독특한 수자원으로서, 사용한 만큼 바닷물이 다시 여과-유입되기 때문에 고갈위험이 없이 이용할 수 있는 순환(지속가능한)자원이다.
일반해수(표층수)의 경우 10~25℃로 계절변동이 있는 반면, 상기 제주용암해수는 평균 17~18℃의 연중 일정한 수온을 가진다. 또한, 일반해수의 경우 염분이 30~35psu로 계절 변동이 심한 반면, 상기 제주용암해수는 33psu로 연중 일정한 염분을 가진다. 또한, 일반해수의 경우 pH가 7.9~8.1로 여름에 높고 겨울에 낮은 농도차를 보이는 반면, 상기 제주용암해수는 pH 7.6으로 연중 일정한 pH를 가진다. 뿐만 아니라, 일반해수의 경우 일반미생물과 대장균이 연중 검출되며 여름철에는 일반미생물이 60,000 CFU/ml까지 검출되고 총대장군균이 15,000 FU/ml까지 검출되는 반면, 상기 제주용암해수는 연중 일반미생물과 총대장균군이 검출되지 않는 특징을 가진다.
상기 제주용암해수는 나트륨 10,000 내지 11,000 mg/L, 마그네슘 1,000 내지 1,500 mg/L, 칼슘 300 내지 500 mg/L, 칼륨 300 내지 500 mg/L, 브롬 60 내지 70 mg/L, 스트론듐 7 내지 8 mg/L, 아연 0.010 내지 0020 mg/L, 철 0.010 내지 0.020 mg/L, 망간 0.005 내지 0.010 mg/L, 바나듐 0.010 내지 0.020 mg/L, 셀레늄 0.010 내지 0.020 mg/L 및 게르마늄 0.001 내지 0.005 mg/L를 포함할 수 있다.
바람직하게는, 상기 제주용암해수는 나트륨 10,510 mg/L, 마그네슘 1,295 mg/L, 칼슘 399 mg/L, 칼륨 400 mg/L, 브롬 63.4 mg/L, 스트론듐 7.70 mg/L, 아연 0.019 mg/L, 철 0.015 mg/L, 망간 0.008 mg/L, 바나듐 0.015 mg/L, 셀레늄 0.013 mg/L 및 게르마늄 0.002 mg/L를 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 제주용암해수는 일반해수 대비 미량원소(아연, 철, 망간, 바나듐, 셀레늄, 게르마늄) 함량이 현저하게 높은 특징을 가지고 있으며, 이러한 미량원소의 함량은 해양심층수 보다 높은 수치를 가진다. 즉, 일반해수의 경우 나트륨 10,672 mg/L, 마그네슘 1,294 mg/L, 칼슘 413 mg/L, 칼륨 387 mg/L, 브롬 67 mg/L, 스트론듐 7.8 mg/L, 아연 0.00035 mg/L, 철 0.00003 mg/L, 망간 0.00002 mg/L, 바나듐 0.002 mg/L, 셀레늄 0.0001 mg/L을 포함한다.
따라서, 본 발명의 제주용암해수는 평균 17~18℃ 수온, 33psu 염분 및 pH 7.6이 연중 일정하게 유지되는 특징 및 미량원소(아연, 철, 망간, 바나듐, 셀레늄, 게르마늄) 함량이 현저하게 높은 특징을 가진다.
본 발명에서 제주용암해수는 그 자체로 사용되거나 가공되어 사용될 수 있는데, 예를 들어 증발, 농축 및 건조에 의해 수득된 고형분의 결정으로 사용할 수 있다. 또는 상기 제주용암해수를 자연건조로 증발시키거나, 인공적으로 탈염 및 건조(또는 증발)시켜 얻은 농축액을 사용할 수 있다. 증발, 농축 및 건조 방법에 특별한 한정은 없으나, 예를 들면 제주용암해수를 1차, 2차 및 3차 증발기로 증발시키고 여과한 후 농축 건조하여 얻을 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 제주용암해수를 그 자체로 사용할 경우 조성물 총 중량을 기준으로 50%(v/v)~100%(v/v)의 양으로 사용할 수 있으며, 농축물로 사용할 경우에는 조성물 총 중량을 기준으로 농축물을 0.1~50%(v/v)의 양으로 함유하여 사용할 수 있다.
구체적인 일실시예로, 본 발명에 따른 상기 제주용암해수의 농축물은 하기와 같은 방법으로 제조될 수 있다. 우선 원수를 채수한 후, 필터링하는 여과 단계를 거칠 수 있다. 이 때 상기 여과 단계는 여러 차례의 여과 단계를 거칠 수 있다. 이렇게 여과 과정을 거쳐 수득한 수득물은 탈염 단계 및 건조 과정을 수행할 수 있으며, 탈염은 이에 제한되는 것은 아니나 전기투석법 및 역삼투압법을 이용할 수 있다.
이후, 자연건조나 인공건조기를 이용한 건조단계를 거쳐 탈염 파우더를 제조 할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 상기 건조를 위해 진공동결 건조기를 사용할 수 있으며, 마지막 단계에서는 탈염 파우더를 분쇄하여 포장할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 제주용암해수의 농축물의 제조는 원수를 채수한 후 건조과정을 통해 먼저 농축과정을 수행할 수 있고, 이후 여과 단계를 수행할 수 있다.
본 발명의 제주용암해수의 농축물은 제주용암해수에 포함된 미네랄 성분을 나트륨 10,000 내지 11,000 중량부, 마그네슘 1,000 내지 1,500 중량부, 칼슘 300 내지 500 중량부, 칼륨 300 내지 500 중량부, 브롬 60 내지 70 중량부, 스트론듐 7 내지 8 중량부, 아연 0.010 내지 0020 중량부, 철 0.010 내지 0.020 중량부, 망간 0.005 내지 0.010 중량부, 바나듐 0.010 내지 0.020 중량부, 셀레늄 0.010 내지 0.020 중량부 및 게르마늄 0.001 내지 0.005 중량부의 비율로 포함하며, 농축물 그 자체로 또는 환원 희석물이 골관절염 예방, 개선 또는 치료의 활성을 갖는다.
본 발명의 일구체예에서, 상기 제주용암해수는 골밀도 강화 효과; 프로스타글란딘 E2 함량 억제 효과; 5-LPO(5-lipoxygenase) 활성 억제 효과; MMP-2 및 MMP-9 활성 억제 효과; 콜라겐 타입 Ⅱ, SOX9 및 아그레칸 mRNA 발현 조절; PARP, COX-2 및 TNF-α활성 억제 효과를 통해 골관절염의 예방, 개선 또는 치료 효과를 갖는다.
또한, 본 발명은 제주용암해수 또는 이의 농축물을 유효성분으로 포함하는 다이클로페낙(diclofenac)의 골관절염 치료 효과를 개선시키기 위한 보조제 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서는 소염진통제에 해당하는 다이클로페낙(diclofenac) 투여와 함께 제주용암해수를 병행하여 적용하는 경우 골관절염 치료에 2배 이상 상승적인 시너지 효과가 발생함을 객관적인 실험을 통해 입증하였다.
따라서 본 발명은 다이클로페낙(diclofenac)을 보조하는 조성물로서 상기 다이클로페낙과 병행 사용시 골관절염 치료 효과를 두드러지게 증진시킬 수 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 상기 제주용암해수는 제주특별자치도 제주시 구좌읍 한동리 2972-1번지 지하 70m 이하에서 취수한 용암해수로서, 나트륨 10,000 내지 11,000 mg/L, 마그네슘 1,000 내지 1,500 mg/L, 칼슘 300 내지 500 mg/L, 칼륨 300 내지 500 mg/L, 브롬 60 내지 70 mg/L, 스트론듐 7 내지 8 mg/L, 아연 0.010 내지 0020 mg/L, 철 0.010 내지 0.020 mg/L, 망간 0.005 내지 0.010 mg/L, 바나듐 0.010 내지 0.020 mg/L, 셀레늄 0.010 내지 0.020 mg/L 및 게르마늄 0.001 내지 0.005 mg/L를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 다이클로페낙(diclofenac)을 투여하고, 이와 병행하여 제주용암해수에 입욕을 하는 단계를 포함하는, 골관절염의 치료방법에 관한 것이다.
상기 다이클로페낙(diclofenac)의 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 보다 바람직한 효과를 위해서, 상기 다이클로페낙의 투여량은 1일 0.1 mg/kg 내지 100mg/kg으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 다이클로페낙은 동물, 바람직하게는 인간을 포함하는 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 정맥, 근육, 피하주사 등에 의해 투여될 수 있다. 상기 다이클로페낙 나트륨의 약학적 투여 형태는 유효성분의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.
본 발명의 골관절염의 치료방법은 다이클로페낙(diclofenac) 투여와 함께 제주용암해수에 입욕하는 단계를 포함한다. 즉, 다이클로페낙을 투여한 후 제주용암해수에 일정시간 동안 입욕할 수 있으며, 입욕시간은 환자의 상태에 따라 달라질 수 있으나, 예를 들어, 10분 내지 60분 동안 입욕할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예>
1. 재료 및 실험방법
(1) 실험동물 준비
60마리의 건강한 SPF/VAF Outbred Crl:CD[Sprague-Dawley, SD] 수컷 랫트 (OrientBio, Seungnam, Korea) [ANNEX I, II]를 7일간 순화 후, 골관절염 유발 수술 또는 위수술을 실시한 다음, 수술 27일 후 체중 (위수술군 평균 411.88±17.40 g, 388~433 g; OA 유발군 평균 409.13±15.11 g, 383~433 g) 및 슬관절 두께 (위수술군 평균 10.96±0.15 mm, 10.76~11.17 mm; OA 유발군 13.87±0.18 mm, 13.61~14.22 mm)를 기준으로 군당 8 마리씩, 하기와 같이 총 6개 군으로 선별하여, 실험에 사용하였으며, 본 동물실험은 대구한의대학교 동물실험윤리 위원회의 사전 승인 하에 실시하였다 [Approval No. DHU2017-052, June 27, 2017 (ANNEX III)].
군 분리 (총 6개군; 군 당 8마리) (하기 표 1 및 도 1 참조)
- Sham control(모의처치 대조군): 위 수술 후, 멸균 증류수 입욕 및 생리식염수 피하 투여 매체 대조군
- OA control(골관절염 대조군): 골관절염 유발 수술 후, 멸균 증류수 입욕 및 생리식염수 피하 투여 유발 대조군
- D2 그룹: 골관절염 유발 수술 후, 멸균 증류수 입욕 및 디클로페낙나트륨 2 mg/kg 피하 투여군
- JMSwB 그룹: 골관절염 유발 수술 후, 제주용암해수 입욕 및 생리식염수 피하 투여군
- D1+JMSwB 그룹: 골관절염 유발 수술 후, 제주용암해수 입욕 및 디클로페낙나트륨 1 mg/kg 피하 투여군
- D2+JMSwB 그룹: 골관절염 유발 수술 후, 제주용암해수 입욕 및 디클로페낙나트륨 2 mg/kg 피하 투여군
실험 설계
그룹 Operation Dose (mg/kg/day) Animal No.
외과적으로 유발된 골관절염 Rat에서 diclofenac sodium의 항-골관절염 활성에 제주용암해수가 미치는 영향
Control Sham operate Bathing on distilled water (20 min/day) with subcutaneous injection with saline (2 ml/kg) R01~R08
Control OA operate Bathing on distilled water (20 min/day) with subcutaneous injection with saline (2 ml/kg) R09~R16
Reference OA operate Bathing on distilled water (20 min/day) with subcutaneous injection with diclofenac sodium (2 mg/kg) R17~R24
Reference OA operate Bathing on JMSw (20 min/day) with subcutaneous injection with saline (2 ml/kg) R31~R32
Active OA operate Bathing on JMSw (20 min/day) with subcutaneous injection with diclofenac sodium (1 mg/kg) R61~R40
Active OA operate Bathing on JMSw (20 min/day) with subcutaneous injection with diclofenac sodium (2 mg/kg) R81~R48
OA = Osteoarthritis(골관절염); JMSw = Jeju magma seawater(제주용암해수)
(2) 제주용암해수 준비
본 실험에서 사용한 제주용암해수는 제주특별자치도 제주시 구좌읍 한동리 2972-1번지에서 취수한 용암해수를 사용하였다. 상기 제주용암해수는 평균 17~18℃ 수온, 33psu 염분 및 PH 7.6의 특징이 연중 일정하게 유지된다. 본 발명의 제주용암해수의 성분은 아래 표 2에서 더욱 자세히 나타내었다.
본 발명 제주용암해수의 성분
성분 조성(mg/ℓ)
Na(나트륨) 10,510
Mg(마그네슘) 1,295
Ca(칼슘) 399
K(칼륨) 400
Br(브롬) 63.40
Sr(스트론듐) 7.70
Zn(아연) 0.019
Fe(철) 0.015
Mn(망간) 0.008
V(바나듐) 0.015
Se(셀레늄) 0.013
Ge(게르마늄) 0.002
(3) 골관절염 유발
실험동물을 설치류용 흡입마취기 (Surgivet, Waukesha, WI, USA)와 환기 장치 (Model 687, Harvard Apparatus, Cambridge, UK)를 이용하여, 2 ~ 3% 아이소플루레인 (Hana Pharm. Co., Hwasung, Korea)과 70% N2O 및 28.5% O2 혼합가스로 흡입 전신마취를 유도한 다음 1 ~ 1.5% 아이소플루레인과 70% N2O 및 28.5% O2 혼합가스로 마취를 유지하면서, 왼쪽 관절낭을 노출하고 전방십자인대 절제 및 내측 반월판 부분 절제를 실시하여 골관절염을 유발하였다. 모의처치 대조군(Sham control)에서는 관절낭을 절제하여 내측 반월판을 확인한 다음 절제하지 않고 관절낭을 폐쇄하였다.
(4) 입욕 및 디클로페낙나트륨 처리
실험동물을 체온 (37℃)과 유사하게 가온 한 5cm 깊이의 제주용암해수 4,000 ml를 채운 랫트 polycarbonate 사육상자 (280×420×180 mm; DJ-102, Daejong Instrument Ind. Co., Seoul, Korea)에 골관절염 유발 수술 4주 후부터 매일 1회씩 6주간 20분씩 자유롭게 입욕시켰으며, 디클로페낙나트륨 (Wako Purechemical Ind. Ltd., Osaka, Japan)을 생리 식염수에 0.4 mg/ml 농도로 용해시켜, 5 ml/kg의 용량 (2mg/kg)으로 역시 골관절염 유발 수술 4주 후부터 매일 1회씩 8주(56일) 동안 등쪽 피부에 23 G needle이 부착된 5 ml 주사기를 이용하여 피하 투여하였다. D1+JMSwB 그룹 및 D2+JMSwB 그룹에서는 디클로페낙나트륨 1 또는 2 mg/kg 피하 투여 30분 후부터 20분 동안 제주용암해수에 입욕시켰다. 모의처치 대조군(Sham control) 및 골관절염 대조군(OA control)에서는 동일한 입욕 및 투여에 따른 보정 스트레스를 가하기 위해, 제주용암해수 대신 37℃로 가온 한 멸균 증류수에 동일한 방법으로 입욕 시켰으며, 디클로페낙나트륨 대신 동일 용량 (5 ml/kg)의 생리식염수를 동일한 방법으로 피하투여 하였다. 또한 D2 그룹에서는 제주용암해수 입욕 대신 멸균 증류수에 동일한 방법으로 입욕시켰으며, JMSwB 그룹에서는 디클로페낙나트륨 대신 동일 용량의 생리식염수를 동일한 방법으로 피하투여하였다 (표 1 및 도 1 참조).
