KR102118240B1 - 폴리펩티드의 α-아미드화 및/또는 C-말단 아미노산 분열의 제어를 위한 세포 배양 매질 및 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 세포 배양에서 발현된 폴리펩티드의 C-말단 이종성을 감소시키기 위한 세포 배양 매질로서, 1 이상의 필수 미량 원소를 유효량으로 포함하는 세포 배양 매질, 및 단백질의 C-말단 이종성을 감소시키기 위한 세포 배양 방법으로서 필수 미량 원소가 사용되는 방법에 관한 것이다.

Description

폴리펩티드의 α-아미드화 및/또는 C-말단 아미노산 분열의 제어를 위한 세포 배양 매질 및 방법{CELL CULTURE MEDIUM AND PROCESS FOR CONTROLLING α-AMIDATION AND/OR C-TERMINAL AMINO ACID CLEAVAGE OF POLYPEPTIDES}

본 발명은 광범위하게는 세포 배양 매질 조성물 및 세포 배양 방법의 기술 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 폴리펩티드, 예컨대 당단백질에서의 이종성 감소에 관한 것이다.

포유류 세포에서의 재조합형 단백질 생성 동안, 단백질의 다수 변형이 이의 발현 후에 발생하고(즉, 전이 후(post-translationally)), 따라서 재조합형 단백질 생성물의 이종성을 유발시킨다. 전이 후 변형은 단백질에 대한 뉴클레오티드 서열 코딩에 의해 인코딩되지 않으나 대부분 몇몇 주변 효소 작용에 의존하기 때문에, 이는 그 생성 중에 엄격한(바람직한) 사양 범위를 제어 및 유지하기 어렵다. 따라서, 특히 재조합형 치료 단백질의 제조 중 최대 난제는 단백질 생성물의 특징 및 품질을 일정하게 유지하는 것이다.

폴리펩티드의 모든 관련하는 잠재 품질 특성의 광범위한 목록 내에서, C-말단 α-아미드화는 C-말단 이종성 그룹에 기인한다. 중쇄 상의 C-말단 리신(Lys)의 프로세싱은 재조합형 단일클론 항체(mAb)의 가장 일반적인 변형 중 하나이다. 중쇄의 C-말단 상의 Lys는 염기성 카르복시펩티다제(CPs)의 활성에 의해 전부 또는 일부 제거될 수 있다. 하나의 C-말단 Lys 잔기의 제거는 128 Da만큼 분자량을 감소시키고 양전하를 1 유닛(unit)만큼 증가시킨다. C-말단 Lys 잔기의 일부 제거는 0, 1 또는 2의 C-말단 Lys 잔기를 갖는 항체의 혼합 개체를 유발시킨다(mAbs의 4차 구조로 인함)(Liu et al. 2008). Lys의 부재 시, 2차 아미노산 글리신(Gly)은 더욱 제거될 수 있고, 잔류하는 C-말단 아미노산 프롤린(Pro)은 이후 효소적으로 α-아미드화된다.

C-말단 α-아미드화는 공지되어 있으며, 펩티드 및 단백질의 생물학적 활성에서 크게 중요하다. 많은 뉴로펩티드가 활성 수용체-결합 분자로 성숙하기 위한 C-말단 α-아미드화 단계를 필요로 한다. 예를 들어, 류로톡신(leurotoxin)의 비아미드화된 동족체는 C-말단 α-아미드화된 Pro를 포함하는 류로톡신과 비교하여 4배 낮은 활성을 갖는다. 인간 혈장 내 인간 면역형성 MART-1 펩티드의 안정성은 C-말단 α-아미드화에 의해 현저하게 증가된다. 뱀 독의 C-터미널 α-아미드화는 이의 단백질분해성 분해를 감소시켜 용액 내 이의 수명을 증가시키고, 변형되지 않은 펩티드에 비해 높은 활성을 유도한다. 테트라펩티드 아세틸-Ser-Asp-Lys-Pro는 인간 및 설치류(murine) 원시 조혈 세포의 증식을 억제하고 안지오텐신 I 변환 효소(ACE: Angiotensin I-Converting Enzyme)에 의해 용이하게 분해된다. 이의 C-말단 α-아미드화된 동족체는 ACE에 의해 분해될 수 없으며, 이의 혈장 레벨은 야생형 펩티드의 것보다 26배 높다. 따라서, 펩티드의 C-말단 α-아미드화는 이의 고유한 생물학적 및 면역학적 활성 및 또한 이의 안정성을 증가시킨다.

C-말단 α-아미드화는 이작용성 펩티딜글리신 α-아미드화(PAM) 효소에 의해 촉매화되는 배타적 촉매 반응이다. 제1 단계는 펩티딜글리신 α-히드록실화 모노옥시게나제(PHM, EC 1.14.14.3) 도메인에 의한 C-말단 글리신 잔기의 α-히드록실화이다. 제2 단계는 펩티딜 α-히드록시글리신 α-아미드화 리아제(PAL, EC 4.3.2.5) 도메인에 의해 상기 α-히드록시글리신 연장된 펩티드를 α-아미드화된 펩티드로 탈알킬화시키는 것이다(Metha NM, 2009). PAM의 효소 반응의 추가 참조를 위해서는, 국제 출원 PCT/EP2011/069756 또는 PCT/EP2013/057866을 참조할 수 있으며, 이의 개시 내용은 그 전체가 본 원에서 참조 인용된다.

이의 내용에서, 정제된 PAM에 대한 몇몇 연구가 실험관 내 및 생체 내 C-말단 α-아미드화를 증가시키기 위해서 수행되었다. 이러한 연구로부터, 많은 상이한 활성화제, 억제제 및 공통인자가 밝혀졌다.

EP 0409294A1은 PAM 효소에 대한 공통인자로서 작용하고, 흡수 스펙트럼이 225 nm 이상이 아니며, 펩티드가 아니고, 닌히드린 양성이 아니며, 분자량이 1,000 Da 미만이고, 전기투석 시 양극으로 이동하며, 양친매성 구조를 갖는 물질을 기술한다. 전술한 억제제는 C-말단 α-아미드화 펩티드 또는 단백질 제조에 사용된다(Gunther K, 1990).

C-말단 α-아미드화에 대한 다른 공통인자가 GB 2233978A에 기술되어 있다. PAM 효소에 대한 공통인자는 식 R-(C=O)_n-(CHOR1)_n-CH₂OR2를 갖는 화합물이며, 여기서 R은 수소 원자 또는 알킬기를 나타내고, R1 및 R2는 PO₃H₂ 또는 SO₃H를 각각 나타낸다(Gozzini et al., 1991).

Bradbury 및 동료의 문헌에서, PAM 억제제 4-페닐-부테노산의 생체 내 사용이 제시되었다. 생체 내 억제제의 이용가능성으로 특정 펩티드 호르몬의 C-말단 α-아미드화의 정도를 제어하여 활성 형태의 순환 레벨을 감소시킬 수 있다. 또한, 생체 내 C-말단 α-아미드화의 제어 능력은 α-아미드화 효소의 세포 내 위치, 이동 및 저장 연구를 촉진시킬 수 있다(Bradbury et al., 1989).

C-말단 이종성이 또한 재조합형 폴리펩티드의 특정 특성에 영향을 미칠 수 있다는 암시가 C-말단 α-아미드화된 펩티드 상의 문헌 데이터로부터 수집된다. C-말단 α-아미드화의 과정은 α-아미드화된 펩티드, 예컨대 칼시토닌, 옥시토신 및 바소프레신의 치료적 잠재성을 인정받아 과학적 및 상업적 주목을 이끌어냈다. 최근, 바람직하게는 α-아미드화 효소에 의해 촉매화되는 프로호르몬의 아미드화 반응을 적용하는 몇몇 효과적인 α-아미드화 반응이 개발되었다(Kim KH 및 Seong BL, 2001). 상기 내용에서, 이작용성 펩티딜글리신 α-아미드화 효소는 C-말단 연장된 펩티드를, C-말단 α-아미드화 잔기를 나타내는 펩티드 호르몬으로 전환시키는 데 생체 내 반응에 성공적으로 적용되었다(Merkler DJ, 1994). C-말단 글리신 연장된 펩티드를 상응하는 데스-글리신(des-glycine) 펩티드 아미드로 촉매 전환시키기 위한 공정이 GB 2 220 938 A(Castigliore et al., 1990)에 기술되어 있다.

그러나, 여전히 항체와 같이 보다 큰 폴리펩티드에서의 C-말단 α-아미드화의 효과는 거의 알려져 있지 않다. 독물학 및 면역원성과 관련하여 재조합형 폴리펩티드의 C-말단 이종성의 영향에 대해서는 이용가능한 정보가 더욱 적거나 없으나, 상기 발견으로부터의 일부 추정이 수행될 수 있다. 항체의 고유 항원성은 상기 변형이 항체 단백질의 표면 또는 전하를 변화시키는 경우에 변경될 수 있다. 항체 표적 펩티드와 관련하여, Maillere 및 동료들은 상기 표적 펩티드의 C-말단 α-아미드화가 상응하는 항체 특이성에 대한 상당한 영향을 유발시킨다는 것을 나타내었다. 마우스 내 항체 반응은 펩티드가 C-말단 α-아미드화를 나타었을 경우에 상당히 증가되었다. 이러한 데이터로부터, 본 발명의 발명자는 C-말단 α-아미드화를 갖는 치료적 폴리펩티드, 구체적으로는 치료적 항체가 또한 민감화(sensitizing)(면역형성) 잠재성을 변경시켰을 수 있다고 가정하였다. C-말단 α-아미드화가 펩티드의 수명 및 결과적으로 또한 T-세포 반응을 증가시킨다는 증거(Maillere et al., 1995)로부터, 항체의 반감기의 연장은 또한 소정의 약리학적 효과뿐만 아니라 단일클론 항체 그 자체에 대한 잠재적인 면역학적 반응에 상당한 영향을 미칠 수 있다.

따라서, 당업자가 항체와 같은 재조합형으로 표현된 치료적 폴리펩티드의 제조에 대해서 이해하게 되는 바와 같이, 생성되는 폴리펩티드의 번역 후 C-말단 변형을 제어하여 (i) 일정한 생성물 품질 및 일정하게 높은 수율을 제공하고/하거나 (ⅱ) 생산 공정의 효율성 증가시키고/시키거나, (ⅲ) 생성되는 폴리펩티드의 생리학적인 활성 및 유도되는 약물의 안전성을 증가 및/또는 미세조정하고/하거나, (ⅳ) 생성된 폴리펩티드의 번역후 특성을 참조 폴리펩티드의 것과 매칭시키는 것이 특히 중요하다.

상기와 관련하여, PAM 및/또는 CP 촉매 활성의 제어 수단을 제공하여 재조합형 (글리코-) 폴리펩티드 생성 중에 C-말단 이종성을 제어 또는 조절하는 안정하고 제어가능한 방법에 대한 필요가 있다. 더욱이, 고품질의 비면역형성 재조합형 폴리펩티드에 대한 필요가 또한 있다.

따라서, 본 발명에 근간이 되는 문제는 C-말단 이종성, 구체적으로는 (치료적) 폴리펩티드 내 C-말단 α-아미드화의 양을 제어하는 수단 및 방법을 제공하는 것이다.

상기 기술적 문제에 대한 해결은 본 발명의 독립 청구항에 특징으로 기재되되어 있는 실시양태를 제공함으로써 달성된다. 상기 독립항은 바람직한 실시양태에 관한 것이다. 수치로 범위 설정된 수치 범위는 상기 범위 설정 수치를 포함하는 것으로 이해되어야 한다는 것이 이해되어야 한다.

본 발명은 비면역형성 폴리펩티드를 생성하기 위한 수단 및 방법을 제공하며, 여기서 상기 수단 및 방법은 대규모 바이오프로세스에 적합하다.

본 발명은 결정된 농도의 1 이상의 필수 미량 원소 또는 이러한 성분을 포함하는 화합물을 세포 배양 매질 내 첨가제로서 적용하는 발현된 폴리펩티드의 아미노산 잔기의 α-아미드화 및/또는 C-말단 분열로 필수적으로 구성되는, 번역후 변환의 C-말단 이종성을 조절(예를 들어 감소)시키기 위한 수단 및 방법에 의해 전술한 문제를 해소한다.

본 발명은 필수 미량 원소가 재조합형으로 발현된 폴리펩티드의 C-말단 이종성을 조절할 수 있다는 놀라운 발견을 기반으로 한다.

다른 말로는, 본 발명은 세포 배양에서 1 이상의 발현된 폴리펩티드의 아미노산 잔기가 α[알파]-아미드화 및/또는 C-말단 분열하는 것을 제어하기 위한 세포 배양 매질로서, 상기 매질은 펩티딜글리신 [알파]-아미드화 모노옥시게나제(PAM) 및/또는 카르복시펩티다제(CP)의 활성에 작용하거나 이를 조절하는 1 이상의 필수 미량 원소 또는 그 원소를 포함하는 화합물을 포함하는 것인 세포 배양 매질에 관한 것이다.

다른 관점에서, 본 발명은 1 이상의 발현된 폴리펩티드의 아미노산 잔기가 α[알파]-아미드화 및/또는 C-말단 분열하는 것을 제어하기 위한 또는 이의 세포 배양 방법으로서, 상기 방법은 적어도 (i) 상기 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포를 포함하는 세포 배양 매질에 1 이상의 필수 미량 원소를 첨가하는 단계; 및 (ⅱ) 상기 숙주 세포에 의해 생성된 폴리펩티드를 발효 및 회수하는 단계를 포함하는 것인 세포 배양 방법을 제공한다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상기 필수 미량 원소는 적어도 아연(Zn), 셀레늄(Se) 및/또는 구리(Cu)로 구성된 군으로부터 선택된다.

본 발명에 따르면, C-말단 아미노산에서의 α-아미드화 발생 감소는 셀레늄(Se) 농도가 0.175 μM 내지 약 2.98 μM인 배지를 이용하여 C-말단 α-아미드화된 Pro의 형성을 감소시키거나, 약 0.2 μM 내지 약 20 μM 범위의 농도로 아연(Zn)을 포함하는 배지를 이용하여 발현된 폴리펩티드(들)의 하나 또는 바람직하게는 모든 C-말단(들) 상의 C-말단 리신 잔기의 비율을 증가시킴으로써 촉진될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 1 μM 내지 2.4 μM의 셀레늄(Se)뿐만 아니라 3 μM 내지 15 μM의 아연(Zn)을 포함하는 매질이 사용된다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 발현은 이종성(heterologous)의 발현이고 진핵 세포 기반의 발현 시스템에서 일어나며, 여기서 진핵 세포 기반 시스템은 곤충 세포, 식물 세포, 포유류 세포, 동물 세포, 및 균 및 이스트 세포를 포함하는 저급 진핵 세포를 포함한다.

본 발명에 따르면, 폴리펩티드의 발현, 즉, 본 발명의 방법은 쉐이크 플라스크(SF), T-플라스크스롤러(T-flasksroller), 병, 백(bag), BR 및/또는 스피너 플라스크(spinner flask)를 포함하는 1 이상의 바이오반응기(BR) 또는 배양 용기에서 일어난다.

본 발명의 또다른 양태는 셀레늄 또는 이의 염을 펩티딜글리신 [α]-아미드화 모노옥시게나제(PAM) 효소에 대한 억제제로서 사용하는 것이다.

