KR102099813B1

KR102099813B1 - 조산에 대한 바이오 마커

Info

Publication number: KR102099813B1
Application number: KR1020187026911A
Authority: KR
Inventors: 시우-청 스티븐 침; 치 인 청; 완 치 청; 탁 영 렁; 윙 샨 리
Original assignee: 더 차이니즈 유니버시티 오브 홍콩
Priority date: 2013-07-24
Filing date: 2014-06-20
Publication date: 2020-04-10
Also published as: EP3024949A1; EP3495502A2; EP3495502A3; ES2724328T3; US10428383B2; US10947593B2; KR20180105276A; JP6734191B2; KR20160027212A; EP3024949A4; US20190376140A1; US20160376651A1; EP3024949B1; WO2015010442A1; EP3495502B1; JP2016526895A

Abstract

본 발명은 여성의 혈액 중 하나 이사의 마커 유전자의 변형된 발현 수준을 검출함으로써 임신 여성의 조상의 증가된 위험을 결정하는 방법을 제공한다. 이러한 방법에 유용한 키트 및 장치 또한 제공된다. 또한, 본 발명은 조산의 가능성을 예방하거나 줄이는 방법을 제공한다.

Description

조산에 대한 바이오 마커{Biomarkers for premature birth}

관련 출원

본 출원은, 내용의 전체가 참조로서 포함된 2013년 7월 24일자로 출원된 미국 가출원 번호 제61/857,975호에 대한 우선권을 주장한다.

인간에 있어서, 조산(premature birth) 또는 조산(preterm birth)은 37주 미만의 임신 기간에서의 출산을 의미한다. 조산은 전세계적으로 유사 사망의 주요 원인 중의 하나이다. 이른 유아 출산은 또한 단기간 및 장기간 중 성장의 장애 및 방해, 및 정신 지체를 포함하는 다양한 합병증으로 고통받을 가능성이 있다. 실질적인 진척이 이르게 출산된 유아의 생존율 및 차후의 발달을 개선하기 위해 이루어졌지만, 조산의 정확한 원인은 아직도 완전히 알려지지 않았다. 조산의 발병율 및 영향을 고려했을 때, 조산의 기회를 감소시키거나 제거하기 위해 예방적 측정이 적절하게 이루어질 수 있도록, 임신 여성에서 조산의 증가된 위험을 더욱 정확하게 검출하기 위한 새로운 방법에 대한 요구가 존재한다. 본 발명은 이것과 다른 관련된 요구들을 충족한다.

본 발명은 임신 여성의 혈액 세포에서 mRNA 수준에서 보여지는, 특정 마커 유전자의 전사가 조산의 가능성과 관련되어 증가되거나 또는 억제될 수 있다는 것을 발견하였다. 이와 같이, 제1 측면에 있어서, 본 발명은 유아의 이른 분만의 임신 여성의 위험을 결정하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 (a) 임신 여성으로부터 수득된 혈액 시료 중, 표 2에 열거된 유전자 중의 하나, 또는 CD164A, 또는 CD62L일 수 있는 마커의 mRNA 수준을 결정하는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a)에서 얻어진 mRNA 수준을 표준 대조군과 대비하는 단계를 포함한다. 표준 대조군 대비 mRNA의 증가 또는 감소가 검출될 때, 이것은 조산의 증가된 위험을 갖는 여성을 지시한다. 증가 또는 감소가 증가된 위험을 지시하는 특정 마커에 대해서 본 출원, 예를 들면, 표 2에서 제공되는 정보에 기반하여 명백해질 것이다. 예를 들면, 마커가 B3GNT5, CD16A, 또는 CD62L일 때, 표준 대조군 대비 mRNA 수준의 증가는 조산의 증가된 위험을 갖는 여성을 지시하고, 반면에, 마커가 CLC 또는 GBP3일 때, 표준 대조군 대비 mRNA 수준의 감소는 조산의 증가된 위험을 갖는 여성을 지시한다. 전혈 및 다양한 혈액의 일부, 예를 들면, 혈청, 혈장 또는 분리된 혈액 세포가 이 방법에 사용될 수 있다.

일부 구체예에 있어서, mRNA 수준은 단계 (b) 전에 동일한 시료 중 기준 유전자(reference gene)의 mRNA 수준에 대하여 정상화된 것이다. 예를 들면, 마커 유전자의 mRNA 수준은 기준 유전자의 mRNA 수준에 대한 비율로서 표현될 수 있다. 예시적 기준 유전자는 GAPDH이다. 일부 경우에 있어서, 하나 이상의 마커 유전자의 mRNA 수준은 조산의 위험을 결정하기 위하여 측정되고, 그들 각각의 표준 대조군과 대비된다.

일부 구체예에 있어서, 단계 (a)는 마이크로어레이, 형광 프로브, 또는 분자 비콘을 위한 질량 분석 또는 혼성화를 포한한다. 일부 구체예에 있어서, 단계 (a)는 증폭 반응, 에를 들면, 중합효소 연쇄 반응(PCR), 특히 정량적 RT-PCR(qRT-PCR)을 포함하는 역 전사 효소-중환효소 연쇄 반응(RT-PCR)을 포함한다. 일부 구체예에 있어서, 단계 (a)는 검출가능한 모이어티를 포함하는 폴리뉴클레오티드 프로브를 활용하는 폴리뉴클레오티드 혼성화 어세이를 포함한다. 예를 들면, 폴리뉴클레오티드 혼성화 어세이는 서던 블랏 분석, 노던 블랏 분석, 또는 인 시투(in situ) 혼성화 어세이를 포함할 수 있다.

특정 구체예에 있어서, 임신 여성이 조산 분만의 증가된 위험을 갖는 것으로 지시될 때, 상기 방법은 조산의 위험을 감소하거나 제거하기 위한 치료 단계를 더 포함할 수 있다.

두 번째 측면에 있어서, 본 발명은 임신 연성에서 조산의 위험을 결정하기 위한 키트를 제공한다. 상기 키트는 이들 구성을 포함한다: (1) 마커 유전자 mRNA의 평균 수준을 제공하는 표준 대조군; 및 (2) 마커 유전자 mRNA를 특이적으로 및 정량적으로 식별하는 제제. 마커 유전자는 표 2의 유전자, CD16A, 및 CD62L로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에 있어서, 상기 제제는 마커 유전자 mRNA와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드 프로브이다. 상기 폴리뉴클레오티드 프로브는 선택적으로 검출가능한 모이어티를 포함한다. 일부 구체예에 있어서, 상기 키트는 증폭 반응 중 마커 유전자 cDNA의 하나 이상의 세그먼트(segment) 또는 마커 유전자 cDNA의 상보체(complement)를 특이적으로 증폭하기 위한 두 개의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 더 포함한다. 종종 상기 키트는 지시 매뉴얼을 더 포함한다.

세 번째 측면에 있어서, 본 발명은 조산의 위험을 감소시키거나, 또는 조산의 위험을 예방하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 (1) 표 2의 마커 유전자에 대한, 또는 CD16A, 또는 CD62L에 대한 안티센스 폴리뉴클레오티드 서열 또는 siRNA; 또는 (2) 표 2의 마커 유전자의 cDNA 서열을 포함하고, 마커 유전자의 전사를 제어하는 발현 카세트의 유효한 양을 여성에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에 있어서, 상기 발현 카세트는 마커 cDNA 서열과 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. (1) 또는 (2)의 선택은 특정 마커 RNA가 조산과 연관되어 증가된 것으로 밝혀지는지 여부에 기초한다.

정의

본 명세서에서 용어 "조산(premature birth)" 및 "조산(preterm birth)"은 동일한 의미를 갖고, 37주 미만의 임신 기간, 예를 들면, 34 주이하의 임신 기간의 인간 유아의 출생을 의미한다.

본 명세서에서 용어 "또는(or)"은 내용이 명확하게 다르게 지시하지 않는 한, "및/또는(and/or)"을 포함하는 그의 의미에서 일반적으로 적용된다.

본 명세서에서 사용된 용어 "혈액(blood)"은 시험될 개체로부터의 혈액 시료 또는 제제를 의미한다. 용어는 전혈, 또는 혈액 세포를 포함할 수 있거나, 또는 사실상 비세포성, 에를 들면, 혈장 또는 혈청인 혈액의 부분을 포함한다.

본 명세서에서 용어 "단리된(isolated)" 핵산 분자는 단리된 핵산 분자와 통상적으로 관련된 다른 핵산 분자로부터 분리된 핵산 분자를 의미한다. 그러므로, "단리된" 핵산 분자는, 그에 제한 없이, 단리된 핵산 분자가 유래한 생명체의 유전체 중 핵산의 하나의 또는 양 말단을 자연적으로 플랭크(flank)하는 뉴클레오티드 서열이 없는 핵산 분자를 포함한다(예를 들면, PCR 또는 제한 엔도뉴클리아제 소화(restriction endonuclease digestion)에 의해 생산된 cDNA 또는 유전체 DNA 단편). 이러한 단리된 핵산 분자는 조작의 편이를 위해 또는 융합 핵산 분자의 생성을 위해 일반적으로 벡터(예를 들면, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터)에 도입된다. 또한, 단리된 핵산 분자는 조작된 핵산 분자, 예를 들면, 재조합 또는 합성 핵산 분자를 포함한다. 예를 들면, 핵산 분자 라이브러리(예를 들면, cDNA 또는 유전체 라이브러리) 또는 겔(예를 들면, 아가로오스, 또는 폴리아크릴아민) 함유 제한-소화(restriction-digested) 유전체 DNA 내의 수백 내지 수만의 다른 핵산 분자 사이에 존재하는 핵산 분자는 "단리된" 핵산 분자가 아니다.

용어 "핵산(nucleic acid)" 또는 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"는 단일 또는 이중 가닥 형태의 디옥시리보핵산(deoxyribonucleic acid)(DNA) 또는 리보핵산(ribonucleic acid)(RNA) 및 그의 중합체를 의미한다. 상세하게 제한되지 않는 한, 용어는 기준 핵산으로서 유사한 결합 특성을 갖고, 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드와 유사한 방법으로 대사되는 천연 뉴클레오티드의 알려진 유사체(analog)를 포함하는 핵산을 포함한다. 다르게 지시되지 않는 한, 특정 핵산 서열은 또한 명백하게 지시된 서열뿐만 아니라, 내재적으로 그의 보존적으로 변형된 변이체(예를 들면, 축퇴 코돈 치환(degenerate codon substitution), 대립 형질, 이종 상동(ortholog), 단일 염기 다형성(SNP), 및 상보적인 서열을 포함한다. 상세하게는 축퇴 코돈 치환은 하나 이상의 선택된(또는 전부) 코돈의 3번째 위치가 혼합된-염(mixed-base) 및/또는 디옥시이노신(deoxyinosine) 잔기로 치환된 서열을 발생시킴으로서 달성될 수 있다(Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); 및 Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)). 용어 핵산은 유전자, cDNA, 및 유전자에 의해 인코딩된 mRNA와 호환적으로 사용된다.

