KR102166429B1 - 사이클릭 다이펩타이드 합성 효소 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 사이클리 다이펩타이드 합성효소에 관한 것이다. 본 발명에 따른 합성효소를 이용하여 항균활성을 가진 사이클릭 다이펩타이드를 생산할 수 있다. 이를 이용하여 과량의 항균활성 물질을 가진 미생물을 제조할 수 있으며, 이에 따라 유용한 식품미생물에 항균 활성을 부여할 수 있고, 증가된 항균활성으로 별도의 항균제가 없이도 보존성 및 건강기능성을 유지할 수 있다.

Description

사이클릭 다이펩타이드 합성 효소{Cyclic dipeptide synthetase}

신규한 효소의 특성화, ATP-의존적 사이클릭 다이펩타이드 합성효소가 Lactobacillus plantarum LBP-K10에서 생물활성의 사이클릭 다이펩타이드를 생산하는데 관여한다.

변형된 Rogosa 및 Sharpe (비프 엑스트렉트가 없느 MRS ) 배지[1]에서 자란 Lactobacillus plantarum LBP-K10으로부터 분리된 김치 유래의 배양 여액(culture filtrates; CFs)내에서 X 선 결정학에 의해 확인 된 cis-cyclo(L-Leu-L-Pro), cis-cyclo(L-Phe-L-Pro), and cis-cyclo(L-Val-L-Pro)를 포함하는 L- 프롤린을 기본으로하는 사이클릭 다이펩타이드(cyclic dipeptides; CDPs)가 식물 및 인간 병원성 진균 및 인플루엔자 바이러스 등에 길항적이라는 것이 밝혀졌다[2,3]. 이들 발견에 영감을 받아, 7 개의 프롤린-기반 CDP 및 하나의 비-프롤린-함유 CDP로 구성된 이 분리물의 CF CDP의 완전한 세트가 가스 크로마토 그래피-질량 분광법(GC-MS)과 결합 된 음이온 교환 수지를 사용하여 밝혀졌다 [4]. 예비 실험으로부터 얻은 이전의 데이타와 같이, 락토 바실러스 CDP는 세포의 수의 감소와 동시에 일어나며 72 시간에 가장 많은 양으로 나타났다. 이러한 모든 증거는 메틸렌 클로라이드(MC) 추출-의존 방식으로 가능한 부분이성질체 물질의 라세미 화합물의 반복적인 크로마토 그래피를 이용한 분리에 의해서 CDP의 분리를 매우 강하게 증가시키는데 관심을 증가시켰다[2-4]. Lb. reuteri RC-14 cyclo (1-Phe-1-Pro) 및 cyclo (1-Tyr-1-Pro)에서 충분이 묘사된[5] 것 처럼, 특별히 CDP 생합성를 통해 2차 대사산물에 의해 조절되는 락토바실러스의 성장[4] 및 CDP 생산과 연관되어 있는 agr-매개 듀얼-채널 쿼롬-센싱 시그널링 사이에 비슷한 관계가 실험실 실험에서 아미노산의 이용의 일부가 복합적인 MRS 배지로부터 완전히 유래하였다고 볼 때 더 매력적인 것으로 보인다. Lactobacillus 또는 Leuconostoc 종의 성장 중에는 일반적으로 복잡한 질소원이 필요하다 [6,7]. 현저하게, Lb. plantarum 종은 필수적인 단백질 생성 (이소류신, 류신, 발린, 리신, 트립토판, 트레오닌) 및 비필수 단백질 생성 (글루탐산, 시스테인) 아미노산의 전형적인 유형에 대한 절대적인 필요를 나타낸다[8]. 아미노산 대사는 박테리오신 유사 물질 및 비 펩티딜 (non-peptidyl) 소형 화합물로 대표되는 여러 형태의 중간 대산 산물에 의한 스트레스 저항, 단백질 생합성, pH 조절, 대사 에너지/산화 환원 균형 변경을 허용하기에 충분히 우호적인 생리학적 사건에 큰 기여를 한다 [9,10].

항균 활성[12], 호르몬 유사 쿼럼 감지 회로[13]와 면역 억제성 잔기 (immunosuppressive moiety)[14]가 주목할 만하게 가지고 있는 자연 발생적 구조적 모티프가 관측되는 2,5-다이케토피페라진(2,5-diketopiperazines)을 가지고 있는 CDP의 넓은 생물활성 스펙트럼을 고려해 보면 [11,12], 이들 3차원적으로 정의된 머리에서 꼬리로의

다이펩타이드 이중체-링 클로저는 생물활성의 모드를 위한 매력적인 스캐폴드로 점진적으로 성립이 되었다[15]. CDPs의 생체내 기능의 포착하기 어려운 성질에도 불구하고, 이들은 이미 알려진 견고한 키랄 측면 구조 및 쿼롬 센싱 오토 인듀서와 교차 통신을 일으키는는 막을 확산하는 능력[17, 18] 때문에, 여러가지 생화학적 사건을 나타낸다 [5,16]. 비록 CDP의 생합성 기원이 충분하게 입증되지는 않았지만, 최근의 연구는 비-리보소옴 펩타이드 합성효소(nonribosomal peptide synthetase; NRPS)가 이들의 합성에 담당하고, 이것은 생합성 경로의 전단 제어에 의하거나, 사슬 연장 동안에 다이펩티딜 중간체의 미성숙 방출에 의하여 이루어진다 고 밝혀졌다[19-21]. 중요하게는, CDP를 특이적으로 만드는 효소인 것으로 밝혀지고 이의 11개의 동족체가 완전히 밝혀진[22, 23] AlbC[22-24]는 알보노르신(albonoursin), 마이코사이클로신(mycocyclosin)[22,23], 사이데로크롬 풀체리민(siderochrome pulcherrimin)[28-30], 노카진 패밀리(nocazine family)[26] 및 메틸화된 다이트립토판 CDP들[25]의 생산을 촉매한다. 특정 항생제의 작용은 아미노 에킬화된 tRNA를 납치하여 사용하는 2차 전담 경로를 통해 CDP 생합성에 기여한다.

프롤린 함유 CDP의 생체 활성에 관한 우리의 예비 연구로부터, 우리는 mMRS 배지에서의 배양 중의 CF 아미노산 조성물이 모든 CDP 풀이 성분에 영향을 주는 효소 기반 CDP 생합성 활성이라 가정하였으며, 이것은 프롤린, 류신 및 페닐알라닌을 포함하는 특정 아미노산의 사용에 더욱 의존하는 것을 더욱 지지한다고 가정하였다. 우리는 LbCDPS 라 명명 된 Lactobacillus 분리균으로부터 새로운 종류의 단백질 CDP 합성 효소를 발견하기 위해 노력하였고, 특별한 마커 없이 주로 변형된 아미노산/닌하이드린 혼합물을 통하여 네이티브 젤을 통과시키고 연속적으로 HPLC 분획화하는 두 방법을 주로 사용하는 아미노산-??칭(quenching) 기반 효소 활성 분석을 통하여 증명하였다. 또한, ATP 존재하에 Lb. plantarum LBP-K10 LbCDPS 의해 유도되는 어떤 형태의 효소적 산물이 HPLC에 의해 분리되었고 GC-MS에 의해 확인되었다. 단일 CDP의 생체 활성에 관한 우리의 이전 연구 [2,3]를 기초로, 정제된 단일 CDP와 LbCDPS에 의한 생산된 효소 촉매 작용을 받아 생산된 생산물 사이의 생체 활성의 차이점을 비교했다. 따라서, 항균활성을 가진 효소적 산물을 가진 ATP 의존성 LbCDPS가 클래스-I 아미노 액킬-tRNA 합성효소 같은 효소 패밀리 같은 이미 알려진 CDP 합성효소와 근본적으로 다른 특정한 박테리아 종에서부터 탐색을 통하여 새롭게 발견되었다.

