KR102125506B1

KR102125506B1 - 아스페르길루스 플라부스 균주를 포함하는 노린재 방제용 미생물 제제

Info

Publication number: KR102125506B1
Application number: KR1020180164790A
Authority: KR
Inventors: 이동혁; 김세진; 남종철; 김지원
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2018-12-19
Filing date: 2018-12-19
Publication date: 2020-06-24

Abstract

본 발명은 아스페르길루스 플라부스(Aspergillus flavus) 균주를 포함하는 노린재 방제용 미생물 제제에 관한 것으로, 구체적으로 수탁번호 KACC93322P로 기탁된 KGw01 균주, 상기 균주 및 이의 포자를 함유하는 노린재 방제용 미생물 제제, 및 상기 미생물 제제를 노린재에 처리하는 단계를 포함하는 노린재 방제 방법에 관한 것이다.

Description

아스페르길루스 플라부스 균주를 포함하는 노린재 방제용 미생물 제제 {Microbial agents for controlling stink bugs comprising an Aspergillus flavus strain}

농작물의 생산량 증감에 영향을 미치는 원인으로는 태풍, 우박과 같은 기후적인 영향과 토양의 종류, 배수 관리 등의 재배 조건에 따른 영향, 그리고 진딧물류, 응애류, 노린재 등 각종 해충에 따른 피해 등을 들 수 있다.

상기 해충 중에서 노린재는 반시류라고 하기도 하며, 지상생활, 수서생활, 진수서성, 반수서성, 육수성, 해수성, 표토 등 다양한 서식지에서 생활한다.

성충으로 낙엽 또는 상록수 숲에서 월동하며 4월 중순부터 활동을 개시하고 전 생육기간 동안 농작물에 피해를 주며, 특히 7 ~ 8월에는 사과, 배 등 대부분의 과실류에 큰 피해를 준다.

노린재는 2000년 이후부터 발생량이 크게 증가하여 이를 관리하지 않을 경우 농작물의 정상적인 수확이 어려울 지경에 이르렀다. 사과와 같은 과실 피해 역시 2000년 이후부터 증가하였고, 2001년 이후부터는 노린재 발생 과원율이 20% 이상으로 지속적으로 사과원에서 피해가 확인되었으며, 2013년에는 발생 과원율이 50% 이상을 차지하여 사과원의 주요 해충으로 자리잡았다.

노린재의 다발생 원인으로 지구 온난화로 인한 노린재의 월동 및 월동 후 증식의 유리한 조건, 산림 생태계의 변화에 의한 노린재의 기주 및 월동에 유리한 조건, 다양한 재배 양식, 화학성분의 약제 관리 증가 등의 농업생태계의 변화와 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있지만, 정확한 원인은 아직 밝혀지지 않고 있다. 노린재의 발생량 증가는 우리나라뿐만 아니라 일본, 미국, 유럽 등 전세계적으로 유사하다.

농작물 및 과실류에 피해를 주는 노린재를 방제하기 위한 방법으로 과실에 봉지를 씌우거나 화학적 성분이 함유된 살충제를 살포하거나, 천적을 이용하여 노린재 알에 기생하는 기생벌에 의한 생물적 방제법 등이 알려져 있다.

그러나, 상기 봉지를 씌우는 법은 일손이 많이 들어 비효율적이며, 화학성분이 함유된 살충제는 토양과 환경 오염은 물론 인체에도 악영향을 미치는 등 문제점이 있었다. 또한 천적을 이용한 방법은 증식에 막대한 비용이 소요되고 방사 시 환경 적응성이 떨어져 현실적으로 적용하기 어려운 문제가 있었다.

특히, 화학성분이 함유된 살충제의 한계를 극복하기 위해 미생물 제제, 천연 추출물을 이용한 생물학적 방제에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.