용어 "유전자(gene)"는 폴리펩티드 사슬을 생산하는 것과 관련된 DNA의 세그멘트를 기술하는데 사용된다; 이것은 개별적인 코딩 세그먼트(엑손) 사이의 개재 서열(intervening sequence)(인트론)뿐만 아니라, 유전자 산물의 전사/번역 및 전사/번역의 조절과 관련된 코딩 영역(리더(leader) 및 트레일러(trailer))에 선행하는 및 차후의 영역을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 유전자가 그의 이름으로 상세하게 식별될 때(예를 들면, 표 2에 열거된 어느 하나, 플러스 CD16A 및 CD62L), 유전자는 해당 유전자의 자연적으로 발생하는 변이체 또는 돌연변이체를 포함한다. 예를 들면, 인간의 cDNA 서열은 GenBank Accessiion No. NM_032047로 기재되어 있다. 본 명세서의 의미 내에서 "B3GNT5 유전자"는 NM_032047의 cDNA와 적어도 80%, 855, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 상동성의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 변이체를 포함한다. 표 2에서 제공된 것을 포함하는 다른 유전자에 대한 퍼센트 서열 상동성이 유사한 방법으로 표현된다. CD16A에 대한 GenBank Accession No.는 NM_000569, NM_001127592, NM_001127593, NM_001127595, 또는 NM_001127596이고, CD62L에 대해서는 NM_000655 또는 NR_029467이다.

본 명세서에서 용어 "폴리펩티드(polypeptide)", "펩티드(peptide)", 및 "단백질(protein)"은 여기서 호환적으로 사용되고, 아미노산 잔기의 중합체를 의미한다. 용어는 자연적으로 발생하는 아미노산 중합체 및 비-자연적으로 발생하는 아미노산 중합체뿐만 아니라, 하나 이상의 아미노산 잔기가 대응되는 자연적으로 발생하는 아미노산의 인공 화학적 모방체(artificial chemical mimetic)인 아미노산 중합체에 적용된다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어는 전장 단백질(즉, 항원)을 포함하는 어느 길이의 아미노산 사슬을 포함하고, 여기서 아미노산 잔기는 공유 펩티드 결합에 의해 연결된 것이다.

용어 "아미노산(amino acid)"는 자연적으로 발생하는 아미노산과 유사한 방법으로 작용하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체뿐만 아니라 자연적으로 발생하는, 및 합성 아미노산을 의미한다. 자연적으로 발생하는 아미노산은 나중에 변형된 아미노산, 예를 들면, 히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트 및 O-포스포세린뿐만 아니라, 유전 코드에 의해 인코딩된 것들이다. 본 명세서의 목적을 위해서, 아미노산 유사체는 자연적으로 발생하는 아미노산과 동일한 기본 화학 구조, 즉, 수소와 결합하는 탄소, 카르복실기, 아미노기, 및 R 기, 예를 들면, 호모세린, 노르루신, 메티오닌 설폭시드, 메티오닌 메틸 설포니움을 갖는 화합물을 의미한다. 이러한 유사체는 변형된 R 기(예를 들면, 노르루신) 또는 변형된 펩티드 백본을 가지나, 자연적으로 발생하는 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 갖는다. 본 명세서의 목적을 위해서, 아미노산 모방체는 아미노산의 일반적인 화학 구조와 상이한 구조를 가지나, 자연적으로 발생하는 아미노산과 유사한 방법으로 작용하는 화학적 화합물을 의미한다.

아미노산은 WO01/12654에 개시된 바와 같이, 하나 이상의 D-아미노산을 포함하는 폴리펩티드의 안정성(예를 들면, 반감기), 생체이용률, 및 다른 특성을 개선하는 비-자연적으로 발생하는 D-카이랄성(D-chirality)을 갖는 것일 수 있다. 일부 경우에 있어서, 치료적 폴리펩티드의 하나 이상, 및 잠재적으로 전부의 아미노산은 D-카이랄성을 갖는다.

아미노산은 본 명세서에서 통상적으로 알려진 세 개의 글자 심볼 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회(Biochemical Nomenclature Commission)에 의해 추천되는 한 글자 심볼에 의해 언급될 수 있다. 이와 같이, 뉴클레오티드는 그들의 통상적으로 인정된 단일-글자 코드에 의해 언급될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 두 개 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산이 기술된 문맥에 있어서, 용어 "상동(identical)", 또는 퍼센트 "상동성(identity)"는 다음의 서열 비교 알고리즘 중의 하나를 사용하여, 또는 수동 정렬(manual alinment) 및 시각 검사(visual inspection)에 의해 측정된 비교 윈도우, 또는 디자인된 영역(designated region)에 대한 최대 일치를 위해 비교되고, 정렬될 때, 동일한, 또는 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 명시된 퍼센트를 갖는 두 개 이상의 서열 또는 서브서열(subsequence)를 의미한다(예를 들면, 본 발명의 방법에서 사용된 변이체 B3GNT5 유전자는 80% 이상 서열 상동성, 바람직하게는 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 상동성을 기준 서열, 예를 들면, GenBank Accession No NM_032047로 제시된 야생형 인간 B3GNT5 cDNA에 대하여 갖는다). 이러한 서열은 이후에 "실질적으로 상동인"으로 불려진다. 폴리뉴클레오티드 서열에 있어서, 이 정의는 또한 시험 서열의 상보체(complement)를 의미한다. 바람직하게는 상동성은 길이로 약 50 아미노산 또는 뉴클레오티드 이상인 영역에 대해서, 또는 더욱 바람직하게는 길이로 75-100 아미노산 또는 뉴클레오티드 여역에 대해서 존재한다.

서열 비교를 위해서, 전형적으로 하나의 서열이 시험 서열이 비교되는 기준 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용할 때, 시험 및 기준 서열은 컴퓨터로 들어가고, 서브 서열 좌표가 디자인되고, 필요하다면, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터가 디자인될 수 있다. 서열 비교 알고리즘은 이후에, 프로그램 파라미터에 기초하여, 기준 서열 대비 시험 서열에 대한 퍼센트 서열 상동성을 계산한다. 핵산 및 단백질의 서열 비교를 위해, 하기에서 논의된 BLAST, 및 BLAST 2.0 알고리즘, 및 디폴트(default) 파라미터가 사용된다.

본 명세서에서 사용된 "비교 윈도우(comparison window)"는 두 개의 서열이 최적으로 정렬된 후, 서열이 연속된 위치의 동일한 수의 기준 서열과 비교될 수 있는, 20 내지 600, 통상적으로 약 50 내지 약 200, 더욱 통상적으로 약 100 내지 약 150으로 이루어진 군으로부터 선택된 연속된 위치의 수의 어느 하나의 세그먼트에 대한 기준(reference)을 포함한다. 비교를 위한 서열의 정렬의 방법은 기술 분야에 잘 알려져 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 예를 들면, local homology algorithm of Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), the homology alignment algorithm of Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), the search for similarity method of Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), computerized implementations of these algorithms (GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), 또는 manual alignment and visual inspection (예를 들면, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995 supplement) 참조)에 의해 수행될 수 있다.

퍼센트 서열 상동성 및 서열 유사성을 결정하기 위해 적합한 알고리즘의 예는 Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 및 Altschul et al. (1977) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402에 각각 기재된 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립생물정보센터 웹사이트, ncbi.nlm.nih.gov에서 공개적으로 사용 가능하다. 알고리즘은 의문의 서열 중 길이 W의 짧은 단어를 식별함으로써, 고 점수 서열쌍(HSPs)을 제1 식별하는 단계를 포함하고, 이것은 데이터베이스 서열 중 동일한 길이의 단어와 정렬될 때, 일부 양의 값의 역치 점수 T(positive-valued threshold score T)와 매치되거나 만족한다. T는 이웃 단어 점수 역치(neighborhood word score threshold)를 의미한다(Altschul et al., supra). 이들 초기 이웃 단어 히트는 그들을 포함하는 더 긴 HSP를 찾기 위해 초기 서치를 시작하기 위한 씨앗으로서 작용한다. 단어 히트는 이후에 각 서열의 양 방향을 따라 축적 정렬 점수(cumulative alignment score)가 증가될 수 있을 만큼 확장된다. 축적 점수는 뉴클레오티드 서열에 대하여 파라미터 M(매칭 잔기의 쌍에 대한 보상 점수; 항상 > 0) 및 N(미스매칭 잔기에 대한 벌칙 점수; 항상 < 0)을 사용하여 계산된다. 아미노산 서열에 대하여, 점수 매트릭스는 축점 점수를 계산하는데 사용된다. 각 방향으로의 단어 히트의 확장은: 축적 정렬 점수가 그의 최대 달성된 값으로부터 양(quantity) X로 떨어질 때; 축적 점수가 하나 이상의 음-점수 잔기 정렬의 축적에 의해 0 이하로 갈 때; 또는 양 서열의 말단에 도달했을 때 정지된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T, 및 X는 정렬의 민감도 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오티드 서열을 위한)은 28의 단어 크기(W), 10의 기대값(expectation)(E), M=1, N=-2, 및 양 가닥의 비교를 디폴트로서 사용한다. 아미노산 서열에 대하여, BLASTP 프로그램은 3의 단어 크기(W), 10의 기대값(E), 및 BLOSUM62 점수 매트릭스를 디폴트로서 사용한다(Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989) 참조).

BLAST 알고리즘은 또한 두 개의 서열 사이의 유사성의 통계적 분석을 수행한다(예를 들면, Karlin and Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993) 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공된 유사성의 하나의 측정은 가장 작은 합계 확률(sum probability)(P(N))이고, 이것은 두 개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 매치가 우연에 의해 일어날 수 있는 확률의 표시를 제공한다. 예를 들면, 만약 시험 핵산 대 기준 핵산의 비교에서 가장 작은 합계 확률이 약 0.2 미만, 더욱 바람직하게는 약 0.01 미만, 및 가장 바람직하게는 약 0.001 미만이면, 핵산은 기준 서열과 유사한 것으로 간주된다.