(5) 관찰항목
상기 실험 설계된 그룹별 동물의 체중 및 증체량의 변화, 슬관절 두께의 변화, 슬관절 (knee joint)의 최대 신장 각도 및 capsule 노출 후 슬관절의 두께 변화, 무릎 관절 전체, 대퇴골과 경골 관절면의 골밀도, 대퇴골 및 경골 관절면의 압착 강도의 변화, 대퇴골 및 경골 관절연골과 관절막내 PGE2 함량, 5-LPO, MMP-2 및 MMP-9 활성, 연골세포외 기질의 구성성분인 콜라겐 타입 II, SOX9 및 아그레칸(aggrecan)에 대한 mRNA 발현 정도, 경골 및 대퇴골 관절 연골과 관절막에 대한 일반 조직병리학적 변화 - Mankin score, 관절연골 두께, 관절막 상피 두께 및 관절막내 침윤 염증세포 수의 변화, 경골 및 대퇴골 관절 연골과 관절막내 PARP, COX-2 및 TNF-α 면역반응세포의 수적 변화, BrdU uptake assay를 통한 대퇴골 및 경골 관절연골과 관절막내 세포 증식성을 각각 평가하였다.
1) 체중 및 증체량 변화 측정방법
체중 변화는 골관절염 유발 수술 1일 전부터 해부할 때(마지막 56번째 제주용암해수 입욕 또는 다이클로페낙 나트륨의 피하 주사한 다음 24시간 후)까지 자동전자저울(XB320M, Precisa Instrument)을 사용하여 적어도 주 1회 측정하였다. 골관절염 유발 수술에서, 초기 시험 물질 처리시 및 종료시, 모든 실험 동물을 급식과의 차이를 줄이기 위해 밤새 단식(물만 급이함)시켰다.
체중 증가량(Body Weight Gains, (g))은 하기 수학식 1에 따라 계산하였다.
[수학식 1]
골관절염 유도 기간의 28 일 동안 체중 증가 = 초기 입욕 또는 피하 치료시 체중 - OA 수술 당일의 체중
입욕 또는 피하 치료 56 일 동안 체중 증가 = 해부시 체중 - 초기 입욕 또는 피하 치료시 체중(골관절염 유발 수술 후 28 일)
2) 슬관절 두께 변화 측정방법
골관절염 유발 수술한 후방 슬관절의 두께를 전자 디지털 캘리퍼스 (CD-15CPS, Mytutoyo, Tokyo, Japan)를 이용하여 측정하였다. 골관절염 유발 수술 후 27 일째, 처음 제주용암해수 입욕 또는 다이클로페낙 나트륨 피하 주사한 날, 제주용암해수 입욕 또는 다이클로페낙 나트륨 피하 주사한 날 이후 1, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 55일째에 슬관절 두께를 측정하였다. 또한, 조인트 캡슐 노출 후 무릎의 두께는 이전 연구에서 기술된 내용[Kim et al., 2012b; Kang et al., 2014a; Moon et al., 2014; Choi et al., 2015]에 따라 동일한 방법을 사용하여 주변 조직과의 차이를 줄이기 위해 실험동물 해부 후 측정하였다.
3) 슬관절 최대 신장 각도 측정방법
실험동물의 무릎을 발목 관절 부위에서 절개하여 관절낭을 손상시키지 않았다. 해부 후 각 무릎의 최대 신장 각도는 이전의 방법에 따라 측정되었다 [Rezende et al., 2006; Kim et al., 2012b; Kang et al., 2014a; 문 등, 2014; Choi et al., 2015]), 가능한 최대 신장 각도를 갖는다. 가능한 모든 편향을 최소화하기 위해, 모든 수술과 신장 수준의 측정은 동일한 수의사가 수행하였다.
4) 관절면의 In live DEXA 골밀도 측정방법
총 무릎 관절, 대퇴골 및 경골 관절면의 평균 초점 BMD는 in live Dual-energy X-ray absorptionmetry(DEXA, Medikors, Seungnam, Korea)를 이용하여 g/cm2로서 측정하였다.
5) 관절면의 압착 강도 측정방법
관절압착강도(Newton)의 측정은 컴퓨터화된 측정기(SV-H1000, Japan Instrumentation System Co., Tokyo, Japan)에 의해 대퇴골과 경골의 관절 표면의 국소적인 압착 강도를 측정하였다.
6) 활막 조직을 갖는 대퇴골 및 경골의 관절연골의 호모게네이트 준비
각 무릎의 최대신장각도의 측정 후 관절막과 함께 대퇴골 및 경골의 관절연골의 일부를 분리하였다. 이후 bead beater (Model TacoTMPre, GeneResearch Biotechnology Corp., Taichung, Taiwan), ultrasonic cell disruptor (Model KS-750, Madell Technology Corp., Ontario, CA, USA) 및 radioimmunoprecipitation assay (RIPA) buffer (Sigma-Aldrich, St. Louise, MO, USA)를 이용하여 조직 호모게네이트를 준비하였다. PGE2 수준과 5-LPO, MMP-2 및 MMP-9의 활성을 측정하기 위하여 4℃ 15,000 rpm에서 원심분리를 진행하여 상등액을 분리하였다. 모든 조직 호모게네이트는 분석 전까지 -150℃ 의 ultradeep freezer (Model MDF-1156, Sanyo, Tokyo, Japan)에서 보관하였다.
7) PGE2 함량 측정방법
대퇴골 및 경골 관절연골과 관절막내 PGE2 함량은 각각 상업용 PGE2 assay kit (PKGE004B, ParameterTM, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 분석한 후, micro plate reader (Sunrise; Tecan, Manedorf, Switzerland)를 이용하여 pg/ml 수준에서 측정하였다.
8) 5-LPO 활성 측정방법
대퇴골 및 경골 관절연골과 관절막내 5-LPO 활성은 각각 상업용 Lipoxygenase Inhibitor Screening Assay kit (Cat No. 760700, Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA)를 이용하여 분석한 후, micro plate reader (Sunrise; Tecan, Manedorf, Switzerland)를 이용하여 μM/min/ml 수준에서 측정하였다.
9) MMP-2 및 MMP-9 활성 측정방법
대퇴골 및 경골 관절연골과 관절막내 MMP-2, MMP-9 활성은 각각 상업용 MMP ELISA kits (MBS494797 for MMP-2 and MBS722532 for MMP-9, Mybiosource, San Diego, CA, USA)를 이용하여 분석한 후, OD 560 nm에서 micro plate reader (Sunrise; Tecan, Manedorf, Switzerland)를 이용하여 ng/ml 수준에서 측정하였다.
10) collagen type II, SOX9 및 aggrecan mRNA 발현 측정방법
RNA는 이전 연구에서 기술된 방법에 따라 Trizol reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 추출하였다[Na et al., 2014;Nam et al., 2014]. RNA 농도 및 질(quality)은 CFX96TM Real-Time System (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)으로 결정하였다. DNA 오염을 제거하기 위하여 시료는 recombinant DNase I (DNA-free; Ambion, Austin, TX, USA)로 처리하였다. RNA는 제조사의 지시에 따라 reagent High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 이용하여 역전사 시켰다. 그리고 cDNA 가닥은 총 RNA로부터 합성된 다음 증폭용 프라이머 및 cDNA 생산물의 혼합물은 PCR에 의해 증폭되었다. 이때 PCR 증폭 조건은 58℃에서 30분, 94℃에서 2분, 35사이클(94℃ 15 초, 60℃ 30초, 68℃ 1분)을 진행한 다음 72℃에서 5분을 진행하였다. ABI Step One Plus Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 이용하여 분석을 수행하였으며, 유전자 발현수준은 OA 대조군에 대한 상대적인 발현량으로 계산되었다. β-액틴 mRNA의 발현은 모든 시료에 있어 대조군으로 사용하였다. PCR용 프라이머 서열은 하기 표 3에 자세히 기재하였다.
RT-RCR에 사용한 유전자 증폭을 위한 프라이머 서열
타겟 유전자 프라이머 서열(5‘-3’) NCBI accession No.
(분자량)
Collagen type Ⅱ 센스 GAGTGGAAGAGCGGAGACTACTG NM_012929
(4538 bp)
안티센스 CTCCATGTTGCAGAAGACTTTCA
SOX9 센스 AGAGCGTTGCTCGGAACTGT NM_080403
(4032 bp)
안티센스 TCCTGGACCGAAACTGGTAAA
Aggrecan 센스 GATGTCCCCTGCAATTACCA NM_022190
(6939 bp)
안티센스 TCTGTGCAAGTGATTCGAGG
β-actin 센스 ATCGTGGGCCGCCCTAGGCA NM_031144
(1293 bp)
안티센스 TGGCCTTAGGGTTCAGAGGGG
NCBI = National Center for Biotechnology Information
RT-PCR = Reverse transcription polymerase chain reaction
SOX9 = Sex determining region Y-box 9
11) BrdU 면역반응세포수 측정방법
실험동물 랫의 무릎 관절 내 세포 증식의 테스트 효과를 평가하기 위하여 BrdU(Sigma-Aldrich, St. Louise, MO, USA)를 복강내 주사함으로써 증식되는 세포를 라벨링하였다. BrdU를 50mg/kg 량으로 살린에 용해시켜 2ml/kg의 볼륨으로 랫의 복강내로 주사하고, 72시간 이후 동물을 희생시켜 해부하였다. 대퇴골 및 경골 관절연골과 관절막내 BrdU 면역반응세포수는 항-BrdU 항체를 이용하여 면역화학염색을 통해 검출하였다.
12) 조직병리학적 변화 관찰, Mankin score 측정방법
조직병리학적 변화를 더욱 자세히 관찰하기 위하여 무릎에서 발견된 대퇴골 및 경골 관절연골 손상을 Mankin scoring system을 사용하여 평가하고 기록하였다(하기 표 4 참조). 이 시스템에서 점수가 높을수록 골관절염 수준이 높은 것으로 판단한다. 전체 조직학적 평가는 동일한 병리학자가 수행하였다. 또한 준비된 시료에서 대퇴골 및 경골 관절연골의 두께, 관절막내의 상피 내피 두께, 관절막내에 침윤된 염증 세포의 수(cells/mm2)는 컴퓨터 기반의 자동화된 이미지 분석기(i Solution FL ver 9.1, IMT i-solution Inc., Vancouver, Quebec, Canada)를 이용하여 측정하였다[Kim et al., 2012b; Kang et al., 2014a; Moon et al., 2014; Choi et al., 2015]. 또한, BrdU, PARP, TNF-α 및 COX-2에 대한 각 항체의 면역반응, 밀도의 20 % 이상이 차지하는 세포는 양성으로 간주하였다[Kim et al., 2012b; Kang et al., 2014a; 문 등, 2014; Choi et al., 2015]. 대퇴골 및 경골 관절연골과 관절막내 각각의 면역반응 세포의 수는 자동화된 디지털 이미지 분석기를 이용하여 개별적으로 세포/mm2 단위로 카운팅하였다.
본 실험에서 사용한 Mankin Scoring 시스템
항목
Surface 0 = normal
1 = irregular
2 = fibrillation / vacuoles
3 = blisters and erosion
Hypocellularity 0 = normal
1 = small decrease in chondrocytes
2 = large decrease in chondrocytes
3 = no cells
Clones 0 = normal
1 = occasional duos
2 = duos or trios
3 = multiple nested cells
Stain intensity for Safranin O 0 = normal
1 = small decrease in color
2 = large decrease in color
3 = no color
13) PARP, COX-2, TNF-α 면역반응세포수 측정방법
세포증식 마커-BrdU를 위한 면역반응은 아비딘-비오틴-퍼옥시다아제 복합체(avidin-biotin-peroxidase complex, ABC)와 함께 정제된 1차 항체( PARP 항체, COX-2 항체, TNF-α항체) 및 peroxidase substrate kit (Vector Labs, Burlingame, CA, USA)를 이용하여 측정하였다. 간략하게는, 내인성 퍼옥시다아제 활성은 30분 동안 메탄올과 0.3 % 과산화수소에서 반응시켜 차단하였고, 면역글로블린의 비특이적 결합은 트립신(Sigma-Aldrich, St. Louise, MO, USA) 및 2N HCl 전처리에 의한 에피토프 회수 후 항온 항습기에서 블로킹 용액(normal horse serum blocking solution)으로 1시간 동안 차단하였다. 일차 항혈청을 4℃ 항온 항습기에서 밤새 처리한 다음, 비오틴이 부착된 2차 항체 및 ABC 시약과 함께 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 마지막으로, 조직 절편을 peroxidase substrate kit와 3분 동안 실온에서 반응시켰다. 모든 절편은 각 단계 사이에 0.01M PBS로 3회 세척하였다. 실험에서 사용한 항-BrdU 항체(ab1893)는 abcam에서 구입하였으며, PARP 항체는 Cell Signaling technology에서 구입하였고, TNF-α 항체는 SANTA CRUZ BIOTHCHNOLOGY, INC.에서 구입하였으며, COX-2 항체는 Cayman Chemical에서 구입하였다.
14) 통계분석
상이한 용량 그룹이 수행되었다. Levene test [Levene, 1981]를 이용하여 등분산성(homogeneity of variance)을 검정하였다. Levene test가 등분산성으로부터 유의한 편차를 보이지 않는다면, 어떤 그룹 비교 쌍이 유의미한 차이가 있는지를 결정하기 위하여 얻은 데이터를 일원 분산 분석(one way ANOVA test)과 뒤이어 LSD (least significant difference) 다중 비교 테스트로 분석하였다. Levene test에서 등분산성이 크게 벗어난 경우 Kruskal-Wallis H test(non-parametric comparison test)를 수행하였다. Kruskal-Wallis H test에서 유의한 차이를 보이는 경우 그룹 비교의 특이적 쌍을 결정하기 위하여 Mann-Whitney U (MW) 테스트를 실시하였다. 통계분석은 SPSS for Windows (Release 14.0K, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 사용하여 수행하였다. P <0.05인 경우 유의미한 것으로 판단하였다. 골관절염 신호의 중증도를 관찰하기 위하여 하기 수학식 2에 따라 모의처치 대조군 및 골관절염 대조군 사이에 변화율(%)를 계산하였다. 테스트 물질 효과의 이해를 돕기 위하여 하기 수학식 3에 따라 골관절염 대조군 및 실험군의 비교된 변화율(%)를 계산하였다.