상기 미생물 제제에 포함되는 곤충병원성 곰팡이는 단세포 형태, 또는 분지된 실모양의 균사와 이 균사들이 모여 이루어진 매트 형태의 균사체로 이루어져 있다. 상기 곤충병원성 곰팡이는 대상으로 하는 해충만을 선별적으로 제거할 수 있는 선택성이 있으므로 일반적으로 사람, 고등생물, 식물 등에 직간접적인 위해 요소가 없어 안전하다. 또한 살충효과가 지속되므로 미생물제제를 반복적으로 살포하는 횟수를 최소한으로 줄일 수 있는 장점이 있다. 현재 화학적 합성 살충제에 대한 해충 저항성의 발달, 소비자의 안전 농산물에 대한 요구, 친환경 농업을 통한 환경 보호의 중요성 등이 부각되면서 곤충병원성 미생물을 활용한 미생물 살충제의 개발 요구가 커지고 있다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 노린재를 효과적으로 방제하기 위한 곤충병원성 곰팡이를 선별하고자 예의 노력한 결과, 노린재 사체로부터 분리한 곤충병원성 곰팡이에서 아플라톡신 생성 균주인 아스페르길루스 플라부스(Aspergillus flavus) KGw01 균주를 선별하였고, 노린재 방제에 효과가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 아스페르길루스 플라부스(Aspergillus flavus)를 포함하는 노린재 방제용 신규 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 아스페르길루스 플라부스(Aspergillus flavus) KGw01 균주 또는 이의 포자를 유효성분으로 함유하는 노린재 방제용 미생물 제제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 노린재 방제용 미생물 제제를 노린재에 처리하는 단계를 포함하는 노린재 방제 방법을 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 발명에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 아스페르길루스 플라부스(Aspergillus flavus)를 포함하는 노린재 방제용 신규 균주를 제공한다.

본 발명의 "아스페르길루스 플라부스"는 누룩곰팡이속 자낭균문에 속하는 균류로서, 부패성 진균류이다. 전세계적으로 분포하는 곰팡이이고, 아열대 또는 열대 지방에 주로 분포하고 있다. 상기 아스페르길루스 플라부스 종 내에는 아플라톡신(Aflatoxin, AF)을 생성하는 균주와 생성하지 않는 균주가 있다.

본 발명의 "아플라톡신"은 공기, 흙, 식물, 동물 등 자연계에 널리 기생하는 곰팡이인 아스페르길루스 플라부스(Aspergillus flavus) 및 아스페르길루스 파라시티쿠스(Aspergillus parasiticus) 균류에 의해 생성되는 맹독소로 지금까지 알려진 발암 물질 중 강력한 발암 유발물질 중의 하나이다. 주로 산패한 호두, 땅콩 등의 견과류에서 발견되고, 상기 아플라톡신에 노출되면 성장 장애, 발달 지연, 간 손상 및 간암을 발생시킨다.

본 발명의 아스페르길루스 플라부스는 상기 아플라톡신을 생성하는 균주이며, 보다 구체적으로 수탁번호 KACC93322P로 기탁된 신규 균주이고, 보다 더 구체적으로 KGw01 균주일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 "KGw01 균주"는 노린재류의 사체로부터 곰팡이를 분리하여 배양하고, 단포자 분리후 계대배양을 하여 확보한 세 균주 중에서 아플라톡신 생성 균주로서 선별된 균주이다. 본 발명의 구체적인 일 구현예에서, 상기 KGw01 균주는 노린재를 효과적으로 방제하는 곤충병원성 곰팡이임을 확인하였다.

본 발명의 "노린재"는 작물의 종자, 열매, 과일 등을 구침으로 찔러 흡즙하는 흡즙성 해충으로 재배 산물을 직접 가해하여 생산량 감소와 품질 저하를 일으킨다. 상기 노린재는 강한 기아내성으로 긴 수명을 가지며, 번식력이 왕성하여 일정 조건이 성립되면 개체수가 급증하고, 약충과 성충 모두 같은 작물을 봄부터 늦가을까지 가해한다. 다양한 기주식물과 이동성이 넓어 방제가 어려운 해충이다.

본 발명의 "방제"는 작물 등의 식물을 병해충의 피해로부터 예방, 발생한 병원체의 제거 또는 병원체의 파급을 저지시키는 것을 의미한다. 병해충에 독성이 있는 살균제 또는 살충제를 사용하는 화학적 방제뿐만 아니라 저항성 식물의 재배, 천연 미생물 제제의 이용, 돌려짓기 등을 통한 병원체에 부적절한 환경을 조성하는 방법, 식물체를 열처리하거나 토양을 증기 처리하여 병원체를 제거하는 방법, 유인물질이나 성페로몬을 이용하여 해충을 유인하여 포살하는 방법 등이 포함된다.