단백질 또는 펩티드에 대한 특정 분자의 결합 관계를 기술된 문맥에서, 문구 "특이적으로 결합한다(specifically bind)"는 단백질 및 다른 생물제제의 이질적인 집단 중 단백질의 존재의 결정요인의 결합 반응을 의미한다. 그러므로, 디자인된 결합 어세이 조건 하에서, 명시된 결합제(예를 들면, 항체)는 배경보다 적어도 두 배로 특정 단백질과 결합하고, 시료 중 존재하는 다른 단백질에 대해 유의적 양으로 실질적으로 결합하지 않는다. 이러한 조건 하에서 항체의 특이적 결합은 유사한 "자매" 단백질이 아닌, 특정 단백질 또는 단백질에 대한 그의 특이성에 대해 선택된다. 다양한 면역어세이 형태가 특정 단백질과 또는 특정 형태로 특이적으로 면역반응성인 항체를 선택하는 사용될 수 있다. 예를 들면, 고체-상 ELISA 면역어세이는 통상적으로 단백질과 특이적으로 면역반응성인 항체를 선택하는데 사용된다(예를 들면, Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988) for a description of immunoassay formats and conditions that can be used to determine specific immunoreactivity 참조). 전형적으로 특이적 또는 선택적 결합 반응은 배경 신호 또는 잡음보다 보다 두배 이상일 것이고, 더욱 전형적으로 배경보다 10 내지 100배 이상이다. 반면에, 다른 폴리뉴클레오티드 서열과 이중-가닥 복합체를 형성하는 폴리뉴클레오티드 서열을 의미하는 문맥에서 사용될 때, 용어 "특이적으로 결합한다"는 용어 "폴리뉴클레오티드 혼성화 방법"에 대한 정의에서 제공된 바와 같이, 왓슨-크릭 염기-쌍에 기반한 "폴리뉴클레오티드 혼성화"를 기술한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "증가(increase)", 또는 "감소(decrease)"는 비교 대주곤, 예를 들면, 확립된 표준 대조군(예를 들면, 임신의 정상 시간 프레임 중 유아를 분만한 임신 여성의 혈액에서 나타난 마커 유전자 mRNA의 평균 수준)으로부터 양(quantity)의 검출가능한 양 또는 음의 변화를 의미한다. 증가는 전형적으로 적어도 10%, 또는 적어도 20%, 또는 50%, 또는 100%인 양의 변화이고, 대조군 값의 적어도 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 6-배, 7-배, 8-배, 9-배, 또는 10-배만큼 높을 수 있다. 유사하게 감소는 전형적으로 적어도 10%, 또는 적어도 20%, 30%, 또는 50%인 음의 변화이고, 대조군 값의 적어도 80%, 또는 90%이다. 비교 기초로부터의 양적인 변화 또는 차이를 나타내는 다른 용어, 예를 들면, "더(more)", "덜(less)", "더 높은(higher)", 더 낮은(lower)"은 본 명세서에서 상기에서 기술된 바와 같이 동일한 방법으로 사용된다. 대조적으로, 용어 "실질적으로 동일(substantially same)", 또는 "실질적으로 변화 없는(substantiallly lack of change)"는 전형적으로, 표준 대조군의 ±10% 이내, 또는 ±5%, 2% 이내, 또는 표준 대조군으로부터 더 작은 변화인, 표준 대조군 값으로부터 값의 변화가 거의 없거나 없는 것을 나타낸다.

본 명세서에서 사용된 "폴리뉴클레오티드 혼성화 방법(polynucleotide hybridization method)"는 적절한 혼성화 조건 하에서, 알려진 서열의 폴리뉴클레오티드 서열과 왓슨-크릭 염기-쌍을 형성할 수 있는 능력에 기반한 미리-결정된 폴리뉴클레오티드 서열의 존재 및/또는 양을 검출하는 방법을 의미한다. 이러한 혼성화 방법의 예는 서던 블랏, 노던 블랏, 인 시투(in situ) 혼성화를 포함한다.

본 명세서에서 사용된 "프라이머(primer)"는 마커 유전자(표 2에 열거된 것 중 하나, 및 CD16A 및 CD62L 더 포함)에 대응되는 폴리뉴클레오티드 서열, 예를 들면, 인간 B3GNT5 유전자 또는 그의 일부에 대한 cDNA 또는 유전체 서열에 기반한 뉴클레오티드 서열을 증폭하기 위해 증폭 방법, 예를 들면, 중합효소 연쇄 반응(PCR)에서 사용될 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 전형적으로 폴리뉴클레오티드 서열의 증폭을 위한 PCR 프라이머의 하나 이상은 그 폴리뉴클레오티드 서열과 서열-특이적이다. 프라이머의 정확한 길이는 온도, 프라이머의 소스, 및 사용되는 방법을 포함하는 많은 요소에 의존할 것이다. 예를 들면, 진단 및 예후 적용을 위해, 타겟 서열의 복잡성에 의존하여, 올리고뉴클레오티드 프라이머는 비록 더 적은 또는 더 많은 뉴클레오티드를 포함할 수 있을지라도, 전형적으로 10, 또는 15, 또는 20, 또는 25 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. 프라이머의 적절한 길이를 결정하는 것과 관련된 인자는 기술분야의 통상의 당업자에게 용이하게 알려져 있다. 본 명세서에서 용어 "프라이머 쌍(primer pair)"는 증폭될 반대 가닥 타겟 DNA 분자, 또는 뉴클레오티드 서열을 플랭크하는 타겟 DNA의 영역에 혼성화하는 프라이머의 쌍을 의미한다. 본 명세서에서 용어 "프라이머 부위(primer site)"는 프라이머가 혼성화하는 타겟 DNA 또는 다른 핵산의 영역을 의미한다.

"표지(label)", "검출가능한 표지(detectable label)", 또는 "검출가능한 모이어티(detectable moiety)"는 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 화학적, 또는 다른 물리적 수단에 의해 검출가능한 조성물이다. 예를 들면, 유용한 라벨은 ³²P, 형광 염료, 전자-밀도 시약(electron-dense reagent), 효소(예를 들면, ELISA에서 통상적으로 사용되는), 비오틴, 디곡시제닌(digoxigenin), 또는 햅텐 및 예를 들면, 펩티드에 방사성 물질을 도입함으로써, 또는 펩티드와 특이적으로 반응성인 항체를 검출하기 위해 사용되는, 검출 가능하게 만들어진 단백질을 포함한다. 전형적으로 검출 가능한 라벨은 프로브의 존재(및 그러므로 그의 결합 타겟)를 용이하게 검출 가능하게 하기 위해, 정의된 결합 특성을 갖는 프로브 또는 분자(예를 들면, 알려진 결합 특이성을 갖는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드)와 부착된다.

본 명세서에서 사용된 "표준 대조군(standard control)"은 임신의 정상 시간 프레임 내에서 유아를 분만한, 건강한 임신 여성 또는, 37 임신주 이전에 빈번한 자궁 수축을 갖는 임신 여성으로부터 수득한 혈액 시료 중 존재하는, 폴리뉴클레오티드 서열, 예를 들면, 표 2에 열거된 마커 유전자, 플러스 CD16A, 및 CD62L 중 어느 하나의 mRNA의 미리 결정된 양 또는 농도를 의미한다. 표준 대조군 값은 시험 시료 중 존재하는 마커 유전자 mRNA의 양을 비교하기 위한 기준으로서 역할을 하기 위해 본 발명의 방법의 사용에 적합하다. 표준 대조군으로서 제공되는 확립된 시료는 통상적으로 정의된 바와 같이 임신의 정상 시간 프레임 내에서 유아를 분만한, 평균의 건강한 임신 여성 또는 37 임신주 이전에 빈번한 자궁 수축을 갖는 임신 여성의 혈액 시료에 대해 전형적인, 마커 mRNA의 평균 양을 제공한다. 표준 대조군 값은 시료의 성질(예를 들면, 이것이 수집된 이후에 어떻게 처리되었는지 여부), mRNA 수준이 또 다른 기준 유전자의 mRNA의 수준에 대하여 정상화 되었는지 여부(예를 들면, 마커 mRNA 수준과 기준 mRNA 사이의 비율), 및 다른 인자, 예를 들면, 대조군 값의 확립의 기초가된 개체의 나이, 임신 기간, 및 민족에 의존하여 다양할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "기준 유전자(reference gene)"는 혈액 시료 중 용이하게 검출 가능하게 일관되게 발현되고 실질적으로 변함없는 수준으로 알려진 "하우스키핑(housekeeping)" 유전자를 의미한다. 혈액 시료에 대한 이러한 "하우스키핑" 유전자의 예는 GAPDH(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase), SDHA (succinate dehydrogenase), HPRT1 (hypoxanthine phosphoribosyl transferase 1), HBS1L (HBS1-like protein), AHSP (alpha haemoglobin stabilising protein), ACTB (beta-actin), RNA18S5 (RNA, 18S ribosomal 5), FCGR3A (the Fc fragment of IgG, low affinity IIIa, receptor), FCGR3B (the Fc fragment of IgG, low affinity IIIa, receptor), B2M (beta-2-microglobulin), HUWE1 (HECT, UBA and WWE domain containing 1, E3 ubiquitin protein ligase), TPT1 (tumor protein, translationally-controlled 1), MYL12B (myosin, light chain 12B, regulatory), SKP1 (S-phase kinase-associated protein 1) 및 혈액 시료로부터의 발현 데이터의 정상화에 적합한 것으로 식별된 유전자(Chang et al., 2011; Cheng et al., 2011)를 포함한다. 복수의 "하우스키핑 유전자"가 또한 사용될 수 있다.

건강한 임신 여성, 또는 37 임신주 이전에 빈번한 자궁 수축을 갖는, 임신의 정상 시간 프레임 내에 분만한 것으로 나중에 확인된, 임신 여성을 기술하는 문맥에서 사용된 용어 "평균(average)"은 건강한 임신 여성, 또는 37 임신주 이전에 빈번한 자궁 수축을 갖는, 임신의 정상 시간 프레임 내에 분만한 것으로 나중에 확인된, 임신 여성의 무작위로 선택된 그룹의 대표인 여성의 혈액 시료 중 발견된 특정 특성, 상세하게는 특정 마커 유전자 mRNA의 양을 의미한다. 이 선택된 그룹은 충분한 수의 여성을 포함하여 이들 개별의 혈액의 마커 mRNA의 평균 양이 건강한 임신 여성, 또는 37 임신주 이전에 빈번한 자궁 수축을 갖는, 임신의 정상 시간 프레임 내에 유아를 분만한 임신 여성의 일반적인 집단 중 마커 mRNA의 대응되는 양을 합리적인 정확함으로 반영하도록 해야 한다. 또한, 여성의 선택된 그룹은 일반적으로 조산의 위험에 대해 시험하기 위한 시료의 개체의 임신 기간과 유사한 임신 기간을 갖는다. 또한, 다른 요인, 예를 들면, 나이, 민족, 병력 또한 고려되고, 바람직하게는 시험 개체와 "평균" 값을 확립하는 개인의 선택된 그룹의 프로파일 사이에 가깝게 일치된다.