[수학식 2]
모의처치 대조군 대비 변화(%) = [((골관절염 대조군 랫의 데이터 - 모의처치 대조군 랫의 데이터) / 모의처치 대조군 랫의 데이터) × 100]
[수학식 3]
골관절염 대조군 대비 변화율 (%) = [((시험 물질 처리된 랫의 데이터 - 골관절염 대조군 랫의 데이터) / 골관절염 대조군 랫의 데이터) × 100]
2. 결과
(1) 체중 및 증체량의 변화
본 실험에서 골관절염 유발 수술 13일 후, 체중이 일정한 실험동물만 선별하여 사용하였다 (위수술군 평균 411.88±17.40 g, 388~433 g; 골관절염 유발군 평균 409.13±15.11 g, 383~433 g). 골관절염 대조군(OA control)의 경우 모의처치 대조군(Sham control)에 비해 유의성 있는 체중 및 증체량의 변화는 관찰되지 않았으며, D2 그룹을 포함한 모든 실험물질 처리군에서 골관절염 대조군(OA control)에 비해 유의성 있는 체중 및 증체량의 변화는 나타나지 않았다. 또한, D1+JMSwB 및 D2+JMSwB 그룹에서도 D2 및 JMSwB 그룹과 비교하여 의미 있는 체중 및 증체량의 변화는 관찰되지 않았다.
골관절염 대조군(OA control)의 경우, 모의처치 대조군(Sham control)에 비해 투여기간 동안의 증체량이 -4.01%의 변화를 나타내었으며, D2, JMSwB, D1+JMSwB 및 D2+JMSwB 그룹에서는 골관절염 대조군(OA control)에 비해 각각 -1.09, 4.08, 4.08 및 4.90%의 변화를 나타내었다.
자세하게는 하기 표 5 및 도 2에서 나타내었다.
실험 그룹별 체중 및 증체량 변화
Periods Body weights (g) at Body weight gains (g)
Groups OA [A]* 27 days after OA First treatment [B]* Sacrifice [C]* OA recovery [B-A] Treatment [C-B]
Sham control 206.50±13.68 411.88±17.40 382.00±19.65 525.50±18.66 175.50±8.85 143.50±9.43
OA control 206.38±12.26 410.25±13.52 381.63±13.91 519.38±26.43 175.25±5.99 137.75±17.43
D2 206.13±13.61 409.38±15.67 380.13±16.99 516.38±13.22 174.00±7.69 136.25±9.02
JMSwB 206.13±13.99 408.75±16.78 378.25±19.25 521.63±19.15 172.13±8.44 143.38±10.32
D1+JMSwB 208.00±12.40 408.88±14.94 380.25±15.50 523.63±21.78 172.25±4.10 143.38±8.90
D2+JMSwB 207.38±15.67 408.38±18.32 380.25±19.40 524.75±23.47 172.88±5.30 144.50±8.47
OA = Osteoarthritis(골관절염); JMSw = Jeju magma seawater(제주용암해수)
(2) 슬관절 두께의 변화
본 실험에서 골관절염 유발 수술 27일 후, 모의처치 대조군 그룹에 비해 현저한 슬관절 두께의 증가를 나타낸 실험동물만 선별하여 사용하였으므로 (위수술군 평균 10.96±0.15 mm, 10.76~11.17 mm; OA 유발군 13.87±0.18 mm, 13.61~14.22 mm), 골관절염 대조군(OA control)에서는 모의처치 대조군 그룹에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 슬관절 두께의 증가가 골관절염 유발 수술 27일후부터 실험 전 기간에 걸쳐 인정되었다. 한편 D2 그룹, D1+JMSwB 및 D2+JMSwB 그룹의 경우 투여시작 1일 후부터 골관절염 대조군(OA control)과 비교하여 유의성 있는 (p<0.01) 슬관절 두께의 감소가 나타났다. 특히 D2+JMSwB 그룹은 처리 시작 21일후부터 D2 및 JMSwB 그룹에 비해서도 슬관절 두께의 감소가 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 수치로 나타났으며, D1+JMSwB 그룹은 실험 전 기간동안 D2 그룹과 유사한 슬관절 두께의 감소를 보여주었다(도 3 참조).
처리 종료 24시간 후 슬관절 두께는 골관절염 대조군(OA control)의 경우 모의처치 대조군(Sham control)에 비해 31.48% 의 변화를 나타내었으나, 실험물질을 처리한 D2, JMSwB, D1+JMSwB 및 D2+JMSwB 그룹에서는 골관절염 대조군(OA control)에 비해 각각 -12.66, -3.78, -12.47 및 -15.98%의 변화를 나타내었다.
(3) Capsule 노출 후 슬관절 두께의 변화
골관절염 대조군(OA control)은 모의처치 대조군(Sham control)에 비해 capsule 노출 후 슬관절 두께가 유의성 있게 (p<0.01) 증가하는 것으로 나타났으며, JMSwB 그룹을 포함한 모든 실험물질 처리군은 골관절염 대조군(OA control)에 비해 capsule 노출 후 슬관절 두께가 유의성 있게 (p<0.01 또는 p<0.05) 감소하는 것으로 나타났다. 특히, D2+JMSwB 그룹은 D2 및 JMSwB 그룹에 비하여 capsule 노출 후 슬관절 두께가 유의성 있게 감소하는 것으로 나타났으며, D1+JMSwB 그룹의 경우 capsule 노출 후 D2 그룹과 유사한 정도로 슬관절 두께가 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 4 참조).
Capsule 노출 후 슬관절 두께는 골관절염 대조군(OA control)의 경우 모의처치 대조군(Sham control)에 비해 16.80%의 변화를 나타내었으나, 실험물질을 처리한 D2, JMSwB, D1+JMSwB 및 D2+JMSwB 그룹에서는 골관절염 대조군(OA control)에 비해 각각 -5.74, -3.24, -6.78 및 -9.61%의 변화를 나타내었다.
(4) 슬관절 최대 신장 각도의 변화
골관절염 대조군(OA control)은 모의처치 대조군(Sham control)에 비해 슬관절 최대 신장 각도가 유의성 있게 (p<0.01) 증가하는 것으로 나타났으며, D1+JMSwB 그룹을 포함한 모든 실험물질 처리군은 골관절염 대조군(OA control) 대비 슬관절 최대 신장 각도가 유의성 있게 감소하는 것으로 나타났다. 특히, D2+JMSwB 그룹의 경우 D2 및 JMSwB 그룹에 비하여 슬관절 최대 신장 각도가 유의성 있게 감소하는 것으로 나타났으며, D1+JMSwB 그룹의 경우 슬관절 최대 신장 각도의 감소 정도가 D2 그룹과 유사한 것을 확인할 수 있었다(도 5 및 도 6 참조).
골관절염 대조군(OA control)에서는 모의처치 대조군(Sham control)에 비해 슬관절 최대 신장 각도가 114.34%의 변화를 나타내었으나, 실험물질을 처리한 D2, JMSwB, D1+JMSwB 및 D2+JMSwB 그룹의 경우 골관절염 대조군(OA control)에 비해 각각 -30.48, -20.07, -33.46 및 -47.96%의 변화를 나타내었다.
(5) 무릎 관절 전체, 대퇴골과 경골 관절면의 In live DEXA 골밀도의 변화
골관절염 대조군(OA control)에서는 In live DEXA image 상에서 대퇴골 및 경골 관절 국소 연골 소실 및 골증식체 (osteophyte) 형성 등 전형적인 골관절염 소견이 인정되어, 모의처치 대조군(Sham control)에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 슬관절 전체, 대퇴골과 경골 관절면의 국소 골밀도의 감소를 각각 나타내었다. 반면에, D2+JMSwB 그룹을 포함한 모든 실험물질 처리군에서는 골관절염 대조군(OA control)에 비해 DEXA image 상의 골관절염 소견이 현저히 억제되어, 유의성 있는 (p<0.01) 슬관절 전체, 대퇴골과 경골 관절면의 국소 골밀도의 증가가 각각 인정되었으며, 특히 D2+JMSwB 그룹의 경우 D2 및 JMSwB 그룹에 비하여 슬관절 골밀도가 유의성 있게 증가하는 것을 보여주었고, D1+JMSwB 그룹의 경우 D2 그룹과 유사한 정도의 슬관절 골밀도의 증가를 보여주었다(표 6 및 도 7 참조).
슬관절 전체 국소 골밀도는 골관절염 대조군(OA control)의 경우 모의처치 대조군(Sham control)에 비해 -24.37%의 변화를 나타내었으나, 실험물질을 처리한 D2, JMSwB, D1+JMSwB 및 D2+JMSwB 그룹에서는 골관절염 대조군(OA control)에 비해 각각 13.97, 7.93, 14.76 및 19.73%의 변화를 나타내었다.
대퇴골 관절면의 국소 골밀도는 골관절염 대조군(OA control)의 경우 모의처치 대조군(Sham control)에 비해 -23.71%의 변화를 나타내었으나, 실험물질을 처리한 D2, JMSwB, D1+JMSwB 및 D2+JMSwB 그룹에서는 골관절염 대조군(OA control)에 비해 각각 11.70, 7.89, 12.53 및 18.07%의 변화를 나타내었다.
경골 관절면의 국소 골밀도는 골관절염 대조군(OA control)의 경우 모의처치 대조군(Sham control)에 비해 -24.16%의 변화를 나타내었으나, 실험물질을 처리한 D2, JMSwB, D1+JMSwB 및 D2+JMSwB 그룹에서는 골관절염 대조군(OA control)에 비해 각각 14.51, 10.17, 15.28 및 19.87%의 변화를 나타내었다.
그룹별 무릎 관절 전체, 대퇴골과 경골 관절면의 국소 골밀도
항목
그룹		 Focal BMD
무릎 관절 전체 대퇴골 관절면 경골 관절면
Sham control 0.0569±0.0020 0.0594±0.0019 0.0606±0.0011
OA control 0.0430±0.0015a 0.0453±0.0017a 0.0460±0.0017a
D2 0.0490±0.0017ab 0.0506±0.0015ab 0.0527±0.0012ab
JMSwB 0.0464±0.0019ab 0.0489±0.0014abd 0.0505±0.0010abc
D1+JMSwB 0.0494±0.0017abe 0.0510±0.0012abe 0.0530±0.0006abe
D2+JMSwB 0.0515±0.0012abce 0.0535±0.0012abce 0.0551±0.0009abce
Values are expressed mean ±SD of eight rats, g/cm2
a p<0.01 as compared with sham control by LSD test
b p<0.01 as compared with OA control by LSD test
c p<0.01 and dp<0.05 as compared with D2 by LSD test
e p<0.01 as compared with JMSwB by LSD test
(6) 대퇴골 및 경골 관절면의 압착 강도의 변화
골관절염 대조군(OA control)의 경우 모의처치 대조군(Sham control)에 비해 대퇴골과 경골 관절면의 압착 강도가 유의성 있게 (p<0.01) 감소하는 것으로 나타났으나, D2 그룹을 포함한 모든 실험물질 처리군의 경우 골관절염 대조군(OA control)에 비해 대퇴골과 경골 관절면의 압착 강도가 유의성 있게(p<0.01) 증가하는 것으로 나타났다. 특히, D2+JMSwB 그룹의 경우 D2 및 JMSwB 그룹에 비하여 대퇴골과 경골 관절면 압착 강도가 유의성 있게 증가되었으며, D1+JMSwB의 경우 D2와 유사한 정도의 관절면 압착 강도의 증가를 보여주었다(도 8 및 도 9 참조).
대퇴골 관절면의 압착 강도는 골관절염 대조군(OA control)의 경우 모의처치 대조군(Sham control)에 비해 -64.90%의 변화를 나타내었으나, 실험물질을 처리한 D2, JMSwB, D1+JMSwB 및 D2+JMSwB 그룹에서는 골관절염 대조군(OA control)에 비해 각각 89.08, 65.86, 92.30 및 123.13%의 변화를 나타내었다.
경골 관절면의 압착 강도는 골관절염 대조군(OA control)의 경우 모의처치 대조군(Sham control)에 비해 -75.04%의 변화를 나타내었으나, 실험물질을 처리한 D2, JMSwB, D1+JMSwB 및 D2+JMSwB 그룹에서는 골관절염 대조군(OA control)에 비해 각각 97.37, 60.39, 104.10 및 171.22%의 변화를 나타내었다.
(7) 대퇴골 및 경골 관절연골과 관절막내 PGE2 함량의 변화
골관절염 대조군(OA control)은 모의처치 대조군(Sham control) 대비 대퇴골 및 경골 관절연골과 관절막내 PGE2 함량이 유의성 있게 (p<0.01) 증가하는 것으로 나타났으며, JMSwB 그룹을 포함한 모든 실험물질 처리군은 골관절염 대조군(OA control)에 비해 대퇴골 및 경골 관절연 골과 관절막내 PGE2 함량의 유의성 있게 감소하는 것으로 나타났다. 특히, D2+JMSwB 그룹의 경우 D2 및 JMSwB 그룹에 비하여 대퇴골 및 경골 관절연골과 관절막내 PGE2 함량이 유의성 있게 감소하는 것으로 나타났으며, D1+JMSwB 그룹의 경우 D2 그룹과 유사한 정도의 대퇴골 및 경골 관절연골과 관절막내 PGE2 함량의 감소를 보여주었다(하기 표 7 참조).
대퇴골 관절연골내 PGE2 함량은 골관절염 대조군(OA control)의 경우 모의처치 대조군(Sham control)에 비해 206.88%의 변화를 나타내었으나, 실험물질을 처리한 D2, JMSwB, D1+JMSwB 및 D2+JMSwB 그룹에서는 골관절염 대조군(OA control)에 비해 각각 -43.99, -25.66, -46.59 및 -60.75%의 변화를 나타내었다.
경골 관절연골내 PGE2 함량은 골관절염 대조군(OA control)의 경우 모의처치 대조군(Sham control)에 비해 227.14%의 변화를 나타내었으나, 실험물질을 처리한 D2, JMSwB, D1+JMSwB 및 D2+JMSwB 그룹에서는 골관절염 대조군(OA control)에 비해 각각 -39.69, -24.50, -42.55 및 -58.64%의 변화를 나타내었다.
관절막내 PGE2 함량은 골관절염 대조군(OA control)의 경우 모의처치 대조군(Sham control)에 비해 376.54%의 변화를 나타내었으나, 실험물질을 처리한 D2, JMSwB, D1+JMSwB 및 D2+JMSwB 그룹에서는 골관절염 대조군(OA control)에 비해 각각 -49.27, -23.49, -52.13 및 -65.37%의 변화를 나타내었다.