도 1: 역가(titer)에 대한 실험계획법(DOE: design of experiment)에 의해 생성된 파레토 차트. 역가 상에 유의적인 효과를 갖는 단독 또는 조합의 미량 원소는 본페로니 한계(Bonferroni limit) 위에 위치하고 있으며, 역가 상에 잠재적인 영향을 갖는 것은 t-수치 한계 위에 위치하였다. 역가 상에 영향을 미치지 않는 미량 원소는 t-수치 한계 아래에 표기되었으며, 따라서 선택되지 않았다. A: 아셀렌산나트륨(Na₂SeO₃), D: 염화아연(ZnCl₂) (μM)
도 2: 역가 상의 아연 및 셀레늄의 영향을 나타내는 DOE에 의해 생성된 등고선도(Contour diagram). 등고선도 상의 밝은 색 영역은 역가 증가 부분을 나타내고, 어두운 색 영역은 역가 감소 부분을 나타낸다. 흰색 박스 내 숫자는 측정된 역가(g/L)를 나타낸다.
도 3: C-말단 α-아미드화된 Pro에 대한 DOE에 의해 생성된 파레토 차트. 본페로니 한계(E = 염화구리(CuCL₂ x 2H₂O) 및 A = 아셀렌산나트륨(Na₂SeO₃)) 위의 효과는 분명 유의적이었으며, t-수치 한계 위의 효과는 잠재적으로 유의적이었다. t-수치 한계 아래의 효과는 이들이 유의적이지 않기 때문에 선택되지 않았다.
도 4: C-말단 α-아미드화된 Pro(C-term. amidated Pro)의 양에 대한 구리 및 셀레늄 농도 증가의 효과가 표시되는 DOE 소프트웨어에 의한 등고선도. 매질 내 구리 농도 증가는 PAM 활성 증가 및 C-말단 α-아미드화된 Pro의 생산 증가를 유도한다. 셀레늄 농도 증가는 PAM 활성 감소 및 C-말단 α-아미드화된 Pro의 감소를 유도한다.
도 5: 아연을 C-말단 Lys(C-term. Lys)의 양에 주된 영향을 미치는 인자로서 나타내는 DOE에 의해 생성되는 파레토 차트. 아연은 본페로니 한계 위의 t-수치를 갖는 유일한 인자인 것으로 계산되었다.
도 6: C-말단 Lys의 양에 대한 아연 농도 증가의 효과가 표시되는 DOE 소프트웨어에 의해 생성되는 등고선도. 매질 내 아연 농도 증가는 CP 활성 증가 및 결과적으로 C-말단 Lys 양의 감소를 유도한다.
도 7: 역가에 대한 아연 및 셀레늄의 효과가 표시되는 DOE 소프트웨어에 의해 생성되는 등고선도. 매질 내 아연 농도 증가는 역가 증가를 유도한다. 3 μM 이상의 셀레늄 농도는 유독성인 것으로 나타났으며, 역가 감소를 유도한다.
도 8: C-말단 α-아미드화된 Pro의 양에 대한 구리 및 셀레늄의 효과가 표시되는 DOE 소프트웨어에 의해 생성되는 등고선도. 매질 내 셀레늄 농도 증가 및 구리 농도 감소는 C-말단 α-아미드화된 Pro 양의 감소를 유도하며, 이는 PAM 효소에 대한 셀레늄의 억제 효과를 나타낸다.
도 9: C-말단 lys의 양에 대한 아연의 효과가 표현되는 DOE 소프트웨어에 의해 생성되는 등고선도. 발효 매질 내 아연 농도의 증가는 C-말단 Lys 양의 감소를 유도하며, 이는 CP 효소의 활성 증가를 나타낸다.
도 10: SF 시스템에서 실시된 확인 실험. (A) PAM 활성(C-말단 α-아미드화된 Pro의 양으로 표시됨)에 대한 구리 감소 및 셀레늄 농도 증가의 효과, 및 2.04 μM 구리(Cu) 및 0.173 μM 셀레늄(Se)을 포함하는 변화되지 않은 인하우스(in-house) 매질과의 비교. (B) CP 활성(C-말단 lys의 양으로 표시됨)에 대한 아연 농도 감소의 효과, 및 22 μM 아연(Zn)을 포함하는 변화되지 않은 인하우스 매질과의 비교.
도 11: BR 시스템에서 실시된 확인 실험. 세포 성장(A) 및 생산성(B)에 대한 셀레늄 농도 증가의 효과가 표현된다.
도 12: 생체 내 PAM 효소 활성에 대한 셀레늄 농도 증가의 효과. 매질 내 셀레늄 농도 증가에 의해 PAM 활성은 감소하며, 이는 C-말단 α-아미드화된 Pro의 양의 상당한 감소를 유도한다.
도 13: BR 시스템에서 실시된 확인 실험. 세포 성장(A) 및 생산성(B)에 대한 아연 농도(conc.) 감소의 효과가 표현된다.
도 14: 생체 내 CP 효소 활성에 대한 아연 농도 감소의 효과. 매질 내 아연 농도(Zn conc.) 감소에 의해 CP 활성은 감소되며, 이는 C-말단 Lys 양의 상당한 증가를 유도한다.

정의

달리 언급되지 않는 경우, 본 원에서 사용되는 용어는 생화학 및 분자 생물학의 옥스퍼드 사전(옥스퍼드 대학 출판, 2006, 인쇄 ISBN-13: 9780198529170 현재 온라인 버젼: 2008; eISBN: 9780191727641)에서 제공되는 정의로 제시된다.

본 발명의 실시에 유용한 기술의 추가적인 이해를 위해, 실시자는 세포 생물학 및 조직 배양에서의 표준 교과서 및 검토서를 참조할 수 있다; 예로서 인용되는 참조문헌을 또한 참조할 수 있음. 분자 및 세포 생화학에서의 일반적인 방법은 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3^rd Ed. (Sambrook et al., Harbor Laboratory Press 2001)]; 문헌[Short Protocols in Molecular Biology, 4^th Ed. (Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons 1999)]; 문헌[Protein Methods (Bollag et al., John Wiley & Sons 1996)]; 문헌[Non-viral Vectors for Gene Therapy (Wagner et al. eds., Academic Press 1999)]; 문헌[Viral Vectors (Kaplitt & Loewy eds., Academic Press 1995)]; 문헌[Immunology Methods Manual (Lefkovits ed., Academic Press 1997)]; 및 문헌[Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998)]과 같은 표준 교재에서 확인될 수 있다. 이러한 개시물에서 참조되는 유전자 조작을 위한 시약, 클로닝 벡터 및 키트는 바이오래드(BioRad), 스트라타진(Stratagene), 인비트로겐(Invitrogen), 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich) 및 클론테크(ClonTech)와 같은 상업적 판매자로부터 이용가능하다. 또한, 국제 출원 PCT/EP2011/069756 및 PCT/EP2013/057866의 개시 내용, 구체적으로는 이의 각각의 실험 부분에서 적용된 방법이 본 원에 참조 인용된다.

본 원에서 적용되는 바와 같이, 세포 배양에서의 생체분자, 예를 들어 발현된 폴리펩티드의 'α-아미드화 제어'는 세포 배양 성장 조건, 예컨대, 비한정적으로 배양 매질, pH, 온도 및 세포 수확까지의 성장 시간을 조절하여 세포 배양으로부터 수득한 C-말단 비-α-아미드화 또는 α-아미드화 Pro-폴리펩티드의 양이 상기 세포 배양에서 생성되는 이종성의 폴리펩티드의 소정 백분율의 전체량을 포함한다는 것을 의미한다.

본 원에서 적용되는 바와 같이, 세포 배양에서의 생체분자, 예를 들어 발현된 폴리펩티드의 '아미노 잔기의 C-말단 분열 제어'는 세포 배양 성장 조건, 예컨대, 비한정적으로 배양 매질, pH, 온도 및 세포 수확까지의 성장 시간을 조절하여 상기 세포 배양으로부터 수득한 폴리펩티드의 양이 C-말단에서의 소정 백분율의 Lys(상기 세포 배양에서 생성된 이종성 폴리펩티드의 전체량의 분율로서 계산)를 포함한다는 것을 의미한다.

펩티딜글리신 [알파]-아미드화 모노옥시게나제(PAM) 효소 및/또는 카르복시펩티다제(CP)의 용어 '작용' 또는 '이의 활성의 조절'은 필수 미량 원소 또는 이 원소를 포함하는 화합물이 상기 효소 상에 측정가능한 효과를 나타내어 상기 PAM 및/또는 CP 효소의 활성 또는 기능이 각각 증가 또는 감소된다는 것을 의미한다. 필수 미량 원소 또는 그 원소를 포함하는 화합물은 PAM 효소 착물의 촉매작용 비율을 저감시켜 C-말단 α-아미드화 과정에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 상기 필수 미량 원소는 이와 같이 PAM 효소 착물에 영향을 미치거나 이를 조절하고, 또는 C-말단 글리신 잔기 분열의 원인이 되는 펩티딜글리신 알파-히드록실화 모노옥시게나제(PHM) 또는 실질 α-아미드화 반응에 원인이 되는 펩티딜아미도-글리콜레이트리아제(peptidylamido-glycolatelyase)(PAL)에 영향을 미친다. 예를 들어 인간 PAM의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 당업계에 공지되어 있으며, 공용 데이터베이스, 예를 들어 NIH 유전자 서열 데이터베이스 유전자은행을 포함하는 국립생명공학정보센터(NCBI: National Centre for Biotechnology Information)에 호스팅된 인터넷 페이지를 통해 얻을 수 있으며, 이는 또한 펍메드 센트럴(PubMed Central)에 의해 이용가능한 해당 참조문헌을 인용한다. 예를 들어, 참조로서, PAM의 인간 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 취득번호(accession number) 유전자 ID: 5066 또는 취득: AAA36414.1 GI: 189595로 이용가능하다.

또한, 필수 미량 원소는 효소 활성에 영향을 미치거나 이를 조절하여 카르복시펩티다제(CP)(EC 3.4.17.2 및 EC 3.4.17.3)의 비율에 영향을 미칠 수 있다. CP는 자유 카르복실기가 발생하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 끝에서의 말단 또는 두번째(penultimate) 결합의 가수분해 분열을 촉매작용하는 엑소펩티다제이다. 인간 카르복시펩티다제의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 당업계에 공지되어 있으며, 공용 데이터베이스, 예를 들어 NIH 유전자 서열 데이터베이스 유전자은행을 포함하는 국립생명공학정보센터(NCBI)에 호스팅된 인터넷 페이지를 통해 얻을 수 있으며, 이는 또한 펍메드 센트럴에 의해 이용가능한 해당 참조문헌을 인용한다. 예를 들어, 참조로서, 카르복실펩티다제 B(CP)의 인간 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 취득번호 NM004460 및 AAB496652.1. 취득: NP001862.2 GI: 4607080로 이용가능하다.

유사한 방법으로, C-말단 α-아미드화 Pro의 용어 '형성 감소'는 α-아미드화 과정 또는 반응이 참조 샘플에 비해 보다 적은 α-아미드화가 발생하는 방식으로 감소, 억제, 지연, 제어, 한정 또는 조절되게 된다는 것을 의미한다. PAM 효소 착물에 의해 영향받는 α-Pro-아미드화는 번역되는 단백질의 Pro 및 R 사이에서의 C-말단 펩티드 결합의 가수분해 및 산화에 기본적으로 의존하며, 여기서 R은 1 이상의 아미노산 잔기, 예를 들어 Gly, Leu, Ile, Val 또는 Phe, 또는 Gly-Lys일 수 있다. 상기 반응은 대부분의 경우에 PAM 효소 착물에 의해 촉매작용된다(상기 참조). 발현 숙주 및 폴리펩티드 발현 조건에 따라, 1 이상의 번역후 Pro-NH₂를 갖는 번역된 단백질의 함량은 ≥ 0% ~ ≤ 100%의 범위에 있을 수 있다. 상기 α-아미드화는 단백질 pH 상승을 유도하고, 따라서 염기성 변이(variant)이다.

(단일클론) 항체 또는 이의 유도체에서, 프롤린(Pro) α-아미드(PA)는, 예를 들어 단백질의 중쇄에서의 C-말단 리신 및 글리신의 번역후 제거 및 현 C-말단 Pro 잔기의 아미드화에 의해 전형적으로 생성된다.

PA의 양은 물리화학적 차이, 예컨대 전하, 소수성 또는 질량에 의해 α-아미드화된 변이체를 비-α-아미드화된 것으로부터 구별하는 다양한 분석 방법을 적용하여 확인 및 정량화할 수 있다. CEX-CPB 방법(카르복시펩티다제 B에 의한 침지(digestion) 후의 양이온 교환 크로마토그래피)와 같은 이온 교환 크로마토그래피는 Pro α-아미드화에 의한 전하 변동을 활용하는 데 적절한 방법이다. 항체의 경우, Pro-α-아미드 변이체의 리신 변이체와의 공용리(co-elution)는 크로마토그래피 분리 전 카르복시펩티다제 B 침지를 이용하여 리신 잔기를 제거함으로써 회피된다. 그러나, 다른 염기성 변이체와의 추가적인 공용리는 수 백분율(예를 들어, 4%)의 정량화 백그라운드(quantification background)을 야기시킬 수 있다. 프롤린 아미드 변이체 추가 백그라운드는, 하나의 C-말단 리신 잔기를 갖는 항체 변이체의 크로마토그래피 위치에서 용리하는 것으로 '유사(pseudo) 1K'로 일컬어진다. '유사 2K'는 2개의 C-말단 리신 잔기를 갖는 항체 변이체의 크로마토그래피 위치에서 용리하는 Pro 아미드 변이체 추가 백그라운드를 내포한다. 상기 CEX 방법(즉, CPB 침지에 의한 리신 제거가 없는 CEX)과의 차이는 '실제(real) 1K' 및 '실제 2K'로 일컬어지는, 리신 잔기를 갖는 항체 변이체의 양을 나타낸다는 것이다. CEX(-CPB)에 의한 정량화는 용액 내 모든 항체 분자에 대한 Pro α-아미드화된 항체의 백분율을 복귀시킨다. α-아미드화된 Pro 변이체를 명백하게 확인 및 정량화할 수 있는 분석 시험 방법은 UV(자외선) 또는 MS(질량 분석) 탐지를 이용하는, 소위 펩티드 맵핑으로 불리우는 엔도펩티다제(예를 들어, LysC, 트립신) 침지된 단백질의 RP-HPLC(역상 고성능 액체 크로마토그래피(reversed-phase high-performance-liquid-chromatography))이다. RP-HPLC 펩티드 맵핑에 의한 정량화는 항체에 있어서 모든 중쇄에 대한 Pro α-아미드화된 중쇄의 백분율을 복귀시킨다.

'유사 1K'은 항체(IgG)의 2개의 중쇄 중 하나가 이의 C-말단에 Pro 아미드를 갖는 CEX-CPB에 의해 측정되는 변이체이다. '유사 2K'는 단일클론 항체의 둘 모두의 중쇄가 이의 C-말단에 Pro α-아미드를 갖는 CEX-CPB에 의해 측정되는 변이체이다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 펩티드 맵핑의 적용은 본 발명의 목적을 위해 또한 선호된다.

본 원에서 사용되는 바와 같이, 용어 '영향을 미친다'는 단백질, 효소, 또는 화학 또는 생리학적 반응의 활성 또는 기능을 저하, 줄임, 지연, 감소, 억제 또는 조절한다는 것을 의미한다.

'억제제'는 화학적 또는 생리학적 반응 또는 대응을 지연 또는 방해하는 어떠한 물질이다.

2개의 상태 간의 양적 차이를 나타내는 용어 '유도하다', '억제하다', '증가시키다', '감소시키다', '저하시키다', '영향을 미치다', '조절하다', '제어하다' 등은 상기 2개의 상태 간의 적어도 통계적으로 유의적인 차이를 의미하며, 세포 또는 폴리펩티드의 발현 또는 활성, 예컨대 α-아미드화의 전체 제거를 필수적으로 나타내지 않는다. 이러한 용어는 본 원에서, 예를 들어 발현 수준, 양 및 활성 수준에 적용된다.

본 원에서 사용되는 바와 같이, 용어 '이종성의(이종성으로)'는 (a) 세포 또는 기관으로부터 단리를 통해 수득되고, 예를 들어 유전자 조작 또는 폴리뉴클레오티드 전이를 통해 다른 세포 또는 기관으로 주입되고/되거나, (b) 세포 또는 기관으로부터 자연에 존재하는 것 이외의 수단을 통해 수득되고, 예를 들어 세포 융합, 유도된 교배 또는 이식유전자(transgenic) 조작을 통해 다른 세포 또는 기관으로 주입된다는 것을 의미한다. 이종성 물질은, 예를 들어 동일 종 또는 유형, 또는 이것이 주입되는 기관 또는 세포와는 다른 종 또는 유형으로부터 수득될 수 있다.

'세포 기반의 발현 시스템'은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드의 생성을 위해 본 발명에 따라 숙주 세포 또는 숙주 세포 용해물로 주입(예를 들어, 형질주입, 감염 또는 변형)되는 발현 시스템 또는 이의 일부 또는 폴리뉴클레오티드를 의미한다.