본 명세서에서 사용된 용어 "양(amount)"은 관심 폴리뉴클레오티드, 예를 들면, 시료 중 존재하는 마커 유전자 mRNA의 정량(quantity)을 의미한다. 이러한 정량은 절대적인 용어, 즉, 시료 중 폴리뉴클레오티드의 총 정량, 또는 상대적인 용어, 즉, 소위 정상화 과정에 의해 생성된, 마커 mRNA 수준과 기준 mRNA 수준 사이의 비율의 형태로 표현된 것을 포함하는, 시료 중 폴리뉴클레오티드의 농도로 표현될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "치료하다(treat)" 또는 "치료(treating)"는 관련된 상태의 증상의 징후, 또는 재발의 제거, 감소, 완화, 전환, 또는 예방, 또는 지연을 일으키는 행위를 기술한다. 즉, 상태의 "치료"는 상태에 대한 치료적, 및 예방적 개입 모두를 포함한다.

I. 배경

인간 조산, 상세하게는 37 주 전 또는 34주 전의 임신 기간의 출산은 증가된 유아 치사율 및 발달 문제를 유도한다. 현재까지 자궁경부 체액(cervicovaginal fluid) 중의 인간 피브로넥틴, 및 경질 초음파검사(transvaginal ultrasonography)을 사용한 자궁경부의 길이가 37 임신주 보다 이른 인간 출산을 예측하기 위한 임상적으로 유용한 마커이다. 예를 들면, Lockwood et al.은 자궁 수축 및 그대로의 막(intact membrane)의 증상을 갖는 117명의 여성에서 자궁 경부 또는 질 체액 중 태아 피브로넥틴의 농도를 측정하였다. 역치로서, > 50 ng/ml을 사용하여, Lockwood et al.은 81.7%의 민감도, 및 82.5%의 특이도로 37 임신주 전에 분만한 여성을 예측하였다(Lockwood et al., 1991). 최근에, 다수의 유사한 연구에 대한 체계적인 리뷰는 이 시험이 증상을 가진 여성 중 74.6%의 민감도, 및 79.5%의 특이도로 34주 전의 출산을 예측할 수 있다고 평가하였다(Honest et al. 2003).

반면에, Murakawa et al.은 37 주 전에 자궁 수축의 증상을 갖는 32명의 여성에서 경질 초음파검사를 사용하여 자궁경부 길이를 측정하였다. 역치로서, < 25 mm을 사용하여, Murakawa et al.은 63.6%의 민감도, 및 85.7%의 특이도로 37주 전에 분만한 여성을 예측하였다(Murakawa et al., 1993). 최근에, 다수의 유사한 연구에 대한 체계적인 리뷰는 이 시험이 증상을 가진 여성 중 46.2%의 민감도, 및 93.7%의 특이도로 34주 전의 출산을 예측할 수 있다고 평가하였다(Sotiriadis et al. 2010).

태아 피브로넥틴 및 자궁경부 길이 이외에, 22개의 시험을 포함하는 319개의 연구가 37주 전의 출산을 예측하기 위한 그들의 수행에 대해 체계적으로 검토하였고, 어느 것도 우수한 정확도를 갖지 못했다(Honest et al., 2012). 그러므로, 고 민감도 및 고 특이도로 37주 전의 인간 출산을 예측할 수 있는 신규한 마커가 매우 요구되고, 그러므로 예방 및 개입이 이익을 얻을 가능성이 큰 사람들에게 목표가 된다.

본 발명자들은 처음으로 임신 여성의 혈액 중 발견된 다수의 바이오마커의 mRNA가 조산의 가능성을 지시하기 위해 정확한 마커로서 작용할 수 있다는 것을 발견하였다. 이 발견은 조산의 위험을 에측하기 위해, 및 조산의 예방적 치료를 위해 중요한 수단을 제공한다. 조기 분만을 에측하기 위한 이 방법은 규칙적인 자궁 수축의 경험을 갖지는 않으나 (1) 이전의 임신 중 37주보다 이른 출산의 이전 경험; (2) 짧아진 자궁경부 길이, 자궁경부의 깔때기모양화(funneling), 또는 핏덩어리(sludge); (3) 생식기계의 감염 또는 염증의 증상; (4) 분만전 출혈; 또는 (5) 다태 임신(multiple pregnancy)을 갖는 여성을 포함하는, 조산과 관련된 것으로 알려진 증상, 예를 들면, 37 임신 주 전의 자궁 수축, 또는 막의 분만 전 단계 파열의 증상을 갖거나, 또는 갖지 않는 임신 여성에 적용될 수 있다.

II. 일반적 방법론

본 발명을 실시하는 것은 분자 생물학 분야의 통상적인 기법을 활용한다. 본 발명을 사용하기 위한 일반적인 방법을 개시하는 기본적인 교과서는 Sambrook and Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd ed. 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); 및 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994))를 포함한다.

핵산에 대해서, 크기는 킬로베이스(kb) 또는 염기쌍(bp)으로 제시된다. 이들은 아가로즈 또는 아크릴아마이드 겔 전기영동으로부터, 시퀀싱된 핵산으로부터, 또는 공개된 DNA 서열로부터 유래된 추정치이다. 단백질에 대하여 크기는 킬로달톤(kDa) 또는 아미노산 잔기 수로 제시된다. 단백질 크기는 전기영동으로부터, 시퀀싱된 단백질로부터, 아미노산 서열로부터, 또는 공개된 단백질 서열로부터 유래된 추정치이다.

상업적으로 입수 가능하지 않은 올리고뉴클레오티드는 예를 들면, Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Lett. 22:1859-1862 (1981)에 의해 처음으로 기술된 고체상 포스포아미디트 트리에스테르법(phosphoramidite triester method)에 따라, Van Devanter et. al., Nucleic Acids Res. 12:6159-6168 (1984)에 기술된 바와 같이 자동화된 합성기(synthesizer)를 사용하여, 화학적으로 합성될 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 정제는 기술분야에 인식된 전략, 예를 들면, Pearson and Reanier, J. Chrom. 255: 137-149 (1983)에 기술된 바와 같이 네이티브 아크릴아마이드 겔 전기 영동 또는 음이온-교환 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 수행될 수 있다.

본 발명에서 사용된 관심 서열, 예를 들면, 인간 B3GNT5, CLC, CD16A, 또는 CD62L 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열, 및 합성 올리고뉴클레오티드(예를 들면, 프라이머)는 예를 들면, Wallace et al., Gene 16: 21-26 (1981)의 시퀀싱 이중 가닥 주형을 위한 사슬 종결법(chain termination method)를 사용하여 검증될 수 있다.

III. 시료의 획득 및 마커 mRNA의 분석

본 발명은 이르게 유아를 분만하는 여성의 위험을 평가하기 위한 수단으로서, 임신 여성의 혈액, 특히 혈장 또는 혈청 시료 중 발견되는 마커 유전자의 적어도 하나로부터 번역된 mRNA의 양의 측정에 관한 것이다. 마커 유전자는 CD16A, 및 CD62L 뿐만 아니라, 표 2에서 확인된 것들을 포함한다. 그러므로, 본 발명의 실시의 제1 단계는 시험될 임신 여성으로부터 혈액 시료를 획득하는 것과 시료로부터 mRNA를 추출하는 것이다.

A. 혈액 시료의 획득 및 준비

혈액 시료는 본 발명의 방법을 사용하는 시험에 적합한 임신 기간의 임신 여성으로부터 수득된다. 적합한 임신 기간은 하기에서 논의된 바와 같이, 시험될 질병에 의존하여 다양할 수 있다. 여성으로부터 혈액의 수집은 병원 또는 클리닉이 일반적으로 따르는 표준 절차와 일치되게 수행된다. 말초혈의 적절한 양, 예를 들면, 전형적으로 5 내지 50 ml이 수집되고, 추가적인 준비 전에 표준 절차에 따라 저장될 수 있다.

본 발명에 따른 모계 혈액 중 발견되는 하나 이상의 마커 유전자로부터 번역된 mRNA의 분석은 예를 들면, 전혈, 또는 혈액 세포를 포함하는 전혈의 제제를 사용하여 수행될 수 있다. 혈액 세포를 포함하지 않는 혈액의 제제, 예를 들면, 혈장 또는 혈청 또한 혈장 또는 혈청 중 존재하는 핵산의 지배적인 소스인 혈액 세포로 인해 본 발명의 실시의 목적을 위해 유용하다(Liu et al., 2002). 시료로부터 혈액 세포를 준비하기 위해, 모계 혈액으로부터 무세포 부분, 예를 들면, 혈장 또는 혈청을 제거하기 위한 방법은 기술 분야의 통상의 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들면, 임신 여성의 혈액은 혈액 응고를 막기 위해 EDTA 함유 튜브, 또는 전문 상업 제품, 예를 들면, 바쿠테이너 SST(Vacutainer SST)(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)에 담겨질 수 있고, 이후에 혈장은 분리되고, 이후에 적절한 기간의 시간 동안 원심분리 또는 중력 단독에 의한 침전을 통해 전혈의 세포 분획으로부터 제거될 수 있다. 만약 원심 분리가 사용된 경우, 독점적으로는 아니고, 전형적으로 적절한 속도, 예를 들면, 1,500 내지 3,000 x g에서 수행될 수 있다. 혈액 시료로부터의 혈장/혈청의 준비를 위한 방법은 기술분야의 통상의 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들면, EDTA-함유 튜브에 수집된 혈액 시료는 혈장을 제거하기 위해 4 ℃에서 10분 동안 16,000 x g에서 원심분리되고, 잔여 혈장을 제거하기 위해 4 ℃에서 10분 동안 1,600 x g에서 재-원심분리된다. 추가적으로, 전혈, 혈액 세포, 혈장 또는 혈청이 수집되거나 준비된 후에, 첨가제가 RNA를 보존하기 위해 첨가될 수 있다. 이들 첨가제는 페놀 및 구아니디니움 이소티오시아네이트(guanidinium isothiocyanate)의 단상 용액, 또는 트리졸(Life Technologies), 트리졸 LS(Life Technologies), RNA Later(Life Technologies - Ambion), RNA Later ICE(Life Technologies - Ambion) 및 PreanAlytiX 시스템(Qiagen/Beckton Dickson)과 관련된 혈액 수집 튜브를 포함하는 상업적으로 입수 가능한 시약을 포함할 수 있다. 다르게 명시되지 않는 한, RNA를 보존하고 및/또는 추출하기 위한 이들 상업적으로 입수 가능한 시약은 제조사의 권장에 따라 수행될 수 있다.