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상기한 목적을 위하여 본 발명의 제 1 의 태양은 서열목록 1의 사이클릭 다이펩티다아제를 제공한다. 상기 사이클릭 다이펩티다아제은 기능적 동등물을 포함한다. 여기서 기능적 동등물은 사이클릭 다이펩티다아제의 아미노산 서열들 중에서 일부 또는 전부가 치환되거나 아미노산의 일부가 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체가 포함된다. 이 때 아미노산의 치환은 보존적인 치환이 되는 것이 바람직하다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예를 들면 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산(Asp, Glu), 염기성 아미노산(His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황 함유 아미노산(Cys, Met). 또한, 이 때 아미노산의 결실은 사이클릭 다이펩티다아제의 활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치하는 것이 바람직하다.
본 발명의 제 2 의 태양은 상기 사이클릭 다이펩티다아제를 암호화하는 유전자를 제공한다. 바람직하게는 상기 유전자는 서열목록 2의 핵산 서열을 포함하는 유전자일 수 있다.
본 발명의 제3의 태양은 상기 사이클릭 다이펩티다아제 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 본 발명은 상기 사이클릭 다이펩티다아제 유전자를 포함하는 각종 벡터, 예를 들어 플라스미드, 코스미드, 파지미드, 파지, 바이러스 등의 재조합 벡터를 제공한다. 상기 재조합 벡터를 만드는 방법은 당업계에 공지되어 있다.
본 발명에 따른 제 4 의 태양은 상기 재조합벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다. 바람직하게는 상기 숙주세포는 이에 제한되는 것은 아니나 원핵세포일 수 있다. 바람직하게는 유산균 또는 대장균일 수 있다.
본 발명의 제 5 의 태양은 상기 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는 사이클릭 다이펩티다아제 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 제 6 의 태양은 상기 사이클릭 펩티다아제를 이용한 사이클릭 펩타이드 제조 방법을 제공한다. 상기 사이클릭 다이펩타이드는 cis-cyclo (L-Val-L-Pro), cis-cyclo (L-Leu-L-Pro) 및 cis-cyclo (L-Phe-L-Pro)으로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나의 사이클릭 다이펩타이드이다.
본 발명의 제 7 의 태양은 상기 사이클릭 펩티다아제에 의해 생산된 사이클릭 펩타이드를 포함하는 식품을 제공한다. 상기 식품에서 이에 제한되는 것은 아니나 상기 사이클릭 펩티다아제를 생산하는 숙주세포는 제거되어서 유전자 변형 미생물이 포함되지 않은 식품일 수 있다. 상기 식품은 사이클릭 펩타이드에 의한 항균활성을 가진다. 식품 조성물로 사용하는 경우, 본 발명의 사이클릭 펩타이드 함유 식품 조성물은 각종 식품류, 예를 들면, 음료, 스프, 국, 냉동식품, 기타 가공식품(빵, 쿠키, 쨈, 캔디, 껌, 차, 기능성 식품류) 등의 각종 음식품에 배합하여 건강기능식품으로 제공될 수 있다. 본원에서 정의되는 "건강기능식품"은 건강기능식품에 관한 법률에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
상기와 같은 식품 제형에 있어서 본 발명 조성물의 첨가량은 성인 1일당 유효 섭취량을 토대로 설정하면 되지만, 통상 1 내지 100g의 중량으로 섭취하는 것이 바람직하다. 또한, 첨가 방법은 특별히 제한은 없고, 각 음식품에 사용되는 다른 원료와 함께 처음부터 첨가하는 것도 가능하다. 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 일반적으로 본 발명의 식품조성물 전체 중량의 0.01 내지 70 중량%로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 식품 조성물은 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게, 천연 탄수화물 또는 여러 가지 향미제 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 예컨대, 천연 탄수화물로서 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜을 사용할 수 있다. 향미제로서는 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물, 예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 이 외에도, 본 발명의 식품조성물은 여러가지 영양제, 비타민류, 전해질, 식이성분, 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명은 요쿠르트 등의 유산균 제제 음료 또는 페이스트 등의 혼합제로 사용할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

본 발명은 신규한 사이클리 다이펩타이드 합성효소에 관한 것이다. 본 발명에 따른 합성효소를 이용하여 항균활성을 가진 사이클릭 다이펩타이드를 생산할 수 있다. 이를 이용하여 과량의 항균활성 물질을 가진 미생물을 제조할 수 있으며, 이에 따라 유용한 식품미생물에 항균 활성을 부여할 수 있고, 증가된 항균활성으로 별도의 항균제가 없이도 보존성 및 건강기능성을 유지할 수 있다.

도 1은 성장기에 따른 Lb. plantarum LBP-K10의 아미노산 프로파일을 보인다.
도 2는 네이티브 젤에서 활성을 사용하여 CDPS를 분리하기 위한 전략을 보인다.
도 3. 효소활성은 네이티브 활성 염색에 의하여 확인되었다. CDPS에 의한 사이클릭 다이펩타이드의 합성은 블루 닌하드린 염색된 젤(화살표로 표시됨)위에 나타난 무채색 밴드를 보였다.
도 4. 효소 및 기질을 포함하는 반응액내에서 사이클릭 다이펩타이드의 HPLC 분석을 보인다. 새로운 기질을 생성한 L-프롤린/L-류신/L-페닐알라닌 효소 촉매된 L-프롤린/L-류신/L-페닐알라닌은 혼합물 ATP의 존재하에서 9.7분후에 나타나는 피크로 보인다(A: 골탄 검은색 라인). 그러나 ATP가 없으면, 효소는 CDPS/ L-프롤린/L-류신/L-페닐알라닌 혼합물에서 어떤 반응도 하지 못하였다(A; 점선). 효소만을 함유하는 용액을 대조군 (A; 대시 라인)으로 사용 하였다. cis-cyclo(L-Pro-L-Leu) (B;MW 210) 및 cis-cyclo(L-Pro-L-Phe)(C; MW 244)를 HPLC로 측정하고, 그 결과는 반응후에 효소/L-프롤린/L-류신/L-페닐알라닌 혼합물에서 2개의 사이클릭 다이펩타이드가 존재하는 것을 보인다(골탄 검은색 라인)
도 5는 Lb. plantarum LBP-K10 내에 있는 효소의 분리를 보인다. (A) 무채색의 밴드(붉은 화살표)는 CDP 합성 능력을 가진 7-11 분획에서 단백질의 존재를 확인하였다(도 14 참조). 14에서 네이티브 염색 밴드에 대응하여 수준이 변화하는 밴드는 스크린 밖에 나타났고, 붉은색으로 표시되었다. (A). 분획 7-9(B에서 붉은색 화살표로 나타냄)의 램리염색(Laemmli-stained) 밴드를 SDS-PAGE에 다시 나타났고, 분획 7 및 9의 밴드를 관측할 수 있었다.
도 6은 사이클릭 다이펩타이드 합성 효소(NCBI gi: 311821850)의 ORF의 핵산 및 아미노산 서열를 보인다. 사이클릭 다이펩타이드 합성 효소의 690 bp 서열을 NCBI의 데이타로부터 얻었다.
도 7은 Lb. plantarum LBP-K10에 있는 사이클릭 다이펩타이드 합성효소의 멀티플 서열 얼라인먼트의 결과를 보인다. Lb. plantarum LBP-K10 사이클릭 다이펩타이드 합성 효소 유전자로부터 유추된 아미노산 서열을 벡터 NTT9.0 익스플로러 클러스털 X 프로그램으로 얼라인 하였다. K10: Lb. plantrum LBP-K10; Lb.n Lb. namurensis; Lb.p : Lb. plantarum; Lb.f : Lb. fabifermentans; St.n : Streptomyces noursei.
도 8은 CDPS의 네이티브 활성 염색 및 대량생산을 보인다. CDPS의 대량생산은 디네이츄어링 전기영동(A)에 의해 확인되었고, 이의 기능은 네이티브 활성 염색(B)로 확인되었다.
도 9는 재조합 CDPS의 배양 여액에서 사이클릭 다이펩타이드의 증가를 보인다. 형질이입된 E. coli 배양에서 사이클릭 다이펩타이드의 유도를 확인하기 위하여, 배양 여액의 HPLC 분석을 수행하였다. 그 결과는 가장 중요한 기능적인 CDP인 F7(L-Val-L-Pro), F14(L-Leu-L-Pro), F17(L-Phe-L-Pro)가 상당히 증가하였다.
도 10은 CDPS 유전자 형질이입된 세균에서 HPLC 시스템을 사용하여 사이클릭 다이펩타이드의 증가된 전체 프로파일을 보인다.
도 11은 형질이입된 E. coli 배지의 MC 추출물이 항균 활성이 증가된 것을 보인다. CDPS 플라스미드로 형질이입된 후, E. coli 로부터의 MC 추출물의 항균 활성은 증가되었고, MCK10의 것과 비교될 만 하였다. 그러나 온전한 또는 대조군 플라스미드가 형질이입된 E. coli 에서는 인디케이터 세균에 대하여 약하거나 무시할 수준의 효과를 보였다.
도 12는 재조합 CDPS의 정제 및 활성 분석을 보인다. superdex75 컬럼 크로마토 그래피로 겔 여과 한 후 재조합 CDPS를 SDS-PAGE 에서 확인 하였다(A). 정제 된 CDPS의 활성을 네이티브 염색 분석 을 사용하여 확인 하였다(B).
도 13a는 HPLC 분석이 시험관내에서 CDP가 cyclo (Pro-Lys)의 합성을 촉매하는 것을 확인한 것을 보인다. CDPS는 시험관내에서 cyclo (Pro-Lys)를 생성하기 위해 L-프롤린 및 L-리신과 같은 두 아미노산 쌍을 촉매한다. L- 프롤린 (왼쪽 위), L- 라이신 (왼쪽 오른쪽), ATP (왼쪽 중앙) 및 CDPS (왼쪽 아래)의 크로마토 그램 피크가 지시된대로 표시되었다. L- 프롤린, L- 라이신 및 ATP의 반응 혼합물의 경우, 10 분 내에 CDP 피크를 나타내지 않았다(중간 오른쪽). 그러나, CDPS가 반응 혼합물에 첨가 될 때, 생합성 된 cyclo (Pro-Lys) 및 cyclo (Lys-Lys) (도면에 나타낸 바와 같이)가 16.5-16.7 분 범위의 새로운 피크로서 관찰되었다.
도 13b는 HPLC 분석이 시험관내에서 CDPS가 cyclo (Pro-Phe)의 합성을 촉매하는 것을 확인한 것을 보인다. CDPS는 L-프롤린 및 L-리신과 같은 두개의 아미노산 쌍을 촉매하여 시험관내에서 cyclo(Pro-Lys)을 생산한다. L- 프롤린 (왼쪽 위), L- 라이신 (왼쪽 오른쪽), ATP (왼쪽 중앙) 및 CDPS (왼쪽 아래) 피크가 지시된 바와 같이 표시되었다. L- 프롤린, L- 라이신 및 ATP의 반응 혼합물의 경우, 10 분 내에 CDP 피크를 나타내지 않았다 (중간 오른쪽). 그러나, CDPS를 반응 혼합물에 첨가 할 때, 생합성 된 cyclo (Pro-Phe) 및 cyclo (Phe-Phe)는 15.5-26 분 범위의 새로운 피크로서 관찰되었다.
도 13는 HPLC 분석은 시험관내에서 cyclo(Pro-Ser)의 촉매적인 합성을 보인다. L- 프롤린 (왼쪽 위), L- 세린 (왼쪽), ATP (왼쪽 중앙) CDPS (왼쪽 아래) 피크가 HPLC 크로마토그램에 표시되었다. L- 프롤린, L- 세린 및 ATP의 반응 혼합물은 10 분 후에 피크를 나타내지 않았다(중간 오른쪽). 그러나, CDPS를 첨가 한 경우, 새로운 물질 (cyclo (Pro-Ser))의 피크가 약 15 분에 나타났다.
도 13d는 HPLC 분석은 시험관내에서 cyclo(Pro-Val)의 촉매적 합성을 촉진하는 CDPS를 확인하한 것을 보인다. L- 프롤린 (왼쪽 위), L- 발린 (왼쪽 오른쪽), ATP (중간 왼쪽) CDPS (왼쪽 아래) 피크가 HPLC 크로마토 그램에 표시되었다. L- 프롤린, L- 발린 및 ATP의 반응 혼합물은 10 분 후에 피크를 나타내지 않았다(중간 오른쪽). 그러나 CDPS를 첨가 할 때 L-프롤린, L-발린, ATP 및 사이클릭 다이펩타이드의 반응 혼합물은 13 분 후에 cyclo (Pro-Val)로 확인 된 새로운 물질의 피크를 보였다.
도 13e는 HPLC 분석은 시험관내 분석에서 cyclo(Pro-Val)의 촉매적 합성을 촉진하는 CDPS를 확인한 것을 보인다. L- 프롤린 (왼쪽 위), L- 류신 (왼쪽 오른쪽), ATP (중간 왼쪽) CDPS (왼쪽 아래) 피크가 HPLC 크로마토 그램에 표시되었습니다. L- 프롤린, L- 류신 및 ATP의 반응 혼합물은 10 분 후에 피크를 나타내지 않았다 (중간 오른쪽). 그러나 CDPS를 첨가 한 경우 L-프롤린, L-류신, ATP 및 사이클릭 다이펩타이드의 반응 혼합물은 19 분 경에 새로운 물질의 피크를 보였다.
도 14는 올리고머의 상태를 결정하기 위한 슈퍼로즈 12 겔 투과 컬럼 (GE Healthcare)으로 분자 질량을 확인 하였다. 슈퍼로즈 12 겔 투과 컬럼에 아프로티닌(Aprotinin), 사이토크롬 C, 알부민 및 알코올 탈수소 효소로와 대비되는 표준 시료를 사용하여 분자량을 결정하였다. FPLC의 결과에 따르면, CDPS의 분자량은 99.18KD로 계산되었다(C). 정제된 CDPS는 12 % SDS-PAGE로 25KD 로 확인되었다(B).
도 15는 CDPS의 결정 및 회절 이미지를 보인다.A : CDPS의 결정체. B : X 선 방사선에 대한 CDPS의 회절 이미지.
도 16은 CDPS의 호모테트라머 구조를 보인다. 새로운 카툰 모델에서 볼 수 있듯이 CDPS는 4 개의 동일한 하위 단위로 구성되었다.
도 17은 CDPS 서브 유닛의 2 차 구조를 보인다. 더 잘 보기 위해, A 단위는 2 차 구조(왼쪽 패널)에 따라 착색되었다. 동일한 서브 유닛은 각각 7 알파 헬릭스(자주색)과 5 3₁₀ 헬릭스(파란색)으로 둘러싸인 6 베타 시트(노란색)를 포함한다. 따라서, 각 서브 유닛은 알파/베타/ 알파 구조의 3 층을 갖는다.
도 18은 CDPS의 구조를 중심으로 한 빈 공간(화살표)을 보인다. 빈 공간은 CDPS의 구조를 중심에 있다(노란색 화살표로 표시).
도 19는 사이클릭 다이펩타이드 합성효소와 PGM1(PDBID : 1YFK)를 비교한 것을 보인다. PDBj데이터베이스를 통해 사이클릭 다이펩타이드 합성효소가 인간 PGM1과 유사한 결합 부위를 함유하고 있음이 확인하였다.