'숙주 세포'는 단리되고/되거나 이종성인 폴리뉴클레오티드 서열이 주입(예를 들어, 변형, 감염 또는 형질주입)되었거나 외인성 핵산을 (예를 들어, 변형, 감염 또는 형질주입에 의해) 가질 수 있는 진핵 또는 원핵 세포, 예컨대 포유류 세포, 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 조류 세포, 균 세포, 박테리아 세포 또는 미생물의 세포를 비한정적으로 포함하는 세포이다. 통합되거나(게놈에서) 자유 복제하는(예를 들어, 플라스미드) 이식유전자를 발현시킬 수 있거나 PAM 및/또는 CP 효소 또는 동일한 기능을 실질적으로 갖는 이의 동족체 및/또는 오솔로그(ortholog)를 내인성으로 또는 이종성으로 포함하는 임의의 세포가 본 발명의 의미에 따라 적합하다; 예를 들어, 적합한 균 세포에 대해서는 US 특허 출원 2008/0305523; 적합한 식물 세포에 대해서는 US 08/477,559; 적합한 조류 세포에 대해서는 EP2560479; 적합한 동물 세포에 대해서는 US 2011/0117643; 적합한 박테리아 세포에 대해서는 US 특허 20130034897, 또한 적합한 미생물 세포에 대해서는 EP1050582를 참조할 수 있다.

용어 '진핵생물' 세포는 곤충, 식물, 조류, 균, 포유동물 및 동물을 비한정적으로 내포하는 핵이 있는(nucleated) 세포 또는 기관을 의미하게 된다.

'세포 배양' 또는 '배양'은 인위적인 시험관 내 환경에서의 세포 유지를 의미한다. 그러나, '세포 배양'은 유전적 용어이고, 개별 세포뿐만 아니라 조직, 기관, 기관 시스템 또는 전체 기관의 배양을 내포하는 데 사용될 수 있으며, 이에 대해서 용어 '조직 배양', '기관 배양', '기관 시스템 배양' 또는 '장기친화성(organotypic) 배양'은 때때로 용어 '세포 배양'과 상호교환적으로 사용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 본 발명의 배지는 임의의 점착성 세포(즉, 배양 용기에 점착하는 세포) 및 현탁액 배양에서 성장하는 임의의 세포를 배양하는 데 사용될 수 있다.

본 원에서 사용되는 바와 같이, 표현 '세포 배양 매질' 또는 '배양 매질' 또는 '발효 매질' 또는 '세포 배양'은 성장에 사용되는 영양액을 의미하고 세포 배양과 관련하여 사용되는 모든 종류의 매질을 의미하게 된다. 전형적으로, 세포 배양 매질은 아미노산, 에너지 공급원으로서 1 이상의 탄수화물, 미량 원소, 비타민, 염 및 가능한 추가 성분(예를 들어, 세포 성장 및/또는 생산성 및/또는 생성물 품질에 영향을 주기 위함)을 포함한다. 혈청이 공급되는 매질에서 성장하는 세포에서 확인되는 발현 수준에 비해 향상된 수준의 재조합형 폴리펩티드 발현이 무혈청 매질에서 성장한 세포로부터 수득될 수 있다. 따라서, 본 발명의 매질은 혈청이 없거나 혈청 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15% 또는 20%로 공급될 수 있다.

본 원에서 사용되는 바와 같이, '공급물', '공급물 매질' 또는 '공급물 용액'은 세포 배양 매질의 종류 또는 특정 성분의 용액을 의미하는데, 이는 세포 성장 및/또는 생산성 및/또는 생산물 품질에 영향을 주기 위해서 공정 중에 항상 세포 배양에 보충제로서 첨가된다.

본 원에서 사용되는 바와 같이, '세포 배양 유체'는 세포가 배양되고 있는 실질 액체를 의미한다. 이는 상기 유체가 상기 정의에 따른 세포 배양 매질 또는 공급물과는 대조적으로 세포, 세포 파편, 세포 단백질(예를 들어, 효소 또는 재조합형 단백질)에 의해 생성되는 대사물질을 함유할 수 있다는 것을 의미한다.

본 원에서 사용되는 바와 같이, 표현 'α-아미드화된 아미노산 잔기의 양'은 단백질 C-말단에서의 단백질 발현 중 또는 후에 형성되는 α-아미드화되는 아미노산 잔기에 대한 것이다. 이는 구체적으로는 α-아미드화되는 Pro의 양과 관련된다. 특정 조건 하에서, 폴리펩티드 내 Pro 잔기는 번역후 α-아미드화되어, 예를 들어 Pro-α-아미드(Pro-NH₂)의 형성을 유도할 수 있다. 이는 일부 경우에, 예를 들어 생성되는 폴리펩티드 내 Pro-α-아미드의 양이 참조 폴리펩티드에서 보다 높거나 낮은 경우에 바람직하지 않다.

본 원에서 사용되는 바와 같이, 필수 미량 원소, 또는 필수 미량 원소의 이온 또는 이의 염을 용어 '포함하는 화합물'은 임의의 유기 또는 무기 화합물과 관련되며, 이는 하기에 정의되는 필수 미량 원소와 동일한 잠재 효과를 생리학적 설정(예를 들어, 세포 배양 유체)에서 가진다.

(미량) 원소는, 그 원소의 식이성 결핍이 그 원소의 생리학적 양의 섭취에 의해 예방가능하거나 회복가능한, 식물, 동물 및/또는 인간을 포함하는 숙주 내 차선의 생물학적 기능을 지속적으로 유도하는 경우에 '필수적'인 것으로 고려된다. 인(P), 칼륨(K) 및 황(S)은 모든 살아있는 시스템에서 다량영양소(macronutrient)로 여겨진다. 칼슘(Ca) 및 마그네슘(Mg)은 상대적으로 많은 양이 요구된다. 하기 원소는 살아있는 유기체에서 단지 미량 또는 초미량 필요하며, 또한 본 발명에 따라 '필수 미량 원소'로 일컬어진다: 비소(As), 붕소(B), 크롬(Cr), 코발트(Co), 구리(Cu), 철(Fe), 불소(F), 리튬(Li), 요오드(I), 망간(Mn), 몰리브덴(Mo), 니켈(Ni), 셀레늄(Se), 스트론튬(Sr), 규소(Si), 황(S), 주석(Sn), 바나듐(V), 아연(Zn) 및 임의로 희토류 원소. 본 발명에 따라, 특정량의 셀레늄(Se), 아연(Zn) 및/또는 구리(Cu)를 사용하는 것이 바람직하다. 추가로, C-말단 이종성에 Se, Zn 또는 Cu, 또는 이의 임의의 조합과 동일한 기능을 나타내는, 필수 미량 원소뿐만아니라 동위원소 또는 라디칼 또는 모방체(mimic)의 모든 가능한 산화 상태가 본 발명에 따라 사용될 수 있다.

분자 내 원자의 '산화 상태'는 이것이 갖거나 잃는 원자가 전자의 수를 제시한다. 필수 미량 원소는 매질 생성 중 임의의 시간에, 또는 상기 매질 사용 전에, 로티퍼(rotifer)에서 단기 농후화(enrichment)(3 h) 후 동시에, 또는 유기적으로 결합되거나(예를 들어, 아미노산, 단백질 또는 생체분자에) 착물 또는 무기성인 미네랄 공급원을 이용하는 회분식 배양 중에 단독으로 임의의 종류의 조합으로 첨가될 수 있다. 또한, 필수 미량 원소는 세포 내 또는 세포 외에서 자유 이온으로 배양 내에 존재할 수 있거나, 착물화될 수 있다.

상기 내용에서, '미량'은 전술된 원소가 단지 미량의 농도로 존재한다는 것을 의미한다. 미량 농도 및 수준은 <10^-5 M, <10^-6 M, <10^-7 M 또는 <10^-8 M 또는 < 10^-9 M일 수 있다. 미량 원소 또는 임의의 다른 성분 또는 화합물은, 미량의 '불순물'을 첨가하기 위해서 불순한 물질을 의도적으로 사용하거나 공지된 첨가에 의해 매질, 조성물 또는 유체에 의도적으로 존재한다. 따라서, 상기 매질, 조성물 또는 유체는 공지되거나 정의된 양의 미량 원소를 가지게 된다.

'유효량'은 단일 또는 다른 제제와의 조합으로 1 투여량 또는 임의의 투여량 또는 경로로 투입되어 효과, 특히 소정의 효과를 나타내는 데 효과적인 양(개개의 화합물, 효소 또는 이온의 사용되는 분자의 투여량 또는 농도 또는 수)를 의미한다.

본 원에서 사용되는 바와 같이, 용어 '약학적 제제 및/또는 조성물'은 포유류, 특히 인간으로의 투여에 적합하거나 적절한 조성물을 의미한다.

용어 '(글리코-)폴리펩티드', '펩티드' 및 '(글리코-)단백질'은 본 원에서 상호교환적으로 사용되어 공유결합된 올리고사카라이드 사슬(글리칸)을 임의로 갖는 아미노산 잔기의 중합체를 의미한다. 상기 용어는 1 이상의 아미노산 잔기(들)가 해당 천연 발생 아미노산뿐만 아니라 천연 발생 아미노산 중합체의 동족체(들)인 아미노산 중합체에 적용된다. 상기 용어는 또한 아미노산을 결합시켜 폴리펩티드를 보완하는 전형적인 펩티드 연쇄의 변이를 포함한다.

본 원에서 사용되는 바와 같이, 용어 '항체'는 단일클론 항체(mAbs), 다중특이성 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 합성 항체, 키메라 항체, 다중클론 항체, 카멜화(camelized) 항체, 단일 사슬 Fvs(scFv), 단일 사슬 항체, 면역학적으로 활성인 항체 단편(예를 들어, 에피토프(epitope)에 결합할 수 있는 항체 단편, 예를 들어, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')₂ 단편, Fv 단편, 항원을 면역 특이적으로 결합시키는 VL 또는 VH 도메인 또는 상보성 결정 영역(CDR)을 함유하는 단편 등), 이작용성 또는 다중작용성 항체, 이황화물 결합된 이중특이성 Fvs(sdFv), 내부체(intrabody) 및 디아바디(diabody), 및 이들 중 임의의 것의 에피토프 결합 단편을 의미한다. 특히, 용어 '항체'는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자, 즉, 항원 결합 부분을 함유하는 분자의 면역학적으로 활성인 단편을 포괄하는 것으로 의도된다. 면역글로불린 분자는 임의의 유형(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 분류(예를 들어, IgG_b IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgAi 및 IgA₂) 또는 하위분류의 것일 수 있다.

용어 '항체 유도체 또는 단편'은 전체 길이 항체의 일부, 일반적으로 표적 결합 또는 변이 영역을 의미한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편을 들 수 있다. 'Fv' 단편은 완벽한 표적 인식 및 결합 부분을 함유하는 최소의 항체 단편이다. 이러한 영역은 단단한 비공유 결합으로 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 변이성 도메인의 이량체(VH-VL이량체)로 구성된다. 이의 구조상, 각각의 변이성 도메인의 3개의 CDR은 서로 작용하여 상기 VH-VL 이량체 표면 상의 표적 반응 부분을 한정한다. 전체적으로, 6개의 CDR이 상기 항체에 표적 결합 특이성을 제공한다. 그러나, 단일 변이성 도메인(또는 표적에 특이성인 단지 3개의 CDR을 포함하는 Fv의 반)도, 전체 결합 부분보다 낮은 친화도(affinity)에서도 불구하고 표적을 인식하고 결합하는 능력을 가진다. '단일 사슬 Fv' 또는 'scFv' 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하며, 여기서 이러한 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬에 존재한다. 일반적으로 상기 Fv 폴리펩티드는 상기 scFv가 표적 결합에 바람직한 구조를 형성할 수 있게 하는 VH 및 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 연결체(linker)를 추가로 포함한다.

용어 '융합 단백질'은, 개별 단백질에 대해서 원래부터 코딩된 2 이상의 유전자의 결합을 통해 생성된, 단백질뿐만이 아닌 펩티드, 폴리펩티드를 의미한다. 이러한 융합 유전자의 번역은 기존 단백질 각각으로부터 유도된 기능성을 갖는 단일 폴리펩티드를 유도한다. 이러한 용어의 의미는, 예를 들어 수용체 도메인 및 IgG Fc 세그먼트로 구성된 구조뿐만이 아니라 키메라 및 인간화된 항체를 포괄한다.

본 원에서 사용되는 바와 같이, 표현 '비항체 단백질'은 항체가 아닌 생리학적으로 활성인 단백질에 관한 것이다. 이러한 정의는 특히 인슐린, 소마트로핀, 에리트로포이에틴, 인터페론 알파 또는 G-CSF, 조직 플라스미노겐 활성화제(tPA), 인자 Ⅷ 및/또는 인터류킨 2, 또는 이의 단편 또는 유도체를 포괄한다.

본 발명의 항체 또는 항체 폴리펩티드를 언급하는 경우, 용어 '변이체', '유도체' 및 '동족체'는 2, 3 또는 그 이상의 특이성 항체 구조, 페길화(pegylated) 항체 구조 등뿐만 아니라, 일반적인 항체 개념, 예를 들어 scFv에 대한 일부 구조적 관계를 갖고 이의 일부 기능성 특성을 보유하면서 상응하는 본래의 결합 분자, 항체 또는 폴리펩티드의 항원 결합 특성의 적어도 일부를 보유하는 임의의 폴리펩티드를 포함한다.

유사한 개념이 본 발명의 의미에서 '단백질의 단편 또는 유도체'에 적용된다.

용어 '키트'는 특정 기능을 수행(예를 들어, 분석 수행, 단백질 발현, 세포 배양, 폴리펩티드 정제 등)하기 위한 재료의 집합체, 바람직하게는 재료(바람직하게는 관련 재료)의 포장된 집합체를 의미한다. 키트는 그 키트에 존재하는 재료의 사용을 기술한 사용설명 물건(instructional material)을 선택적으로 포함한다.

본 원에서 사용되는 바와 같이, '셀레늄 또는 이의 염', '아연 또는 이의 염' 및/또는 '구리 또는 이의 염'과 같은 기존 이온 또는 이의 염의 용어 '농도'는 세포 배양 매질(예를 들어, 세포 배양 매질 또는 공급물 매질 또는 공급물 용액) 또는 세포 배양 유체 내 셀레늄 및/또는 아연 및/또는 구리 이온의 최종 농도를 의미한다.

발명의 상세한 설명

본 발명이 자세히 기술되기 전에, 본 발명은 기술되는 장치의 특정 구성요소 부분 또는 기술되는 방법의 공정 단계가 변할 수 있기 때문에 이에 한정되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 본 원에서 사용되는 용어는 특정 실시양태만을 기술하는 데 목적이 있으며, 한정하려는 의미는 아니다. 명세서 및 첨부되는 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태 '하나의(a)', '한(an)' 및 '그(the)'는 그 내용이 명백히 달리 의미하지 않으면 단수 및/또는 복수의 지시대상을 포함하는 것으로 주지되어야 한다. 더욱이, 수치로 한정되는 파라미터 범위가 제시되는 경우에, 그 범위는 이러한 한정 수치를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명은 폴리펩티드의 생산 방법뿐만 아니라 배양 매질을 제공하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 C-말단 α-아미드화된 Pro의 양 감소 및/또는 C-말단 Lys의 양 증가를 나타낸다. 성장 및 생산성을 억제하지 않음으로써, 특정 농도의 셀레늄(Se) 및 아연(Zn) 첨가는, 예를 들어 대규모 바이오공정을 이용하여 치료적으로 유용한 고품질의 비면역형성 (글리코-)폴리펩티드를 생산하는 데 적용될 수 있다.

따라서, 본 발명은 세포 배양 중 1 이상의 발현된 폴리펩티드의 아미노산 잔기의 α-아미드화 또는 C-말단 분열의 제어를 위한 또는 이의 세포 배양 매질에 관한 것이며, 여기서 상기 매질은 펩티딜글리신 [알파] α-아미드화 모노옥시게나제(PAM) 또는 카르복시펩티다제(CP) 효소에 작용하는 1 이상의 필수 미량 원소 또는 그 원소를 포함하는 화합물을 포함하거나 이것으로 필수적으로 구성되거나 또는 이것으로 구성된다.