B. RNA의 추출 및 정량

생물학적 시료로부터 mRNA를 추출하기 위한 다수의 방법이 있다. mRNA 준비의 일반적 방법(예를 들면, Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3d ed., 2001에 기술)은 다음과 같을 수 있다; 다양한 상업적으로 입수 가능한 시약 또는 키트, 예를 들면, 티리졸 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA), Oligotex Direct mRNA 키트 (Qiagen, Valencia, CA), RNeasy Mini 키트 (Qiagen, Hilden, Germany), 및 PolyATtract® Series 9600™ (Promega, Madison, WI)이 시험 개체의 생물학적 시료로부터의 mRNA를 수득하는데 사용될 수 있다. 이들 방법의 하나 이상의 조합이 또한 사용될 수 있다.

모든 오염 DNA가 RNA 제제로부터 제거되는 것이 필수적이다. 그러므로, 증폭 및 정량 단계에서의 DNase의 처리를 통한, 시료의 주의 깊은 조작, 및 적절한 음성 대조군이 사용되어야 한다.

1. mRNA 수준의 PCR 기반 정량적 결정

mRNA가 시료로부터 추출되고 나면, 표 2에서 확인된 마커 유전자의 하나 이상으로부터 번역된 mRNA의 양이 정량될 수 있다. mRNA 수준을 결정하기 위한 바람직한 방법은 증폭-기반 방법, 예를 들면, 중합효소 연쇄 반응(PCR), 특히 역전사효소-중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)이다.

증폭 단계 전에, 마커 유전자 mRNA의 DNA 카피(cDNA)가 합성되어야 한다. 이것은 RNA를 증폭하기 위한 개별적인 단계로서, 또는 균질한 역전사효소-중합효소 연쇄 반응(RT-PCR), 중합효소 연쇄 반응의 변형인, 역전사에 의해 달성될 수 있다. 리보핵산의 PCR 증폭을 위해 적합한 방법은 Romero and Rotbart in Diagnostic Molecular Biology: Principles and Applications pp.401-406; Persing et al., eds., Mayo Foundation, Rochester, MN, 1993; Egger et al., J. Clin. Microbiol. 33:1442-1447, 1995; 및 미국특허번호 제5,075,212호에 의해 기술된다.

PCR의 일반적 방법의 기술분야에 잘 알려져 있으므로, 본 명세서에서 상세하게 기술하지 않는다. PCR 방법, 프로토콜, 및 프라이머 디자인의 원칙의 검토를 위해, 예를 들면, Innis, et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. N.Y., 1990를 참조한다. PCR 시약 및 프로토콜은 또한 상업적인 판매 회사, 예를 들면, 로슈 분자 시스템(Roche molecular systems)로부터 입수 가능하다.

PCR은 열안정성 효소(thermostable enzyme)로 자동화된 과정으로 가장 일반적으로 수행된다. 이 과정에 있어서, 반응 혼합물의 온도는 변성 영역, 프라이머 어닐링 영역, 및 신장(extension) 반응 영역을 통해 자동적으로 순환된다. 이 목적을 위해 특이적으로 적용된 장치는 상업적으로 입수 가능하다.

타겟 mRNA의 PCR 증폭이 전형적으로 본 발명의 실시에 사용될지라도, 기술 분야의 통상의 당업자는 모계 혈액 시료 중 이들 mRNA 종의 증폭이 알려진 방법, 예를 들면, 충분한 증폭을 제공하는, 리가아제 연쇄 반응(LCR), 전사-매개 증폭, 및 자가-유지 서열 복제 또는 핵산 서열-기반 증폭(NASBA), 헬리카아제 의존 증폭(HDA), 롤링 서클 증폭(RCA), 및 루프-매개 이소더말 증폭(loop-mediated isothermal amplification)(LAMP)에 의해 달성될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 더 최근에 개발된 가지-DNA기법(branched-DNA techonology)이 또한 모계 혈액 중 mRNA 마커의 양을 정량적으로 결정하는데 사용될 수 있다. 임상 시료 중 핵산 서열의 직접적인 정량을 위한 가지-DNA 신호 증폭의 검토를 위해 Nolte, Adv. Clin. Chem. 33:201-235, 1998를 참조한다.

2. 다른 정량적 방법

마커 유전자 mRNA는 기술 분야의 통상의 당업자에게 잘 알려진 다른 표준 기법을 사용하여 검출될 수 있다. 검출 단계는 전형적으로 증폭 단계 이후에 진행되나, 증폭 단계는 본 발명의 방법에서 요구되지 않는다. 예를 들면, mRNA는 증폭 단계가 선행하던지 않던지, 크기 분획법(size fractionation)(예를 들면, 겔 전기영동)에 의해 확인될 수 있다. 잘 알려진 기법(예를 들면, Sambrook and Russell, supra)에 따라 아가로즈 또는 폴리아크릴아마이드 겔 중, 및 브롬 에티디움(ethidium bromide)으로 라벨링된 시료를 작동시킨 후에, 표준 비교로서 동일한 시료 크기의 밴드의 존재는 타겟 mRNA의 존재의 지시가 되고, 이것의 양은 이후에 밴드의 강도에 기반하여 대조군과 비교된다. 대안적으로, 마커 유전자 mRNA에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프로브는 이러한 mRNA 종의 존재를 검출하고, 프로브에 의해 주어진 신호의 강도에 기반하여, 표준 대조군 대비 mRNA의 양을 지시하는데 사용될 수 있다.

서열-특이적인 프로브 혼성화는 핵산의 다른 종을 포함하는 특정 핵산의 검출의 잘 알려진 방법이다. 충분하게 엄격한 혼성화 조건 하에서, 프로브는 실질적으로 상보적인 서열과만 특이적으로 혼성화한다. 혼성화 조건의 엄격성은 서열 미스매치의 다양한 양을 용인하기 위해 완화될 수 있다.

용액상, 고체상, 또는 혼합상 혼성화 어세이를 포함하나 그에 한정되지 않는 다수의 혼성화 방식이 기술 분야에 잘 알려졌다. 다음의 문헌은 다양한 혼성화 어세이 방식의 개괄을 제공한다; Singer et al., Biotechniques 4:230, 1986; Haase et al., Methods in Virology, pp. 189-226, 1984; Wilkinson, In situ Hybridization, Wilkinson ed., IRL Press, Oxford University Press, Oxford; 및 Hames and Higgins eds., Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, IRL Press, 1987.

혼성화 복합체는 잘 알려진 기법에 따라 검출된다. 타겟 핵산, 즉, mRNA 또는 증폭된 mRNA에 특이적으로 혼성화할 수 있는 핵산 프로브는 혼성화된 핵산의 존재를 검출하는데 전형적으로 사용되는 다수의 방법 중 어느 하나에 의해 표지될 수 있다. 검출의 하나의 통상적인 방법은 ³H, ¹²⁵I, ³⁵S, ¹⁴C, 또는 ³²P 등으로 표지된 프로브를 사용하는 자동방사선(autoradiography)의 사용이다. 방사성 동위원소의 선택은 선택된 동위원소의 합성의 용이성, 안정성, 및 반감기에 의한 연구 선호도에 의존한다. 다른 표지는 형광단(fluorophore), 화학 발광제, 및 효소로 표지된 항리간드 또는 항체에 결합하는 화합물(예를 들면, 비오틴 및 디곡시제닌(digoxigenin))을 포함한다. 대안적으로, 프로브는 표지, 예를 들면, 형광단, 화학 발광제, 또는 효소와 직접적으로 컨쥬게이트할 수 있다. 표지의 선택은 요구된는 민감성, 프로브와의 컨쥬게이션의 용이성, 요구되는 안정성, 및 사용 가능한 장치에 의존한다.

본 발명을 실시하기 위해 필요한 프로브 및 프라이머는 잘 알려진 기법을 사용하여 합성되고 표지될 수 있다. 프로브 및 프라이머로서 사용되는 올리고뉴클레오티드는 Needham-VanDevanter et al., Nucleic Acids Res. 12:6159-6168, 1984에 기술된 바와 같은 자동화된 합성기를 사용하여, Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Letts., 22:1859-1862, 1981에 의해 처음 기술된 고체상 포스포아미디트 트리에스테르법에 따라 화학적으로 합성될 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 정제는 Pearson and Regnier, J. Chrom., 255:137-149, 1983에 기술된 바와 같이, 네이티브 아크릴아마이드 겔 전기영동 또는 음이온-교환 HPLC에 의한 것이다.

IV. 표준 대조군의 확립

본 발명의 방법을 실시하기 위한 표준 대조군을 확립하기 위해서, "건강한" 임신 여성, 또는 37 임신주 이전에 빈번한 자궁 수축을 갖는, 통상적인 방법에 의해 임신의 정상 시간 프레임 내에 분만한 것으로 나중에 확인된, 임신 여성의 그룹이 처음에 선택된다. 이들 개체는 적절한 파라미터, 예를 들면, 특정 임신 기간 및 상대적인 건강한 상태 내에 있다. 선택적으로 개체는 유사한 나이 또는 유사한 인종 배경에 기반하여 더 그룹화된다.

선택된 개체의 정상 분만 시간은 나중에 확인될 것이고, 정상 분만 시간 프레임 보다 이르게 또는 나중에 출산을 한 것으로 판명된 선택된 개체는 "표준 대조군"으로서 데이터를 제공하기 위한 그룹으로부터 제거될 것이다.

또한, 개체의 선택된 그룹은 합리적인 크기를 가져, 그룹으로부터 수득된 혈액 시료 중 마커 mRNA의 평균 양/농도가 건강한 임신 여성, 또는 37 임신주 이전에 빈번한 자궁 수축을 갖는, 정상 시간 프레임 내에 출산할 예정인, 임신 여성의 일반적인 집단 중 정상 또는 평균 수준의 대표로서 합리적으로 간주될 수 있다. 바람직하게는, 선택된 그룹은 적어도 10명의 인간 개체를 포함한다.

대조군 값의 확립의 기본적인 과학적 원칙과 일치되게, 대조군의 mRNA 수준은 시험 개체 중 mRNA 수준을 결정하는데 사용되는 동일한 방법에 의해 결정된다. 예를 들면, 만약 마커 유전자의 mRNA 수준이 시험될 여성으로부터 수득된 시료의 특정 종류(예를 들면, 혈장)에서 결정된다면, 대조군 또한 시료의 동일한 종류로부터 수득되어야 한다. 만약 마커 유전자의 mRNA의 수준이 기준 유전자의 mRNA 수준에 대하여 정상화된 후에 결정된다면(예를 들면, 기준 유전자 mRNA에 대한 마커 유전자 mRNA의 비율로서 표시), 이후에 표준 대조군 또한 동일한 기준 유전자 mRNA 수준에 대하여 정상화된 값의 형태로 표시되어야 한다.