방법

화학물질. LbCDPS 스크리닝 및 HPLC 분석에 의한 효소적 생성물을 위한 것을 포함하여 모든 생화학물질 및 시약은 시그마-알드리치 또는 피셔 사이언티픽에서 구매하였고, 아래에 기재된 다음의 실험을 제외하고는 추가의 정제 없이 충분한 순수도(>99.9%)를 가지고 있었다.

세포. 한국의 발효된 김치로부터의 Lb. plantarum LBP-K10가 16S rDNA sequencing 방법으로 동정되었고, 이전에 기술한 바와 같이 mMRS에서 배양되었다[2]. 유산균의 일상적인 성장을 위해서, 쇠고기 추출물이 없는 변형 된 MRS 배지 (2 % 포도당, 0.5 % 효모 추출물, 0.5 % 소디움 아세테이트(CH₃COONa) ,0.2 % 시트르산 암모늄 염기성(C₆H₁₄N₂O₇), 0.2% 다이포타슘 포스페이트(K₂HPO₄), 0.01 % 마그네슘 설페이트 (MgSO4), 0.005 % 망간 황산염(MnSO₄) 및 액체 배지 또는 1.8 % 아가 플레이트에 적절한 보충재가 이전에 기술된 바와 같이 사용되었다[1]. Lb. plantarum LBP-K10은 일반적으로 1.8%의 아가를 포함하는 MRS 배지에서 일반적으로 유지되었다. 액체 배지에서 세포를 성장시키기 전에, 저장 컬쳐를 한천 경사배지에서 배양하고 4 ^oC에서 저장하였다. 또한, 여기에서 시험 된 모든 항균 실험은 plantarum LBP-K10로부터 정제 된 각각의 단일 CDP 및 아미노산의 조합으로부터 합성된 LbCDPS 활성에 기초한 CDP 모두를 사용하여 수행 하였다. 다제내성 세균 및 참조 균주에 대한 항균효과는 시드 접종 후 매 24h 시간 마다 측정되었고, 희석법이 항균 물질의 최소 억제 농도(MIC)를 결정하는데 사용되었다[31].

프리 아미노산 함량 분석

프리 아미노산 샘플 분석은 선행연구를 기본으로 하고, 약간의 조정을 가하여 진행되었다. 프리 아미노산 함량은 L-8800 고속 아미노산 분석기(L-8800 high-speed AA analyser, Hitachi, Japan)를 이용하여 김의 방법에 따라 분석하였다(Kim, M.-Y. et al., 2009). 0.75g의 동결 건조기를 통해 동결 건조된 락토바실러스 CF 분말을 10mL 3% 트리클로로 아세트산으로 1 시간 동안 희석하고, 10,000rpm 조건에서 15분간 원심분리 하였다. 수집된 상등액을 0.22㎛ - 셀룰로오스 아세테이트 멤브레인(GE Healthcare, USA)으로 여과하였다. 여과 후 생성된 여과액을 L-8800 고속 아미노산 분석기(Hitachi, Japan)에 로딩하였다. 크로마토그래피 분리는 이온 교환 칼럼 # 2622SC PF를 이용하였고, 사용된 이동상은 PF1, PF2, PF3, PF4, PF-RG, R-3, C-1, 닌히드린 용액 및 완충액(Wako, Japan)을 사용하였다. 표준 아미노산 용액은 와코시(Wako-shi, Japan)에서 구입한 타입 ANII와 타입 B형을 사용하였다.

활성 분석(Activity assay)

LbCDPS 활성은 기본적으로 네이티브 겔을 사용하여 활성 염색을 통해 340nm에서 분광 광도법 또는 아미노산 및 아민과의 닌히드린 반응을 형광측정법으로 측정하는 방식인 닌히드린(2,2- 디히드록시인단 -1,3- 디온)-쉬프 염색[ninhydrin (2,2-Dihydroxyindane-1,3-dione)-Schiff staining] 기술을 활용하였는데, 이들 두 가지 방식 모두는 특히 변형된 네이티브 PAGE 수행 후 활성 염색을 위한 방법을 사용할 때, 발색단(chromophores)을 형성시킬 수 있다(Shaykh et al. 1983, Friedman 2004).

효소 반응을 위한 50 ml LbCDPS 분석 혼합물은 pH 8.0의 50mM Tris-HCl 용액에 1.0㎍/ml LbCDPS, 1 mM ATP, 50 mM Tris-HCl 및 각각의 아미노산 1mM로 구성되었는데, 이들 아미노산들의 조합은 CDPs를 형성하기 위해 2개의 아미노산이 링크되어 구성되었다.

또한, 락토바실러스 배양액 효소 조건과 유사한 미량 화합물로 0.2% K₂HPO₄, 0.01%MgSO₄, 및 0.005% MgSO₄ 성분이 첨가되었다. LbCDPS 활성은 기질 포함 분석 혼합물(substrate-containing assay mixtures)로 기본적으로 네이티브 PAGE 상태에서 관찰될 수 있는데, LbCDPS 활성을 통해 이들을 완전히 겔화시키고, 아민 염색된 닌히드린, 아미노산, 및 안정화 단백질을 얻을 수 있는 것이 가능하다.