PAM 효소의 많은 활성화제 또는 억제제에 대한 모든 이용가능한 데이터에도 불구하고, 본 발명의 발명자는 놀랍게도 셀레늄이 PAM 활성에 주요한 영향을 미친다는 것을 발견하였다. 매주 적은 상업적으로 이용가능한 매질(IMDM 0.067 μM, 어드밴스드(advanced) DMEM 0.03 μM, 어드밴스드 RPMI 0.03 μM, 어드밴스드 MEM 0.03 μM)에 포함되는 지금까지 알려진 최대의 셀레늄 농도 약 0.1 μM 이상으로, 생산(발효) 배지 내 셀레늄의 농도를 증가시킴으로써, 본 발명자는, 본 발명의 실시예에서 나타나는 바와 같이, PAM 효소의 활성을 억제할 수 있었으며, 생성되는 재조합형 폴리펩티트 생성물은 C-말단 α-아미드화의 양이 유의적으로 감소되었다.

또한, 생산(발효) 매질 내 아연 이온 농도를 감소시킴으로써, CP의 활성이 억제되어 C-말단 Lys 양의 감소를 유도하고, 결과적으로 더욱 적은 양의 C-말단 α-아미드화를 유도한다. 따라서, 본 발명은 생산 매질 내 2개의 필수 미량 원소(첨가제)의 농도를 변경하여, 신뢰성 있는 C-말단 이종성을 갖는 생성물을 생성할 수 있다는 놀라운 발견을 제공한다.

본 발명에 따른 제1 '단변수(univariate)' 접근에서, PAM 효소의 몇몇 공지된 억제제가 시험되었으나, 이들 대부분이 생산성 감소 또는 불량한 세포 배양 성능을 유도하였다. 제2 '다변수(multivariate)' 접근에서, 생성물 매질은 다수의 빌딩 블럭(building block)으로 나누어지고, 실험계획법(DOE) 방식으로 시험되었다. 발명자는 놀랍게도 셀레늄이 C-말단 α-아미드화된 Pro의 생체 내 형성에 주요한 음성적 영향을 미친다는 것을 발견하였다. 생산 매질 내 셀레늄의 농도를 독성 수준 이하로 증가시킴으로써, 세포 배양 성능 및 생산성은 허용가능하도록 유지되며, 가장 중요하게는 PAM 효소의 활성은 억제될 수 있다. 결과적으로, 생성되는 폴리펩티드 생성물은 C-말단 α-아미드화된 Pro의 양의 유의적인 감소를 나타낸다(도 11 및 12뿐만 아니라 실시예 11 참조).

이러한 발견의 관점에서, 본 발명은 자연스럽게 1 이상의 발현된 폴리펩티드의 아미노산 잔기의 α-아미드화 및/또는 C-말단 분열의 제어를 위한 또는 이의 세포 배양 방법으로 연장되며, 여기서 상기 방법은 적어도 하기 단계를 포함하거나 이것으로 필수적으로 구성된다: 1 이상의 필수 미량 원소를, 폴리펩티드를 생성하는 숙주 세포를 포함하거나 이것으로 필수적으로 구성되는 배양 매질에 첨가하는 단계; 및 상기 폴리펩티드를 발효 및 회수하는 단계.

달리 말하자면, 본 발명은 상기 세포 배양으로 수득된 항체를 포함하는, 재조합형으로 발현된 폴리펩티드의 이종성을 감소시키는 방법으로서, 펩티딜글리신 [알파]-아미드화 모노옥시게나제(PAM) 또는 카르복시펩티다제(CP) 효소의 활성을 감소 및/또는 억제할 수 있는 1 이상의 필수 미량 원소를 상기 세포 배양 매질에 첨가하여 이종성이 감소된 상기 폴리펩티드를 수득하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 또한, CP 효소의 활성을 감소 및/또는 억제할 수 있는 또다른 필수 미량 원소가 첨가된다.

바람직한 실시양태에서, 상기 필수 미량 원소, 또는 이의 부가물은 C-말단 [알파]-아미드화된 프롤린의 양을 감소시키거나 C-말단 리신의 양을 증가시킨다.

본 발명에 따라서, 당업자는 상기 매질에 필수 미량 원소(들) 또는 그 필수 미량 원소(들)와 동일한 효과를 나타내는 필수 미량 원소(들)의 모방체가 보충될 수 있다는 것을 이해하게 된다. 본 발명에 따라서, 상기 필수 미량 원소는 이온 또는 이의 염, 또는 그 이온 또는 이의 염을 포함하는 화합물이다. 바람직한 실시양태에서, 상기 필수 미량 원소는 셀레늄(Se), 아연(Zn) 및/또는 구리(Cu)로 구성된 군으로부터 선택된다. 상기 정의된 바와 같이, 각각의 화합물이 본 발명의 의미 내의 C-말단 Pro α-아미드화 또는 C-말단 리신 분열에 효과를 나타내는 한, Se, Zn 및/또는 Cu의 임의의 적합한 염, 또는 셀레늄(Se), 아연(Zn) 및/또는 구리(Cu) 이온을 함유하거나 포함하거나 또는 이것으로 필수적으로 구성되는 임의의 무기 또는 유기 화합물이 사용될 수 있다.

DOE 실험 중에, 제2의 놀라운 관찰이 이루어졌다. 아연이 실시예 5 및 9, 및 도 5, 6 및 9에 나타낸 바와 같이 CP 효소의 주된 생체 내 활성화제인 것으로 확인되었다. 생산 매질 내 아연 농도를 감소시킴으로써, CP 효소의 활성은 감소시킬 수 있으며, 상응하는 재조합형 생성물은 C-말단 Lys 양의 증가를 나타내었다(도 14뿐만 아니라 실시예 11 참조). 셀레늄 농도 증가 및 아연 농도 감소는 α-아미드화 Pro 및/또는 Lys와 관련하여 기결정된 C-말단 이종성을 갖는 참조 생성물에 상당하는 C-말단 이종성 갖는 재조합형 폴리펩티드 생성물을 유도한다. 상기 생성 매질 내 Se 및 Zn 농도를 조절함으로써, 생성된 단백질의 α-아미드화된 Pro 및/또는 Lys와 관련한 C-말단 이종성은 참조 단백질의 각각의 C-말단 이종성으로 조절될 수 있다. C-말단 a-아미드화된 Pro의 양은 감소될 수 있으며, C-말단 Lys의 양은 증가될 수 있다.

또한, 본 발명의 발명자는 놀랍게도 세포 배양 매질 내 낮은 아연 농도에서도 각각의 폴리펩티드 발현뿐만 아니라 숙주 세포의 성장이 악화되지 않는다는 것을 발견하였다.

따라서, 본 발명은 매질 또는 방법에 관한 것이며, 여기서 필수 미량 원소 또는 이의 부가물은 C-말단 α-아미드화된 Pro의 형성을 감소시키고 C-말단 Lys의 양을 증가시킨다. 바람직한 실시양태에서, 셀레늄은 α-아미드화를 제어하기 위해서, 본 발명의 방법에 사용되는 세포 배양 매질 또는 매질에 유효량으로 첨가된다. 본 발명의 더욱 바람직한 실시양태에서, 아연은 아미노산 잔기의 C-말단 분열의 제어 및/또는 α-아미드화의 제어를 위해 상기 방법에 사용되는 세포 배양 매질 또는 매질에 유효량으로 첨가된다.

당업자에게는, 상기 정의한 1 이상의 필수 미량 원소, 바람직하게는 셀레늄이 상기 배양 공정 초기에 상기 매질에 첨가될 수 있거나, 특정 농도의 셀레늄이 이미 상기 매질에 함유되어, 발현된 폴리펩티드의 α-아미드화를 낮은 수준으로 유지, 즉, C-말단 α-아미드화 과정을 감소 또는 억제한다는 것이 명백하게 된다. 따라서, 본 발명의 공정은 재조합형으로 발현된 폴리펩티드, 예컨대 C-말단 상에 알파 Pro 아미노 잔기를 나타내는 단백질 또는 펩티드의 이종성을 조절, 제어, 감소 또는 저하시키는 데 이용될 수 있다. 0.173 μM 셀레늄 및/또는 2.04 μM 구리 및/또는 22 μM 아연 이온을 나타내는 매우 소수의 상업적으로 이용가능한 매질과 비교하여 상기 매질 내 아연 농도를 감소시킴으로써 상기 약술된 바와 같이 C-말단 α-아미드화의 감소를 추가적으로 향상시키게 된다. 소정의 폴리펩티드를 발현시키는 세포가 낮은 구리 이온 농도의 존재 하에, 예를 들어 2.04 μM 이하로 추가적으로 배양되는 경우에 추가적인 향상이 달성될 수 있다. α-아미드화 및 비-α-아미드화/탈아미드화 폴리펩티드의 이종성 개체군을 갖는 것이 바람직한 경우에, 셀레늄 첨가제를 배양 중 늦은 시점에 상기 세포 배양 매질에 첨가할 수 있다.

따라서, 본 발명은 일부 실시양태에서 배양 매질에 유효량의 셀레늄 및/또는 아연 및/또는 구리를 첨가하여 당단백질의 아미노산 잔기의 C-말단 α-아미드화 및/또는 C-말단 분열을 조절함으로써 세포 배양 내에 당단백질을 생성하는 방법 및 세포 배양 매질을 제공한다. 일부 실시양태에서, 유효량은 PAM 활성을 억제 또는 감소시키는 데 충분하다. 일부 실시양태에서, 유효량은 상기 CP 활성을 억제하거나 영향을 미치거나 감소시키거나 저하시키는 데 충분하다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 셀레늄은 α-아미드화 제어에 사용된다.

본 발명에서 사용하기 위해 셀레늄 이온을 제공하는 셀레늄 화합물은 수용성(조금씩 수용성인 것 포함) 유기 및 무기 셀레늄 염 또는 에스테르를 포함하는 임의의 약리학적으로 허용가능한 셀레늄 염일 수 있다. 다른 바람직한 화합물은 아셀렌산염, 셀렌산염, 셀렌산, 아셀렌산(selenous acid) 또는 아셀렌산(selenious acid)이다. 다른 셀레늄 화합물, 예컨대 셀레늄 메티오닌, 셀레늄 시스테인, 셀레나이트 푸마레이트, 2-셀레노-5-메틸아미노메틸-우리딘 및 셀레노-단백질이 사용될 수 있다. 본 발명에 따라서, 셀레늄 이온은 바람직하게는 아셀렌산나트륨의 형태로 사용된다. 아셀렌산나트륨은 독성이 강한 셀레늄 화합물이기 때문에 아셀렌산나트륨은 다른 셀레늄 형태로 대체될 수 있으며, 이는 높은 투여량의 아셀렌산나트륨과 동일한 생체활성을 보유하나 보다 낮은 독성을 갖는다. 셀레늄 또는 α-아미드화 제어 능력과 관련하여 셀레늄의 기능을 모방하는 화합물, 예를 들어 셀레늄의 동위원소 또는 라디칼, 또는 주기율표에서 동일한 화학적 군에 속하는 원소의 동위원소 또는 라디칼을 함유하는 추가의 적합한 화합물이 상기 정의되어 있거나 당업자에 공지되어 있다.

본 발명의 더욱 바람직한 실시양태에서, 아연이 아미노산 잔기의 C-말단 분열을 제어하는 데 및/또는 α-아미드화를 제어하는 데 사용된다.

본 발명에서 사용하기 위한 아연 이온을 제공하는 아연 화합물은 수용성(조금씩 수용성인 것 포함) 유기 및 무기 아연 염 또는 에스테르를 포함하는 임의의 약리학적으로 허용가능한 아연 염일 수 있다. 다른 바람직한 화합물은 조금씩 가용성인 아연 염이며, 이중 시트르산아연, 염화아연 또는 질산아연이 가장 바람직하다. 적용될 수 있는 적합한 아연 염의 예로는 아세트산아연, 불화아연, 황산암모늄아연(zinc ammonium sulfate), 포름산아연, 브롬산아연, 요오드화아연, 염화아연, 질산아연, 크롬산아연, 설폰산페놀아연(zinc phenol sulfonate), 시트르산아연, 살리실산아연, 디티온산아연, 황산아연, 불화규산아연(zinc fluosilicate), 글루콘산아연, 타르타르산아연, 숙신산아연, 글리세로인산아연(zinc glycerophosphate) 및 이들의 혼합물을 들 수 있다. 사용될 수 있는 Zn 함유 화합물로는 비한정적으로 ZnCl, Zn(NO₃)₂, ZnBr 및 ZnSO₄.7H₂O를 들 수 있다. 바람직하게는, 사용되는 Zn 화합물은 염화아연(x 2H₂O가 있거나 없는 ZnCl₂) 또는 황산아연.7H₂O (ZnSO₄.7H₂O)이다. 전형적으로 Zn의 농도는 본 발명의 1×매질에 대해서 주어진다. 본 발명에 따라서, 아연 이온은 바람직하게는 염화아연(ZnCl₂)의 형태로 사용된다. 또한, 본 발명에 따르면 매질 중 아연 농도를 CP 활성이 상기 정의된 바와 같이 감소 또는 저하되는 농도로 감소시키는 데 적합한 임의의 유기 또는 무기 화합물이 바람직하다.

실시예에서 도시된 바와 같이, 본 발명의 매질에 매우 적은 양의 구리 이온을 첨가하거나 본 발명의 공정에 이를 첨가하거나 이용하는 것은 조합적 또는 상보적 효과를 유도하며, 여기서 생성된 폴리펩티드의 비-α-아미드화된 Pro 잔기의 양은 더욱 증가될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따라서 본 발명의 방법에서 사용되는 세포 배양 매질 또는 매질은 유효량의 구리 또는 이의 부가물을 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 사용하기 위한 구리 이온을 제공하는 구리 화합물은 수용성(조금씩 수용성인 것 포함) 유기 및 무기 구리 염 또는 에스테르를 포함하는 임의의 생리학적으로 허용가능한 구리 염일 수 있다. 다른 바람직한 구리 염 또는 에스테르, 예컨대 구리 설페이트, 구리 살리실레이트 C₇H₄O₃Cu-H₂O, 구리 히드록시드 또는 구리 옥시클로리드가 공지되어 있다. 본 개시에 따라, 구리 이온은 바람직하게는 염화구리의 형태로 사용된다.

결합된 셀레늄, 아연 또는 구리 이온을 매질에 방출하는, 중합체성 셀레늄, 아연 또는 구리 함유 주쇄 블록 공중합체, 유기 화합물이 공지되어 있다.

따라서, 본 발명에 따라 실시되고 실시예에서 기술되는 실험에 따라서, 본 발명의 목적은 방법 또는 매질을 제공하는 것이며, 여기서 매질은 하기 필수 미량 원소 중 1 이상 또는 이들의 조합을 포함한다: 0.175 μM 내지 약 2.98 μM, 바람직하게는 1 μM 내지 2.4 μM 범위 농도의 셀레늄(Se), 및/또는 약 0.2 μM 내지 약 20 μM, 바람직하게는 3 μM 내지 15 μM 범위 농도의 아연(Zn), 및/또는 약 0.18 μM 내지 약 0.8 μM 범위 농도의 구리(Cu).

일부 실시양태에서, 아연(Zn), 셀레늄(Se) 및/또는 구리(Cu)의 농도는, 예를 들어 하기 수치 중 1 이상보다 클 수 있다: 0.005 μM 0.006 μM, 0.007 μM, 0.008 μM, 0.009 μM, 0.01 μM, 0.02 μM, 0.03 μM, 0.04 μM, 0.05 μM, 0.06 μM, 0.07 μM, 0.08 μM, 0.09 μM, 0.10 μM, 0.11 μM 0.12 μM, 0.13 μM 0.14 μM, 0.15 μM, 0.16 μM, 0.17 μM, 0.18 μM, 0.19 μM, 0.20 μM, 0.21 μM, 0.22 μM, 0.23 μM, 0.24 μM, 0.25 μM, 0.30 μM, 0.35 μM, 0.40 μM, 0.5 μM, 1.0 μM, 1.1 μM, 1.2 μM, 1.3 μM, 1.4 μM, 1.5 μM, 1.6 μM, 1.7 μM, 1.8 μM, 1.9 μM, 2.0 μM, 2.1 μM, 2.2 μM, 2.3 μM, 2.4 μM, 2.5 μM, 2.6 μM, 2.7 μM, 2.8 μM, 2.9 μM, 3.0 μM, 5.0 μM, 10.0 μM, 11.0 μM, 12.0 μM, 13.0 μM, 14.0 μM, 15.0 μM, 16.0 μM, 17.0 μM, 18.0 μM, 19.0 μM, 20.0 μM, 21.0 μM, 22.0 μM, 23.0 μM, 24.0 μM, 25.0 μM, 26.0 μM, 27.0 μM, 28.0 μM, 29.0 μM or 30.0 μM.