어느 하나의 주어진 마커 mRNA에 대한 평균 값이 선택된 대조군의 각 개체 중 발견된 개별적인 값에 기반하여 확립되고 나면, 이 평균 또는 중간 값은 표준 대조군으로 고려된다. 표준 편차 또한 동일한 과정 동안 결정된다. 동일한 경우에 있어서, 개별적인 표준 대조군은 구별된 특징, 예를 들면, 나이, 성, 또는 인종 배경을 갖는 개별적으로 정의된 그룹에 대하여 확립될 수 있다.

V. 조산을 예방하기 위한 치료 방법

표 2에서 확인된 마커 유전자의 mRNA 수준과 조산의 위험 사이에의 상관 관계를 설명함으로써, 본 발명은 치료받지 않으면 조산을 경험할 가능성이 있고, 전체 기간에 도달하기 전에 그들의 유아를 잘 분만하는 임신 여성을 예방적으로 치료하는 방법을 제공한다: 증가된 또는 감소된 마커 mRNA 수준이 검출되고, 조산의 증가된 위험이 결정되면, 담당 의사는 예방적으로 여성을, 예를 들면, 호흡 장애, 심신내 출혈(intraventricular hemorrhage), 괴사성 장염(necrotizing enterocolitis), 및 동맥관개존증(patent ductus arteriosus)으로부터의 신생아 질병률(morbidity) 및 사망률(mortality)을 낮추는 것으로 알려진 출산 전 코르티코스테로이드(antenatal corticosteroid)로 치료하는 선택을 갖는다(Roberts and Dalziel, 2006, Cochrane Database Syst Rev(3): CD004454; Wapner et al. 2006, Am J Obstet Gynecol 195(3): 633-42). 또한, 자궁수축억제제(tocolytid drug)가 너무 이른 출산의 고위험의 여성 중 임신 기간을 연장하는데 사용될 수 있다. 이들 약물의 사용은 신생아 질병율 및 사망률을 낮추기 위해 전문의 집단으로의 이송 및 코르티코스테로이드의 투여를 가능하게 하는, 48-시간 지연된 분만을 제공한다(Iams et al., 2008 Lancet 371(9607): 164-75). 또한, 경피 글리세릴 트리니트레이트(transdermal glyceryl trinitrate)로의 처치는 효과적으로 신생아 사망률을 낮추는 것으로 보고되었다(Smith et al. 2007, Am J Obstet Gynecol 196(1): 37 e1-8), 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 조산의 치료는 37주의 임신 기간 전에, 예를 들면, 34주의 임신 기간 전의 어느 시점에 출산하는 임신 여성의 가능성을 감소하거나 제거하는 것을 포함한다.

조산을 치료하기 위한 또 다른 가능성은 표준 대조군 값으로부터 벗어난 것으로 밝혀진 마커 유전자의 mRNA의 수준을 직접적으로 조절함에 의한다. 예를 들면, 마커 유전자가 표준 대조군값으로부터 증가된 것으로 밝혀진 경우, 조치는 이 유전자의 mRNA의 수준을 특이적으로 감소시키기 위해 이루어질 수 있다. 안티센스 폴리뉴클레오티드 서열 및 siRNA가 이 목적을 위해 임신 여성에 투여될 수 있다. 반면에, 마커 유전자가 표준 대조군 값으로부터 감소된 것으로 밝혀진 경우, 조치는 이 유전자의 mRNA의 수준을 특이적으로 증가시키기 위해 이루어질 수 있다. 마커 유전자의 코딩 서열을 포함하고, 및 서열의 전사를 제어하는, 단리된 핵산, 예를 들면, 발현 카세트가 이 목적을 위해 임신 여성에 투여될 수 있다.

VI. 키트 및 장치

본 발명은 임신 여성 중 이른 분만의 위험을 결정하기 위한 어느 하나의 마커 유전자(예를 들면, CD16A 및 CD62L 뿐만 아니라 표 2에 열거된 것)의 mRNA 수준을 평가하기 위해 본 명세서에서 기술된 방법을 실시하기 위한 조성물 및 키트를 제공한다.

마커 유전자 mRNA 수준을 결정하기 위한 어세이를 수행하기 위한 키트는 전형적으로 서열 또는 그의 상보 서열을 코딩하는 마커 유전자의 하나 이상의 세그먼트와 특이적 혼성화에 유용한 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함한다. 선택적으로, 이 올리고뉴클레오티드 프로브는 검출 가능한 모이어티로 표지된다. 일부 경우에 있어서, 키트는 PCR, 특히 RT-PCR에 의한 마커 유전자 DNA 또는 mRNA의 하나 이상의 세그먼트의 증폭에 사용될 수 있는 두 개 이상의 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함할 수 있다. 일부 경우에 있어서, 키트는 상기 기술된 프로브 및/또는 프라이머의 복수의 세트를 포함하여, 하나 이상의 마커 유전자 mRNA가 시험되고 정량화될 수 있다. 일부 경우에 있어서, 키트는 기준 유전자의 mRNA 수준을 결정하기 위해 사용될 수 있는 상기 기술된 프로브 및/또는 프라이머를 더 포함할 수 있다.

종종, 키트는 또한 적절한 표준 대조군을 포함한다. 표준 대조군은 혈액 시료의 특정 종류 중 하나 이상의 마커 유전자 mRNA의 평균 값을 지시한다. 일부 경우에 있어서, 이러한 표준 대조군은 세트 값의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 사용자가 시험 개체 중 시험 시료를 분석하고, 조산의 위험을 평가하는 것을 안내하기 위한 지시 매뉴얼을 제공할 수 있다.

추가적인 측면에 있어서, 본 발명은 또한, 본 명세서에서 기술된 방법 단계의 전부 또는 일부를 수행할 수 있는 하나 이상의 장치를 포함하는 장치 또는 시스템 중 내장될 수 있다. 예를 들면, 일부 경우에 있어서, 장치 또는 시스템은 혈액 시료, 예를 들면, 조산의 위험에 대한 시험될, 조산의 위험이 평가될 임신 여성으로부터 수득된 혈장 시료를 받자마자 다음의 단계를 수행한다: (a) 시료 중, 선택적으로 기준 유전자의 mRNA 수준에 대하여 정상화될 수 있는, 마커 유전자 mRNA의 양 또는 농도를 결정하는 단계; (b) 상기 양 또는 농도를 표준 대조군 값과 비교하는 단계; 및 (c) 조산의 증가된 위험이 존재하는지 여부를 나타내는 결과를 제공하는 단계. 다른 경우에 있어서, 본 발명의 장치 또는 시스템은 단계 (a)가 수행되고 (a)로부터의 상기 양 또는 농도가 상기 장치에 들어간 후에, 단계 (b) 및 (c)의 태스크를 수행한다. 바람직하게는 상기 장치 또는 시스템은 부분적으로 또는 완전히 자동화된 것이다.

도 1: 임신 34주보다 이른 출산의 결과의 증상을 보이는 여성(시험군), 및 37주 또는 그 이후의 출산의 결과의 증상을 보이는 여성(기준군)의 혈액 중 B3GNT5 mRNA의 농도의 박스 플롯(box plot). 박스는 최소 25 퍼센트 및 최대 75 퍼센트로 작성되었다. 박스 내의 선은 중앙값으로 작성된다. 위스커(whisker)는 최소 10 퍼센트 및 최대 90 퍼센트로 작성된다. 위스커 아래 및 위의 포인트는 개별적인 점으로 작성된다.
도 2: 증상을 보이는 여성 중 임신 34주보다 이른 출산을 예측하기 위한 B3GNT5 mRNA의 수신자 조작 특성 곡선(Receiver-operating characteristics curve).
도 3: 임신 34주보다 이른 출산의 결과의 증상을 보이는 여성(시험군), 및 37주 또는 그 이후의 출산의 결과의 증상을 보이는 여성(기준군)의 혈액 중 CLC mRNA의 농도의 박스 플롯. 박스는 최소 25 퍼센트 및 최대 75 퍼센트로 작성되었다. 박스 내의 선은 중앙값으로 작성된다. 위스커는 최소 10 퍼센트 및 최대 90 퍼센트로 작성된다. 위스커 아래 및 위의 포인트는 개별적인 점으로 작성된다.
도 4: 증상을 보이는 여성 중 임신 34주보다 이른 출산을 예측하기 위한 CLC mRNA의 수신자 조작 특성 곡선.
도 5: 임신 34주보다 이른 출산의 결과의 증상을 보이는 여성(시험군), 및 37주 또는 그 이후의 출산의 결과의 증상을 보이는 여성(기준군)의 혈액 중 GBP3 mRNA의 농도의 박스 플롯. 박스는 최소 25 퍼센트 및 최대 75 퍼센트로 작성되었다. 박스 내의 선은 중앙값으로 작성된다. 위스커는 최소 10 퍼센트 및 최대 90 퍼센트로 작성된다. 위스커 아래 및 위의 포인트는 개별적인 점으로 작성된다.
도 6: 증상을 보이는 여성 중 임신 34주보다 이른 출산을 예측하기 위한 GBP3 mRNA의 수신자 조작 특성 곡선.
도 7: 임신 34주보다 이른 출산의 결과의 증상을 보이는 여성(시험군), 및 37주 또는 그 이후의 출산의 결과의 증상을 보이는 여성(기준군)의 혈액 중 CD16A mRNA의 농도의 박스 플롯. 박스는 최소 25 퍼센트 및 최대 75 퍼센트로 작성되었다. 박스 내의 선은 중앙값으로 작성된다. 위스커는 최소 10 퍼센트 및 최대 90 퍼센트로 작성된다. 위스커 아래 및 위의 포인트는 개별적인 점으로 작성된다.
도 8: 증상을 보이는 여성 중 임신 34주보다 이른 출산을 예측하기 위한 CD16A mRNA의 수신자 조작 특성 곡선.
도 9: 임신 34주보다 이른 출산의 결과의 증상을 보이는 여성(시험군), 및 37주 또는 그 이후의 출산의 결과의 증상을 보이는 여성(기준군)의 혈액 중 CD62L mRNA의 농도의 박스 플롯. 박스는 최소 25 퍼센트 및 최대 75 퍼센트로 작성되었다. 박스 내의 선은 중앙값으로 작성된다. 위스커는 최소 10 퍼센트 및 최대 90 퍼센트로 작성된다. 위스커 아래 및 위의 포인트는 개별적인 점으로 작성된다.
도 10: 증상을 보이는 여성 중 임신 34주보다 이른 출산을 예측하기 위한 CD62L mRNA의 수신자 조작 특성 곡선.

다음의 실시예는 설명의 형태로 제공되는 것이고, 제한의 형태로 제공되는 것이 아니다. 기술 분야의 통상의 당업자는 기본적으로 동일한 또는 유사한 결과를 산출하기 위해 변화되거나 변형될 수 있는 비-결정적인 파라미터를 용이하게 인식할 것이다.