상기 실험 원리에 따라, 세포 조 추출물 및 여러 유형의 칼럼 크로마토 그래피에서 용출된 세포 분획물 모두에 대하여 네이티브 PAGE를 수행하였고, 생성된 겔을 즉시 얼음을 이용하여 냉각시킨 멸균 증류수로 2회에 걸쳐 각각 10분 동안 세척하였고, pH 8.0의 50mM Tris-HCl 용액으로 안정화시켰다.

이 후, pH 8.0의 50mM Tris-HCl 용액으로 안정화시킨 다양한 조합의 아미노산 페어(pairs)를 함유한 반응 용액에 상기 안정화된 겔을 침전시켰다. 반응용액에 침전하여 반응시킨 겔을 25 mM 닌히드린으로 염색하였고, 2시간 동안 추가적으로 인큐베이션 하였다. 그 결과 무색의 밴드(achromatic bands)가 네이티브 겔에서 관찰되었다.

LbCDPS 근처의 아미노산들은 탈수 및 축합되는 과정을 통해 아미노 그룹을 잃고 CDPs로 고리화되기 때문에, 무색 밴드는 파란색 또는 갈색 색상으로 표시될 수 있다.

이와는 달리, 닌히드린 계의 염색된 겔의 다른 부분들은 LbCDPS를 나타내지 않았다.

락토바실러스 플란타늄 LBP-K10 균주에서 Lb CDPS의 정제

세포 조 추출물로부터 세포 단백질을 얻기 위해 3일 동안 배양된 락토바실러스 플란타늄 LBP K-10 균주를 10,000 x g 조건에서 20분 동안 원심분리하여 수집하였고, 세포 펠렛을 얼음으로 냉각한 멸균 증류수로 2회 세척하였으며, 1 mM PMSF(phenylmethanesulfonyl fluoride)를 함유하는 pH 8.0의 50mM Tris-HCl 용액에 재현탁시켰다.

세포 펠렛을 냉동 및 해동을 10회 반복한 후, 적절한 양의 리소자임(Sigma)을 갖는 소니케이터 W-225R(Heat Systems-ultrasonics, Inc)를 사용하여 세포벽을 파쇄하였고, 이를 통해 세포 펠렛을 균질화시켰다. 파쇄되지 않은 세포 및 세포 파편을 10,000 x g 조건에서 30분 동안 원심분리하여 제거하였다. LbCDPS를 정제하는데 사용되는 세포질 분획을 포함하는 상등액을 0.22㎛ 셀룰로즈 아세테이트 멤브레인으로 여과하였다.

CDP 생성의 촉매 작용에 의해 LbCDPS를 분리하기 위하여, 각 실험에서 150g(습윤 질량)의 Lb. 락토바실러스 플란타늄 LBP-K10 균주를 상기와 같이 준비 하였다. 상기 준비된 균주에 30% 황산 암모늄((NH₄)-₂SO₄)을 첨가하였고, 90분 동안 냉각시키면서 교반시켰다. 생성되는 침전물을 원심 분리를 통해 수집하였고, 컬럼 크로마토그래피(GE Healthcare)에 대략 550mg의 단백질이 사용되었고, 컬럼 크로마마토그래피는 Mono Q^TM 5/50GL(MQ-AEC)이 구비된 음이온 교환 크로마토그래피, Phenyl Superose^TM 610/300GL(PS-HIC)이 구비된 소수성 상호 작용 크로마토그래피(hydrophobic interaction chromatography), Mono Q HR5/5 column, 및 Superdex 200 10/300 GL이 구비된 겔 여과 크로마토그래피(gel filtration chromatography)를 순차적으로 사용하였다.

모든 크로마토그래피 분획은 pH 8.0의 50mM Tris-HCl 용액을 사용하여 수행 하였고, 음이온교환 크로마토그래피(MQ-AEC)는 시료를 0 내지 0.5M NaCl(0.2 ml/min) 용액에 선형 농도구배(linear gradient)로 용출시켰고, 소수성 결합 크로마토그래피(PS-HIC)는 샘플을 1.5 내지 0M (NH₄)₂SO₄(0.5ml/min) 용액에 선형 농도구배로 용출시켰다.

모든 실험 과정에서, 중요한 효소 활성을 갖는 생성된 단백질 분획물은 전술한 방법을 사용하여 12% 네이티브-PAGE 분석에 의해 즉시 가시화되었다. 용출된 각각의 분획은 전술한 바와 같이 적절한 양의 아미노산, ATP 및 미량 성분(minor components)과 반응하는데 사용되었다. 사용된 모든 용액은 탈이온수 및 여과수(298K 에서 비저항 18.2-MΩ cm, Milli-Q, Millipore)로 준비되었다.

대장균 발현 형질전환체 및 대장균에서 LbCDPS의 생산.

대장균에서 LbCDPS 단백질을 발현시키기 위해, 락토바실러스 플란타늄 LBP K-10 게놈 DNA를 주형으로 사용하여 아미노산 서열 전체에 대응하는 뉴클레오타이드 서열로부터 추정된 DNA 단편으로 중합 효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 증폭시켰다.

PCR 반응은 하기 프라이머를 이용하여 수행하였다:

5'-CATATGGCAAAATTAGTATTGATTCGTCACGGT-3'(NdeI site, forward; 서열번호 3) 및

5'-GGATCCTTATTTGCCTAACTTTTCCTTACCAAG-3’(BamHI site, reverse; 서열번호 4)(NCBI accession number: CBX85836).

PCR 반응은 100ng의 게놈 DNA, 0.5μM의 프라이머 DNA, 0.2mM dNTPs, 10 x Ex Taq 완충 용액, 및 0.025 U / ㎕ Taq polymerase(TaKaRa Bio Inc. 일본)를 함유하는 증폭 혼합물(amplification mixture)을 사용하여 30 사이클 동안 Biometra thermocycler(Tampa, USA)) 기기를 이용하여 수행되었다.

PCR 조건은 95℃에서 30초 변성(denaturing), 55℃에서 30초 어닐링(annealing), 및 72 ℃에서 1.5분 신장 조건으로 수행되었다. 693의 염기쌍 염기 서열로부터 PCR 반응에 의해 프라이머가 증폭되었다. 플라스미드 구조체의 서열 및 구조체의 상세한 설명은 검증 가능하며, 모든 구조물의 기능은 서열 검증되었다. 이를 통해 NdeI/BamHI로 절제할 수 있는 LbCDPS 유전자를 포함하는 플라스미드를 제작하였다.

0.69kb의 NdeI/BamHI 분해 단편에 해당하는 PCR 증폭 단편을 pGEM T EASY 벡터에 삽입하여 pCDPS를 수득하고, NdeI/BamHI로 절단하여 생성된 단편을 pET3a (+) 벡터에 TaKaRa의 Mix ligation kit(TaKaRa Bio Inc.)를 사용하여 연속적으로 클론닝 하였다. 삽입된 단편과 벡터의 비율은 5 : 1 (mole)이었다. 상기와 같이 생성된 벡터를 4℃에서 오버나이트 라이게이션 한 후, 대장균 BL21(DE3) 균주를 호스트로 사용하여 LbCDPS를 함유하는 pET3a(+) 벡터를 형질전환시켰다.

대장균에서 LbCDPS의 정제

상기 제작된 pET3a(+)- LbCDPS/BL21(DE3) 균주와 대조군 BL21(DE3) 균주를 50㎍/mL 농도의 암피실린을 첨가한 37℃, pH 7.4의 LB 배지에서 배양하였고, 종균 배양액을 얻었다. 암피실린 50㎍/㎖과 1%(v/v) pET3a-CDPS/BL21(DE3) 배양물 또는 대조군 BL21(DE3) 배양물을 LB 배지에 넣고 600nm에서 광학 밀도가 0.4-0.5의 값에 도달할 때까지 37℃에서 2.5 시간 동안 배양하였다.

광학 밀도 점에서 IPTG 1(isopropyl-beta-d-thiogalactopyranoside 1, Sigma, USA)을 최종 1mM의 농도로 첨가하고, 30℃에서 6시간 동안 LbCDPS 단백질 합성을 유도하기 위해 배양하였다. BL21(DE3) 세포에 형질전환된 pET3a-LbCDPS 형질전환체를 배양하여 수확하였고, 4 ℃에서 8,000 x g 조건에서 20분 동안 원심 분리 하였다. LbCDPS 과잉 생산 세포를 1mM PMSF와 1:9(w/v)의 비율로 pH 8.0의 50mM Tris-HCl 용액으로 구성된 용해 완충액에 용해시키고, 얼음에서 15 분간 초음파 처리 하였다. 10,000 x g, 4 ℃에서 20 분 동안 원심 분리하여 세포 파쇄물을 제거한 후, 상등여액을 새로운 튜브에 모아 추출 용액(extract solution)으로 사용 하였다(참고문헌 36).

단백질의 정량은 Bio-Rad 단백질 분석 시약(Bio-Rad, USA)을 사용하여 Bradford 방법[참고문헌 37 참조]에 의해 결정되었다. 상기 배양여액을 1M (NH₄)-₂SO₄로 적정한 페닐 세파로스(Phenyl sepharose) CL-4B 컬럼 상에 로딩 하였다.