그룹별 대퇴골 및 경골 관절연골과 관절막내 PGE2 함량
항목
그룹		 PGE2 levels
대퇴골 관절연골 경골 관절연골 관절막내
Sham control 41.64±10.85 32.80±10.34 33.23±10.67
OA control 127.77±24.94a 107.30±20.38a 158.36±29.05f
D2 71.56±12.74ab 64.71±11.04ab 80.33±11.30fg
JMSwB 94.98±11.25abc 81.00±10.01abd 121.15±16.38fgh
D1+JMSwB 68.24±10.72abe 61.65±12.56abe 75.81±14.63fgi
D2+JMSwB 50.15±12.53bce 44.38±8.87bce 54.84±11.63fghi
Values are expressed mean ±SD of eight rats, pg/ml
a p<0.01 as compared with sham control by LSD test
b p<0.01 as compared with OA control by LSD test
c p<0.01 and dp<0.05 as compared with D2 by LSD test
e p<0.01 as compared with JMSwB by LSD test
f p<0.01 as compared with sham control by MW test
g p<0.01 as compared with OA control by MW test
h p<0.01 as compared with D2 by MW test
i p<0.01 as compared with JMSwB by MW test
(8) 대퇴골 및 경골 관절연골과 관절막내 5-LPO 활성의 변화
골관절염 대조군(OA control)은 모의처치 대조군(Sham control) 대비 대퇴골 및 경골 관절연골과 관절막내 5-LPO 활성이 유의성 있게 (p<0.01) 증가하는 것으로 나타났으나, D1+JMSwB 그룹을 포함한 모든 실험물질 처리군에서는 골관절염 대조군(OA control)에 비해 대퇴골 및 경골 관절연골과 관절막내 5-LPO 활성이 유의성 있게 감소하는 것으로 나타났다. 특히, D2+JMSwB 그룹의 경우 D2 및 JMSwB 그룹에 비하여 대퇴골 및 경골 관절연골과 관절막내 5-LPO 활성이 유의서 있게 감소하는 것을 확인할 수 있었으며, D1+JMSwB 그룹의 경우 D2 그룹과 유사한 정도의 5-LPO 활성 감소를 보여주었다 (하기 표 8 참조).
대퇴골 관절연골내 5-LPO 활성은 골관절염 대조군(OA control)의 경우 모의처치 대조군(Sham control)에 비해 3243.99%의 변화를 나타내었으나, 실험물질을 처리한 D2, JMSwB, D1+JMSwB 및 D2+JMSwB 그룹에서는 골관절염 대조군(OA control)에 비해 각각 -84.73, -65.50, -86.00 및 -92.47%의 변화를 나타내었다.
경골 관절연골내 5-LPO 활성은 골관절염 대조군(OA control)의 경우 모의처치 대조군(Sham control)에 비해 4234.67%의 변화를 나타내었으나, 실험물질을 처리한 D2, JMSwB, D1+JMSwB 및 D2+JMSwB 그룹에서는 골관절염 대조군(OA control)에 비해 각각 -75.02, -58.37, -76.65 및 -87.99%의 변화를 나타내었다.
관절막내 5-LPO 활성은 골관절염 대조군(OA control)의 경우 모의처치 대조군(Sham control)에 비해 4626.21%의 변화를 나타내었으나, 실험물질을 처리한 D2, JMSwB, D1+JMSwB 및 D2+JMSwB 그룹에서는 골관절염 대조군(OA control)에 비해 각각 -67.28, -42.69, -67.81 및 -82.85%의 변화를 나타내었다.
그룹별 대퇴골 및 경골 관절연골과 관절막내 5-LPO 활성의 변화
항목
그룹		 5-LPO activity
대퇴골 관절연골 경골 관절연골 관절막내
Sham control 0.16±0.08 0.09±0.06 0.26±0.13
OA control 5.49±1.54a 4.05±1.30a 12.17±2.60a
D2 0.84±0.26ab 1.01±0.41ab 3.98±1.18ab
JMSwB 1.90±0.65abc 1.69±0.40abc 6.98±1.42abc
D1+JMSwB 0.77±0.16abd 0.95±0.38abd 3.92±1.40abd
D2+JMSwB 0.41±0.12abcd 0.49±0.14abcd 2.09±0.85abcd
Values are expressed mean ±SD of eight rats, μM/min/ml
a p<0.01 as compared with sham control by MW test
b p<0.01 as compared with OA control by MW test
c p<0.01 as compared with D2 by MW test
d p<0.01 as compared with JMSwB by MW test
(9) 대퇴골 및 경골 관절연골과 관절막내 MMP-2 및 MMP-9 활성의 변화
골관절염 대조군(OA control)은 모의처치 대조군(Sham control)에 비해 대퇴골 및 경골 관절연골과 관절막내 MMP-2 및 MMP-9 활성이 유의성 있게 (p<0.01) 증가하는 것으로 나타났으며, D2+JMSwB 그룹을 포함한 모든 실험물질 처리군에서는 골관절염 대조군(OA control)에 비해 대퇴골 및 경골 관절연골과 관절막내 MMP-2 및 MMP-9활성이 유의성 있게 감소하는 것으로 나타났다. 특히, D2+JMSwB 그룹의 경우 D2 및 JMSwB 그룹에 비하여 대퇴골 및 경골 관절연골과 관절막내 MMP-2 및 MMP-9 활성이 유의성 있게 감소하는 것을 확인하였으며, D1+JMSwB 그룹의 경우 D2 그룹과 유사한 정도의 MMP-2 및 MMP-9 활성의 감소를 보여주었다(하기 표 9 및 표 10 참조).
대퇴골 관절연골내 MMP-2 활성은 골관절염 대조군(OA control)의 경우 모의처치 대조군(Sham control)에 비해 538.10%의 변화를 나타내었으나, 실험물질을 처리한 D2, JMSwB, D1+JMSwB 및 D2+JMSwB 그룹에서는 골관절염 대조군(OA control)에 비해 각각 -55.83, -41.58, -57.52 및 -72.09%의 변화를 나타내었다.
경골 관절연골내 MMP-2 활성은 골관절염 대조군(OA control)의 경우 모의처치 대조군(Sham control)에 비해 501.41%의 변화를 나타내었으나, 실험물질을 처리한 D2, JMSwB, D1+JMSwB 및 D2+JMSwB 그룹에서는 골관절염 대조군(OA control)에 비해 각각 -48.24, -28.43, -51.65 및 -67.13%의 변화를 나타내었다.
관절막내 MMP-2 활성은 골관절염 대조군(OA control)의 경우 모의처치 대조군(Sham control)에 비해 569.45%의 변화를 나타내었으나, 실험물질을 처리한 D2, JMSwB, D1+JMSwB 및 D2+JMSwB 그룹에서는 골관절염 대조군(OA control)에 비해 각각 -49.59, -30.02, -53.31 및 -70.25%의 변화를 나타내었다.
대퇴골 관절연골내 MMP-9 활성은 골관절염 대조군(OA control)의 경우 모의처치 대조군(Sham control)에 비해 455.29%의 변화를 나타내었으나, 실험물질을 처리한 D2, JMSwB, D1+JMSwB 및 D2+JMSwB 그룹에서는 골관절염 대조군(OA control)에 비해 각각 -52.69, -45.28, -57.46 및 -70.49%의 변화를 나타내었다.
경골 관절연골내 MMP-9 활성은 골관절염 대조군(OA control)의 경우 모의처치 대조군(Sham control)에 비해 360.35%의 변화를 나타내었으나, 실험물질을 처리한 D2 , JMSwB, D1+JMSwB 및 D2+JMSwB 그룹에서는 골관절염 대조군(OA control)에 비해 각각 -45.79, -26.72, -50.42 및 -62.59%의 변화를 나타내었다.
관절막내 MMP-9 활성은 골관절염 대조군(OA control)의 경우 모의처치 대조군(Sham control)에 비해 540.06%의 변화를 나타내었으나, 실험물질을 처리한 D2, JMSwB, D1+JMSwB 및 D2+JMSwB 그룹에서는 골관절염 대조군(OA control)에 비해 각각 -48.21, -36.93, -49.58 및 -66.34%의 변화를 나타내었다.
그룹별 대퇴골 및 경골 관절연골과 관절막내 MMP-2 활성의 변화
항목
그룹		 MMP-2 activity
대퇴골 관절연골 경골 관절연골 관절막내
Sham control 1.10±0.33 0.97±0.19 0.88±0.27
OA control 7.04±1.37f 5.86±1.18a 5.92±0.92f
D2 3.11±0.45fg 3.03±0.51ac 2.98±0.23fg
JMSwB 4.11±0.98fgi 4.19±0.81acd 4.14±0.95fgh
D1+JMSwB 2.99±0.85fgk 2.83±0.77ace 2.76±0.49fgk
D2+JMSwB 1.96±0.49fghj 1.93±0.38bcde 1.76±0.26fghj
Values are expressed mean ±SD of eight rats, μg/ml
a p<0.01 and bp<0.05 as compared with sham control by LSD test
c p<0.01 as compared with OA control by LSD test
d p<0.01 as compared with D2 by LSD test
e p<0.01 as compared with JMSwB by LSD test
f p<0.01 as compared with sham control by MW test
g p<0.01 as compared with OA control by MW test
h p<0.01 and ip<0.05 as compared with D2 by MW test
j p<0.01 and kp<0.05 as compared with JMSwB by MW test
그룹별 대퇴골 및 경골 관절연골과 관절막내 MMP-9 활성의 변화
항목
그룹		 MMP-9 activity
대퇴골 관절연골 경골 관절연골 관절막내
Sham control 1.06±0.34 1.08±0.45 0.79±0.29
OA control 5.90±1.30e 4.95±0.70a 5.03±1.19e
D2 2.79±0.42ef 2.68±0.50ab 2.61±0.41ef
JMSwB 3.23±0.52ef 3.63±0.59abc 3.17±0.47efh
D1+JMSwB 2.51±0.33efhi 2.45±0.54abd 2.54±0.42efj
D2+JMSwB 1.74±0.25efgi 1.85±0.44abcd 1.69±0.28efgi
Values are expressed mean ±SD of eight rats, μg/ml
a p<0.01 as compared with sham control by LSD test
b p<0.01 as compared with OA control by LSD test
c p<0.01 as compared with D2 by LSD test
d p<0.01 as compared with JMSwB by LSD test
e p<0.01 as compared with sham control by MW test
f p<0.01 as compared with OA control by MW test
g p<0.01 and h p<0.05 as compared with D2 by MW test
i p<0.01 and j p<0.05 as compared with JMSwB by MW test
(10) 대퇴골 및 경골 관절연골과 관절막내 연골세포외 기질의 구성성분인 콜라겐 타입 Ⅱ, SOX9 및 아그레칸 mRNA 발현의 변화
10-1. 콜라겐 타입 II mRNA 발현의 변화
골관절염 대조군(OA control)에서는 모의처치 대조군(Sham control)에 비해 대퇴골 및 경골 관절연골내에서 콜라겐 타입 Ⅱ mRNA 발현이 유의성 있게 (p<0.01) 감소되는 것으로 나타났으며, 반면에 관절막내에서 콜라겐 타입 Ⅱ mRNA 발현은 유의성 있게 증가하는 것으로 나타났다. 한편, D2 그룹을 포함한 모든 실험물질 처리군에서는 골관절염 대조군(OA control)에 비해 대퇴골 및 경골 관절연골내 콜라겐 타입 Ⅱ mRNA 발현이 유의성 있게 (p<0.01또는 p<0.05) 증대되며, 관절막내 콜라겐 타입 Ⅱ mRNA 발현은 감소하는 것으로 나타났다. 특히, D2+JMSwB 그룹의 경우 D2 및 JMSwB 그룹에 비하여 대퇴골 및 경골 관절연골내 콜라겐 타입 Ⅱ mRNA 발현이 유의성 있게 (p<0.01 또는 p<0.05) 증대되며 관절막내 콜라겐 타입 Ⅱ mRNA 발현 또한 유의성 있게 감소하는 것을 확인할 수 있었다. D1+JMSwB 그룹의 경우 D2와 유사한 정도의 콜라겐 타입 ⅡmRNA 발현의 변화를 보여주었다(하기 표 11 참조).
대퇴골 관절연골내 콜라겐 타입 Ⅱ mRNA 발현은 골관절염 대조군(OA control)의 경우 모의처치 대조군(Sham control)에 비해 -75.69%의 변화를 나타내었으나, 실험물질을 처리한 D2, JMSwB, D1+JMSwB 및 D2+JMSwB 그룹에서는 골관절염 대조군(OA control)에 비해 각각 89.69, 53.09, 101.55 및 140.21%의 변화를 나타내었다.
경골 관절연골내 콜라겐 타입 Ⅱ mRNA 발현은 골관절염 대조군(OA control)의 경우 모의처치 대조군(Sham control)에 비해 -80.54%의 변화를 나타내었으나, 실험물질을 처리한 D2, JMSwB, D1+JMSwB 및 D2+JMSwB 그룹에서는 골관절염 대조군(OA control)에 비해 각각 127.67, 49.69, 135.85 및 198.11%의 변화를 나타내었다.
관절막내 콜라겐 타입 Ⅱ mRNA 발현은 골관절염 대조군(OA control)의 경우 모의처치 대조군(Sham control)에 비해 775.43%의 변화를 나타내었으나, 실험물질을 처리한 D2, JMSwB, D1+JMSwB 및 D2+JMSwB 그룹에서는 OA 대조군에 비해 각각 -51.59, -36.21, -54.17 및 -65.26%의 변화를 나타내었다.
그룹별 대퇴골 및 경골 관절연골과 관절막내 콜라겐 타입 II mRNA 발현
항목
그룹		 Collagen type II mRNA expressions
대퇴골 관절연골 경골 관절연골 관절막내
Sham control 1.00±0.13 1.02±0.15 0.94±0.13
OA control 0.24±0.08a 0.20±0.03a 8.24±1.36g
D2 0.46±0.06ab 0.45±0.05ab 3.99±0.62gh
JMSwB 0.37±0.07ab 0.30±0.03acd 5.26±0.81ghi
D1+JMSwB 0.49±0.09abf 0.47±0.08abe 3.78±1.07ghk
D2+JMSwB 0.58±0.08abde 0.59±0.10abde 2.86±0.75ghij
Values are expressed mean ±SD of eight rats, Relative to control/β-actin
a p<0.01 as compared with sham control by LSD test
b p<0.01 and c p<0.05 as compared with OA control by LSD test
d p<0.01 as compared with D2 by LSD test
e p<0.01 and f p<0.05 as compared with JMSwB by LSD test
g p<0.01 as compared with sham control by MW test
h p<0.01 as compared with OA control by MW test
i p<0.05 as compared with D2 by MW test
j p<0.01 and k p<0.05 as compared with JMSwB by MW test
10-2. SOX9 mRNA 발현의 변화
골관절염 대조군(OA control)은 모의처치 대조군(Sham control)에 비해 대퇴골 및 경골 관절연골과 관절막내 SOX9 mRNA 발현이 유의성 있게 (p<0.01) 감소하는 것으로 나타났으나, JMSwB 그룹을 포함한 모든 실험물질 처리군에서는 골관절염 대조군(OA control)에 비해 대퇴골 및 경골 관절연골과 관절막내 SOX9 mRNA 발현이 유의성 있게 (p<0.01또는 p<0.05) 증가하는 것으로 나타났다. 특히, D2+JMSwB 그룹의 경우 D2 및 JMSwB 그룹에 비하여 대퇴골 및 경골 관절연골과 관절막내 SOX9 mRNA 발현이 유의성 있게 (p<0.01 또는 p<0.05) 증가하는 것을 확인하였으며, D1+JMSwB 그룹의 경우 D2와 유사한 정도의 SOX9 mRNA 발현의 변화를 보여주었다(표 12 참조).