서론

최근에, 자궁경부 체액(cervicovaginal fluid) 중의 인간 피브로넥틴, 및 경질 초음파검사(transvaginal ultrasonography)을 사용한 자궁경부의 길이는 37 임신주 전의 인간 출산을 예측하기 위한 가장 유용한 마커이다. 이들 방법이 그들의 고 특이도에 대해 사용되는 반면, 그들의 민감도는 겨우 중간이다.

본 발명은 모계 말초 혈장 중 순환하는 임신-관련된 RNA, 마이크로 RNA(Tsui et al. 2004; Chim et al. 2008) 및 DNA 메틸화 마커(Chim et al. 2005; Chim et al. 2008; Tsui et al. 2010)의 전신적 발견의 오래된 관심을 갖는다. 임상적 관심 중, 본 발명자들은 특정 순환 RNA 전사체가 자궁 수축이 존재하고 및 34 임신주 보다 이른 출산이 야기된 여성에서 더욱 빈번하게 검출되나, 임신 기간-일치된 여성에서는 아닌 것을 발견하였다(Chim et al. 2012). 무세포 모계 혈장 중 유망한 데이터는 본 발명자가 혈액 세포를 포함하는 다른 혈액 구획이 34주보다 이른 출산을 예측할수 있는 RNA 전사체를 포함하는지 여부를 체계적으로 조사하게 하였다.

전신적 및 전체-유전체 접근법 중 이러한 마커를 확인하기 위해, 본 발명자들은 엑손 어레이 기법(exon array techonology)을 사용하여 거의 전부의 30,000 인간 유전자 및 그들의 변이체의 RNA 수준을 프로파일링 하였다. 이 기법은 본 발명자가 유전자 수준보다 더욱 상세한, 엑손 수준에서 고 해상(resolution)에서 혈액의 글로벌 유전자 발현(RNA) 프로파일, 또는 전사체(transcriptome)를 생성하게 하였다. 본 발명자들은 34 주 이전의 규칙적인 자궁 수축의 존재 중 여성으로부터 수득된 모게 혈액의 전사체를 체계적으로 프로파일링하였다. 이들 중, 32 유전자로부터의 RNA 전사체의 패널이, 37주 또는 그 이후에 출산이 나타난 여성과 비교하여, 34주보다 이른 출산이 나타난 여성의 혈액 중 용이하게 측정가능하고, 구별되어 발현된다는 것이 확인되었다.

34 임신주 보다 이른 인간의 출산은 신생아 질병률 및 사망률에 더욱 취약하기 때문에, 34 주 보다 이른 출산은 이 연구의 대부분의 부분에서 결과 측정으로서 사용된다. 그러나, 이러한 실험적 디자인 및 결과 측정은 37주보다 이른 출산, 또는 자궁 수준의 존재의 2 내지 7일 이내에 예측하기 위한 마커의 발견을 불가능하게 하지 않는다.

정량적 역-전사효소 중합 효소 연쇄 반응(qRT-PCR)을 사용하여, 본 발명자들은 확인된 혈액 마커가 단독으로 사용될 때, 고 민감도 및 고 특이성으로 34주보다 이른 출산을 예측하는데 이미 사용될 수 있다는 것을 증명하였다.

방법 및 결과

참가자의 모집. 34 임신 주 이전에 규칙적이고 빈번한 자궁 수축을 갖는 임신 여성(10분마다 >1)을 주지된 동의와 함께 본 연구에서 참가자로 요청되었다. 말초혈액은 출산 전 자궁 수준 동안 각 참가자로부터 수득되었다. 분만 결과는 추적 검사되었다. 34 주보다 이른 출산을 나타낸 것으로 나중에 확인된 여성은 시험군으로 분류하였고, 37 주 또는 그 이후에 출산을 나타낸 것으로 나중에 확인된 여성은 기준군으로 분류하였다. 지시된 조산, 전자간증(preeclampsia), 다태임신, 태아가사(fetal distress), 발육 부전(growth restriction), 염색체 또는 구조적 이상은 제외하였다.

혈액 처리. 말초혈의 12 mL를 출산 전 자궁 수준의 존재 동안 임신 여성으로부터 EDTA-함유 튜브(Beckton Dickson)에 수집하고, 6 시간 이내에 처리하였다. 요약하여, 혈액을 1,600 x g로 원심분리하였다. 혈장을 제거하였다. 혈액 시료를 혈장의 추가적인 제거를 위해 다시 5,000 x g에서 원심분리하였다. 수집된 혈액 세포의 0.3 mL를 0. mL 트리졸 LS(Invitrogen, Life Technologies)와 혼합하고, -80 섭씹도에서 RNA 추출까지 보관하였다.

엑손 에러이에 기반한 혈액 전사체의 프로파일링. 각 혈액 시료에 대하여, RNA를 트리졸 LS-혈액 세포로부터 추출하고, 유전체 DNA 오염을 제거하기 위해 DNase I(Invitrogen, Life Techonologies)로 처리하였다. 태반 조직으로부터의 RNA 제제의 양 및 질은 분광광도계(spectrophotometer) 및 바이오분석기 (Bioanalyzer)(Agilent)로 평가하였다. 6 개의 혈액 RNA 시료(시험군으로부터 3, 및 기준군으로부터 또 다른 3개, 표 1)는 Exon 1.0ST gene expression assay(Affymetrix)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 분석하였다.

엑손 어레이 데이타의 전처리. 이후에 프로브 신호 데이터를 Patek Genomics Suite(version 6.5, Partek Inc.)를 사용하여 분석하였다. 상이한 혈액 시료로부터의 프로브 신호를 정상화하기 위해, Robust Multi Array(RMA) 정상화(Irizarry et al., 2003)를 수행하였다. 각 어레이는 필수적으로 전부인 >30,000 인간 유전자 및 전사 변이체의 RNA 발현 수준을 조사하는 1,400,000 이상의 세트의 프로브를 포함한다. 프로브 신호의 대부분이 마이크로어레이 데이타 중 변화되지 않는다 하더라도, 그들의 완전한 수는 다중가설 시험을 포함하는 통계적 분석을 방해할 것이므로, 제거되어야 한다. 이를 위하여, 본 발명자들은 모든 프로브에 대한 T-테스트를 처음에 수행하였고(다중 시험 비교(multiple testing comparison)에 대한 조절 없이), 9,264개의 프로브만이 시험군과 기준군 사이에 변화하였다는 것을 확인하였다.

데이터 마이닝(data mining) 및 마커의 체계적(systematic) 확인. 혈액 수집물에서 임신 기간 중의 차이를 설명하기 위해, 시험군 각 시료를 매칭된 임신 기간의 기준군의 또 다른 시료와 쌍을 이루었다(1주 이내). 두 군 사이의 변화된 프로브를 확인하기 위해, 쌍 T-테스트를 9,264개의 프로브에 대하여 수행하였다. 이들 중, 3,778 프로브는 두 군 사이에서 변화하였다(p-값, 범위 5.0 x 10^-6 내지 0.049). 다중가설 시험을 위한 조절을 만들기 위해, q-값은 거짓 발견 비율법(False Discovery Rate method)(Storey 2002)으로 계산하였고, 3500개의 프로브를 선택하였다(q-값 < 0.007639). 이들 중, 153개 프로브의 중간 신호가 두 군 사이에 > 2.6 배 변화하였다(기준군 대비, 시험군에서 72개의 프로브 및 81개의 프로브가 각각 상향-조절되고, 하향-조절되었다).

두 군을 잠재적으로 구별할 수 있는 상향-조절된 프로브를 더 분리하기 위해, 본 발명자들은 기준군의 신호의 삼사분위수(third quartile)보다 >2-배 더 높은 시험군의 신호의 제일사분위수(first quartile)의 신호를 조사하였고, 이 조건을 충족하는 52개의 프로브를 선택하였다. 유사하게, 두 군을 잠재적으로 구별할 수 있는 하향-조절된 프로브를 더 분리하기 위해, 본 발명자들은 기준군의 신호의 삼사분위수보다 >2-배 더 높은 시험군의 신호의 제일사분위수의 신호를 조사하였고, 이 조건을 충족하는 72개의 프로브를 선택하였다. 그러므로, 124개의 프로브(= 52+72)가 두 군을 구별하는 가능성을 갖는 것으로 확인되었다.

혈액 시료중 용이하게 검출가능한 RNA 전사체를 더 정제하기 위해, 본 발명자들은 하나 이상의 군 중 중간값 발현 신호 > 169 유닛(= 2 ^ 7.4 유닛)을 갖는 >1 프로브로 표시되는 RNA 전사체에 대해서만 선택하였고, 48개의 프로브(14개의 상향-조절된 프로브 및 34개의 하향-조절된 프로브)를 확인하였다. 이들 프로브 신호는 32개의 유전자(13개의 상향 조절된 유전자 및 19개의 하향-조절된 유전자)로부터의 RNA 전사체로부터 유래된 것이다. 이것으로 32개의 RNA 전사체의 이 패널은 혈액 중 용이하게 검출가능하고, 34주보다 이른 출산을 나타내는 여성을 예측하는데 사용될 수 있다는 것을 알 수 있다(표 2).

확인된 신규 마커의 qRT-PCR 분석. 엑손 어레이 기법을 사용하여 확인된 마커 및 상기 데이터 마이닝 전략(표 2)이 유용하다는 것을 증명하기 위해, 본 발명자들은 유전자 발현 프로파일 중 골드-스탠다드인 qRT-PCR을 수행하였다. 여성으로부터 수집된 20개의 혈액 RNA 시료(시험군으로부터 10개, 기준군으로부터 또 다른 10개, 표 3)를 분석하였다.

표 2에서 확인된 3개의 마커 RNA 전사체의 농도를 qRT-PCR에 의해 결정하였다. 즉, UDP-GlcNAc:betaGal beta-1,3-N-acetylglucosaminyltransferase 5 (B3GTN5), Charcot-Leyden crystal galectin (CLC), 및 guanylate binding protein 3 (GBP3)를 코딩하는 이들 mRNA의 농도를 측정하였다. 전자의 마커 RNA 전사체는 37주 또는 그 이후의 출산을 나타내는 여성 대비, 34주 보다 이른 출산을 나타내는 여성의 혈액 중 상향-조절되는 것으로 나타난 반면, 후자의 두 개의 마커는 하향-조절되는 것으로 나타났다. 각 qRT-PCR로의 RNA 투입의 변이를 제저하기 위해, 마커 RNA 농도를 기준 RNA, glyceraldehyde-3-phosphate dehyrdogenase (GAPDH) mRNA에 대하여 정상화하였다.