칼럼을 동일한 완충액으로 세척 한 후, 컬럼에 결합된 단백질을 50 mM Tris-HCl 완충액 상에서 1 내지 0mM (NH₄)-₂SO₄범위의 역선형 농도구배(reverse linear gradient)로 3㎖/min의 유속으로 용출시켰다. 용출된 분획을 닌히드린 (ninhydrin) 시약을 사용하여 활성 염색을 수행한 후, PM10 멤브레인(Amicon사)을 사용하여 한외 여과하여 농축시켰다. 이어서, 농축된 효소 용액을 pH 8.0의 50mM Tris-HCl으로 FPLC 시스템을 통해 superdex75를 사용하여 탈염시켰다. LbCDPS는 pH 8.0의 50mM Tris-HCl 용액으로 평형화 된 DEAE-Sepharose CL-6B 컬럼 상에 추가로 로딩되었다. 동일한 완충액에서 0 내지 1M NaCl의 선형 농도구배 조건 하에서 효소를 용출시켰다. 정제된 효소는 4℃에서 저장되었다.

분자량 결정(Molecular mass determination)

정제된 LbCDPS의 분자량은 superose 12 GL300((HiLoad 16/60, 1.6 x 10 cm, GE Pharmacia))가 로딩된 겔 여과 크로마토그래피(gel filteraion chromatography)를 이용하여, 알코올 디하이드로게나아제(150 kDa), 소 혈청 알부민(66 kDa), 사이토크롬 C(12.4 kDa), 및 아프로티닌(6.5 kDa) 단백질로 각각 보정된 단백질 스탠다드를 사용하여 결정하였다.

HPLC 분석

in vitro 효소-촉매 반응에 의해 수행된 활성 또는 CDP 함유 분획을 동결 건조시키고, MC(mass chromatography)로 추출하였다. 추출물에 존재하는 메틸렌 클로라이드(methylene chloride)를 휘발시켜 제거한 후, 이를 증류수에 용해시키고 0.22㎛ 셀룰로오스 아세테이트 멤브레인(Milli-Q, Millipore)을 이용하여 여과하였다.

락토바실러스 배양 추출물에서 정제된 CDP 또는 LbCDPS에서 생성된 CDP의 여과된 샘플을 모두 준-정제(semi-preparative) Hypersiloctadecyl silica C18 역상 컬럼(9.4 x 250 mm, Agilent, USA) 및 ChemStation HPLC software를 구비한 준-정제 Agilent 1200 시리즈 HPLC 시스템을 이용하여 분리하였다(참고문헌 2 참조).

이동상은 물 67.0%, 아세토니트릴 3.0% 및 메탄올 30.0%를 사용하였고, 각각 210, 260 및 280nm의 파장을 갖는 UV 흡광도를 사용하였으며, 각각 45분 동안 대응하는 크로마토그램을 관찰하였다. 관찰 후, 각 분획을 모아 동결 건조하여 분말을 수득하였다.

2D-LC MS/MS 분석.

쿠마시 블루(Coomassie Blue) R-250 시약으로 시각화한 겔(gel) 스팟을 절개한 후, 각각 10 mM, 및 50 mM 농도의 요오드아세트아미드(iodoacetamide)를 이용하여 환원/알킬화 및 탈색시켰다(참고문헌 38 참조).

아세토니트릴로 겔 조각을 탈수한 후, 새로 준비된 두 배 부피의 트립신(20ng/mL in 25 mM NH₄HCO₃)용액을 첨가하고 섭씨 37℃에서 18시간 동안 배양하였다.

펩타이드를 0.1% 트리플루오로아세트산 및 50% 아세토니트릴 용액 10mL 로 2회 연속 추출하고, 진공 원심분리기를 통해 건조시킨 다음, 10mL의 0.1% 트리플루오로아세트산 용액에 재용해시켰다.

질량 분석과 단백질 동정은 ProteomeX LTQ 2D-LC-MS / MS 분광계(Sinco, Inc.)를 이용하여 수행되었고, 아미노산 서열은 Clustal 2.1 프로그램을 이용하여 분석하였다.

X선 크리스탈로그래피를 이용한 결정화 및 구조 결정.

LbCDPS는 295K에서 24-웰 코스타 플레이트(costa plates)를 사용하여 행잉 드롭 증기 확산법(hanging-drop vapor-diffusion method)에 의해 결정화되었다. LbCDPS의 초기 결정화 스크리닝은 Crystal ScreenI/II, Index, SaltRx. Natrix, Cryo, MembFac kits(Hampton Research, USA) 및 Wizard I, II screening soultions(Emerald BioSystems)을 이용한 마이크로-배치(micro-batch) 방법에 의해 수행되었다. 1uL의 단백질 용액과 같은 부피의 결정화 스크리닝 용액으로 구성된 드롭플릿(Droplets)을 72 웰 HLA 플레이트(Nunc)에서 실리콘 오일과 파라핀 오일이 1 : 1의 비율로 혼합된 레이어에 로딩하고, 295K에서 평형상태를 유지하였다.

3일 동안, pH 7.5, 100mM HEPES, 50 mM 염화마그네슘 및 30% 폴리에틸렌 글리콜 550(PEG 550)을 포함하는 조건 하에서 수개의 막대 모양(rod-shaped)의 크리스탈 번들(bundles)을 생산하였다.

이후, 결정화 조건을 30% PEG 550에서 16% PEG 550으로 조절하여 24-well 배양 플레이트를 사용하여 행잉-드랍 증기 확산(hanging-drop vapor diffusion) 방법으로 최적화하였다. 마지막으로, 단일 결정이 단백질 샘플(20MG/ML) 1μL 및 50mM MgCl₂,100mMHEPES,pH7.5,및 17% PEG550 조건 하에서, 침전 솔루션(precipitant solution)과 동일한 볼륨을 포함하는 드롭플릿(Droplets)에서 만들어졌다. 드롭플릿(Droplets)은 295K에서 동일한 침전용액 400μL에 대해 평형을 이루고 결정은 7일 정도에 최대 크기로 증가하였다.

셀레노메티닐(selenomethionyl) LbCDPS는 50 mM MgCl₂,100mMHEPES,pH7.5,및 17% PEG 550를 함유하는 침전 용액으로 네이티브 LbCDPS의 결정화와 동일한 절차에 의해 결정화되었다. 네이티브 LbCDPS 단결정을 5mM 기질(ATP, L β- 프로린 및 페닐알라닌)을 결정화 조건에서 배양하여 보조 인자 결합 복합체 구조(cofactor binding complex structure)를 해결하였다. 데이터 수집을 위해 나일론 루프(50 μm Mounted CryoLoop, Hampton Research)를 사용하여 LbCDPS의 단결정을 장착하고, 추가적인 동결방지제 없이 크라이오스트림 쿨러(Cryostream cooler, Oxford Cryosystems)를 사용하여 100K로 냉각시켰다. 포항 광원(Pohang Light Source, PLS)의 빔 라인 6C에서 ADSC Quantum 210 CCD를 사용하여 1.89Å 해상도의 네이티브 데이터 세트를 1.1 Å 파장으로 수집하였다. 크리스탈과 검출기 사이의 거리를 150mm로 설정하여 총 360 프레임의 1도 증감(1 degree oscillation)을 수집하였다. 2.30 Å 크기의 SAD 데이터 세트는 PLS의 빔라인 7A상의 ADSC Quantum 270 CCD를 사용하여 20.8Å의 파장에서 수집되었다. 총 999 프레임의 1도 진동이 120mm로 설정된 크리스탈 대 검출기 거리(crystal-to-detector distance)로 수집되었다.

재조합 CDPS에 의해 생산 된 CDP의 항균활성 분석(Antimicrobial assays of CDPs produced by recombinant CDPS)

디스크 확산 분석을 이용하여 항균 활성을 조사 하였다[참고문헌 39 참조]. 재조합 대장균의 배양 상등액을 사용하여 6mm 종이 디스크(Toyo Roshikaisha, 1td)에 점적하였다. 지표 균주로 사용되는 다제 내성 박테리아 균주(Multidrug-resistant bacteria strains)를 1% 용융 한천에 접종하였다.

점적된 디스크 페이퍼를 한천 플레이트 상에 놓고 적절한 온도에서 24 시간 동안 배양 하였다. 항균 활성은 억제 지름 (mm)에 의해 평가되었다.

Lactobacillus CFs에 의해 전달되는 아미노산 사용은 CDP 생합성을 수반하는 박테리아 세포 성장에 의해 외관상 변경되는 것으로 보인다.

Lactobacillus 균주는 제한된 생합성 능력을 위해 정교하거나 변경된 영양학적으로 까다로운 배양 요구 조건으로 인해 발효 중에 영양, 환경 및 산화 스트레스를 비롯한 다양한 대사적 사건을 보통 직면합니다. 따라서 세포 성장에 필요한 이러한 영양소는 일반적으로 생체내에서 숙주로부터 재구성되거나 시험관내 배양 배지에 펩톤과 효모 추출물을 포함한 복잡한 함량으로 보충함으로서 재구성된다[41]. 아미노산의 경우 락토바실러스의 성장, 발효 활동 및 젖산 생산에 기여할 수 있습니다 [42,43]. Lactobacillus 성장 동안의 아미노산 프로파일은 세포에 의해 소비 된 아미노산이 CF의 아미노산 함량 변화와 관련된 CDP 생산을 반영할지 여부을 이러한 이유에 따라 우선적으로 조사된다. 아미노산 분석기를 통한 선행 프롤린 감소는 최대 CDP 생산 기간으로 강조되어지는 약 60 시간에서 72 시간까지의 CF에서 특이적으로 감소되었고[4], 반면에 필수 또는 비필수 단백질생성 아미노산을 포함하는 대부분의 다른 아미노산은 세포 성장 동안 정상 상태의 내용물을 유지 한 후 60 시간에서 72 시간 사이에 유의적으로 상승했다(도1).