공급물 용액에서 셀레늄, 아연 및/또는 구리의 농도는 세포 배양 매질 또는 세포 배양 유체에서보다 유의적으로 높게, 예를 들어 3 μM까지 일 수 있다는 것이 주지되어야 한다.

전술한 바와 같은 필수 미량 원소는 세포 배양 공정 초기에 매질에 첨가될 수 있다. 대안적으로, 필수 미량 원소는 세포 배양 공정 중에, 예를 들어 공급물 매질의 성분(들)으로서 공급될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 상기 이온은 본 원에서 기술되거나 포유류 세포 배양 업계의 당업자에게 공지된 다른 적절한 영양분과 함께 또는 이것 없이 공급-회분식 배양 시스템에 개별적으로 또는 회분식 조합으로 첨가된다.

따라서, 본 발명의 매질 또는 방법의 한 실시양태에서, 발현된 폴리펩티드의 C-말단 α-아미드화된 Pro의 양은 2.04 μM의 구리 및 0.173 μM의 셀레늄을 포함하는 표준 매질을 사용하는 것에 비해 감소된다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서 2.3 μM ± 0.6 μM의 셀레늄이 매질에 존재하며, 바람직하게는 상기 매질은 또한 0.4 μM ± 0.5 μM의 구리를 또한 포함한다.

상기 내용과 관련하여, 당업자는 유효량의 아연 및/또는 구리를 더 포함하는 매질은 C-말단 아미노산의 α-아미드화의 속도, 양 또는 비율을 더욱 감소, 억제 또는 저하시킬 수 있게 된다는 것을 이해하게 된다.

본 발명의 내용에서, 용어 '최소 수준'으로의 아연 농도의 감소는 세포가 여전히 성장하고 폴리펩티드, 예컨대 당단백질을 충분한 양으로 생성할 수 있는 수준으로 이해되어야 한다. 본 원에서 성장 및 생산성과 관련하여 충분한 양은 각각 14 일의 배양 후에 1 g/L 이상이 생성되고, 14일의 배양 후 세포 1 ml당 2 x 10⁶ 세포 이상이 성장한다는 것으로 이해되어야 한다.

결과적으로, 22 μM 아연 이온을 나타내는 몇몇의 표준 매질을 사용하는 것보다 증가된, 즉, 보다 높은 C-말단 Lys의 양을 나타내는 당단백질이 생성될 수 있다. 따라서, PAM 효소는 Lys 아미노산 존재로 인해 C-말단 Pro 잔기를 α-아미드화시킬 수 없으며, 따라서 비-α-아미드화된 당단백질의 생산/양의 증가를 유도한다.

따라서, 본 발명의 매질 또는 방법은 아미노산 잔기의 C-말단 분열 제어 및/또는 α-아미드화 제어를 위한 또는 이의 아연 사용에 관한 것이다. 또한, 본 발명에 따른 한 실시양태에서, 발현된 폴리펩티드의 C-말단 Lys의 양은 22 μM 아연 이온을 갖는 표준 매질 사용과 비교하여 증가되며, 바람직하게는 여기서 2.3 μM 내지 11 μM ± 0.5 μM가 상기 매질에 존재한다. 바람직한 실시양태에서, 아연은 3 μM 이상의 농도로 존재하며, 여기서 '이상'은 아연 이온 농도가 3.00 μM 이상, 예를 들어 3.05 μM, 3.1 μM, 3.2 μM, 3.3 μM, 3.4 μM, 3.5 μM인 것을 나타낸다. 용어 '이상'은 구리뿐만 아니라 셀레늄의 농도에 대해서 동등하게 정의된다. 본 발명의 추가 실시양태에서, C-말단 Lys의 양은 22 μM 아연을 갖는 표준 매질을 사용하는 것에 비해 10%, 15%, 바람직하게는 16% ± 0.79%로 증가된다.

본 발명의 방법으로부터 수득된 폴리펩티드는 진단적 또는 치료적 조성물로서 약물학적 제제 및/또는 조성물 제조에 사용될 수 있다. 따라서, 수득된 폴리펩티드는 생물학적 활성 제제의 다른 성분, 예컨대 약물학적으로 허용가능한 계면활성제, 부형제, 담체, 희석제 및 비히클, 및/또는 추가의 진단적 또는 치료적 화합물, 예컨대 마커 또는 폴리펩티드에 부착 또는 연결되는 약물과 함께 투여될 수 있다. 선택적으로 다량의 Se, Zn 및/또는 Cu, 또는 하기 개술되는 바와 같은 조성의 화합물과의 조합으로 투여될 수 있다.

본 발명의 매질 또는 방법은 임의의 배양 방법에 적용될 수 있으나, 진핵 세포, 특히 생체분자 생성 세포에 특히 바람직하다. 바이오생산은 백신 생산, 단백질 생산, 당단백질 생산, 항체 또는 항원 생산, 핵산 생산, 세포기관 생산, 지질 생산, 탄수화물 생산 등을 포함할 수 있다. 본 발명에 따르면 폴리펩티드 생산이 바람직하다.

폴리펩티드는 세포 기반 발현 시스템으로도 명명되는 발현 시스템에 의해 생성되며, 여기서 본 발명의 매질에서 배양되는 숙주 세포는 폴리펩티드를 발현시킨다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 숙주 세포 내 각각의 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 이종성 발현을 유도함으로써 제공된다. 본 발명의 또다른 바람직한 실시양태에서, 상기 이종성 발현은 세포 기반 발현 시스템에서 일어난다. 이러한 세포 기반 발현 시스템은 본 발명의 매질의 존재 하에 폴리펩티드 발현을 허용하기 위해 본 발명에 따른 방법에 적용되는 숙주 세포를 의미한다.

상기 정의된 숙주 세포는 핵산, 예컨대 각각의 폴리펩티드에 대해 코딩하는 활성 유전자를 함유하고, 이러한 핵산은 매질 내 세포 배양 중 전사 및 번역된다. 상기 유전자는 외인성 유전자로서 바람직하게는 규제(규제성) 성분과 함께 이러한 숙주 세포로 유도될 수 있거나(예를 들어, P-B 0 148 605 참조), 활성의 내인성 유전자로서 숙주 세포에 이미 존재할 수 있거나, 비활성의 내인성 유전자로서 활성화될 수 있다. 내인성 유전자의 이러한 활성화는 동종성 재조합에 의해 규제(규제성) 성분을 게놈에 특이적으로 유도함으로써 달성될 수 있으며, 추가적인 참조를 위해 국제 출원 WO 91/09955 및 WO 93/09222를 참조할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상기 발현은 이종성 단백질 발현이다.

이론에 얽매이려는 의도 없이, 본 발명의 매질 또는 매질을 적용하는 방법은 1 이상의 번역후 Pro-NH₂를 갖는 폴리펩티드를 발현시킬 수 있는 임의의 상기 정의된 숙주 세포를 배양하는 데 적합하다. 당업자는 적합한 숙주 세포 특이성 매질 조성물 및 배양 방법을 잘 인지하고 있다.

더욱 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 상기 진핵 세포 기반의 발현 시스템은 진핵 숙주 세포를 포함하며, 여기서 진핵 세포는 곤충 세포, 식물 세포, 조류 세포, 균 세포, 포유류 세포, 동물 세포 및/또는 저급 진핵, 예컨대 사상균 또는 이스트 세포로 구성되거나 이로 필수적으로 구성된 군으로부터 선택된다. 바람직한 실시양태에서, 상기 진핵 세포 기반의 발현 시스템은 포유류 시스템이다.

본 발명에 따라 세포 기반 발현 시스템으로서 사용될 수 있는 곤충, 식물, 조류, 균, 포유류, 동물 및/또는 저급 진핵생물 종은 해당 이식유전자를 갖도록 유전자 조작될 수 있는 상기 종들 중 임의의 것일 수 있거나, 당업계에 공지되어 있다.

본 발명의 또다른 실시양태에서, 상기 진핵 세포 기반 발현 시스템은 하기로 구성된 군으로 필수적으로 구성되거나 이를 포함하거나 이로부터 선택된다:

- 베이비 햄스터 신장 세포주(예를 들어, BHK21)

- 중국 햄스터 난소 세포주(예를 들어, CHO-K1, CHO-DG44, CHO-DXB 또는 CHO-dhfr^-)

- 뮤린(Murine) 골수종 세포주(예를 들어, SP2/0)

- 마우스 골수종 세포주(예를 들어, NS0)

- 인간 배아 신장 세포주(예를 들어, HEK-293)

- 인간 망막 유도 세포주(예를 들어, PER-C6), 및/또는

- 양수 세포주(예를 들어, CAP).

바람직하게는, 햄스터 세포 기반의 발현 시스템이 사용되고 있다. BHK21('베이비 햄스터 신장') 세포는 신생 햄스터 신장 조직의 비정상적으로 빠르게 성장하는 1차 배양으로부터의 클론에서 유래하는, 시리아 햄스터 세포의 유사이배체(quasi-diploid) 형성된 세포주에 속한다. 상업적으로 이용가능하고 본 발명의 내용에서 사용될 수 있는 BHK-21 세포주에 대한 비한정적인 예로는 BHK-21(C-13); BHK21-pcDNA3.1-HC; BHK570; Flp-In-BHK 세포주; 및/또는 BHK 21(클론 13) 햄스터 세포주가 있다.

중국 햄스터 난소(CHO) 세포는 중국 햄스터의 난소로부터 유래된 세포주이다. 이는 생물학 및 의료 연구 및 치료적 단백질 생산에 상업적으로 흔히 사용된다. 이는 1960년대에 소개되었으며, 단층 배양으로서 처음부터 성장된다. 오늘날, CHO 세포는 재조합형 단백질 치료제의 공업적 생산을 위한 가장 일반적으로 사용되는 포유류 숙주이며, 보통 현탁액 배양으로 성장된다.

상업적으로 이용가능하고 본 발명의 내용에서 사용될 수 있는 CHO 세포주에 대한 비한정적인 예로는 자유형 CHO-S 세포; ER-CHO 세포주; CHO 1-15 500 CHINESE HAM; CHO-DXB, CHO-dhfr-, CHO DP-12 클론#1934; CHO-CD36; CHO-ICAM-1; CHO-K1; 난소; HuZP3-CHOLec3.2.8.1; xrs5; CHO-K1/BB2 세포; CHO-K1/BB3 세포; CHO-K1/EDG8/G알파15 세포; CHO-K1/M5 세포; CHO-K1/NK1 세포; CHO-K1/NK3 세포; CHO-K1/NMUR1 세포; CHO-K1/NTSR1 세포; CHO-K1/OX1 세포; CHO-K1/PAC1/Gα15 세포; CHO-K1/PTAFR 세포; CHO-K1/TRH1 세포; CHO-K1/V1B 세포; 5HT1A G알파-15-NFAT-BLA CHO-K1 세포주; AVPR2 CRE-BLA CHO-K1 세포주; SFM 부착된 CHO-S 세포; DG44 세포; Flp-In-CHO 세포주; GeneSwitch-CHO 세포주; NFAT-bla CHO-K1 세포주; T-REx-CHO 세포주; GenoStat CHO K-1 Stable 세포주; GenoStat CHO K-1 Stable 세포주 키트; CHO-K1 세포주 햄스터, CHO-PEPT1 세포주가 있다. 특히 바람직한 실시양태에서, 햄스터 세포 기반의 발현 시스템은 CHO-dhfr^- 세포주이다.

본 발명의 또다른 바람직한 실시양태에서, 상기 이종성 발현은 진핵 세포 기반의 발현 시스템에서 일어난다. 바람직하게는, 상기 발현된 단백질은 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 단백질이다:

- 항체, 또는 이의 단편 또는 유도체,

- 융합 단백질, 및/또는

- 비항체 단백질.

바람직하게는, 본 발명에 따른 방법 및 매질은 하기 단백질 중 하나의 전부 또는 일부와 동일하거나 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 (재조합형) 생성하는 데 적합하다: Flt3 리간드, CD40 리간드, 에리트로포이에(erythropoie)는 에리트로포이에틴(EPO), 다르베포에틴(darbepoetin) 알파를 비롯한 다르베포에틴 및 트롬보포이에틴(thrombopoietin)과 같은 자극성 단백질임. 칼시토닌, 렙틴(leptin), Fas 리간드, NF-카파 B의 수용체 활성화제에 대한 리간드(RANKL), 종양 괴사 인자(TNF)-관련 아폽토시스 유도 리간드(TRAIL), 흉선 스트로마(thymicstroma) 유도된 림포포이에틴, 과립구 집락 자극 인자, 과립세포-대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF: granulocyte-macrophage colony stimulating factor), 성장 인자, 예컨대 비만 세포 성장 인자, 줄기세포 성장 인자, 표피 성장 인자, 케라티노사이트(keratinocyte) 성장 인자, 대핵세포(megakaryote) 성장 및 발달 인자, RANTES, 성장 호르몬, 인슐린, 인슐리노트로핀(insulinotropin), 인슐린 유사(insulin-like) 성장 인자, 부갑상선 호르몬, 인터페론, 예컨대 α-인터페론, β-인터페론 및 γ-인터페론, 신경 성장 인자, 뇌유도된 신경영향 인자(brain-derived neurotrophic factor), 시냅토태그민 유사(synaptotagmin-like) 단백질(SLP1-5), 뉴로트로핀-3" 글루카곤, 인터류킨, 예컨대 IL-1, IL-1a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17 및 IL-18, 집락 자극 인자, 림포톡신-p, 종양 괴사 인자(TNF), 백혈병 억제 인자, 온코스타틴-M, 및 세포 표면 분자 ELK 및 Hek에 대한 다양한 리간드(예컨대 eph-관련 키나제 또는 LERKS에 대한 리간드).

본 발명의 방법 및 매질을 이용하여 생성될 수 있는 추가 단백질로는 상기 언급한 임의의 단백질에 대한 수용체의 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 단백질, 상기 언급한 임의의 단백질의 수용체에 대한 길항제, 및 상기 수용체 또는 길항제와 실질적으로 유사한 단백질을 들 수 있다.

또한, 본 발명의 방법 및 매질을 이용하여 생성될 수 있는 단백질로는 분화 항원의 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 단백질(CD 단백질로 일컬어짐) 또는 이의 리간드, 또는 이들 중 어느 것과 실질적으로 유사한 단백질을 들 수 있다. 상기 항원의 예로는 CD20, CD22, CD27, CD30, CD39, CD40 및 이것으로의 리간드를 포함하는 분화 항원이 있다.

효소 활성 단백질 또는 이의 리간드는 본 발명의 방법 및 매질을 이용하여 또한 생성될 수 있다. 예로는 하기 단백질 중 하나의 전부 또는 일부를 포함하는 단백질 또는 이의 리간드, 또는 이들 중 하나와 실질적으로 유사한 단백질을 들 수 있다: 메탈로프로테이나제-디스인테그린(metalloproteinase-disintegrin) 패밀리 구성원, 키나제, 글루코세레브로시다제(glucocerebrosidase), 과산화물 디스뮤타제(superoxide dismutase), 조직 플라스미노겐 활성화제, 인자 Ⅷ, 인자 Ⅸ, 아폴리포프로테인(apolipoprotein) E, 아폴리포프로테인 A-1, 글로빈, IL-2 길항제, 알파-1 안티트립신, TNF-알파 전환 효소, 전술한 효소들 중 임의의 것에 대한 리간드, 및 수많은 다른 효소 및 이의 리간드.