대퇴골 관절연골내 SOX9 mRNA 발현은 골관절염 대조군(OA control)의 경우 모의처치 대조군(Sham control)에 비해 -85.84%의 변화를 나타내었으나, 실험물질을 처리한 D2, JMSwB, D1+JMSwB 및 D2+JMSwB 그룹에서는 골관절염 대조군(OA control)에 비해 각각 150.00, 74.14, 181.03 및 296.55%의 변화를 나타내었다.
경골 관절연골내 SOX9 mRNA 발현은 골관절염 대조군(OA control)의 경우 모의처치 대조군(Sham control)에 비해 -85.92%의 변화를 나타내었으나, 실험물질을 처리한 D2, JMSwB, D1+JMSwB 및 D2+JMSwB 그룹에서는 골관절염 대조군(OA control)에 비해 각각 148.15, 59.26, 187.96 및 269.44%의 변화를 나타내었다.
관절막내 SOX9 mRNA 발현은 골관절염 대조군(OA control)의 경우 모의처치 대조군(Sham control)에 비해 -89.19%의 변화를 나타내었으나, 실험물질을 처리한 D2, JMSwB, D1+JMSwB 및 D2+JMSwB 그룹에서는 골관절염 대조군(OA control)에 비해 각각 187.73, 101.14, 222.73 및 409.09%의 변화를 나타내었다.
그룹별 대퇴골 및 경골 관절연골과 관절막내 SOX9 mRNA 발현
항목
그룹		 SOX9 mRNA expressions
대퇴골 관절연골 경골 관절연골 관절막내
Sham control 1.02±0.19 0.96±0.13 1.02±0.11
OA control 0.15±0.05f 0.14±0.04f 0.11±0.05a
D2 0.36±0.11fg 0.34±0.07fg 0.32±0.06ab
JMSwB 0.25±0.07fhj 0.22±0.05fgi 0.22±0.06abd
D1+JMSwB 0.41±0.10fgk 0.39±0.13fgk 0.36±0.06abe
D2+JMSwB 0.58±0.15fgik 0.50±0.07fgik 0.56±0.09abce
Values are expressed mean ±SD of eight rats, Relative to control/β-actin
a p<0.01 as compared with sham control by LSD test
b p<0.01 as compared with OA control by LSD test
c p<0.01 and d p<0.05 as compared with D2 by LSD test
e p<0.01 as compared with JMSwB by LSD test
f p<0.01 as compared with sham control by MW test
g p<0.01 and h p<0.05 as compared with OA control by MW test
i p<0.01 and j p<0.05 as compared with D2 by MW test
k p<0.01 as compared with JMSwB by MW test
10-3. 아그레칸(aggrecan) mRNA 발현의 변화
골관절염 대조군(OA control)은 모의처치 대조군(Sham control)에 비해 대퇴골 및 경골 관절연골과 관절막내 aggrecan mRNA 발현이 유의성 있게 (p<0.01) 감소하는 것으로 나타났으나, D1+JMSwB 그룹을 포함한 모든 실험물질 처리군에서는 골관절염 대조군(OA control)에 비해 대퇴골 및 경골 관절연골과 관절막내 aggrecan mRNA 발현이 유의성 있게 증가하는 것으로 나타났다. 특히, D2+JMSwB 그룹의 경우 D2 및 JMSwB 그룹에 비하여 대퇴골 및 경골 관절연골과 관절막내 aggrecan mRNA 발현이 유의성 있게 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, D1+JMSwB 그룹의 경우 D2 그룹과 유사한 정도의 aggrecan mRNA 발현의 변화를 보여주었다(하기 표 13 참조).
대퇴골 관절연골내 aggrecan mRNA 발현은 골관절염 대조군(OA control)의 경우 모의처치 대조군(Sham control)에 비해 -89.01%의 변화를 나타내었으나, 실험물질을 처리한 D2, JMSwB, D1+JMSwB 및 D2+JMSwB 그룹에서는 골관절염 대조군(OA control)에 비해 각각 214.29, 102.29, 221.14 및 322.86%의 변화를 나타내었다.
경골 관절연골내 aggrecan mRNA 발현은 골관절염 대조군(OA control)의 경우 모의처치 대조군(Sham control)에 비해 -89.51%의 변화를 나타내었으나, 실험물질을 처리한 D2, JMSwB, D1+JMSwB 및 D2+JMSwB 그룹에서는 골관절염 대조군(OA control)에 비해 각각 170.93, 88.37, 196.51 및 389.53%의 변화를 나타내었다.
관절막내 aggrecan mRNA 발현은 골관절염 대조군(OA control)의 경우 모의처치 대조군(Sham control)에 비해 -88.21%의 변화를 나타내었으나, 실험물질을 처리한 D2, JMSwB, D1+JMSwB 및 D2+JMSwB 그룹에서는 골관절염 대조군(OA control)에 비해 각각 169.47, 93.68, 193.68 및 314.74%의 변화를 나타내었다.
그룹별 대퇴골 및 경골 관절연골과 관절막내 aggrecan mRNA 발현
항목
그룹		 Aggrecan mRNA expressions
대퇴골 관절연골 경골 관절연골 관절막내
Sham control 1.00±0.11 1.03±0.23 1.01±0.12
OA control 0.11±0.06a 0.11±0.06f 0.12±0.05a
D2 0.34±0.08ab 0.29±0.06fg 0.32±0.09ab
JMSwB 0.22±0.05abc 0.20±0.05fgh 0.23±0.06abd
D1+JMSwB 0.35±0.09abe 0.32±0.07fgi 0.35±0.06abe
D2+JMSwB 0.46±0.07abce 0.53±0.10fghi 0.49±0.08abce
Values are expressed mean ±SD of eight rats, Relative to control/β-actin
a p<0.01 as compared with sham control by LSD test
b p<0.01 as compared with OA control by LSD test
c p<0.01 and d p<0.05 as compared with D2 by LSD test
e p<0.01 as compared with JMSwB by LSD test
f p<0.01 as compared with sham control by MW test
g p<0.01 as compared with OA control by MW test
h p<0.01 as compared with D2 by MW test
i p<0.01 as compared with JMSwB by MW test
(11) 대퇴골 및 경골 관절연골과 관절막내 세포 증식성의 변화 - BrdU 면역반응세포의 변화
골관절염 대조군(OA control)은 모의처치 대조군(Sham control)에 비해 대퇴골 및 경골 관절연골내 BrdU 면역반응세포수의 경우 유의성 있게 (p<0.01) 감소하였으며, 관절막내 BrdU 면역반응세포수는 유의성 있게 증대되는 것으로 나타났다. 한편, D2 그룹에서는 골관절염 대조군(OA control)과 유사한 패턴의 BrdU 면역반응 세포의 수적 변화를 보여주었다. 반면에, D2 그룹을 제외한 모든 실험물질 처리군에서는 골관절염 대조군(OA control)에 비해 대퇴골 및 경골 관절연골내 BrdU 면역반응세포의 수적 증가와 관절막내 BrdU 면역반응세포의 감소가 유의미한 수치로 나타났다. 특히, D2+JMSwB의 경우 D2 및 JMSwB 그룹에 비하여 대퇴골 및 경골 관절연골내 BrdU 면역반응세포의 증가와 관절막내 BrdU 면역반응세포의 수적 감소가 유의미한 수치로 나타났으며, D1+JMSwB 그룹의 경우 D2 그룹과 유사한 관절막내 BrdU 면역반응세포의 수적 감소를 보여주었다(하기 표 14 및 도 10참조).
대퇴골 관절연골내 BrdU 면역반응세포의 수는 골관절염 대조군(OA control)의 경우 모의처치 대조군(Sham control)에 비해 -67.87%의 변화를 나타내었으나, 실험물질을 처리한 D2, JMSwB, D1+JMSwB 및 D2+JMSwB 그룹에서는 골관절염 대조군(OA control)에 비해 각각 4.26, 77.20, 134.04 및 248.02%의 변화를 나타내었다.
경골 관절연골내 BrdU 면역반응세포의 수는 골관절염 대조군(OA control)의 경우 모의처치 대조군(Sham control)에 비해 -67.28%의 변화를 나타내었으나, 실험물질을 처리한 D2, JMSwB, D1+JMSwB 및 D2+JMSwB 그룹에서는 골관절염 대조군(OA control)에 비해 각각 5.20, 100.40, 167.20 및 268.80%의 변화를 나타내었다.
관절막내 BrdU 면역반응세포의 수는 골관절염 대조군(OA control)의 경우 모의처치 대조군(Sham control)에 비해 989.00%의 변화를 나타내었으나, 실험물질을 처리한 D2, JMSwB, D1+JMSwB 및 D2+JMSwB 그룹에서는 골관절염 대조군(OA control)에 비해 각각 -61.92, -34.86, -67.14 및 -81.06%의 변화를 나타내었다.
그룹별 대퇴골 및 경골 관절연골과 관절막내 BrdU 면역반응세포수
항목
그룹		 BrdU-immunoreactive cell numbers
대퇴골 관절연골 경골 관절연골 관절막내
Sham control 128.00±32.60 95.50±29.75 84.13±25.59
OA control 41.13±12.09g 31.25±11.60a 916.13±178.22g
D2 42.88±10.40g 32.88±11.63a 348.88±147.46gi
JMSwB 72.88±11.03gij 62.63±14.45acd 596.75±119.94gik
D1+JMSwB 96.25±15.56hijl 83.50±12.67cdf 301.00±73.78gil
D2+JMSwB 143.13±12.93ijl 115.25±19.83bcde 173.50±26.71gijl
Values are expressed mean ±SD of eight rats, Relative to control/β-actin
a p<0.01 as compared with sham control by LSD test
b p<0.01 as compared with OA control by LSD test
c p<0.01 and d p<0.05 as compared with D2 by LSD test
e p<0.01 as compared with JMSwB by LSD test
f p<0.01 as compared with sham control by MW test
g p<0.01 as compared with OA control by MW test
h p<0.01 as compared with D2 by MW test
i p<0.01 as compared with JMSwB by MW test
(12) 대퇴골 및 경골 관절연골 Mankin score의 변화
골관절염 대조군(OA control)은 모의처치 대조군(Sham control)에 비해 현저한 관절연골 표면 손상, 연골세포 감소, 증식성 clone 형성 및 Safranin O 염색성의 감소를 나타내어, 유의성 있는 (p<0.01) 대퇴골 및 경골 관절연골의 Mankin score의 증가를 나타내었다. 반면에, D2+JMSwB 그룹을 포함한 모든 실험물질 처리군은 골관절염 대조군(OA control)에 비해 대퇴골 및 경골 관절연골의 Mankin score가 유의성 있게 (p<0.01) 감소되는 것으로 나타났다. 특히, D2+JMSwB 그룹의 경우 D2 및 JMSwB 그룹에 비하여 대퇴골 및 경골 관절연골의 Mankin score가 유의성 있게 감소하는 것을 확인할 수 있었으며 , D1+JMSwB 그룹의 경우 D2와 유사한 정도의 Mankin score의 감소를 보여주었다(하기 표 15, 16 및 도 11 참조)
대퇴골 관절연골 Mankin score는 골관절염 대조군(OA control)의 경우 모의처치 대조군(Sham control)에 비해 521.43%의 변화를 나타내었으나, 실험물질을 처리한 D2, JMSwB, D1+JMSwB 및 D2+JMSwB 그룹에서는 골관절염 대조군(OA control)에 비해 각각 -37.93, -20.69, -41.38 및 -60.92%의 변화를 나타내었다.
경골 관절연골 Mankin score는 골관절염 대조군(OA control)의 경우 모의처치 대조군(Sham control)에 비해 553.85%의 변화를 나타내었으나, 실험물질을 처리한 D2, JMSwB, D1+JMSwB 및 D2+JMSwB 그룹에서는 골관절염 대조군 그룹에 비해 각각 -38.82, -20.00, -40.00 및 -58.82%의 변화를 나타내었다.
그룹별 대퇴골 관절연골의 Mankin score
항목
그룹		 Mankin scores
Surface Cellularity Clone Stain intensity Total*
Sham control 0.38±0.52 0.50±0.76 0.13±0.35 0.75±0.71 1.75±1.39
OA control 2.75±0.46a 2.75±0.46a 2.63±0.52a 2.75±0.46a 10.88±1.39a
D2 1.88±0.64ab 1.63±0.52ab 1.63±0.52ab 1.63±0.52ab 6.75±1.58ab
JMSwB 2.25±0.46a 2.00±0.53ab 2.13±0.64a 2.25±0.46a 8.63±1.19ab
D1+JMSwB 1.63±0.52abf 1.38±0.52abf 1.50±0.53abf 1.88±0.35ab 6.38±1.41abe
D2+JMSwB 1.25±0.46abde 1.25±0.46abe 0.88±0.64abce 0.88±0.64bce 4.25±1.16abce
Values are expressed mean ±SD of eight rats, score (*Max of totalized scores = 12)
a p<0.01 as compared with sham control by LSD test
b p<0.01 as compared with OA control by LSD test
c p<0.01 and d p<0.05 as compared with D2 by LSD test
e p<0.01 and f p<0.05 as compared with JMSwB by LSD test
그룹별 경골 관절연골의 Mankin score
항목
그룹		 Mankin scores
Surface Cellularity Clone Stain intensity Total*
Sham control 0.50±0.53 0.38±0.52 0.13±0.35 0.63±0.52 1.63±1.41
OA control 2.75±0.46a 2.50±0.53h 2.75±0.46a 2.63±0.52a 10.63±1.30a
D2 1.63±0.52ab 1.63±0.52hk 1.50±0.53ab 1.75±0.46ab 6.50±1.51ab
JMSwB 2.38±0.52a 2.13±0.35h 2.25±0.46ac 1.75±0.46ab 8.50±1.07ab
D1+JMSwB 1.75±0.71abg 1.38±0.52hjm 1.75±0.46abg 1.50±0.53ab 6.38±1.41abf
D2+JMSwB 1.50±0.53abf 1.25±0.46ijl 0.88±0.64abef 0.75±0.46bdf 4.38±1.30abdf
Values are expressed mean ±SD of eight rats, score (*Max of totalized scores = 12)
a p<0.01 as compared with sham control by LSD test
b p<0.01 and c p<0.05 as compared with OA control by LSD test
d p<0.01 and e p<0.05 as compared with D2 by LSD test
f p<0.01 and g p<0.05 as compared with JMSwB by LSD test
h p<0.01 and i p<0.05 as compared with sham control by MW test
j p<0.01 and k p<0.05as compared with OA control by MW test
l p<0.01 and m p<0.05 as compared with JMSwB by MW test
(13) 대퇴골 및 경골 관절연골과 관절막의 일반조직학적 변화
13-1. 대퇴골 관절연골 두께의 변화
골관절염 대조군(OA control)은 모의처치 대조군(Sham control)에 비해 대퇴골 관절연골 두께가 유의성 있게 (p<0.01) 감소하는 것으로 나타났으나, D2 그룹을 포함한 모든 실험물질 처리군은 골관절염 대조군(OA control)에 비해 대퇴골 관절연골 두께가 유의성 있게 증대되는 것으로 나타났다. 특히, D2+JMSwB 그룹의 경우 D2 및 JMSwB 그룹에 비하여 대퇴골 관절연골 두께가 유의서 있게 증대되는 것을 확인할 수 있었으며, D1+JMSwB 그룹의 경우 D2 그룹과 유사한 정도의 대퇴골 관절연골 두께의 증가를 보여주었다 (하기 표 17 및 도 11 참조).