이 유리 아미노산 프로필은 Lb. reuteri의 성장이 MRS 배지에서 외인성 글루타티온의 존재 또는 부재에 의하여 분명하게 대표되었다[44]. 또한, Lactobacillus CFs의 이러한 아미노산 값은 프롤린 기반 CDP [4] 생합성-CDPS의 존재에 관한 추가 실험을 수행하는 기초가 되었다.

활성 염색 및 연속적인 크로마토그래피 분리를 사용하는 결합된 분석은 네이티브 젤에서 닌하이드린 반응에 의해 가능성이 있다.

아미노산, 펩타이드 및 단백질을 포함하는 생물물질을 확인하기 위해서 닌하이드린-포지티브 화합물을 사용할 때 네이티브 젤에서 색깔을 가진 발색단을 포함하는 닌하이드린의 도식적인 계층이 알파-아미노산 그룹의 염기적성질 및 입체적 조건의 기능에 기초하여 새로운 염색 방법을 위해 도입되었다(도 2).

컬럼 크로마토그래피에서의 세포 조추출물 또는 여액에서 LbCDPS의 검출을 위한 활성 염색은 여러 가지 다른 형태의 pH, ATP의 존재 및 부존재 및 유산균 배양액 안에 있는 효소 활성을 위한 적은 화합물의 완충용액내에서 여러 가지 L-아미노산을 포함하는 기질과의 겔의 반응에 따라서 가능할 수 있어 보였다(도 2). 또한 2mM의 닌하이드린 용액을 처리한 후 아민에 대한 닌히 드린 시험 동안 Ruhemann's purple (2- (1,3-디옥소인단-2- ) 이미노인단-1,3-디온)과 하이드리단틴(2,2'-dihydroxy-1H,1' H-2,2'-biindene-1,1',3,3'(2H,2' H)-tetrone)을 포함한 화학당량적인 닌하이드린 유래 발색단이 일반적으로 주된 반응 중간산물 또는 최종산물로 추정된다(도 2).

CDPS 활성도 및 이의 확증

생체내 합성 능력을 조사하여 CDPS의 존재를 조사하였다. 첫째, Lb. plantarum LBP-K10 으로부터의 조 추출물을 HPLC 시스템을 통해 300 mM NaCl로 용출시키고 1 시간마다 수집하여 총 11 개의 분획을 얻었다. 그런 다음, NaCl의 선형 농도 구배가 각 분획에 대해 수행되었다. 각 분획을 네이티브 SDS-PAGE를 수행하고, ATP가 있거나없는 프롤린 / 루신 또는 프롤린 / 페닐알라닌과 반응한 후 닌하이드린으로 염색 하였다. 우리의 예상대로 ATP 보충 조건에서 청색으로 염색 된 젤에서 무채색의 밴드가 관찰 될 수있었습니다(도 3). 우리는 사이클리 다이펩타이드의 생성을 검증하려고 시도했다. 우리는 Lb. plantarum LBP-K10 로부터 모든 분획을 아미노산과 ATP로 혼합하여였다. HPLC 분석은 cis-cyclo (L-Pro-L-Leu) 및 cis-cyclo (L-Pro-L-Phe)의 합성을 확인했습니다. 이 결과는 Lb. plantarum LBP-K10 조절된 배지에 CDPS의 존재를 나타 낼뿐만 아니라 CDPS의 활성이 ATP 의존성이라는 단서를 제공 하였다(도 4C)

Lb. plantarum LBP-K10 CDPS의 2D-LC-MS/MS

상기 결과에 따라, 본 발명자들은 도 3에서 강한 활성을 나타내는 5-11 분획의 네이티브 활성 염색에 의해 합성 활성을 확인하였다. 합성 능력은 증가하여 분획 9에서 가장 강한 활성을 나타냈다. 그 후, 활성은 점차 감소 하였다(도 3). 그 다음, 단백질 분획 5-11을 SDS 페이지에서 분리하여 CDPS로서 작용 한 후보 단백질을 조사 하였다. 우리는 합성 활동이 CDPS 단백질의 농축액에서 있어야 한다고 제안했다.

흥미롭게도, 빨간색 화살표로 표시된 밴드는 A 에서 밴드로 지시된 합성 능력과 같은 경향성을 보였다(도 5). 빨간색 화살표 표시된 밴드(분획 7-9)는 자른 후 램미리 염색 (laemmli-staining)으로 염색한

후 SDS-페이지를 수행했다. 분획 7 및 9의 밴드가 관찰 될 수 있었다(도 6B). 질량 분석 및 단백질 확인은 ProteomeX LTQ 분광기 (Sinco, Inc)에서 도 5A에 나타낸 분획 9 밴드로부터 분리된 CDPS로 수행 하였다. 단백질과 같은 분리된 CDPS는 계산된 분자량이 26.1 kDa 인 230 개의 아미노산으로 구성된 폴리펩타이드로 확인 될 수있다 (표 1). NCBI 게놈 데이터베이스로부터 690 bp의 서열을 얻을 수 있었다(도 6 및도 7). 그러나 11821150과 같은 접근번호만 할당되었다. 우리는이 연구에서이 CDPS 유사 단백질을 사이클릭 다이펩타이드 생합성 효소(cyclic dipeptide synthetase; CDPS)로 명명했다.

표 1 분리된 CDPS의 2D LC-MS로부터의 결과

Accession	MW [kDa]	calc. pI	Score	Description
gi311821850	26.1	5.07	1893.40	unnamed protein product [ Lactobacillus plantarum ]
gi342240618	30.9	5.20	328.45	fructose-bisphosphate aldolase [Lactobacillus plantarum WCFS1]
gi334089837	36.4	5.54	188.77	glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase [Lactobacillus plantarum]
gi300767613	25.7	4.64	138.68	triose-phosphate isomerase [Lactobacillus plantarum subsp. plantarum ATCC 14917]
gi342241915	47.1	4.88	84.67	30S ribosomal protein S1 [Lactobacillus plantarum WCFS1]
gi342242436	49.8	5.07	84.25	glucose-6-phosphate isomerase [Lactobacillus plantarum WCFS1]
gi342243047	47.2	5.64	78.17	adenylosuccinate synthase [Lactobacillus plantarum WCFS1]
gi342242987	39.9	5.78	67.88	inosine 5'-monophosphate (IMP) dehydrogenase [Lactobacillus plantarum WCFS1]
gi376010934	48.2	5.39	54.85	glutathione reductase [Lactobacillus plantarum subsp. plantarum NC8]
gi224831202	37.2	5.06	54.46	D-lactate dehydrogenase [Lactobacillus plantarum]
gi342240527	25.9	5.08	51.25	glucosamine-6-phosphate isomerase/deaminase [Lactobacillus plantarum WCFS1]
gi308180800	21.5	5.01	46.21	co-chaperone GrpE [Lactobacillus plantarum subsp. plantarum ST-III]
gi342241697	27.2	4.82	44.55	L-serine/threonine specific protein phosphatase [Lactobacillus plantarum WCFS1]
gi342241415	63.1	4.83	42.45	phosphoenolpyruvate-protein phosphotransferase [Lactobacillus plantarum WCFS1]
gi254555282	27.5	4.68	39.69	hydroxyethylthiazole kinase [Lactobacillus plantarum JDM1]
gi300636243	62.8	5.14	26.28	unnamed protein product [Lactobacillus plantarum]
gi46430487	33.9	4.98	25.74	L-lactate dehydrogenase [Lactobacillus plantarum]
gi45644480	57.4	4.81	22.95	GroEL [Lactobacillus plantarum]
gi308179245	23.8	5.02	22.56	beta-phosphoglucomutase [Lactobacillus plantarum subsp. plantarum ST-III]
gi254556766	96.5	5.34	20.49	ATP-dependent Clp protease, ATP-binding subunit ClpB [Lactobacillus plantarum JDM1]
gi2190422	40.7	5.59	19.72	alanine racemase [Lactobacillus plantarum]
gi376008932	25.9	5.21	19.58	D-ribitol-5-phosphate cytidylyltransferase [Lactobacillus plantarum subsp. plantarum NC8]
gi342242174	26.2	4.65	18.47	cell division initiation protein DivIVA [Lactobacillus plantarum WCFS1]
gi342241708	26.6	4.93	17.97	ribonuclease III [Lactobacillus plantarum WCFS1]
gi376009253	20.8	5.10	17.53	formylmethionine deformylase [Lactobacillus plantarum subsp. plantarum NC8]
gi254556111	53.2	5.33	16.91	aspartyl/glutamyl-tRNA amidotransferase subunit B [Lactobacillus plantarum JDM1]

재조합 CDPS의 활성

대장균의 pET3a (+) 시스템에서 CDPS 과발현은 쿠마시 블루로 염색 된 SDS 페이지에서 먼저 확인되었다(도 8). CDPS가 첨가 된 본래의 겔을 ATP의 존재하에 여러 종류의 아미노산과 함께 4 시간 동안 배양 한 후, 닌히 드린 염색에 의해 무색의 밴드가 관찰했다(도 8B). CDPS의 과발현이 사이클릭 다이펩타이드 생성을 초래할 수 있음을 확인하기 위해, HPLC를 이 유전자로 형질이입된 박테리아에 의해 생성 된 전체 사이클릭 다이펩타이드를 분석하기 위해 적용되었다. HPLC 결과의 넓은 스펙트럼에 따르면, 3 개의 L-프롤린 기반 사이클릭 다이펩타이드, cis-cyclo (L-Val-L-Pro), cis-cyclo (L-Leu-L-Pro), cis-cyclo (L-Phe-L-Pro)는 유의하게 증가 하였다 (도 9). CDPS 플라스미드로 형질 감염시킨 후, 이들 분획의 함량은 2.05, 2.33 및 2.56 배까지 현저히 증가 하였다(도 9 및도 10). pET3a-CDPS 플라스미드로 형질 감염된 대장균이 기능적 CDPS를 생성 할 수 있는지를 확인하기 위해, 디스크 확산 분석을 Lb. plantrum LBP-K10와 동일한 방법으로 수행 하였다. 도 11에 나타낸 바와 같이, CDPS 형질 전환 된 대장균 배양 여액은 그램 양성균 및 그람 음성균에 대하여 항균 활성을 나타내지만 대조군은 그렇지 않았다. 이러한 데이터는 대장균에서의 CDPS 형질 감염이 기능적인 표적 CDPS 발현을 야기한다는 것을 강하게 시사한다.