본 발명의 "곤충병원성 곰팡이"는 단세포 형태, 또는 분지된 실모양의 균사와 이 균사들이 모여 이루어진 매트 형태의 균사체로 이루어진 곰팡이이다. 상기 곤충병원성 곰팡이는 기주곤충의 체벽을 통해 침투한다. 곤충병원성 곰팡이의 생식에 의하여 생성되는 분생포자는 미생물 제제에서 가장 흔하게 사용되는 감염단계이다. 즉, 곤충병원성 곰팡이의 분생포자가 기주곤충의 표피에 부착하고, 부착된 분생포자가 발아하여 균사가 기주곤충의 체벽을 뚫고 곤충의 내부로 침투하게 되며, 기주곤충의 체내에 침입한 균사는 기주체액에서 증식한 후 조직체 내로 침입하여 기주곤충의 면역작용을 차단하고 독성물질을 분비하여 기주곤충을 치사시킨다. 상기 곤충병원성 곰팡이는 대상으로 하는 해충만을 선별적으로 제거할 수 있는 선택성을 가진다.

본 발명의 구체적인 일 구현예에서, 상기 곤충병원성 곰팡이는 아스페르길루스 속 균류일 수 있으며, 보다 구체적으로 아스페르길루스 플라부스, 보다 더 구체적으로 아스페르길루스 플라부스 KGw01 균주일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 다른 하나의 양태는 아스페르길루스 플라부스(Aspergillus flavus) KGw01 균주 또는 이의 포자를 유효성분으로 함유하는 노린재 방제용 미생물 제제를 제공한다.

본 발명의 "아스페르길루스 플라부스", "KGw01 균주", "노린재", 및 "방제"는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명의 "포자"는 무성생식 식물 중에서 양치식물, 선태식물, 조류, 균류(곰팡이)에서 분리되는 단세포의 생식세포이다. 두꺼운 세포벽을 가지며, 많은 양이 형성되어 넓게 분산된다. 단독으로 성장해 새로운 개체를 형성한다. 본 발명의 구체적인 일 구현예에서 상기 포자는 KGw01 균주의 포자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 "미생물 제제"는 미생물 자체를 직접 이용하거나 미생물을 포함한 제제를 이용하여 농작물에 피해를 주는 곤충, 응애, 선충 등의 해충과 각종 식물 병원균 또는 잡초를 효과적으로 방제하는데 쓰이는 생물 제제이다. 본 발명의 구체적인 일 구현예에서, 상기 해충은 노린재류일 수 있고, 일례로 갈색날개노린재, 썩덩나무노린재, 톱다리개미허리노린재, 풀색노린재 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 구체적인 일 구현예에서, 상기 미생물 제제는 아플라톡신을 생성하는 균주로 선별된 아스페르길루스 플라부스 KGw01 균주 또는 이의 포자를 유효성분으로 함유할 수 있다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 노린재 방제용 미생물 제제를 노린재에 처리하는 단계를 포함하는, 노린재 방제 방법을 제공한다.

상기 방제 방법은 노린재에 직접 또는 간접적으로 본 발명의 노린재 방제용 미생물 제제를 처리하는 방법일 수 있고, 일례로 인간, 동물 등의 주변 또는 노린재가 서식할 것으로 예측되는 장소에 상기 노린재 방제용 미생물 제제를 위치시키는 것일 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 구현예에서, 상기 방제 방법은 노린재에 직접 살포하여 직접 접촉하게 하는 방법이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 아스페르길루스 플라부스(Aspergillus flavus)를 포함하는 신규 균주, 상기 신규 균주인 KGw01 균주 및 이의 포자를 함유하는 노린재 방제용 미생물 제제는 노린재에 높은 살충력을 보이므로, 이동성이 넓어 방제가 어려운 노린재를 효과적으로 방제할 수 있는 친환경 미생물 제제로 활용도가 높을 것으로 기대된다.