대퇴골 관절연골 두께는 골관절염 대조군(OA control)의 경우 모의처치 대조군(Sham control)에 비해 -63.43%의 변화를 나타내었으나, 실험물질을 처리한 D2, JMSwB, D1+JMSwB 및 D2+JMSwB 구룹에서는 골관절염 대조군(OA control)에 비해 각각 80.57, 27.22, 93.57 및 113.04%의 변화를 나타내었다.
13-2. 경골 관절연골 두께의 변화
골관절염 대조군(OA control)은 모의처치 대조군(Sham control)에 비해 경골 관절연골 두께가 유의성 있게 (p<0.01) 감소하는 것으로 나타났으나, JMSwB 그룹을 포함한 모든 실험물질 처리군은 골관절염 대조군(OA control)에 비해 경골 관절연골 두께가 유의성 있게 증가되는 것으로 나타났다. 특히, D2+JMSwB 그룹의 경우 D2 및 JMSwB 그룹에 비하여 경골 관절연골 두께가 유의성 있게 증대되는 것을 확인할 수 있었으며, D1+JMSwB 그룹의 경우 D2 그룹과 유사한 정도의 경골 관절연골 두께 증가를 보여주었다(하기 표 17 및 도 11 참조).
경골 관절연골 두께는 골관절염 대조군(OA control)의 경우 모의처치 대조군(Sham control)에 비해 -80.30%의 변화를 나타내었으나, 실험물질을 처리한 D2, JMSwB, D1+JMSwB 및 D2+JMSwB 그룹에서는 골관절염 대조군(OA control)에 비해 각각 238.81, 195.68, 254.08 및 376.40%의 변화를 나타내었다.
13-3. 관절막 상피 두께의 변화
골관절염 대조군(OA control)은 모의처치 대조군(Sham control)에 비해 관절막 표면 상피 두께가 유의성 있게 (p<0.01) 증가하는 것으로 나타났으나, D1+JMSwB 그룹을 포함한 모든 실험물질 처리군은 골관절염 대조군(OA control)에 비해 관절막 표면 상피 두께가 유의서 있게 감소하는 것으로 나타났다. 특히, D2+JMSwB 그룹의 경우 D2 및 JMSwB 그룹에 비하여 관절막 표면 상피 두께가 유의서 있게 감소하는 것을 확인할 수 있었으며, D1+JMSwB 그룹의 경우 D2 그룹과 유사한 정도의 관절막 표면 상피 두께의 감소를 보여주었다 (하기 표 17 및 도 11 참조).
관절막 표면 상피 두께는 골관절염 대조군(OA control)의 경우 모의처치 대조군(Sham control)에 비해 240.20%의 변화를 나타내었으나, 실험물질을 처리한 D2, JMSwB, D1+JMSwB 및 D2+JMSwB 그룹에서는 골관절염 대조군(OA control)에 비해 각각 -26.83, -20.82, -28.20 및 -48.89%의 변화를 나타내었다.
13-4. 관절막내 침윤 염증세포의 수적 변화
골관절염 대조군(OA control)은 모의처치 대조군(Sham control)에 비해 관절막내 침윤 염증세포의 수가 유의성 있게 (p<0.01) 증가하는 것으로 나타났으나, D2+JMSwB 그룹을 포함한 모든 실험물질 처리군은 골관절염 대조군(OA control)에 비해 관절막내 침윤 염증세포 수가 유의서 있게 감소하는 것으로 나타났다. 특히, D2+JMSwB 그룹의 경우 D2 및 JMSwB 그룹에 비하여 관절막내 침윤 염증세포의 수가 유의성 있게 감소되는 것을 확인할 수 있었으며, D1+JMSwB 그룹의 경우 D2 그룹과 유사한 정도의 관절막내 침윤 염증세포의 수적 감소를 보여주었다(하기 표 16 및 도 11 참조).
관절막내 침윤 염증세포의 수는 골관절염 대조군(OA control)의 경우 모의처치 대조군(Sham control)에 비해 1501.13%의 변화를 나타내었으나, 실험물질을 처리한 D2, JMSwB, D1+JMSwB 및 D2+JMSwB 그룹에서는 골관절염 대조군(OA control)에 비해 각각 -56.45, -38.20, -64.38 및 -76.19%의 변화를 나타내었다.
그룹별 대퇴골 및 경골 관절연골과 관절막의 일반조직학적 분석 결과
항목
그룹		 General histomorphometry
대퇴골 관절연골 두께 (μm) 경골 관절연골
두께 (μm)		 관절막 상피 두께 (μm) 관절막내 침윤 염증세포의 수
(cells/mm2)
Sham control 423.08±90.58 398.91±44.58 11.47±2.25 33.25±10.12
OA control 154.71±31.81g 78.58±16.07a 39.02±6.06a 532.38±100.03a
D2 279.36±25.66gi 266.22±34.19ab 28.55±3.93ab 231.88±72.79ab
JMSwB 196.82±16.58gij 232.33±29.14abd 30.90±4.08ab 329.00±63.59abd
D1+JMSwB 299.47±35.26gik 278.22±25.86abf 28.02±3.05ab 189.63±68.32abe
D2+JMSwB 329.60±30.69hijk 374.33±19.88bce 19.95±4.00abce 126.75±31.80abce
Values are expressed mean ±SD of eight rats
a p<0.01 as compared with sham control by LSD test
b p<0.01 as compared with OA control by LSD test
c p<0.01 and d p<0.05 as compared with D2 by LSD test
e p<0.01 and f p<0.05 as compared with JMSwB by LSD test
g p<0.01 and h p<0.05 as compared with sham control by MW test
i p<0.01 as compared with OA control by MW test
j p<0.01 as compared with D2 by MW test
k p<0.01 as compared with JMSwB by MW test
(14) 대퇴골 및 경골 관절연골과 관절막내 PARP 면역반응세포의 수적 변화
골관절염 대조군(OA control)은 모의처치 대조군(Sham control)에 비해 대퇴골 및 경골 관절연골과 관절막내 PARP 면역반응세포 수가 유의성 있게 (p<0.01) 증가하는 것으로 나타났으며, D2+JMSwB 그룹을 포함하는 모든 실험물질 처리군은 골관절염 대조군(OA control)에 비해 대퇴골 및 경골 관절연골과 관절막내 PARP 면역반응세포의 수가 유의서 있게 감소하는 것으로 나타났다. 특히, D2+JMSwB 그룹의 경우 D2 및 JMSwB 그룹에 비하여 대퇴골 및 경골 관절연골과 관절막내 PARP 면역반응세포의 수가 유의성 있게 감소하는 것을 확인할 수 있었으며, D1+JMSwB 그룹의 경우 D2 그룹과 유사한 정도의 PARP 면역반응세포의 수적 감소를 보여주었다 (하기 표 18 및 도 12 참조).
대퇴골 관절연골내 PARP 면역반응세포의 수는 골관절염 대조군(OA control)의 경우 모의처치 대조군(Sham control)에 비해 542.74%의 변화를 나타내었으나, 실험물질을 처리한 D2, JMSwB, D1+JMSwB 및 D2+JMSwB 그룹에서는 골관절염 대조군(OA control)에 비해 각각 -63.62, -31.20, -65.00 및 -73.99%의 변화를 나타내었다.
경골 관절연골내 PARP 면역반응세포의 수는 골관절염 대조군(OA control)의 경우 모의처치 대조군(Sham control)에 비해 600.66%의 변화를 나타내었으나, 실험물질을 처리한 D2, JMSwB, D1+JMSwB 및 D2+JMSwB 그룹에서는 골관절염 대조군(OA control)에 비해 각각 -51.35, -34.56, -56.49 및 -68.46%의 변화를 나타내었다.
관절막내 PARP 면역반응세포의 수는 골관절염 대조군(OA control)의 경우 모의처치 대조군(Sham control)에 비해 1012.40%의 변화를 나타내었으나, 실험물질을 처리한 D2, JMSwB, D1+JMSwB 및 D2+JMSwB 그룹에서는 골관절염 대조군(OA control)에 비해 각각 -74.63, -56.01, -76.07 및 -86.73%의 변화를 나타내었다.
그룹별 대퇴골 및 경골 관절연골과 관절막의 PARP 면역반응세포의 수
항목
그룹		 PARP-immunolabeled cell numbers
대퇴골 관절연골 경골 관절연골 관절막내
Sham control 73.13±15.15 56.63±16.98 79.63±23.68
OA control 470.00±119.55a 396.75±107.50a 885.75±153.13a
D2 171.00±26.87ac 193.00±46.24ac 224.75±40.11ac
JMSwB 323.38±60.28acd 259.63±25.81acd 389.63±66.72acd
D1+JMSwB 164.50±25.07ace 172.63±36.11ace 212.00±57.62ace
D2+JMSwB 122.25±22.57bcde 125.13±24.64bcde 117.50±15.70bcde
Values are expressed mean ±SD of eight rats, cells/mm2
a p<0.01 and b p<0.05 as compared with sham control by MW test
c p<0.01 as compared with OA control by MW test
d p<0.01 as compared with D2 by MW test
e p<0.01 as compared with JMSwB by MW test
(15) 대퇴골 및 경골 관절연골과 관절막내 COX-2 면역반응세포의 수적 변화
골관절염 대조군(OA control)은 모의처치 대조군(Sham control)에 비해 대퇴골 및 경골 관절연골과 관절막내 COX-2 면역반응세포 수가 유의성 있게(p<0.01) 증가하는 것으로 나타났으나, D2 그룹을 포함한 모든 실험물질 처리군은 골관절염 대조군(OA control)에 비해 대퇴골 및 경골 관절연골과 관절막내 COX-2 면역반응세포의 수가 유의성 있게 감소하는 것으로 나타났다. 특히, D2+JMSwB 그룹의 경우 D2 및 JMSwB 그룹에 비하여 대퇴골 및 경골 관절연골과 관절막내 COX-2 면역반응세포의 수가 유의성 있게 감소되는 것을 확인할 수 있었으며, D1+JMSwB 그룹의 경우 D2 그룹과 유사한 정도의 COX-2 면역반응세포의 수적 감소를 보여주었다(하기 표 19 및 도 13 참조).
대퇴골 및 경골 관절연골내 COX-2 면역반응세포의 수는 골관절염 대조군(OA control)의 경우 모의처치 대조군(Sham control)에 비해 513.04 및 285.09%의 변화를 나타내었다. 반면에, 실험물질을 처리한 D2, JMSwB, D1+JMSwB 및 D2+JMSwB 그룹에서는 골관절염 대조군에 비해 각각 -59.85, -42.83, -62.97 및 -74.25%의 대퇴골 관절연골내 COX-2 면역반응세포의 수적 변화를 나타내었고, 각각 -49.26, -34.31, -51.90 및 -63.97%의 경골 관절연골내 COX-2 면역반응세포의 수적 변화를 나타내었다.
관절막내 COX-2 면역반응세포의 수는 골관절염 대조군(OA control)의 경우 모의처치 대조군(Sham control)에 비해 1622.27%의 변화를 나타내었으나, 실험물질을 처리한 D2, JMSwB, D1+JMSwB 및 D2+JMSwB 그룹에서는 골관절염 대조군에 비해 각각 -64.95, -47.74, -69.44 및 -75.51%의 변화를 나타내었다.
그룹별 대퇴골 및 경골 관절연골과 관절막의 COX-2 면역반응세포의 수
항목
그룹		 COX-2-immunostained cell numbers
대퇴골 관절연골 경골 관절연골 관절막내
Sham control 66.13±22.33 92.25±22.61 27.50±10.24
OA control 405.38±27.70a 355.25±105.96f 473.63±82.78f
D2 162.75±25.81ac 180.25±27.76fh 166.00±29.12fh
JMSwB 231.75±51.07acd 233.38±34.42fhi 247.50±32.44fhi
D1+JMSwB 150.13±37.33ace 170.88±31.55fhj 144.75±22.73fhj
D2+JMSwB 104.38±14.56bcde 128.00±26.23ghij 116.00±31.60fhij
Values are expressed mean ±SD of eight rats, cells/mm2
a p<0.01 and b p<0.05 as compared with sham control by LSD test
c p<0.01 as compared with OA control by LSD test
d p<0.01 as compared with D2 by LSD test
e p<0.01 as compared with JMSwB by LSD test
f p<0.01 and g p<0.05 as compared with sham control by MW test
h p<0.01 as compared with OA control by MW test
i p<0.01 as compared with D2 by MW test
j p<0.01 as compared with JMSwB by MW test
(16) 대퇴골 및 경골 관절연골과 관절막내 TNF-α 면역반응세포의 수적 변화
골관절염 대조군(OA control)은 모의처치 대조군(Sham control)에 비해 대퇴골 및 경골 관절연골과 관절막내 TNF-α 면역반응세포 수가 유의성 있게 (p<0.01) 증가되는 것으로 나타났으며, JMSwB 그룹을 포함한 모든 실험물질 처리군은 골관절염 대조군(OA control)에 비해 대퇴골 및 경골 관절연골과 관절막내 TNF-α 면역반응세포의 수가 유의성 있게 감소되는 것으로 나타났다. 특히, D2+JMSwB 그룹의 경우 D2 및 JMSwB 그룹에 비하여 대퇴골 및 경골 관절연골과 관절막내 TNF-α 면역반응세포의 수가 유의미하게 감소되는 것을 확인할 수 있었으며, D1+JMSwB 그룹의 경우 D2 그룹과 유사한 정도의 TNF-α 면역반응세포의 수적 감소를 보여주었다(표 20 및 도 14 참조).