분리된 효소에 의한 사이클릭 다이펩타이드이 관측

재조합 과발현 CDPS가 기능적임을 확인하기 위해, 사이클릭 다이펩타이드 합성 활성을 시험 관내 또는 생체 내에서 시험 하였다. CDPS를 superdex 75 크로마토그램으로 정제하고 매 시간마다 수집 하였다. SDS- 페이지에서 25 kDa 초과 발현 된 각각의 분획이 확인되었다. 우리의 이전 결과와 일치하여, F9 분획은 가장 농축 된 CDP를 함유한다 (도 12A). 정제 된 CDPS의 닌하이드린 염색 후 합성 기능 분석을 전과 같이 수행 하였다. 효소 반응 및 연속 활성 염색을 통해, CDPS가 위치하는 활성 밴드는 투명한 회색을 나타내지만 백그라운드는 일반적으로 청색을 나타낸다 (도 12B). 시험관내에서 정제 효소에 의해 합성 된 사이클릭 다이펩타이드의 존재는 HPLC에 의해 추가로 확인되었다. HPLC 분석 조건에서, 불순물 또는 용매 피크가 10 분 이내에 검출되었다. 더욱이, 사이클릭 다이펩타이드의 체류 시간은 항상 10 분보다 길게 나타났다. 따라서 10 분 이상 체류 시간을 갖는 HPLC 크로마토그램에 의해 검출 된 피크는 효소 반응을 통해 생성된 사이클릭 다이펩타이드 또는 다른 부산물로 간주된다. 이러한 결과는 효소 반응에 의해 유도 된 예측된 사이클릭 다이펩타이드 분획화가 수행 될 수 있음을 나타낸다. 박테리아의 생물학적 활성을 위한 최적 온도가 섭씨 37도이고, CDPS의 활성은 ATP에 의존적이기 때문에, 반응 용액의 pH 값이 반응 조건과 관련된 가장 중요한 요소 일 수 있다. 따라서 L-프롤린과 L-리신, L-프롤린과 L-페닐알라닌, L-프롤린과 L-세린을 포함한 각 아미노산 조합을 사용하여 여러 pH 조건을 집중적으로 조사했다. 시험관내 조건에서 효소 반응에 의해 생성 된 사이클릭 다이펩타이드의 양을 HPLC 크로마토그램으로 측정 하였다. 흥미롭게도, 효소 활성에 대한 가장 효율적인 pH 값은 아미노산 조합 의존적 방식에 따라 정교하게 달랐다. 따라서 CDPS 활성은 pH 8에서 다른 pH보다 유의하게 높았다. HPLC 스펙트럼 (도 13a,도 13d) 나타낸 것 처럼 cyclo (Pro-Ser) 생산을위한 pH 6에서 낮은 활성을 보이는 것과 (도 13c) 대조적으로 pH 8은사이클로 다이펩타이드의 최고 피크를 갖는 cyclo(Pro-Lys) 및 cyclo(Pro-Val)의 생산을 위한 최적의 반응 pH 조건이었다 . 참고적인 실험과 비교할 때, HPLC 크로마토그램은 CDPS가 Pro-Lys, Pro-Phe, Pro-Val, Pro-Ser 및 Pro-Leu와 같은 각각의 사이클릭 다이펩타이드의 생성에 기여했다(도 13).

HPLC에 나타난 피크가 사이클릭 다이펩타이드인지를 확인하기 위해, 각각의 피크에 따른 각각의 화합물을 채취하여 전자 이온화 및 화학 이온화를 이용한 GC/MS 분석을 수행 하였다. 데이타베이스로부터 우리가 얻은 참고문헌과 이전의 젖산으로부터 분리된 화합물로부터 우리는 L-프롤린과 L-페닐알라닌을 포함한 반응 시스템에서 cyclo (Phe-Phe)와 cyclo (Pro-Phe)가 생성 될 수 있다고 결론 지었다(표 2a), L- 프롤린 및 L- 라이신을 포함하는 시스템에서 cyclo(Pro-Lys) 및 cyclo(Lys-Lys)이 생성되고(표 2b), L-프롤린과 L-세린을 포함하는 시스템에서는 cyclo(Pro-Ser)이 생성되고(표 2c), L-프롤린과 L-발린을 포함한 시스템은 cyclo (Pro-Val)를 생산된다. 그러나, 소량 또는 비효율적 이온화로 인해 검출 될 수없는 다른 종류의 사이클릭 다이펩타이드가 존재할 가능성을 배제 할 수 없었다.

표 2a L-Proline 및 L-Phenylalanine과 반응 한 생성물의 질량 분석

표 2b L-프롤린 및 L-리신과 반응 한 생성물의 EI 및 CI를 이용한 GC-MS에 의한 질량 분석

배

표 2c L-프롤린 및 L-리신과 반응 한 생성물의 EI 및 CI를 이용한 GC-MS에 의한 질량 분석

표 2d L-프롤린 및 L-세린과 반응 한 생성물의 EI 및 CI를 이용한 GC-MS에 의한 질량 분석

표 2e L-프롤린 및 L-류신과 반응 한 생성물의 EI 및 CI를 이용한 GC-MS에 의한 질량 분석

용액 중의 CDPS의 분자량

올리고머의 상태를 확인하기 위해, 정제된 CDPS 단백질 (도 14)을 Superose 12 10/300 GL 컬럼 (GE Healthare)에 분자량 표준과 함께 걸어주었다. Kav = (Ve-Vo) / (Vt-Vo) : Ve, 용출 부피; Vo, 공극 부피; Vt, 총 부피인 Kav에 대하여 표준 단백질의 분자량의 로그를 플롯팅하여 표준곡선을 만들었다. 동일한 컬럼을 사용하여 얻어진 CDPS의 Kav 단백질의 표준물질고의 프로파일과 비교하였다: CDPS의 예측 분자량은 99.18 kDa (Kav = 0.5)이며, 이는 CDPS가 용액 중에 사중체로 존재 함을 나타낸다(도 14C).

CDPS의 구조 결정

CDP의 구조를 더 잘 이해하기 위해, X 선 분석이 수행되었다. 결정

네이티브 데이타 세트와 Se-Met 치환물을 대한민국 포항 라이트 소스(Pohang Light Source; PLS)에서 BL-7A에서 Area detector Systems Corporation (ADSC)의 Quantum 210 전하 결합 소자 영역 검출기 시스템으로 100K에서 수집되었습니다. 회절 데이타는 프로그램 DENZO와 SCALEPACK [45]을 사용하여 처리되고 크기화되었다. 결정은 단위 격자 매개 변수 a = 234.63, b = 63.60, c = 70.43 옹스트롬 및 β = 94.17을 갖는 단사 정계 공간 그룹 c2에 속한다. 비대칭 단위가 하나의 분자를 함유하고 있다고 가정했을 때 결정의 용매 함량은 39.3 %였다 [46].

4 개의 셀레늄 사이트가 위치하고 (데이터는 표시되지 않음), SOLVE 및 RESOLVE [47,48] 프로그램을 사용하여 위상 세밀화를 수행했다. 초기 페이징 및 모델 구축은 Se-Met CDPS MAD 데이터 세트를 사용하여 수행되었다. 모델 구축은 프로그램 COOT 소프트웨어 [49]를 사용하고 CCP4 프로그램 슈트 (Collaborative Computational Project, 1994)에서 REFMAC5 [50]로 미세 조정했다. CDPS의 단결정은 50 mM MgCl2, 100 mM HEPES pH 7.5 및 17 % PEG550에서 제조되었다(도 15). 네이티브 CDPS 구조는 Rwork가 39.3이고 Rfree가 11.6이고 분해능 범위가 5.0-2.08 A이다. 네이티브 CDPS 구조의 세세한 통계수치는 표 3에 요약되어있다.