도 1a는 과원에서 채집한 노린재에 감염된 곤충병원성 곰팡이를 나타낸 도이고, 도 1b는 상기 곰팡이를 확대한 도이다.
도 2a는 아스페르길루스 플라부스 KGw01 균주의 배양을 나타낸 도이고, 도 2b는 상기 균주의 균학적 특성을 나타낸 도이다.
도 3은 ITS, β tubulin, calmodulin 영역의 염기서열 확인을 위해 추출한 DNA를 분석한 도이다.
도 4는 아스페르길루스 플라부스 KGw01 균주의 아플라톡신 생성 여부를 확인한 도이다.
도 5는 곤충병원성 곰팡이 아스페르길루스 플라부스 KGw01 접종 후 썩덩나무노린재 성충의 보정사망률을 나타낸 도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 곤충병원성 곰팡이 Aspergillus flavus 동정

과원에서 노린재에 감염된 곤충병원성 곰팡이를 채집하였다(도 1a 및 도 1b). 상기 노린재류의 사체로부터 곰팡이를 분리하여 배양하였고(도 2a), 분리된 곰팡이에서 다시 단포자를 분리한 후 계대 배양을 하여 균주를 확보하였다(도 2b).

상기 계대 배양을 통해 균주 3개를 확보하여 서열번호 1의 ITS 염기서열, 서열번호 2의 β tubulin 염기서열, 및 서열번호 3의 calmodulin 염기서열을 분석하였다. 곰팡이의 유전자 염기서역 분석을 위해 배양된 곰팡이의 균사체를 긁어 Quick method법(Chi 등, 2009)을 이용하여 genomic DNA를 추출하였다. 유전자 증폭을 위해 사용한 프라이머는 primers ITS-1F (서열번호 4, 5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'), ITS-4 (서열번호 5, 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'), Bt2a (서열번호 6, 5'-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3'), Bt2b (서열번호 7, 5'-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3'), cmd5 (서열번호 8, 5'-CCGAGTACAAGGARGCCTTC-3'), cmd6 (서열번호 9, 5'-CCGATRGAGGTCATRACGTGG-3')(Marchesi 등, 1998)로 각각의 영역을 증폭하였으며, 최종 PCR산물을 1.0% agarose gel에서 전기영동하여 확인하였다. 전기영동으로 확인된 PCR 증폭산물은 NucleoSpin Gel and PCR Clean-up (MN, Germany)을 이용하여 정제하였다. 염기서열 분석은 Macrogen(Seoul, Korea)에 의뢰하였으며, 얻어진 염기서열은 DNASTAR computer package 5.05를 이용하여 정리한 뒤, NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 BLAST search를 통하여 nucleotide sequence의 유사도를 조사 하였다. 그 결과, 상기 균주는 아스페르길루스 플라부스(Aspergillus flavus)와 100%의 상동성을 나타내었으며. 균주는 아스페르길루스 플라부스(Aspergillus flavus)동정되었다.

실시예 2. 아플라톡신 검출키트를 이용한 아플라톡신 생성 유무 확인

본 발명의 아스페르길루스 플라부스 균주의 아플라톡신 생성 유무를 확인하기 위하여, 아플라톡신 검출 키트(Romer Labs, USA)를 이용하여 액체 배양한 균주의 아플라톡신 생성 유무를 확인한 결과, 아스페르길루스 플라부스 KGw01 균주는 아플라톡신을 생성하는 균주로 확인되었다(도 4).

실시예 3: 곤충병원성 곰팡이를 이용한 노린재류에 대한 병원성 검정

곤충병원성 곰팡이 아스페르길루스 플라부스 KGw01 균주를 이용하여 포장에서 채집한 건전한 썩덩나무노린재 성충에 대한 병원성을 검정한 결과, 일반적인 생물농약의 농도인 10⁶에서 살포 3일 후 100%의 보정사망률을 보임을 확인하였다(도 5).

이를 통해, 아스페르길루스 플라부스 KGw01 균주는 아플라톡신 생성 균주로서 높은 살충력을 가지고 있음을 확인하였다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 아스페르길루스 플라부스(Aspergillus flavus) KGw01 균주를 포함하는 노린재 방제용 미생물 제제는 아플라톡신을 분비하는 KGw01 균주를 포함하고 노린재에 높은 살충력을 보이므로, 노린재를 효과적으로 방제하기 위한 친환경 미생물 방제제로 활용도가 높을 것으로 기대된다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