대퇴골 및 경골 관절연골내 TNF-α 면역반응세포의 수는 골관절염 대조군(OA control)의 경우 모의처치 대조군(Sham control)에 비해 481.21 및 608.38%의 변화를 나타내었다. 반면에, 실험물질을 처리한 D2, JMSwB, D1+JMSwB 및 D2+JMSwB 그룹에서는 골관절염 대조군에 비해 각각 -59.61, -28.99, -62.28 및 -71.05%의 대퇴골 관절연골내 TNF-α 면역반응세포의 수적 변화를 나타내었고, 각각 -47.32, -29.81, -54.02 및 -66.21%의 경골 관절연골내 TNF-α 면역반응세포의 수적 변화를 나타내었다.
관절막내 TNF-α 면역반응세포의 수는 골관절염 대조군(OA control)의 경우 모의처치 대조군(Sham control)에 비해 3777.69%의 변화를 나타내었으나, 실험물질을 처리한 D2, JMSwB, D1+JMSwB 및 D2+JMSwB 그룹에서는 골관절염 대조군에 비해 각각 -66.18, -44.24, -69.65 및 -81.15%의 변화를 나타내었다.
그룹별 대퇴골 및 경골 관절연골과 관절막의 TNF-α 면역반응세포의 수
항목
그룹		 TNF-α-immunostained cell numbers
대퇴골 관절연골 경골 관절연골 관절막내
Sham control 57.88±15.10 44.75±13.98 16.25±3.11
OA control 336.38±82.76a 317.00±58.22a 630.13±132.35a
D2 135.88±21.49ab 167.00±29.80ab 213.13±44.14ab
JMSwB 238.88±24.97abc 222.50±44.62abd 351.38±100.53abc
D1+JMSwB 126.88±22.09abe 145.75±20.24abe 191.25±36.97abe
D2+JMSwB 97.38±16.43abce 107.13±15.58abce 118.75±22.58abce
Values are expressed mean ±SD of eight rats, cells/mm2
a p<0.01 as compared with sham control by MW test
b p<0.01 as compared with OA control by MW test
c p<0.01 and d p<0.05 as compared with D2 by MW test
e p<0.01 as compared with JMSwB by MW test
상기에서 자세히 살펴본 실험결과를 하기에서 정리하였다.
먼저, 본 실험에서 골관절염 유발 수술 27일 후, 체중이 일정한 실험동물만 선별하여 사용하였으며 (위수술군 평균 411.88±17.40 g, 388~433 g; OA 유발군 평균 409.13±15.11 g, 383~433 g), 모의처치 대조군(Sham control)에 비해 유의성 있는 체중 및 증체량의 변화는 골관절염 대조군(OA control)에서 인정되지 않았으며, 골관절염 대조군(OA control)에 비해 유의성 있는 체중 및 증체량의 변화는 D2 그룹을 포함한 모든 실험물질 처리군에서 인정되지 않았고, D1+JMSwB 그룹 및 D2+JMSwB 그룹에서도 D2 그룹 및 JMSwB 그룹과 비교하여 의미 있는 체중 및 증체량의 변화는 인정되지 않았다. 본 실험에 사용한 모든 랫트는 동일한 연령의 정상 랫트의 체중 증가 범주 [Fox et al., 1984; Tajima, 1989] 내에서 체중 증가를 각각 나타내었다.
골관절염은 대표적인 만성 염증성 질환으로, 골관절염시 염증반응의 일환으로 COX-2 및 5-LPO의 발현이 증가함에 따라, IL-1, TNF-α 등에 의해 영향을 받아 PGE2 및 류코트리엔(leukotriene)이 생산되고, 이에 따라 연골 손상과 함께 주위 관절의 부종에 의한 관절 두께의 현저한 증가와 함께 비정상적인 골 성장 및 통증을 나타내는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 실험에서는 골관절염 유발 수술 13일 후, 모의처치 대조군에 비해 현저한 관절 두께의 증가를 나타낸 실험동물 (위수술군 평균 10.96±0.15 mm, 10.76~11.17 mm; 골관절염 유발군 13.87 ±0.18 mm, 13.61~14.22 mm)만 선별하여 사용하였으며, 대퇴골 및 경골 관절연골의 두께 감소와 함께 COX-2 및 TNF-α 면역반응세포의 수적 증가가 인정되었고, 관절막내 염증세포의 침윤과 COX-2 및 TNF-α 면역반응세포의 증가 역시 인정되었다. 또한 이와 함께 대퇴골 및 경골 관절연골과 관절막내 PGE2 함량, 5-LPO 활성의 증가 역시 각각 인정되었다. 반면에, D2 그룹, JMSwB 그룹, D1+JMSwB 그룹 및 D2+ JMSwB 그룹에서 골관절염 관련 염증 반응의 증가가 유의성 있게 현저히 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 특히 D2+JMSwB 그룹의 경우 D2 및 JMSwB 그룹에 비하여 유의성 있는 염증 반응 감소 효과가 나타났으며, D1+JMSwB 그룹의 경우 D2 그룹과 유사한 정도의 염증 반응 감소 효과가 나타났다. 이러한 결과는 적어도 본 실험의 조건하에서 제주용암해수 입욕의 항염효과를 나타내는 직접적인 증거뿐만 아니라, 제주용암해수 입욕은 다이클로페낙 나트륨(diclofenac sodium)의 골관절염에 대한 항염 효과를 적어도 2배 이상 상승적으로 증가시키는 명확한 증거 중 하나로 판단된다.
골관절염시 관절 연골의 물리적 손상에 의해, 관절 국소 연골 소실 및 골증식체 형성이 인정되며, 이러한 관절연골의 손상은 육안 및 X-ray 이미지 상에서 쉽게 관찰된다 [Sakano et al., 2000; Kim et al., 2012b]. 따라서 X-ray 및 육안 연골 손상 면적의 감소는 골관절염에 대한 치료 및 예방 효과를 나타내는 직접적인 증거로 활용되고 있다 [Jiang et al., 2010; Kim et al., 2012a]. 또한 골밀도는 다양한 골 관련 질환에서 골의 질적 진단을 위해 사용되고 있으며 [Diez, 2002; Syed and Khan, 2002; Lee et al., 2008], 관절 표면의 국소 골밀도의 변화는 OA의 진행 정도를 파악하는 중요한 자료를 제공해 준다 [Karystinou et al., 2015; Tsouknidas et al., 2015]. 다양한 골질환에서 골 구조물의 파괴에 의한 골강도의 감소가 초래되며 [Horcajada-Molteni et al., 2000; Bilston et al., 2002], 골관절염 시에도 관절 표면 연골의 세포외 기질 파괴 및 세포의 손상에 의해 표면 연골에 대한 압착 강도의 감소가 초래될 것으로 생각된다. 본 실험의 결과, 골관절염 대조군(OA control)에서는 DEXA 이미지 상에서 현저한 관절 국소 연골 소실 및 골증식체 형성이 인정되었으며, 이로 인한 무릎 관절 전체, 대퇴골과 경골 관절면의 국소 골밀도의 감소가 초래되었으며, 대퇴골 및 경골 관절면의 압착 강도 역시 현저한 감소를 나타내었다. 반면에 D2 그룹, JMSwB 그룹, D1+JMSwB 그룹 및 D2+ JMSwB 그룹에서는 이러한 골관절염 관련 관절 국소 연골 소실 및 골증식체 형성과 이와 관련된 골밀도 및 표면 연골 압착 강도의 감소가 유의성 있게 현저히 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 특히 D2+JMSwB 그룹의 경우 D2 및 JMSwB 그룹에 비하여 슬관절 골밀도 및 압착강도가 유의성 있게 증가하는 것으로 나타났으며, D1+JMSwB 그룹의 경우 D2와 유사한 정도의 슬관절 골밀도 및 압착강도의 증가가 나타났다. 이러한 결과는 적어도 본 실험의 조건하에서 제주용암해수 입욕의 골관절염 개선 효과를 나타내는 확실한 증거뿐 만 아니라, 제주용암해수 입욕은 다이클로페낙 나트륨(diclofenac sodium)의 골관절염에 대한 개선 효과를 적어도 2배 이상 상승적으로 증가시키는 명확한 증거 중 하나로 판단된다.
염증성 관절에서 연골 및 골 파괴에 중요한 역할을 하는 것이 MMP같은 단백 분해 효소이며, MMP는 조직내의 길항 시스템에 의해 길항된다. 또한 MMP는 생체 내에서 세포외 기질 단백질(extracellular matrix protein)로 작용하고 골관절염에서는 PG의 분해와 관련이 있으므로 [Nagasa and Woessner, 1999], MMP 활성 조절이 관절염 치료에서 매우 중요한 것으로 알려져 있다 [Halliwell, 2000; Na et al., 2014]. 본 실험의 골관절염 대조군(OA control)에서 대퇴골 및 경골 관절연골과 관절막내 MMP-2 및 MMP-9 활성의 증가가 인정되는 반면, D2 그룹, JMSwB 그룹, D1+JMSwB 그룹 및 D2+ JMSwB 그룹의 경우 이러한 MMP-2 및 MMP-9 활성이 현저히 억제되는 것을 확인하였다. 특히, D2+JMSwB 그룹의 경우 D2 및 JMSwB 그룹에 비하여 대퇴골 및 경골 관절연골과 관절막내에서 MMP-2 및 MMP-9 활성이 유의성 있게 감소하는 것으로 나타났으며, D1+JMSwB 그룹의 경우 D2 그룹과 유사한 정도의 MMP-2 및 MMP-9 활성 감소 효과가 나타났다. 이러한 결과는 적어도 본 실험의 조건하에서 제주용암해수 입욕의 MMP 활성 억제에 의한 연골세포 보호 효과를 나타내는 직접적인 증거뿐만 아니라, 제주용암해수 입욕은 다이클로페낙 나트륨(diclofenac sodium)의 MMP 활성 억제에 의한 연골세포 보호 효과를 적어도 2배 이상 상승적으로 증가시키는 명확한 증거 중 하나로 판단된다.
골관절염시 만성염증에 의한 섬유화가 진행됨에 따라 유발된 관절의 운동성이 매우 제한 받게 된다. 따라서 관절의 최대 신장 각도는 이러한 운동성을 평가하는데 가장 기본적인 지표로 사용되고 있다. 신장 각도가 낮을수록 높은 운동성을 나타내게 된다. 본 실험의 결과 골관절염 대조군(OA control)의 경우, 모의처치 대조군(Sham control)에 비해 현저한 슬관절 최대 신장 각도의 증가가 인정되어, 수술적 골관절염이 비교적 잘 유발된 것으로 판단된다. 또한 섬유화에 의한 관절 stiffness 의 일환으로 관절막의 세포 증식에 의한 표면 상피의 비후와 증식이 이전의 보고들 [Permuy et al., 2015ab]과 유사하게 골관절염 대조군(OA control)에서 인정되었다. 반면에, D2 그룹, JMSwB 그룹, D1+JMSwB 그룹 및 D2+ JMSwB 그룹의 경우 이러한 골관절염에 의한 관절 신장 각도의 증가, 관절막 표면 상피의 조직학적 비후 소견이 유의성 있게 현저히 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 특히, D2+JMSwB 그룹의 경우 D2 및 JMSwB 그룹에 비하여 관절 신장 각도의 감소 및 관절막 상피 두께가 유의성 있게 감소하는 것으로 나타났으며, D1+JMSwB 그룹의 경우 D2 그룹과 유사한 정도의 관절 신장 각도 및 관절막 상피 두께 감소 효과가 나타났다. 이러한 결과는 적어도 본 실험의 조건하에서 제주용암해수 입욕의 골관절염에 의한 관절 stiffness 억제 효과를 나타내는 직접적인 증거뿐만 아니라, 제주용암해수 입욕은 다이클로페낙 나트륨(diclofenac sodium)의 관절 stiffness 억제 효과를 적어도 2배 이상 상승적으로 증가시키는 명확한 증거 중 하나로 판단된다.
Mankin score는 관절연골 표면 손상, 연골세포의 수, 증식성 clone 형성 정도 및 Safranin O 염색성을 기준으로 골관절염을 평가하는 가장 기본적인 조직병리학적 관찰로, 스코어가 높을수록 골관절염의 유발 정도가 높은 것으로 알려져 있다 [Armstrong et al., 1994; Rezende et al., 2006; Kim et al., 2012b; Kang et al., 2014a; Moon et al., 2014; Choi et al., 2015]. 또한 골관절염시 관절 연골 손상에 따른 현저한 관절 연골 두께의 감소가 수반된다 [Moore et al., 2005; Patel et al., 2005; Cao et al., 2006; Kim et al., 2012b; Kang et al., 2014a; Moon et al., 2014; Choi et al., 2015]. 본 실험의 결과, D2 그룹, JMSwB 그룹, D1+JMSwB 그룹 및 D2+ JMSwB 그룹에서 골관절염에 의한 경골 및 대퇴골 관절연골 Mankin score 의 증가 소견과 관절 연골 두께의 감소 소견이 현저히 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 특히 D2+JMSwB 그룹의 경우 D2 및 JMSwB 그룹에 비하여 대퇴골 및 경골 관절연골 두께가 유의성 있게 증가하며, Mankin score 또한 유의성 있게 감소하는 것으로 나타났다. 한편, D1+JMSwB 그룹의 경우 D2와 유사한 정도의 관절연골 두께 증가 및 Mankin score의 감소 효과가 나타났다. 이러한 결과는 적어도 본 실험의 조건하에서 제주용암해수 입욕의 관절 연골 보호 효과를 나타내는 직접적인 증거뿐만 아니라, 제주용암해수 입욕은 다이클로페낙 나트륨(diclofenac sodium)의 관절 연골 보호 효과를 적어도 2배 이상 상승적으로 증가시키는 명확한 증거 중 하나로 판단된다.