표 3 CDPS의 데이터 수집 및 세밀화 통계수치

a. 괄호 안의 숫자는 바깥 쉘에 대한 것이다.

b. R _sym=Σ_hΣ_I/Σ_h,_i-I_h/Σ_hΣ_II_h,i 여기서 Ih는 h의 반사와 관련된 대칭성의 I 관측의 평균 강도를 의미한다. .

c. R=Σ/F_o-F_c/ΣF_O, where F_o=F_p, and F_c is the calculated protein structure factor from the atomic model. R _free was calculated with 10% of the reflections.

d. R=Σ/F_o-F_c/ΣF_O, 여기서 Fo = Fp이고, Fc는 원자 모델로부터 계산된 단백질 구조 인자이다. Rfree는 반사율의 10 %에서 계산되었다.

재조합 CDPS의 전체 구조

도 16에 도시 된 바와 같이 CDPS의 리본 모델에 따르면, CDPS는 4 개의 동일한 서브 유닛을 갖는 사중체 구조로 구성된다. 2 차 구조의 관점에서, 서브 유닛은 알파 / 베타 / 알파의 3 개의 주요 층을 갖는다 (도 17). 여기에는 6 가닥의 혼합 베타 시트가 포함되어 있으며 하나의 가닥은 나머지에 역평행하게 존재한다. 전체 7개의 알파 나선과 5

310 나선이 베타 시트 레이어를 둘러싸고 있다. 네 개의 서브 유닛은 함께 대칭으로 중합되어 중심에 빈 공간을 형성한다(도 18). 유사한 결합 사이트가 PDBj 데이터베이스(http://pdbj.org/giraf/)를 통해 검색되었다. 흥미롭게도 결과는 CDPS의 서열은 알칼라인 포스파타제 수퍼 패밀리의 하나인 인간 phosphoglycerate mutase 1 (PGM1)과 74 %의 유사성 점수로 비교될 만 하였다(도 19). 주목할 만 하게도, 질량 110,000 kDa의 호모사중체(homotetramer)인 효모의 PGM 효소를 제외하고, PGM 효소는 보통 호모 이중체 분자이다. 따라서, 우리는 유산균 박테리아로부터 분리 된 CDPS가 알칼라인 포스파타제 수퍼 패밀리의 새로운 구성원임을 확인했다.

토의

CDPS의 구조와 기능을 풀어내는 것은 미생물에서 CDP 합성의 생리학적 과정을 밝히고 기능적 CDP를 생산하기위한 생체외 생물 반응기를 발명하는데 중추적인 역할을 한다. 이 연구에서 항균적 성질을 가진 CDP, 특히 프롤린 기반 CDP를 합성할 수 있는 새로운 CDPS 단백질을 확인했다. 이 유전자를 대장균으로 형질이입시키면, 기능성 CDPS를 얻을 수 있었다. 또한, HPLC 확인을 통해, 우리는 PBS 완충액에서 CDPS, 아미노산, ATP로 구성된 in vitro 반응 시스템을 성공적으로 결정했다. 우리는 섭씨 37도와 ATP 보충 조건에서 CDPS가 목표 CDP를 합성 할 수 있다는 것을 알아냈다. 그러나, 생체내 시스템과 비교하여, 합성 효능은 상당히 낮았다. 이것은 더 CDP의 높은 생산을 위해, 최적의 물리 화학적 조건을 정의해야하는 것 외에도 다른 보조 분자가 필요할 수 있음을 나타낼 수 있습니다. 더욱이, 우리는 CDPS가 특히 프롤린 계 DZK 고리 구조를 갖는 CDP의 합성을 촉매한다는 것을 알아 냈다. 우리는 X 선 결정학적 분석에 의해 CDPS의 3 차원 구조를 더 분석했다. 우리는 현재 합성 과정을 보다 자세하게 밝히기 위해 촉매 사이트를 확인하기 위해 노력하고 있습니다. 결론적으로 CDPS는 이름없는 단백질 (gi311821850)의 기능과 같이 처음보고 되었으며, 새로 발견된 CDPS 단백질인 CDPS를 기반으로 한 시험관 내 CDP 합성 조건을 성공적으로 개발했습니다. 이 연구는 생합성 경로를 통해 시험관내에서 CDP를 생산하고 미생물에서 기능성 CDP 합성 경로에 대한 생리학 기전을 발견하는데 기여할 것이다.

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<110> SNU R&DB Foundation <120> Cyclic dipeptide synthetase <130> PN170003 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 230 <212> PRT <213> Lactobacillus plantarum <400> 1 Met Ala Lys Leu Val Leu Ile Arg His Gly Gln Ser Glu Trp Asn Leu 1 5 10 15 Ser Asn Gln Phe Thr Gly Trp Val Asp Val Asp Leu Ser Glu Lys Gly 20 25 30 Val Glu Glu Ala Lys Ala Ala Gly Gln Lys Val Lys Glu Ala Gly Leu 35 40 45 Glu Phe Asp Tyr Ala Phe Thr Ser Val Leu Thr Arg Ala Ile Lys Thr 50 55 60 Leu His Tyr Val Leu Glu Glu Ser Asp Gln Leu Trp Ile Pro Glu Thr 65 70 75 80 Lys Thr Trp Arg Leu Asn Glu Arg His Tyr Gly Ala Leu Gln Gly Leu 85 90 95 Asn Lys Lys Glu Thr Ala Glu Lys Tyr Gly Asp Asp Gln Val His Ile 100 105 110 Trp Arg Arg Ser Tyr Asp Val Leu Pro Pro Leu Leu Ser Ala Asp Asp 115 120 125 Glu Gly Ser Ala Val Asn Asp Arg Arg Tyr Ala Asp Leu Asp Pro Asn 130 135 140 Ile Val Pro Gly Gly Glu Asn Leu Lys Val Thr Leu Glu Arg Val Met 145 150 155 160 Pro Phe Trp Glu Asp Gln Ile Ala Pro Lys Leu Leu Asp Gly Lys Asn 165 170 175 Val Ile Ile Ala Ala His Gly Asn Ser Leu Arg Ala Leu Ser Lys Tyr 180 185 190 Ile Glu Gln Ile Ser Asp Asp Asp Ile Met Asp Leu Glu Met Ala Thr 195 200 205 Gly Glu Pro Val Val Tyr Asp Phe Asp Glu Lys Leu Lys Val Leu Gly 210 215 220 Lys Glu Lys Leu Gly Lys 225 230 <210> 2 <211> 693 <212> DNA <213> Lactobacillus plantarum <400> 2 atggcaaaat tagtattgat tcgtcacggt caaagtgaat ggaacttatc taaccaattt 60 actggttggg ttgacgttga tttaagcgaa aagggtgttg aagaagctaa ggctgctggt 120 caaaaagtta aagaagcagg cttagaattc gattacgcct ttacttcagt tttgactcgt 180 gccatcaaga ctttgcacta tgtgcttgaa gaatccgacc aactctggat tccagaaacc 240 aagacttggc gtttaaacga acgtcattat ggtgcattac aaggattgaa caagaaggaa 300 accgctgaaa aatacggtga cgaccaagtt catatctggc gtcgttctta tgatgtttta 360 cctccattat tgagtgccga tgatgaaggt tcagccgtta acgatcgtcg ttacgctgac 420 ttagacccta acatcgtccc tggtggcgaa aacttgaagg ttaccttgga acgcgttatg 480 cctttctggg aagaccaaat cgcacctaag ttattagacg gcaagaatgt aatcattgct 540 gcccacggta actcattacg tgccttaagc aagtacatcg aacaaatcag tgatgatgat 600 atcatggacc ttgaaatggc tactggcgaa ccagttgtct atgactttga tgaaaagtta 660 aaggttcttg gtaaggaaaa gttaggcaaa taa 693 <210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NdeI site, forward <400> 3 catatggcaa aattagtatt gattcgtcac ggt 33 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BamHI site, reverse primer <400> 4 ggatccttat ttgcctaact tttccttacc aag 33

Claims (11)

1. 서열목록 1의 효소를 포함하는 사이클릭 다이펩타이드 합성용 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 사이클릭 다이펩타이드는 cis-cyclo (L-Val-L-Pro), cis-cyclo (L-Leu-L-Pro) 및 cis-cyclo (L-Phe-L-Pro)으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상의 사이클릭 다이펩타이드인 것을 특징으로 사이클릭 다이펩타이드 합성용 조성물.
3. 서열목록 2의 사이클릭 다이펩티다아제를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합벡터를 숙주세포내 형질전환하여 사이클릭 다이펩티다아제를 생산하는 것을 특징으로 하는 사이클릭 다이펩타이드 합성용 조성물 제조 방법.
4. 제 3 항에 있어서, 상기 사이클릭 다이펩타이드는 cis-cyclo (L-Val-L-Pro), cis-cyclo (L-Leu-L-Pro) 및 cis-cyclo (L-Phe-L-Pro)으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상의 사이클릭 다이펩타이드인 것을 특징으로 하는 사이클릭 다이펩타이드 합성용 조성물 제조방법.
5. 제 3 항에 있어서 상기 숙주세포는 원핵세포인 것을 특징으로 하는 사이클릭 다이펩타이드 합성용 조성물 제조방법.
6. 제 1 항에 따른 사이클릭 다이펩티다아제 합성용 조성물를 이용한 사이클릭 다이펩타이드 함량 증가 방법.
7. 제 6 항에 있어서, 상기 사이클릭 다이펩타이드는 cis-cyclo (L-Val-L-Pro), cis-cyclo (L-Leu-L-Pro) 및 cis-cyclo (L-Phe-L-Pro)으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상의 사이클릭 다이펩타이드인 것을 특징으로 하는 사이클릭 다이펩타이드 함량 증가 방법.
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