농업생명공학연구원

KACC93322

20181213

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Microbial agents for controlling stink bugs comprising an Aspergillus flavus strain <130> KPA181159-KR <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 529 <212> DNA <213> Aspergillus flavus <400> 1 tcaacctgga aaagattgat ttgcgttcgg caagcgccgg ccgggcctac agagcgggtg 60 acaaagcccc atacgctcga ggatcggacg cggtgccgcc gctgcctttg gggcccgtcc 120 cccccggaga ggggacgacg acccaacaca caagccgtgc ttgatgggca gcaatgacgc 180 tcggacaggc atgccccccg gaataccagg gggcgcaatg tgcgttcaaa gactcgatga 240 ttcacggaat tctgcaattc acactagtta tcgcatttcg ctgcgttctt catcgatgcc 300 ggaaccaaga gatccattgt tgaaagtttt aactgattgc gatacaatca actcagactt 360 cactagatca gacagagttc gtggtgtctc cggcgggcgc gggcccgggg ctgagagccc 420 ccggcggcca tgaatggcgg gcccgccgaa gcaactaagg tacagtaaac acgggtggga 480 ggttgggctc gctaggaacc ctacactcgg taatgatcct tccgcaggt 529 <210> 2 <211> 448 <212> DNA <213> Aspergillus flavus <400> 2 gaaaacgaag ttgtcgggac ggaagagctg accgaaggga ccggcacgga cggcgtccat 60 ggtaccaggc tcaagatcaa cgaggacggc acgagggaca tacttgtttc cgctggcctg 120 gagaagcggt caggagttgc aaagcgtttt catagatgct gaaattttga ggtacgcacc 180 tcgttgaagt agacgttcat acgctccagc tggagatcgg aggagccatt gtaactatcc 240 ttgccgtcag atccattcca acttctaatg ccatatggtc gtcgttcgtt cgaggtgtat 300 acaggctgta cttacacacc ggagccgtca aggccgtgct cgccagagat ggtttgcctg 360 caaagttgtt agcaaacatg tggcagatat aacaggacac atccgagatc atgcttttga 420 ggagttcctt ggtccaaagc atactaac 448 <210> 3 <211> 544 <212> DNA <213> Aspergillus flavus <400> 3 attggggagg tctgacgtgg cgcaattcgg cagcggagat gaagccgttg ttatcgcggt 60 cgaaaacctt gaaagcctcc cggatctcct cctcagagtc ggtatccttc atctttctcg 120 ccatcatcgt caggaactct atttgaacat taacagctat ttcatttatg aatcgtacgg 180 aagccgtctc gtaccaggga agtcaatggt gccattgttg tcggcgtcaa cctcgttaat 240 catgtcctgg agttccgact cagaggggtt ttggcccaga gagcgcatga cagtgcccaa 300 ctccttggtg gtgatctggc ctgcatatca agtcaattca tcaatgccaa gacttcagcc 360 gatcgaacag aaactggata aaattttggc ggctaaaaca tattgatcgc atttgaaggg 420 agaatgaata aataaactgt actaaccatc accgtccttg tcctatagga aacccaagaa 480 aagccaagtc agcttgtgtt caaatcatga cgactaacaa aaccaatttt cacgaacgac 540 gata 544 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITS-1F <400> 4 cttggtcatt tagaggaagt aa 22 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITS-4 <400> 5 tcctccgctt attgatatgc 20 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bt2a <400> 6 ggtaaccaaa tcggtgctgc tttc 24 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bt2b <400> 7 accctcagtg tagtgaccct tggc 24 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cmd5 <400> 8 ccgagtacaa ggargccttc 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cmd6 <400> 9 ccgatrgagg tcatracgtg g 21

Claims

노린재 방제능이 있는, 수탁번호 KACC93322P로 기탁된 아스페르길루스 플라부스(Aspergillus flavus) KGw01 균주.
삭제
아스페르길루스 플라부스 KGw01 균주 또는 이의 포자를 유효성분으로 함유하는, 노린재 방제용 미생물 제제.
제3항에 있어서, 상기 아스페르길루스 플라부스 KGw01 균주는 아플라톡신 생성 균주인 것인, 노린재 방제용 미생물 제제.
제3항에 있어서, 상기 아스페르길루스 플라부스 KGw01 균주는 서열번호 1의 ITS 염기서열, 서열번호 2의 β tubulin 염기서열, 및 서열번호 3의 calmodulin 염기서열을 포함하는 것인, 노린재 방제용 미생물 제제.
제3항에 있어서, 상기 노린재는 갈색날개노린재, 썩덩나무노린재, 톱다리개미허리노린재, 또는 풀색노린재인 것인, 노린재 방제용 미생물 제제.
제3항 내지 제6항 중 어느 한 항의 노린재 방제용 미생물 제제를 노린재에 처리하는 단계를 포함하는, 노린재 방제 방법.