PARP(Poly ADP ribose polymerase)는 카스파아제-3의 주요 표적 분자로, DNA 수복을 촉진하는 것으로 알려져 있어 아폽토시스(apoptosis)의 마커로 이용되어 왔으며, 세포괴사(necrosis)에도 일부 관여하므로, 과도하게 증가된 아폽토시스의 발현 억제는 다양한 장기 손상에 대한 예방 목적으로 이용되고 있으며 [Cole and Perez-Polo, 2002], 연골세포의 아폽토시스 억제 역시 골관절염의 치료 표적으로 이용되고 있다 [Cheng et al., 2013; Xue et al., 2015]. 또한 외과적으로 유발된 골관절염 랫트의 관절 연골세포의 아폽토시스에 의한 손상 및 감소 역시 이미 잘 알려져 있다 [Kang et al., 2014a]. 본 실험의 결과에서도, 아폽토시스를 의미하는 PARP 면역반응세포의 수적 증가가 골관절염 대조군(OA control)의 대퇴골 및 경골 관절 연골과 관절막에서 각각 인정된 반면, D2 그룹, JMSwB 그룹, D1+JMSwB 그룹 및 D2+ JMSwB 그룹에서는 골관절염에 의한 경골 및 대퇴골 관절연골과 관절막내 PARP 면역반응세포의 수적 증가가 현저히 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 특히 D2+JMSwB 그룹의 경우 D2 및 JMSwB 그룹에 비하여 대퇴골 및 경골 관절연골과 관절막내 PARP 면역반응세포 수가 유의성 있게 감소하는 것으로 나타났으며, D1+JMSwB 그룹의 경우 D2와 유사한 정도의 PARP 면역반응세포의 수적 감소 효과가 나타났다. 이러한 결과는 적어도 본 실험의 조건하에서 제주용암해수 입욕의 아폽토시스 억제를 통한 관절 연골 보호 효과를 나타내는 직접적인 증거뿐만 아니라, 제주용암해수 입욕은 다이클로페낙 나트륨(diclofenac sodium)의 아폽토시스 억제를 통한 관절 연골 보호 효과를 적어도 2배 이상 상승적으로 증가시키는 명확한 증거 중 하나로 판단된다.
BrdU uptake 및 일차항체를 이용한 검출 방법은 세포의 증식 여부를 판단하는 가장 흔히 사용되어온 방법이다 [Ganey et al., 2003; Moore et al., 2005; Kim et al., 2012b; Kang et al., 2014a; Moon et al., 2014; Choi et al., 2015]. 주입한 BrdU를 함유한 세포는 새로 증식한 세포 또는 증식이 왕성한 세포를 의미한다. 본 실험의 결과, 골관절염 대조군(OA control)에서는 모의처치 대조군(Sham control)에 비해 대퇴골 및 경골 관절연골에서 BrdU 면역반응세포의 수가 현저하게 감소되는 것으로 나타났으며, 반면에 관절막에서는 BrdU 면역반응세포 수가 증가하는 것으로 나타났다. 관절막에서의 BrdU 면역반응세포 수 증대는 염증세포 침윤 및 증식성 섬유화의 일환으로 판단된다. 한편, D2 그룹에서는 골관절염 대조군(OA control)에 비해 항염 효과의 일환으로 판단되는 BrdU 면역반응세포의 수적 감소가 관절막에서 인정된 반면, 골관절염 대조군(OA control)과 유사한 BrdU 면역반응세포의 수적 변화를 대퇴골 및 경골 관절연골에서 나타내었다. 반면에, JMSwB 그룹, D1+JMSwB 그룹 및 D2+ JMSwB 그룹에서는 골관절염 대조군(OA control)에 비해 경골 및 대퇴골 관절연골내 BrdU 면역반응세포의 수가 유의적으로 증대되는 것으로 나타났으며, 관절막에서는 항염 효과를 의미하는 BrdU 면역 반응세포의 수적 감소가 나타났다. 특히 D2+JMSwB 그룹의 경우 D2 및 JMSwB 그룹에 비하여 대퇴골 및 경골 관절연골내 BrdU 면역반응세포의 수가 유의성 있게 증대되는 것으로 나타났으며, 관절막내 BrdU 면역반응세포의 수가 감소하는 것으로 나타났다. D1+JMSwB 그룹의 경우 D2 그룹과 유사한 결과를 나타내었다. 이러한 결과는 적어도 본 실험의 조건하에서 제주용암해수 입욕의 관절 연골 세포 증식 촉진 효과를 나타내는 직접적인 증거 중 하나로 판단된다.
연골의 세포외 기질은 주로 콜라겐, 글리코사미노글리칸 및 아그레칸과 같은 프로스타글란딘(Prostaglandin:PG)로 구성되어 있으며, SOX9은 연골세포의 분화에 필수적인 전사 인자로 알려져 있다 [Mundlos and Olsen, 1997]. 골관절염 시 염증성 반응의 결과, 연골의 항상성 유지에 중요한 연골세포의 변화와 사멸로 인하여 콜라겐 타입 II, 아그레칸, SOX9과 같은 세포외 기질의 생산이 감소하고, 분해가 촉진되면, 연골의 기본구조가 파괴되어 관절은 체중부하를 견디지 못하고, 염증과 통증을 수반하게 되므로 [Guzman et al., 2003], 이들 세포와 기질의 소실 억제는 OA의 치료에 중요 표적 중 하나로 활용되어 왔다 [Rai et al., 2011; Innes et al., 2013; Warnock et al., 2014]. 본 실험의 결과에서도 연골세포외 기질의 구성성분인 콜라겐 타입 II, SOX9 및 아그레칸에 대한 mRNA 발현의 감소가 대퇴골 및 경골 관절 연골에서 인정되었으며, 관절막에서도 현저한 SOX9 및 aggrecan mRNA의 감소가 인정되었다. 또한, 골관절염 시 초래되는 관절 섬유화와 stiffness[Rezende et al., 2006; Kim et al., 2012b; Kang et al., 2014a; Moon et al., 2014; Choi et al., 2015]의 일환으로 생각되는 콜라겐 타입 II mRNA의 발현 증가가 관절막에서 인정되었다. 반면에, D2 그룹, JMSwB 그룹, D1+JMSwB 그룹 및 D2+ JMSwB 그룹에서 골관절염에 의한 연골형성 관련 mRNA의 발현 감소 및 관절막내 콜라겐 타입 II mRNA 발현 증가가 현저히 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 특히 D2+JMSwB 그룹의 경우 D2 및 JMSwB에 비하여 연골형성 관련 mRNA 발현 변화가 유의성 있게 억제되는 것으로 나타났으며, D1+JMSwB 그룹에서는 D2 그룹과 유사한 정도의 연골형성 관련 mRNA 발현 변화 억제 효과가 인정되었다. 이러한 결과는 적어도 본 실험의 조건하에서 제주용암해수 입욕의 골관절염에 대한 항염, 연골세포 보호 및 증식 촉진을 통한 연골세포외 기질 형성 및 연골막내 항섬유화 효과를 나타내는 직접적인 증거뿐만 아니라, 제주용암해수 입욕은 다이클로페낙 나트륨(diclofenac sodium)의 항염 효과를 통한 연골세포외 기질 형성 촉진 및 연골막내 항섬유화 효과를 적어도 2배 이상 상승적으로 증가시키는 명확한 증거 중 하나로 판단된다.
결과적으로, 외과적으로 유발된 랫트 골관절염 소견이 D2 그룹, JMSwB 그룹, D1+JMSwB 그룹 및 D2+JMSwB 그룹의 56일에 걸친 연속적인 제주용암해수 입욕처리에 의해 유의성 있게 현저히 억제되었고, 특히 D2+JMSwB 그룹의 경우 D2 및 JMSwB 그룹 대비 모든 관련 지표에 대해 일정하게 골관절염 개선 효과가 우수한 것으로 나타났다. 한편, D1+JMSwB 그룹에서는 D2와 유사한 정도의 OA 개선 효과가 인정되었다. 따라서 적어도 본 실험의 조건하에서, 제주용암해수의 입욕은 항염 및 연골 보호 효과를 통해 비교적 효과적인 골관절염 개선 효과를 나타내었으며, 특히 다이클로페낙 나트륨(diclofenac sodium)의 골관절염 개선 활성 역시 2배 이상 상승적으로 증가 시키는 것으로 관찰되어, 다이클로페낙 나트륨(diclofenac sodium)의 투여와 동시에 제주용암해수 입욕은 새로운 보다 효과적인 골관절염 개선을 위한 대체 요법으로 적용할 수 있을 것으로 기대된다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
OA: Osteoarthritis
JMSw: Jeju magma seawater
Sham control: 위 수술 후, 멸균 증류수 입욕 및 생리식염수 피하 투여 매체 대조군
OA control: 골관절염 유발 수술 후, 멸균 증류수 입욕 및 생리식염수 피하 투여 유발 대조군
D2: 골관절염 유발 수술 후, 멸균 증류수 입욕 및 디클로페낙나트륨 2 mg/kg 피하 투여군
JMSwB: 골관절염 유발 수술 후, 제주용암해수 입욕 및 생리식염수 피하 투여군
D1+JMSwB: 골관절염 유발 수술 후, 제주용암해수 입욕 및 디클로페낙나트륨 1 mg/kg 피하 투여군
D2+JMSwB: 골관절염 유발 수술 후, 제주용암해수 입욕 및 디클로페낙나트륨 2 mg/kg 피하 투여군

Claims (4)

  1. 골관절염의 예방 또는 치료용 피부 외용제 조성물로서,
    상기 조성물은 제주용암해수 또는 이의 농축물을 유효성분으로 포함하며,
    상기 제주용암해수는 제주특별자치도 제주시 구좌읍 한동리 2972-1번지에서 취수한 제주용암해수이며, 나트륨 10,000 내지 11,000 mg/L, 마그네슘 1,000 내지 1,500 mg/L, 칼슘 300 내지 500 mg/L, 칼륨 300 내지 500 mg/L, 브롬 60 내지 70 mg/L, 스트론듐 7 내지 8 mg/L, 아연 0.010 내지 0020 mg/L, 철 0.010 내지 0.020 mg/L, 망간 0.005 내지 0.010 mg/L, 바나듐 0.010 내지 0.020 mg/L, 셀레늄 0.010 내지 0.020 mg/L 및 게르마늄 0.001 내지 0.005 mg/L를 포함하고,
    상기 조성물은 골밀도 강화 효과; 프로스타글란딘 E2 함량 억제 효과; 5-LPO(5-lipoxygenase) 활성 억제 효과; MMP-2 및 MMP-9 활성 억제 효과; 콜라겐 타입 Ⅱ, SOX9 및 아그레칸 mRNA 발현 조절 효과; PARP, COX-2 및 TNF-α활성 억제 효과를 통해 골관절염 치료 효과를 가지며,
    상기 조성물은 다이클로페낙(diclofenac)의 골관절염 치료 효과를 증진시킬 수 있는 것을 특징으로 하는, 골관절염의 예방 또는 치료용 피부 외용제 조성물.
  2. 골관절염의 예방 또는 개선용 입욕제 조성물로서,
    상기 조성물은 제주용암해수 또는 이의 농축물을 유효성분으로 포함하며,
    상기 제주용암해수는 제주특별자치도 제주시 구좌읍 한동리 2972-1번지에서 취수한 제주용암해수이며, 나트륨 10,000 내지 11,000 mg/L, 마그네슘 1,000 내지 1,500 mg/L, 칼슘 300 내지 500 mg/L, 칼륨 300 내지 500 mg/L, 브롬 60 내지 70 mg/L, 스트론듐 7 내지 8 mg/L, 아연 0.010 내지 0020 mg/L, 철 0.010 내지 0.020 mg/L, 망간 0.005 내지 0.010 mg/L, 바나듐 0.010 내지 0.020 mg/L, 셀레늄 0.010 내지 0.020 mg/L 및 게르마늄 0.001 내지 0.005 mg/L를 포함하고,
    상기 조성물은 골밀도 강화 효과; 프로스타글란딘 E2 함량 억제 효과; 5-LPO(5-lipoxygenase) 활성 억제 효과; MMP-2 및 MMP-9 활성 억제 효과; 콜라겐 타입 Ⅱ, SOX9 및 아그레칸 mRNA 발현 조절 효과; PARP, COX-2 및 TNF-α활성 억제 효과를 통해 골관절염 개선 효과를 가지며,
    상기 조성물은 다이클로페낙(diclofenac)의 골관절염 치료 효과를 증진시킬 수 있는 것을 특징으로 하는, 골관절염의 예방 또는 개선용 입욕제 조성물.
  3. 다이클로페낙(diclofenac)의 골관절염 치료 효과를 개선시키기 위한 보조제 조성물로서,
    상기 조성물은 제주용암해수 또는 이의 농축물을 유효성분으로 포함하며,
    상기 제주용암해수는 제주특별자치도 제주시 구좌읍 한동리 2972-1번지에서 취수한 제주용암해수이며, 나트륨 10,000 내지 11,000 mg/L, 마그네슘 1,000 내지 1,500 mg/L, 칼슘 300 내지 500 mg/L, 칼륨 300 내지 500 mg/L, 브롬 60 내지 70 mg/L, 스트론듐 7 내지 8 mg/L, 아연 0.010 내지 0020 mg/L, 철 0.010 내지 0.020 mg/L, 망간 0.005 내지 0.010 mg/L, 바나듐 0.010 내지 0.020 mg/L, 셀레늄 0.010 내지 0.020 mg/L 및 게르마늄 0.001 내지 0.005 mg/L를 포함하고,
    상기 조성물은 골밀도 강화 효과; 프로스타글란딘 E2 함량 억제 효과; 5-LPO(5-lipoxygenase) 활성 억제 효과; MMP-2 및 MMP-9 활성 억제 효과; 콜라겐 타입 Ⅱ, SOX9 및 아그레칸 mRNA 발현 조절 효과; PARP, COX-2 및 TNF-α활성 억제 효과를 통해 골관절염 개선 효과를 가지며,
    상기 조성물은 외용제 제형인 것을 특징으로 하는 보조제 조성물.
  4. 인간을 제외한 개체에 다이클로페낙(diclofenac)을 투여하고, 이와 병행하여 제주용암해수에 입욕을 하는 단계를 포함하며,
    상기 제주용암해수는 제주특별자치도 제주시 구좌읍 한동리 2972-1번지에서 취수한 제주용암해수이며, 나트륨 10,000 내지 11,000 mg/L, 마그네슘 1,000 내지 1,500 mg/L, 칼슘 300 내지 500 mg/L, 칼륨 300 내지 500 mg/L, 브롬 60 내지 70 mg/L, 스트론듐 7 내지 8 mg/L, 아연 0.010 내지 0020 mg/L, 철 0.010 내지 0.020 mg/L, 망간 0.005 내지 0.010 mg/L, 바나듐 0.010 내지 0.020 mg/L, 셀레늄 0.010 내지 0.020 mg/L 및 게르마늄 0.001 내지 0.005 mg/L를 포함하고,
    상기 제주용암해수는 골밀도 강화 효과; 프로스타글란딘 E2 함량 억제 효과; 5-LPO(5-lipoxygenase) 활성 억제 효과; MMP-2 및 MMP-9 활성 억제 효과; 콜라겐 타입 Ⅱ, SOX9 및 아그레칸 mRNA 발현 조절 효과; PARP, COX-2 및 TNF-α활성 억제 효과를 갖는 것을 특징으로 하는, 골관절염의 치료방법.
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