본 발명의 방법 및 매질은 특정 표적 단백질에 결합하고 이의 활성을 변형시키도록 실험관 내에서 선택되는 키메라 단백질, 및 이의 항체 또는 일부 및 키메라 항체, 즉, 1 이상의 뮤린 변이성 항체 면역글로불린 도메인에 결합된 인간 불변성(constant) 항체 면역글로불린 도메인을 갖는 항체, 이의 단편 또는 실질적으로 유사한 단백질을 생성하는 데 또한 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 항체 및 세포독성 또는 발광성 물질을 포함하는 컨쥬게이트(conjugate)를 생성하는 데 사용될 수 있다. 항체, 본 발명의 방법 및 매질을 이용하여 생성될 수 있는 항체, 시험관 내 선택된 키메라 단백질 또는 항체/세포독 또는 항체/발광체 컨쥬게이트의 예로는 상기 언급한 단백질 및/또는 하기 항원 중 임의의 것을 비한정적으로 포함하는 단백질 중 임의의 하나 또는 이들의 조합을 분간하는 것을 포함한다: CD2, CD3, CD4, CD8, CD11a, CD14, CD18, CD20, CD22, CD23, CD25, CD33, CD40, CD44, CD52, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD147, IL-la, IL-1, IL-2, IL-3, IL-7, IL-4, IL-5, IL-8, IL-10, IL-2 수용체, IL-4 수용체, IL-6 수용체, IL-13 수용체, IL-18 수용체 하위단위, PDGF-ß, 및 이의 동족체, VEGF, TGF, TGF-ß2, TGF-p1, EGF 수용체 VEGF 수용체, 간세포 성장 인자, 오스테오프로테게린(osteoprotegerin) 리간드, 인터페론 감마, B 림프구 자극제, C5 보체(complement), IgE, 종양 항원 CA125, 종양 항원 MUC1, PEM 항원, ErbB2/HER-2, 일련의 환자에 증가된 수준으로 존재하는 종양-관련 에피토프, 유방, 결장, 편평상피 세포, 전립선, 췌장, 폐 및/또는 신장 암 세포 상에서 및/또는 흑색종, 신경교종 또는 신경아세포종 세포 상에서 발현되는 암-관련 에피토프 또는 단백질, 종양의 괴사 코어, 인테그린 알파 4 베타 7, 인테그린 VLA-4, B2 인테그린, TRAIL 수용체 1,2,3 및 4, RANK, RANK 리간드, TNF-α, 접합 분자 VAP-1, 상피세포 접합 분자(EpCAM), 세포간 접합 분자-3 (ICAM-3), 류코인테그린어드헤신(leukointegrinadhesin), 혈소판 당단백질 gpⅡb/Ⅲa, 심장 미오신 중쇄, 부갑상선 호르몬, MHC I, 암종배아 항원(CEA: carcinoembryonic antigen), 알파-페토프로테인 (AFP), 종양 괴사 인자 (TNF), Fc-y-1 수용체, HLA-DR 10 베타, HLA-DR 항원, L-셀렉틴 및 IFN-γ.

자연적으로, 본 발명은 본 발명의 추가 양태에서 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 폴리펩티드로 확장된다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 바람직하게는 상기 또는 실시예에서 개괄되는 바와 동일하고 참조 매질에서 발현되는 폴리펩티드와 비교하여, 30%, 25%, 20%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2.5% 및/또는 2% 미만의 C-말단 알파 아미드화된 프롤린을 포함한다. 특히 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 5% 미만의 C-말단 알파 아미드화된 프롤린을 포함한다.

본 발명의 방법 및 매질은 또한 상기 언급한 생분자 중 임의의 것, 예컨대 단백질 또는 실질적으로 유사한 단백질을 포함하는 재조합형 융합 단백질을 생성하는 데 이용될 수 있다. 예를 들어, 다랑체화(multimerisation) 도메인과 더불어 상기 언급한 단백질 중 하나를 포함하는 재조합형 융합 단백질, 예컨대 류신 지퍼(leucine zipper), 코일드 코일(coiled coil), 항체의 Fc 일부 또는 실질적으로 유사한 단백질은 본 발명의 방법 및 매질을 이용하여 생성될 수 있다. 특히, 상기 재조합형 융합 단백질 중에는 TNFR 또는 RANK의 적어도 일부가 항체의 Fc 일부에 융합된 단백질이 포함된다.

다른 바람직한 실시양태에서, 상기 방법은 하기를 포함하는 1 이상의 바이오반응기 또는 배양 용기에서 실시된다:

- 쉐이크 플라스크

- T-플라스크

- 백(bag)

- 롤러바틀(rollerbottle)

- 바이오반응기, 및/또는

- 스피너 플라스크.

바람직하게는 상기 바이오반응기 또는 배양 용기는 50 ml 내지 40,000 L의 용기를 가질 수 있다. 표준 바이오반응기 또는 배양 용기 크기에 대한 예: 50 ml (예를 들어, 쉐이크 플라스크 또는 T-플라스크), 500 ml, 2 L, 5 L, 15 L, 100 L 및 300 L (예를 들어, 바이오반응기 또는 백), 및 1,000 L, 2,000 L, 5,000 L, 10,000 L, 25,000 L 및 40,000 L (대형 바이오반응기).

또다른 바람직한 실시양태에서, 세포 배양은 점착성 배양에서, 예를 들어 단층 배양에서 실시된다. 다른 바람직한 실시양태에 따르면, 세포 배양은 또한 현탁 배양에서 실시될 수 있다.

연속 및 비연속 세포 배양 공정은 본 발명에 따라 이용될 수 있다. 다른 공지된 반응기 기술, 예를 들어 관류(perfusion) 기술 등이 또한 이용될 수 있다. 회분식 공정 및 공급-회분식(fed-batch) 공정이 특히 바람직한 실시양태이다.

상기에 따라서, 본 발명은 셀레늄 이온이 PAM 효소의 작용 및 활성을 제어 또는 지연할 수 있다는 지식을 처음으로 제공한다. 따라서, 본 발명은 자연적으로 또다른 실시양태에서 PAM 효소에 대한 억제제로서의 셀레늄 또는 이의 염의 용도로 확장된다. 또한, 본 발명의 또다른 목적은 카르복시펩티다제(CP)에 대한 활성화제로서의 아연 또는 이의 염의 용도를 제공하는 것이다.

본 발명은 또한 배양 세포의 배양에 사용하기 위한 키트를 제공한다. 본 발명에 따른 키트는 1 이상의 컨테이너를 포함하고, 여기서 1 이상의 제1 컨테이너는 본 발명의 배양 매질 또는 1 이상의 셀레늄, 아연 및/또는 구리를 함유한다. 본 발명의 추가 키트는 1 이상의 컨테이너를 포함하고, 제1 컨테이너는 기본 배양 매질을 함유하고, 제2 컨테이너는 상기 정의된 바와 같은 1 이상의 필수 미량 원소를 바람직하게는 증가된 농도로, 즉, 농축 형태로 함유한다. 바람직하게는, 성분을 포함하는 용액은 1x 매질 제형으로 동일한 성분의 농축보다 더욱 농축된다. 상기 성분은 10배 더욱 농축(10x 제형), 25배 더욱 농축(25x 제형), 50배 더욱 농축(50x 제형) 또는 100배 더욱 농축(100x 제형)될 수 있다. 상기 기재된 성분 중 일부 또는 전부는 용액에서 함께 혼합되는 경우 '기본 배양 매질'을 형성할 수 있다. 이러한 키트는 1 이상의 보충제, 예컨데 시토킨, 아미노산, 비타민, 무기 염, 당, 완충 염, 지질, 인슐린(또는 인슐린 대체물) 및/또는 트랜스페린(또는 트랜스페린 대체물 및/또는 동물 펩티드 및/또는 이스트 펩티드 및 식물 펩티드) 또는 이들의 임의의 조합을 함유하는 1 이상의 추가 컨테이너를 더 포함할 수 있다. 키트는 액체 또는 고체 분말 형태 또는 이들 둘 모두의 조합으로 매질을 포함할 수 있다. 또한, 키트는 배양 세포의 배치(batch)를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따르면, 상기 매질 또는 상기 언급된 조성물 및/또는 용액의 임의의 것은 액체 또는 고체 분말, 또는 이들 둘 모두의 조합일 수 있으며, 액체 용액은 농축된 성분 또는 사용준비된 매질 또는 조성물을 포함한다. 상기 분말은 1x, 2x, 3x, 4x, 5x, 10x, 20x, 40x, 50x 또는 100x 농축된 또는 x배 더욱 농축된 세포 배양 매질 용액 또는 조성물의 수분 함량을 증발시켜 생성될 수 있다. 대안적으로, 매질 성분은 적합한 농축의 건조 형태로, 즉 상기 정의한 바와 같은 x-배 농축된 형태로 컨테이너에 첨가된다.

본 발명은 성장 세포에서 사용하기 위한 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 상기 정의된 바와 같은 유효량으로 1 이상의 세레늄을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 조성물은 상기 정의된 바와 같은 유효량으로 아연을 더 포함한다. 선택적으로, 상기 조성물은 상기 서술된 바와 같이 1 이상의 세포를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 더욱 바람직한 실시양태에서, 상기 조성물은 상기 정의된 바와 같은 매질을 포함하거나 이것으로 필수적으로 구성된다.

디스클레이머

명세서를 지나치게 길게 함 없이 포괄적인 개시를 제공하기 위해서, 출원인은 상기 참조된 특허 및 특허 출원 각각을 본 원에서 참조로 인용한다.

상술되는 실시양태에서의 성분 및 특징의 특정 조합은 단지 예시적인 것이며; 이러한 교시는 참조로 인용되는 상기 및 특허/출원에서의 다른 교시와 상호교환되거나 대체되는 것이 또한 명백히 고려된다. 당업자가 인정하게 되는 바와 같이, 본 원에서 기술되는 것의 변경, 수정 및 기타 수행은 청구되는 본 발명의 사상 및 범위로부터 이탈함 없이 당업자에게 발생할 수 있다. 따라서, 상기 기술은 단지 예에 의한 것이며, 한정하는 것으로 의도되지 않는다. 본 발명의 범위는 하기 청구 범위 및 이의 동등물에서 한정된다.

실시예

본 발명의 추가적인 서술, 특징, 특성 및 장점이 종속항 및 각각의 도면 및 실시예의 하기 서술에 개시되어 있으며, 이는 단지 예시 및 설명으로 본 발명의 바람직한 실시양태를 나타낸다. 하지만, 이러한 도면 및 실시예는 결코 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 이해되어서는 안된다.

본 원에서 적용되는 것과 같은 통상의 방법의 자세한 설명은 인용 문헌에서 확인될 수 있다; 문헌["The Merck Manual of Diagnosis and Therapy" Seventeenth Ed. by Beers and Berkow (Merck & Co., Inc. 2003)] 또한 참조 가능.

본 발명의 실시는 달리 명시되지 않는 한 해당 기술 내에 있는 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 형질전환 생물학, 미생물학, 재조합형 DNA 및 면역학의 통상의 기술을 적용하게 된다. 본 발명의 실시에 유용한 일반적인 기술을 추가적으로 고려하기 위해서, 실시자는 세포 생물학 및 조식 배양에서의 표준 교재 및 검토서를 참조할 수 있다; 예로서 인용된 참조문헌을 또한 참조할 수 있다. 분자 및 세포 생화학에서의 일반적인 방법은 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3^rd Ed. (Sambrook et al., Harbor Laboratory Press 2001)]; 문헌[Short Protocols in Molecular Biology, 4^th Ed. (Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons 1999)]; 문헌[DNA Cloning, Volumes I and II (Glover ed., 1985)]; 문헌[Oligonucleotide Synthesis (Gait ed., 1984)]; 문헌[Nucleic Acid Hybridization (Hames and Higgins eds. 1984)]; 문헌[Transcription And Translation (Hames and Higgins eds. 1984)]; 문헌[Culture Of Animal Cells (Freshney and Alan, Liss, Inc., 1987)]; 문헌[Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Miller and Calos, eds.)]; 문헌[Current Protocols in Molecular Biology and Short Protocols in Molecular Biology, 3^rd Edition (Ausubel et al., eds.)]; 및 문헌[Recombinant DNA Methodology (Wu, ed., Academic Press)]. 문헌[Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (Miller and Calos, eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory)]; 문헌[Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al., eds.)]; 문헌[Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986)]; 문헌[Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984)]; 문헌[the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.)]; 문헌[Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987)]; 문헌[Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (Weir and Blackwell, eds., 1986)]. 문헌[Protein Methods (Bollag et al., John Wiley & Sons 1996)]; 문헌[Non-viral Vectors for Gene Therapy (Wagner et al. eds., Academic Press 1999)]; 문헌[Viral Vectors (Kaplitt & Loewy eds., Academic Press 1995)]; 문헌[Immunology Methods Manual (Lefkovits ed., Academic Press 1997)]; 및 문헌[Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998)]에서와 같은 표준 교재에서 확인할 수 있다. 이러한 개시물에 참조되는 유전자 조작을 위한 시약, 클로닝 벡터 및 키트는 바이오래드, 스트라타진, 인비트로겐, 시그마-알드리치 및 클론테크와 같은 상업적 판매자로부터 이용가능하다. 또한, 국제 출원 PCT/EP2011/069756 또는 PCT/EP2013/057866의 개시 내용, 특히 이의 개별 실험 부분에서 이용되는 방법이 본 원에서 참조 인용된다.

실시예 1: PAM 억제제의 아미노산 아미드화/프롤린 아미드 형성에 대한 영향

실험(상이한 예시적 당단백질 이용)을 쉐이크 플라스크(SF) 시스템에서 실시하였으며, 최종 부피가 125 ml인 500L SF를 사용하였다. 종양 괴사 인자, TNF와 연관되는 단일클론 항체를 발현시키는 재조합형 인간 안티-IL-8 또는 CHO-SSF 세포를 생성하는 리서치 워킹 셀 뱅크(rWCB: research working cell bank), 예컨대 CHO 세포주 DP-12 (CHO DP-12 클론#1934 [CHO DP-12, 클론#1934 aIL8.92 NB 28605/14] (ATCC^® CRL-12445™)을 해동시키면서 모든 실험을 시작한 후(더 자세한 내용은 PCT/EP2011/074181 참조), 접종에 충분한 세포가 모든 실험에 이용가능할 때까지 제조 지침에 따른 표준 조건 하에서 다수의 하위배양(subcultivation)을 실시하고, 14일의 일반적인 공급-회분식 발효를 이용하고, 글루코스, 글루타민 및 아미노산의 공급을 포함하는 일반적인 공급 방식을 실시하였다. 모든 SF를 하기 조건의 쉐이커 인큐베이터(shaker incubator)(Kuhner, 스위스)에서 인큐베이팅하였다: 온도 36.5℃, CO₂=10% 및 쉐이킹 속도 200 rpm. 모든 실험에서, 국제 출원 WO 2011/134920에서 예로서 기술된 발효 매질과 유사한 성분 및 유사한 성분 함량을 나타내는 동일한 인하우스 성장 및 생성 매질을 사용하였다.

미량 원소의 영향을 평가하기 위해서, 선정된 미량 원소의 농도는 제시된 값에 따라 체계적으로 변경하였다. 모든 결과는 바이오반응기(BR) 시스템에서 최종적으로 확인되었으며, 여기서 5L의 유리 바이오반응기가 사용되었다.

SF 및 BR 시스템 둘 모두에서, 세포 성장 및 세포 생존가능성은, 세포 생존가능성 측정을 위해 트리판 블루 배제 방법(trypan blue exclusion method)을 적용하고 세포 농도 측정을 위해 자동 세포 카운팅을 적용하는 Vi-Cell XR 분석기(Beckman Coulter)에 의해 측정하였다. 단일클론 항체 함량은 친화성 액체 크로마토그래피(ALC: affinity liquid chromatography)에 의해 측정하였다. 보정 곡선은 일반 참조물을 희석시켜 형성하였다. 수득한 결과는 단일클론 항체 둘 모두의 몰 흡광 계수에서의 차이에 대해서 적절한 반응 인자에 의해 교정하였다. 상기 결과는 수확물 리터(L)당 단백질의 그램(g)으로 표시하였다.

BR 및 SF 바이오공정 14일 종점에서(즉, 14일에), 수확물을 50 ml의 원심분리관으로 샘플링하였다. 배양을 원심분리하고(3,220 g, 15 min), 멸균 필터링하며(Millipore Steriflip, SCGP00525), 수확물로부터 샘플을 MabSelectSuRe 친화성 칼럼을 사용하는 단일 정제 단계를 이용하여 정제하였다. 정제는, 1 ml HiTrap 칼럼을 갖는 AKTA 크로마토그래피 시스템(GE Healthcare, cat.no. 11-0034-93), 또는 200 μl RoboColumns을 갖는 TECAN Freedom EVO 피펫 스테이션(pipetting station)(Atoll, cat.no. 01050408R)을 이용하여 실시하였다.

C-말단 α-아미드화된 Pro의 양 및 C-말단 Lys의 양을 측정하기 위해서 양이온 교환 크로마토그래피(CEX)를 실험 절차에 따라 수행하였다. 주요 하전된 변수는 0K, 유사 1K(1+) 및 유사 2K(2+)로 지정하였다. 양전하는 중쇄의 C-말단에서의 Lys 또는 α-아미드화된 Pro를 의미한다. 하전된 변이체(Lys, α-아미드화된 Pro)는 C-말단 Lys의 CP 분열에 의해 분화된 후, 동일한 CEX가 실시되었다. 3개의 주요 변이체 전에 추출하는 구조는 AP(산성 피크)로 명명되고, 이들 후에 추출하는 것은 BP(염기성 피크)로 명명되었다.

실시예 2: 개별 미량 원소 농도의 평가

C-말단 α-아미드화에 대한 개별 미량 원소의 다양한 농도를 조사하는 실험을 실시하였다. PAM 활성에 주된 영향을 미치는 미량 원소를 탐지하기 위해서, 매우 농후한 플랫폼 매질에 포함되어 있는 6개의 미량 원소를 MinRes Ⅳ 스크리닝 디자인(Design Expert software)을 이용하여 우선 시험하였다. 하기에서, C-말단 α-아미드화에 유의적인 효과를 나타내는 상기 미량 원소만이 추가로 아래에서 자세하게 논의되고 설명된다. 따라서, 시험되는 원소, 즉, 셀레늄, 아연 및 구리에 대한 농도는 하기 표 1에 기술된다.

미량 원소에 의한 MinRes Ⅳ 디자인 설정
미량 원소	최소[μM]	최대[μM]
아셀렌화나트륨(Na2SeO3)	0.017	0.173
염화아연(ZnCl2)	2.204	22.012
염화구리(CuCl2·2H20)	0.204	2.041

상기 실험은 최종 부피가 125 ml인 500 ml SF에서 실시하였다. 공급-회분식 바이오공정 14일 후에, 수확물을 수집하고, 원심분리하며, PES 멤브레인을 통해 멸균 필터링하고, 즉시 단일 단계 친화성 크로마토그래피(AC) 정제를 수행한 후, 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의한 C-말단 α-아미드화 분석을 실시하였다. 디자인 엑스퍼트(Design Expert) 버전 7.1.3(Stat-Ease, Inc., 미니애폴리스, 미국)을 이용하여 반응 표면 디자인을 수립하고 상기 실험 결과의 통계 분석을 실시하였다. MinRes Ⅳ 디자인을 이용하여 상기 조사된 단일클론 항체의 세포 생산성, C-말단 α-아미드화 및 C-말단 카르복시펩티드화에 대한 상기 시험된 미량 원소의 영향을 측정하였다. 분석된 디자인 엑스퍼트(Stat-Ease, Inc., 미니애폴리스, 미국) 반응은 공급-회분식 역가의 최종, C-말단 α-아미드화된 Pro의 양 및 C-말단 Lys의 양을 포함하였다.

실시예 3: 셀레늄 및 아연 농도 증가는 수확물 리터(L)당 단백질 그램(g)을 증가시킴

역가(리터당 그램)에 대한 시험된 미량 원소의 표준화된 효과는 우선 파레토 차트 상에 도시되어 있으며, 여기서 주요 효과(시험된 원소)는 다른 것보다 명백히 큰 효과를 나타냄으로써 수집된다. 본페로니 한계 위에 있는 효과는 분명히 유의적이고, t-수치 한계 위에 있는 효과는 잠재적으로 유의하였다. t-수치 한계 아래의 효과는 이들이 유의적이지 않기 때문에 선택되지 않았다. 유의적인 효과의 선택 후, ANOVA 통계 프로그램을 적용하여 통계적으로 유의적인 효과만이 상기 모델에 포함되었다는 것을 확인하였다. 특정 반응에 주요 효과를 나타내는 매질 첨가제는 0.1보다 낮은 P-수치를 나타내었다.

역가에 주요한 긍정적인 효과를 주는 인자(예를 들어, 시험된 미량 원소) 중에, 아연 및 셀레늄은 유의적인 효과를 갖는 것으로 계산되었으며, 상기 미량 원소 둘 모두는 파레토 차트 상에서 본페로니 한계 위에 있었다. 언급된 미량 원소 둘 모두는 이들 둘 간의 상호작용이 파레토 차트 상에서 t-수치 한계 위에 있기 때문에 조합으로 또한 역가에 영향을 미쳤다(도 1). 생성 매질에서 아연의 농도를 2.201 μM에서 22.012 μM로 증가시키고 셀레늄의 농도를 0.017 μM에서 0.173 μM로 증가시킴으로써, 역가는 0.4 g/L에서 각각 0.6 g/L 또는 0.5 mg/L까지 증가하였다. 아연 및 셀레늄의 농도를 증가시킴으로써 역가는 0.4 g/L에서 0.65 g/L 이상으로 증가하였다(도 2).

실시예 4: 셀레늄(Se) 및 구리(Cu)는 C-말단 α- 아미드화된 Pro에 영향을 미침

C-말단 α-아미드화에 대한 상기 시험된 미량 원소의 효과를 분석할 때, 아연 및 구리는 주요 영향을 갖고 이러한 두개의 인자는 파레토 차트 상에서 본페로니 한계 위에 있을 것으로 기대되었다. 예측된 바와 같이, 구리 농도 감소는 C-말단 α-아미드화의 감소를 나타내었다. 놀랍게도, 셀레늄 농도 증가는 C-말단 α-아미드화에 대한 주된 감소 효과를 나타내었다(도 3). 생성 매질 내 셀레늄 농도의 10배 증가는 C-말단 α-아미드화된 Pro의 양을 6.5%에서 4.5%로 감소시키고, 구리 농도의 10배 증가는 C-말단 α-아미드화된 Pro의 양을 2.5% 증가시켰다(도 4).

수득된 결과로부터, PAM 활성은 생성 매질 내 구리 및 셀레늄 농도를 변화시켜 효과적으로 조절할 수 있다는 것이 가정될 수 있다. C-말단 α-아미드화 감소를 위해, 셀레늄 농도는 최대치(0.173 μM)이고 구리 농도는 최소 범위(0.2 μM)에 있어야 한다.

실시예 5: 아연(Zn)은 C-말단 Lys 존재에 주된 영향을 나타냄

아연은 PAM 조절을 위한 중요 미량 원소로서 배제되기 때문에, C-말단 Lys의 백분율(양)에 대한 아연의 역할이 검토되었다. Lys는 흔히 효소 CP의 작용을 위한 기재 및 C-말단 아미노이다. 재조합형 생성물이 Pro-Gly-Lys의 C-말단 서열을 보유하는 경우, Lys 잔기는 CP의 작용에 의해 우선 분열되어야 한다. 이후 잔류하는 말단 Gly는 2개의 순차 반응에서 C-말단 아미드화된 Pro를 생성하는 PAM 효소 작용에 노출된다(상기 참조). 따라서, C-말단 α-아미드화의 양은 또한 CP의 작용에 간접적으로 의존한다.

C-말단 Lys의 양에 대한 상기 시험된 미량 원소의 효과를 분석할 때, 아연만이 CP 효소에 대한 주요 영향을 미치는 미량 원소로서 선택되었다(도 5). 아연 농도를 10배 증가시킴으로써, C-말단 Lys의 양은 22%에서 8.5%로 감소하였으며(도 6), 이는 아연이 CP의 활성화제로서 작용한다는 것을 의미한다.

실시예 6: 미량 원소 Se, Zn 및 Cu의 유효 농도의 평가

6개의 미량 원소에 의한 스크리닝 실험(즉, 실험 1) 후에, 아연, 셀레늄 및 구리는 배양 성능(역가), C-말단 α-아미드화 및 C-말단 카르복시펩티드화에 주된 영향을 미친다는 것이 측정되었다. 후속 실험(즉, 실험 2)에서, 인하우스 매질 중 이러한 3개의 미량 원소의 농도 범위 영향은 반응 표면 중앙 복합 디자인(response surface central composite design)으로 연구되었다.

선택된 미량 원소 각각은 5개의 수준으로 변경되었다: 플러스 및 마이너스 알파(축 포인트), 플러스 및 마이너스 1(인자 포인트) 및 중앙 포인트. 따라서, 반응 표면 중앙 복합 디자인이 생성되었으며, 여기서 아연, 구리 및 셀레늄 농도는 각각 0.15 μM 내지 15 μM, 0.01 μM 내지 0.2 μM, 및 0.1 μM 내지 6 μM에서 변동한다. 상기 선택된 시험 농도는 표 2에 나타내었다.

상기 실험은 최종 부피가 125 ml인 500 ml SF에서 실시하였다. 공급-회분식 바이오공정 14일 후에, 수확물을 수집하고, 원심분리하며, PES 멤브레인을 통해 멸균 필터링하고, 즉시 단일 단계 AC 정제를 수행한 후, SEC에 의한 C-말단 α-아미드화의 후속 분석을 실시하였다.

실험 2를 위한 제어 설정 포인트
	염화아연(μM)	염화구리(μM)	아셀렌화나트륨(μM)
SF01	7.41	0.18	2.98
SF02	3.09	0.14	4.65
SF03	7.41	0.10	2.98
SF04	11.73	0.05	4.65
SF05	3.09	0.14	1.31
SF06	11.73	0.05	1.31
SF07	7.41	0.10	2.98
SF08	11.73	0.14	4.65
SF09	7.41	0.02	2.98
SF10	7.41	0.10	5.78
SF11	11.73	0.14	1.31
SF12	7.41	0.10	2.98
SF13	7.41	0.10	2.98
SF14	14.67	0.10	2.98
SF15	7.41	0.10	2.98
SF16	7.41	0.10	0.17
SF17	3.09	0.05	4.65
SF18	7.41	0.10	2.98
SF19	0.15	0.10	2.98
SF20	3.09	0.05	1.31

상기 기술한 분석 단계를 수행한 후, 측정된 수치는 DOE 프로그램에 삽입하고 분석하였다. 통계적 유의성의 α-값은 0.100으로 설정하였으며, 이는 0.100보다 높은 P-수치를 갖는 인자는 유의적이지 않기 때문에 통계적 모드에서 배제된다는 의미이다.

실시예 7: Se 및 Zn의 농도 증가는 수확물 리터(L)당 단백질 그램(g)을 증가시킴

역가를 위해서, 유의적인 이차 모델을 < 0.0001의 p 수치에 의해 계산하였다. 2개의 시험된 미량 원소만이 역가에 유의적인 효과를 가지는 것으로 계산되었다: P-수치 0.0029의 아연 및 P-수치 < 0.0001의 셀레늄. 적합 시험(fit test)의 유의적인 결여가 계산되지 않았으며(P-수치 0.1506), '예측된 R-스퀘어(predicted R-square)'(0.8251)는 'Adj R-스퀘어(Adj R-square)'(0.9283)와 합리적으로 일치하였다. 18.856의 높은 'AdeqPrecisior'가 계산되었으며, 이는 높은 신호 대 노이즈 비율(signal to noise ratio)을 의미한다. 따라서, 상기 모델은 디자인 공간을 안내(navigate)하는 데 적합하였다. 상기 모델은 아연 농도를 7 μM에서 12 μM로 증가시켜 역가를 0.4 g/L에서 0.6 g/L 이상으로 증가시킬 수 있다는 것을 제안하였다(도 7). 셀레늄과 관련하여, 실시예 1 내지 5의 실험 1에서 10의 인자로 셀레늄 농도를 증가시켜 역가를 증가시키는 것이 가능하다는 것이 확인될 수 있었다(도 2). 발효 매질에서 일반적인 셀레늄 농도는 약 0.01 ∼ 0.06 μ 범위에 있다는 것이 공지되어 있다. 실시예 6의 실험 2에서 더욱 높은 셀레늄 농도가 시험되었다. 3 μM의 농도에서 셀레늄은 세포 배양에 독성이게 되며, 생존가능성은 80% 아래로 떨어졌다(데이터는 도시되지 않음). 결과적으로 3 μM 이상의 셀레늄 농도의 부정적인 효과는 역가 감소를 유발시킨다(도 7). 따라서, 셀레늄의 농도는 독성 농도 이하로 유지되어야 한다.

실시예 8: Se 농도 증가와 함께 Cu 농도 감소는 C-말단 α- 아미드화된 Pro를 급격히 감소시킴

C-말단 α-아미드화에 대해서 유의적인 이차 모델은 0.0001의 P-수치로 계산하였다. 3개의 모든 시험된 인자(Zn, Cu 및 Se)는 C-말단 α-아미드화된 Pro의 양에 유의적인 효과를 가지는 것으로 계산되었다: P-수치 0.0177의 아연, P-수치 <0.0001의 구리 및 P-수치 0.0002의 셀레늄. 적합 시험의 유의적인 결여가 계산되지 않았으며(P-수치 0.3239), 이는 상기 모델이 예측 수단으로서 이용될 수 있다는 것을 제시하였다. 20.363의 높은 'AdeqPrecisior'가 계산되었으며, 이는 높은 신호 대 노이즈 비율을 의미한다. 따라서, 상기 모델은 디자인 공간을 안내하는 데 적합하였다. 상기 모델은 구리 농도를 감소시켜 C-말단 α-아미드화를 유의적으로 감소시킬 수 있다는 것을 제안하였다. 구리 농도를 0.18 μM에서 0.06 μM로 감소시켜 C-말단 α-아미드화된 Pro의 양을 2.2%에서 2.1%로 약간 감소시켰다.

놀랍게도, PAM 효소 활성에 대한 셀레늄의 유의적인 음성적 효과가 또한 확인되었다. 셀레늄 농도를 0.17 μM에서 3.00 μM로 증가시켜 C-말단 α-아미드화된 Pro의 양을 2.2%에서 1.26%로 감소시켰다(도 8).

결국, C-말단 α-아미드화된 Pro의 양을 1% 아래로 감소시키기 위해서는 구리 농도는 감소되고 셀레늄 농도는 증가될 필요가 있다는 것이 확인될 수 있었다.

실시예 9 : Zn 농도 증가는 C-말단 Lys의 양을 감소시킴

CP 활성을 조절하는 공통인자로서의 아연의 유의적인 중요성은, C-말단 Lys의 양에 대한 상기 시험된 미량 원소의 효과를 분석하는 실시예 6 내지 8의 실험 2에서 또한 탐지되었다. CP 활성에 대해서 유의적인 이차 모델을 <0.0001의 P-수치에 의해 계산하였다. 아연(P-수치 <0.0001)은 C-말단 Lys의 양에 영향을 미치는 주요 인자로서 계산되었다. CP 활성에 대한 구리(P-수치 0.0080) 및 셀레늄(P-수치 0.0014)의 일부 효과가 또한 계산되었다. 적합 시험의 유의적인 결여가 계산되지 않았으며(P-수치 0.2830), '예측된 R-스퀘어'(0.9663)는 'Adj R-스퀘어'(0.9977)와 합리적으로 일치하였다. 이는 모델이 예측 수단으로서 이용될 수 있다는 것을 제시하였다. 100.942의 높은 'AdeqPrecisior'가 계산되었으며, 이는 높은 신호 대 노이즈 비율을 의미한다. 따라서, 상기 모델은 디자인 공간을 안내하는 데 적합하였다. 상기 모델은 아연 농도를 0.15 μM에서 5.00 μM로 증가시켜 C-말단 Lys의 양이 15%에서 5%로 증가된다는 것을 제시하였으며(도 9), 이는 아연이 CP의 주요 활성화제로서 작용할 수 있다는 것을 의미한다.

실시예 10: C-말단 아미드화된 Pro의 양의 최소화 및 C-말단 Lys의 양의 최대화

실시예 2 내지 9의 실험 2를 분석한 후에, 수 및 그래프 최적화를 DOE 소프트웨어를 이용하여 수행하였다.

우선, C-말단 아미드화된 Pro의 양의 최적화를 위한 모델을 연구하였다. 상기 프로그램은 높은 바람직도(desirability)(0.882)로, 0.4 μM의 구리 및 2.3 μM의 셀레늄을 이용하는 것으로 C-말단 아미드화된 Pro의 양이 0.78% 및 1.52%의 예측 구간 내에 있게 된다는 95% 확률이 존재하는 것으로 계산하였다.

제2 최적화 절차에서, C-말단 Lys의 양을 최대화하기 위한 모델이 연구되었다. 상기 프로그램은 높은 바람직도(0.920)로, 3.67 μM의 아연, 2.3 μM의 셀레늄 및 0.18 μM의 구리를 이용하는 것으로 C-말단 Lys의 양이 12.27% 및 13.02%의 예측 구간 내에 있게 된다는 95% 확률이 존재하는 것으로 계산하였다.

따라서, 2개의 새로운 매질 레시피(recipe)가 생성되었다. 구리(0.4 μM) 및 셀레늄(2.3 μM)의 계산된 농도와 연관하여, (조절된 인하우스 매질과 비교하여) 구리 농도가 감소하고 셀레늄 농도가 증가한 발효 매질을 SF 시스템을 이용하는 3개의 패러렐(parallel)에서 시험하였다. 모든 SF 접근법에서 앞선 실험에서와 동일한 조작 파라미터를 적용하였다. 구리 농도가 감소하고 셀레늄 농도가 증가한 매질 내의 C-말단 α-아미드화된 Pro의 측정량은 2.33% ± 0.09%이었으며, 따라서 예측 구간보다 약간 위였다. 우리의 인하우스 매질(2.04 μM 구리 및 0.173 μM 셀레늄)에서 생성되는 각각의 단백질에 의해 측정되는 결과들과 비교하는 경우, C-말단 α-아미드화된 Pro의 양은 상당히 감소하였다(도 10A).

상기 CP 활성을 최적화(즉, 감소)시키기 위해서, 아연 농도가 감소한 매질이 설계되고, 3개의 패러렐에서 시험하며, 변하지 않은 인하우스 매질과 비교하였다. 2.3 μM 아연을 포함하는 매질을 이용함으로써, CP의 활성은 저하되었고, 따라서 C-말단 Lys의 양은 1.99% ± 0.08%에서 15.97% ± 0.79%로 증가하였다(도 10B).

실시예 11: 신규한 PAM 억제제로서 셀레늄을 나타내는 생체 내 데이터

상기 기술된 DOE 실험으로부터 C-말단 α-아미드화의 공정은 발효 공정 중 매질에 존재하는 특정 미량 원소에 의해 엄격하게 조절된다. 아미노산 서열 Pro-Gly-Lys로 종결되는 펩티드의 경우, 상기 2개의 효소, 즉, PAM 및 CP의 작용이 필요하다. 앞선 실험에서, PAM 효소의 활성은 공지된 공통인자 아연 및 구리에 의해서만 조절되는 것이 아니다는 것이 확일될 수 있었다. 놀랍게도, 상기 매질 내에 셀레늄이 존재하여 PAM 효소 활성을 유의적으로 감소시킨다는 것이 또한 확인되었다. CP 효소의 활성을 위한 아연의 중요성이 또한 확인될 수 있었다.

상기 수득된 SF 결과는 또한 바이오반응기(BR) 환경에서 최종적으로 시험되었다. 모든 실험은 5L BR에서 수행되었다.

PAM 활성에 대한 셀레늄의 효과를 시험하기 위해서, 2개의 매질 조성물, 즉, 0.17 μM의 셀레늄을 갖는 매질 및 2.31 μM의 셀레늄을 갖는 매질이 시험되었다. 세포 배양 성장은 상기 2개의 매질 간에 비슷하였으며, 생존가능성의 유의적인 감소는 탐지되지 않아 셀레늄 농도 증가는 세포에 유독하지 않았다는 것을 나타내었다(도 11A). 셀레늄 농도 증가에 의해 역가는 1 g/L 감소하여(도 11B) 상기 시험된 셀레늄 농도가, 감소하였지만 여전히 허용가능한 생산성을 유도한다는 것을 의미하였다. 셀레늄 농도 증가는 C-말단 α-아미드화된 Pro의 양에 대한 주된 영향을 미쳤다. 0.17 μM의 셀레늄을 포함하는 매질에서 재조합형 단백질을 생성하는 경우, 생성된 펩티드는 9.3% C-말단 α-아미드화된 Pro를 포함하는 반면에, 2.31 μM의 셀레늄을 포함하는 매질의 경우에는 상응하는 양이 단지 2.25%였다(도 12).

수득된 결과는 셀레늄이 PAM 효소 활성에 대한 신규한 억제 인자이다는 것을 증명하였다. 따라서, PAM 효소의 작용 및 이후 C-말단 α-아미드화된 Pro의 양은 발효 매질 내 이용가능한 셀레늄의 농도에 의해 생체 내에서 (대규모 단백질 생산 중에도) 유의적으로 조절될 수 있다.

CP 활성에 대한 아연의 효과를 시험하기 위해서 3개의 상이한 염화아연 농도, 즉, 3.7 μM, 11 μM 및 22 μM가 시험되었다. 세포 배양 성장은 22 μM 및 11 μM 아연 농도를 포함하는 매질 간에 비슷하였으나, 유의적으로 낮은 성장이 3.7 μM 아연을 포함하는 매질에서 측정되어(도 13A) 세포로의 아연의 불충분한 제공으로 인한 성장 한계를 나타내었다. 생산성과 관련하여, 아연 농도 감소에 의해 생산성의 지속적인 감소가 측정되었다. 아연 농도가 최고로 높은 매질에서 3.86 g/L의 역가가 달성되었으며, 아연 농도가 11 μM인 매질에서는 최종 역가가 2.90 g/L이었고, 아연 농도가 최저인 매질에서는 최종 역가가 단지 1.86 g/L이었다(도 13B).

C-말단 Lys의 양에 대한 아연 농도 증가의 유의적인 효과가 측정되었다. 22 μM 아연을 포함하는 매질에서 재조합형 단백질을 생성하는 경우, 생성되는 펩티드는 단지 C-말단 Lys 3.15%를 가졌으며, 3.7 μ의 아연을 포함하는 매질에서는 C-말단 Lys의 함량이 6%이었다(도 14).

수득된 결과는 아연이 CP 효소의 활성화제이다는 것을 증명하였다. 아연 농도 증가에 의해, CP 효소는 더욱 작용성이었고 C-말단 Lys 양의 감소를 유도하였다. 반대로, C-말단 Lys의 양은 매질 내 이용가능한 아연 이온의 농도를 감소시켜 증가될 수 있다. 그리고 결과적으로, C-말단 Lys의 양의 증가는 (간접적으로) C-말단 α-아미드화된 Pro의 양의 감소를 유도한다.

참조문헌

Bradbury AF, Mistry J, Roos BA, Smyth DG. (1989). 4-Phenyl-3-butenoic acid, an in vivo inhibitor of peptidylglycine hydroxylase (peptide amidating enzyme). European Journal of Biochemistry; 189: 363-368.

Castigliore R, Gozzini L, Visco C, Galantino M. (1990) Use of PAM enzyme in solid phase peptide synthesis. United Kingdom Patent Application GB 2 220 938 A.

Eipper BA, Perkins SN, Husten EJ, Johnson RC, Keutmann HT, Mains RE. (1991) Peptidyl-alpha-hydroxyglycine alpha-amidatinglyase: Purification, characterization, and expression. The Journal of Biological Chemistry. 266: 7827-7833.

Gozzini l. Peergo R, Castigliore R. (1991) Cofactors for enzymatic amidation. United Kingdom Patent Application GB 2 233 978A.

Gunther K. (1990) Cofactor for the PAM enzyme. European Patent Application EP 0 409 294 A1.

Kim KH, Seong BL. (2001) Peptide Amidation: Production of Peptide Hormones in vivo and in vitro. Biotechnology and Bioprocess Engineering; 6: 244-251.

Liu H, Gaza-Bulseco G, Faldu D, Chumsae C, Sun J. Heterogeneity of Monoclonal Antibodies. Journal of Pharmaceutical Sciences; 97: 2426-2447.

Maillere B, Mourier G, Herve M, Menez A. (1995) Fine chemical modifications at N- and C-termini enhance peptide presentation to T cells by increasing the lifespan of both free and MHC-complexed peptides. Molecular Immunology; 32:1377-1385.

Merkler DJ. (1994) C-terminal amidated peptides: production by the in vitro enzymatic amidation of glycine-extended peptides and the importance of the amide to bioactivity. Enzyme and Microbial Technology; 16: 450-456.

Metha NM, Carpenter SE, Consalvo AP. (2009) C Terimanl α-Amidation. In: Walsh G. Post translational modification of Protein biopharmacetuticals. Wiley-VCH Verlag GmbH, Co.KGaA, Weinheim, Germany, pp. 253-276.

Claims (23)

1. 세포 배양 내 1 이상의 발현된 폴리펩티드의 [알파]-아미드화 및 아미노산 잔기 C-말단 분열을 제어하기 위한 세포 배양 매질로서, 상기 매질은, 각각 카르복시펩티다제(CP)를 활성화시키고 펩티딜글리신 [알파]-아미드화 모노옥시게나제(PAM) 효소를 억제하는 작용을 하는 0.2 μM 내지 20 μM 범위의 농도의 아연 및 0.175 μM 내지 2.98 μM 범위의 농도의 셀레늄의 미량 원소, 또는 이러한 원소를 포함하는 화합물을 포함하는 것인 세포 배양 매질.
2. 1 이상의 발현된 폴리펩티드의 아미노산 잔기 C-말단 분열 및 [알파]-아미드화를 제어하기 위한 세포 배양 방법으로서, 상기 방법은 적어도 하기 단계를 포함하는 것인 세포 배양 방법:
   (i) 각각 카르복시펩티다제(CP)를 활성화시키고 펩티딜글리신 [알파]-아미드화 모노옥시게나제(PAM) 효소를 억제하는 작용을 하는, 0.2 μM 내지 20 μM 범위의 농도의 미량 원소 아연 또는 이를 포함하는 화합물, 및 0.175 μM 내지 2.98 μM 범위의 농도의 미량 원소 셀레늄 또는 이를 포함하는 화합물을, 상기 폴리펩티드를 생성하는 숙주 세포를 포함하는 배양 매질에 첨가하는 단계; 및
   (ⅱ) 상기 폴리펩티드를 발효 및 회수하는 단계.
3. 제1항에 있어서, 상기 미량 원소 또는 이의 부가물(addition)은
   (i) C-말단 [알파]-아미드화된 프롤린의 양을 감소시키고/시키거나 C-말단 리신의 양을 증가시키고;
   (ⅱ) 이온 또는 이의 염, 또는 그 이온 또는 이의 염을 포함하는 화합물인 것인 세포 배양 매질.
4. 제1항에 있어서, 0.02 μM 내지 1 μM 범위의 농도의 구리 또는 이의 부가물을 더 포함하는 세포 배양 매질.
5. 제1항에 있어서, 상기 매질은 1 μM 내지 2.4 μM 범위의 농도의 셀레늄 및/또는 3 μM 이상 내지 15 μM 범위의 농도의 아연을 포함하는 것인 세포 배양 매질.
6. 제4항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
   (i) 상기 발현된 폴리펩티드의 C-말단 알파-아미드화된 프롤린은 2.04 μM 구리 및 0.173 μM 셀레늄을 함유하는 표준 매질의 사용에 비해 감소한다. 여기서, 2.3 μM ± 0.6 μM 셀레늄이 상기 매질에 존재하고/하거나, 상기 매질은 또한 0.4 μM ± 0.5 μM 구리를 포함한다; 및/또는
   (ⅱ) 상기 발현된 폴리펩티드의 C-말단 리신은 22 μM 아연을 함유하는 표준 매질의 사용에 비해 증가하고, 2.3 μM 내지 11 μM ± 0.5 μM 아연이 상기 매질에 존재하는 것인 세포 배양 매질.
7. 제1항에 있어서, 상기 발현된 폴리펩티드는
   (i) 이종(heterologously) 발현된 폴리펩티드이고, 상기 이종성 발현은 진핵 세포 기반의 발현 시스템에서 일어난다; 및/또는
   (ⅱ) 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 세포 배양 매질:
   (a) 항체 또는 이의 단편 또는 유도체,
   (b) 융합 단백질, 및/또는
   (c) 비항체(non-antibody) 단백질.
8. 제7항에 있어서, 상기 진핵 세포 기반의 발현 시스템은 곤충 세포, 식물 세포, 조류 세포, 균 세포, 포유류 세포 및 동물 세포로 필수적으로 구성되는 군으로부터 선택되는 진핵 세포를 포함하는 것인 세포 배양 매질.
9. 제7항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 진핵 세포 기반의 발현 시스템은 포유류 발현 시스템인 것인 세포 배양 매질.
10. 제9항에 있어서, 상기 포유류 발현 시스템은 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 포유류 세포주인 것인 세포 배양 매질:
    - 베이비 햄스터 신장 세포주
    - 중국 햄스터 난소 세포주
    - 뮤린(Murine) 골수종 세포주
    - 마우스 골수종 세포주
    - 인간 배아 신장 세포주
    - 인간 망막 유도 세포주, 또는
    - 양수 세포주.
11. 제2항에 있어서, 상기 미량 원소 또는 이의 부가물은
    (i) C-말단 [알파]-아미드화된 프롤린의 양을 감소시키고/시키거나 C-말단 리신의 양을 증가시키고;
    (ⅱ) 이온 또는 이의 염, 또는 그 이온 또는 이의 염을 포함하는 화합물인 것인 세포 배양 방법.
12. 제2항에 있어서, 0.02 μM 내지 1 μM 범위의 농도의 구리 또는 이의 부가물을 더 포함하는 세포 배양 방법.
13. 제2항에 있어서, 상기 매질은 1 μM 내지 2.4 μM 범위의 농도의 셀레늄 및/또는 3 μM 이상 내지 15 μM 범위의 농도의 아연을 포함하는 것인 세포 배양 방법.
14. 제12항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 상기 발현된 폴리펩티드의 C-말단 알파-아미드화된 프롤린은 2.04 μM 구리 및 0.173 μM 셀레늄을 함유하는 표준 매질의 사용에 비해 감소한다. 여기서 2.3 μM ± 0.6 μM 셀레늄이 상기 매질에 존재하고/하거나, 상기 매질은 또한 0.4 μM ± 0.5 μM 구리를 포함한다; 및/또는
    (ⅱ) 상기 발현된 폴리펩티드의 C-말단 리신은 22 μM 아연을 함유하는 표준 매질의 사용에 비해 증가하고, 2.3 μM 내지 11 μM ± 0.5 μM 아연이 상기 매질에 존재하는 것인 세포 배양 방법.
15. 제2항에 있어서, 상기 발현된 폴리펩티드는
    (i) 이종 발현된 폴리펩티드이고, 상기 이종성 발현은 진핵 세포 기반의 발현 시스템에서 일어난다; 및/또는
    (ⅱ) 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 세포 배양 방법:
    (a) 항체 또는 이의 단편 또는 유도체,
    (b) 융합 단백질, 및/또는
    (c) 비항체 단백질.
16. 제15항에 있어서, 상기 진핵 세포 기반의 발현 시스템은 곤충 세포, 식물 세포, 조류 세포, 균 세포, 포유류 세포 및 동물 세포로 필수적으로 구성되는 군으로부터 선택되는 진핵 세포를 포함하는 것인 세포 배양 방법.
17. 제15항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 진핵 세포 기반의 발현 시스템은 포유류 발현 시스템인 것인 세포 배양 방법.
18. 제17항에 있어서, 상기 포유류 발현 시스템은 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 포유류 세포주인 것인 세포 배양 방법:
    - 베이비 햄스터 신장 세포주
    - 중국 햄스터 난소 세포주
    - 뮤린 골수종 세포주
    - 마우스 골수종 세포주
    - 인간 배아 신장 세포주
    - 인간 망막 유도 세포주, 또는
    - 양수 세포주.
19. 삭제
20. 삭제
21. 제2항에 있어서, 상기 방법은 하기를 포함하는 1 이상의 바이오반응기 또는 배양 용기에서 실시하는 것인 방법:
    - 쉐이크 플라스크(shake flask)
    - T-플라스크
    - 롤러 바틀(roller bottle)
    - 백(bag)
    - 바이오반응기, 및/또는
    - 스피너플라스크(spinnerflask).
22. 펩티딜글리신 [알파]-아미드화 모노옥시게나제(PAM) 효소에 대한 억제제로서 셀레늄 또는 이의 염을 사용하는 것을 포함하는, 셀레늄 또는 이의 염의 사용 방법.
23. 카르복시펩티다제(CP)에 대한 활성화제로서 0.2 μM 내지 20 μM 범위의 농도의 아연 또는 이의 염을 사용하는 것을 포함하는, 아연 또는 이의 염의 사용 방법.

Images