B3GNT5 qRT-PCR 어세이를 위해, 정방향 프라이머는 5'-TTG GGC TTG CTT TGT TTC CT-3'이었고, 역방향 프라이머는 5'-GCC TGC CGA TCT GGT AGA AG -3'이었고, 및 가수분해 프로브는 5'(6FAM)-AGG CCC AGC ATT T-3'(MGB)이었고, 여기서 6FAM은 6-카르복시플루오레세인 리포터 염료(6-carboxyfluorescein reporter dye)이고, MGB는 마이너 그루브-결합 비형광 퀸처(minor groove-binding nonfluorescent quencher)이다. CLC qRT-PCR 어세이를 위해, 정방향 프라이머는 5'-GCT GCC TCT TTG TCT ACT GGT TCT A -3'이었고, 역방향 프라이머는 5'-GCA GAT ATG GTT CAT TCA AGA AAC A-3'이었고, 및 가수분해 프로브는 5'(6FAM)-AAT CAA AGG GCG ACC ACT-3'(MGB)이었다. GBP3 qRT-PCR 어세이를 위해, 정방향 프라이머는 5'-GGC CTC GTC TAG AGA GCC TAG TG-3'이었고, 역방향 프라이머는 5'- TGC GTT CTC CAT GCA GGG-3'이었고, 및 가수분해 프로브는 5'(6FAM)-TGA CCT ATA TCA ATG CTA TCA G-3'(MGB)이었다. GAPDH qRT-PCR 어세이를 위한, 프리어머 및 프로브에 대한 서열은 기존에 공개되었다(Chim et al. 2012).

RNA 제제 중 오염 유전체 DNA의 효과를 최소화하기 위해, B3GNT5 mRNA를 제외한, 모든 mRNA 타겟에 대한 qRT-PCR 어세이는 인트론-스패닝(intron-spanning)으로 디자인하였다. 그러나, mRNA 서열의 특정 제약에 의해, B3GNT5 mRNA에 대한 qRT-PCR 어세이는 인트론을 가로지르지 않았다.

모든 qRT-PCR 어세이에 대해, B3GNT5 어세이를 제외하고, 각 qRT-PCR은 EZ rTth RNA PCR 시약 세트 (Life Technologies) 중 공급된 성분을 사용하여 25 μL의 반응 부피로 세팅하였다. 각 반응은 5μL의 5 x EZ 버퍼, 및 3mM Mn(OAc)₂, 300 μM의 dATP, dCTP, dGTP, 600 μM dUTP, 2.5 U의 rTth 중합효소, 0.25 U의 우라실 N-글리코실라아제(UNG) 및 5 μL의 혈액 시료로부터 추출된 RNA의 최종 농도를 포함하였다. 본 연구에서 B3GNT5 어세이를 위해, 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 가수분해 프라이머의 최종 농도는 각각 300 nM, 300 nM, 및 200 nM 이었다. 열 사이클 조건은 2분 동안 50 ℃, 30분 동안 60 ℃, 5분 동안 95 ℃, 뒤이어 (20초 동안 94 ℃, 및 1분 동안 60 ℃) 45 사이클이었다.

mRNA 타겟의 증폭은 ABI 프리즘 7900 서열 검출 시스템(Life Technologies), 및서열 검출 소프트웨어 버전 2.1(Life Techonologies)로 검사하고 분석하였다. 각 어세이에 대해서, 칼리브레이션(calibration)은 알려진 농도에서 타겟팅된 앰플리콘(amplicon)을 표시하는 HPLC-정제된 합성 DNA 올리고뉴클레오티드(Sigam-Proligo)의 연속적 희석을 증폭함으로써 준비하였다. mRNA 타겟의 절대적 농도는 혈액 세포 중 총 RNA의 ng 당 카피의 수로 계산하였다. 각 혈액 RNA 시료에 대하여, 정상화된 마커 RNA 농도는 마커 RNA(즉, B3GNT5 mRNA, CLC mRNA, 및 GBP3 mRNA)의 절대적 농도를 기준 RNA(즉, GAPDH mRNA)의 절대적 농도로 나눔으로써 계산하였다. 이 정상화된 마커 농도에 대한 단위는 없었다.

표 2에 열거되지 않은 RNA 전사체의 qRT-PCR 분석. 본 연구에서 확인된 마커 RNA 전사체의 예측적 능력을 비교하고 대조하기 위해(표 2), 표 2에 열거되지 않은 두 개의 RNA 전사체, 즉 Fc fragment of IgG, low affinity IIIa, receptor (FCGR3A, 동의어: CD16A) 및 selectin L (SELL, 동의어: CD62L)를 코딩하는 것을 유사하게 분석하였다. 이들 두 개의 RNA 전사체는 혈액 세포에서 고 발현되고, 다른 인간 세포에서 저 발현된다(Su et al. 2004). 임신 여성으로부터 수집된 20개의 혈액 RNA 시료(시험군으로부터 10개, 기준군으로부터 또 다른 10개, 표 3)를 분석하였다.

CD16A qRT-PCR 어세이를 위해, 정방향 프라이머는 5'-ACC CGG TGC AGC TAG AAG TC-3'이었고, 역방향 프라이머는 5'-GAA TAG GGT CTT CCT CCT TGA ACA-3'이었고, 및 가수분해 프로브는 5'(6FAM)-TTG CTC CAG GCC CCT-3'(MGB)이었다. CD62L qRT-PCR 어세이를 위해, 정방향 프라이머는 5'-TTC AGC CTC CCC ACC TTC T-3'이었고, 역방향 프라이머는 5'-GGT GTG GAA GTC AGC CAA CTG-3'이었고, 및 가수분해 프로브는 5'(6FAM)-CAG CCA CCT CTC TT-3'(MGB)이었다. 반응 조건 및 열 프로파일은 상기 언급된 다른 qRT-PCR 어세이와 동일하였다. 각 혈액 RNA 시료에 대하여, CD16A mRNA, 및 CD62L mRNA의 정상화된 농도는 상기한 바와 같이 계산하였다.

본 연구에 의해 최종 후보로 선발된 B3GNT5 mRNA를 타겟팅하는 qRT-PCR 어세이로부터 얻어진 데이터(표 2). 혈액 시료를 규칙적이고 빈번한 자궁 수축의 존재 동안 20명의 여성으로부터 수집하였다. 이들 중, 10명의 여성은 34주보다 이른 출산을 나타냈고(시험군), 나머지 10명은 37주 또는 그 이후의 출산을 나타냈다(기준군). GAPDH-정상화된 혈액 B3GNT5 mRNA 농도의 중간값(제일사분위수-삼사분위수)은 시험군 및 기준군에서 각각 1.06(0.644-1.44) 및 0.362(0.211-0.391)이었다(도 1). 시험군 중 이 중간값 정상화된 B3GNT5 mRNA 농도는 기준군보다 2.99-배 높았다(p=0.002, 만-휘트니 순위합 검정(Mann-Whitney rank sum test)).

34주보다 이른 출산을 식별하기 위한 이 마커의 최적 역치 농도를 결정하기 위해, 본 발명자들은 수신자-조작 특성(ROC) 곡선을 계획하였다(도 2, 곡선하 면적 = 0.915, 95% 신뢰 구간(CI) = 0.788-1.04, p= 0.00172). 이 어세이에 대해 양성으로 여성을 정의하기 위한 역치로서 GAPDH-정상화된 혈액 B3GNT5 mRNA 농도 > 0.495를 사용하여, 본 발명자들은 90.0% 민감도 및 90.0% 특이도로 34주보다 이른 출산을 나타내는 여성을 식별할 수 있었다. B3GNT5 mRNA에 대한 양성 예측도(positive predictive value) 및 음성 예측도(negative predictive value)는 각각 90.0% 및 90.0%이다.

본 연구에 의해 최종 후보로 선발된 CLC mRNA를 타겟팅하는 qRT-PCR 어세이로부터 얻어진 데이터(표 2). GAPDH-정상화된 혈액 CLC mRNA 농도의 중간값(제일사분위수-삼사분위수)은 시험군 및 기준군에서 각각 2.40(1.68-4.03) 및 6.05(4.43-15.6)이었다(도 3). 시험군 중 이 중간값 정상화된 CLC mRNA 농도는 기준군보다 2.52-배 낮았다(p=0.011, 만-휘트니 순위합 검정).

수신자-조작 특성(ROC) 곡선을 계획하였다(도 4, 곡선하 면적 = 0.840, 95% CI = 0.637-1.04, p= 0.0102). 이 어세이에 대해 양성으로 여성을 정의하기 위한 역치로서 GAPDH-정상화된 혈액 CLC mRNA 농도 < 4.150를 사용하여, 본 발명자들은 80% 민감도 및 90% 특이도로 34주보다 이른 출산을 나타내는 여성을 식별할 수 있었다. CLC mRNA에 대한 양성 예측도 및 음성 예측도는 각각 88.9% 및 81.8%이다.

본 연구에 의해 최종 후보로 선발된 GBP3 mRNA를 타겟팅하는 qRT-PCR 어세이로부터 얻어진 데이터(표 2). GAPDH-정상화된 혈액 GBP3 mRNA 농도의 중간값(제일사분위수-삼사분위수)은 시험군 및 기준군에서 각각 0.0587 (0.0134-0.131) 및 0.465 (0.107-0.867)이었다(도 5). 시험군 중 이 중간값 정상화된 GBP3 mRNA 농도는 기준군보다 7.92-배 낮았다(p=0.0173, 만-휘트니 순위합 검정).

수신자-조작 특성(ROC) 곡선을 계획하였다(도 6, 곡선하 면적 = 0.820, 95% 신뢰구간 = 0.624-1.02, p= 0.0156). 양성으로 여성을 정의하기 위한 역치로서 GAPDH-정상화된 혈액 GBP3 mRNA 농도 < 0.0914를 사용하여, 본 발명자들은 60% 민감도 및 90% 특이도로 34주보다 이른 출산을 나타내는 여성을 식별할 수 있었다. GBP3 mRNA에 대한 양성 예측도 및 음성 예측도는 각각 85.7% 및 69.2%이다.

표 2에 열거되지 않은 CD16A mRNA를 타겟팅하는 qRT-PCR 어세이로부터의 데이터. GAPDH-정상화된 혈액 CD16A mRNA 농도의 중간값(제일사분위수-삼사분위수)은 시험군 및 기준군에서 각각 365 (267-541) 및 341 (300-426)이었다(도 7). 시험군 중 이 중간값 정상화된 CD16A mRNA 농도는 기준군과 유의적으로 다르지 않았다(p=0.571, 만-휘트니 순위합 검정).

CD16A mRNA의 예측 능력을 시각화하기 위해, ROC 곡선을 계획하였다(도 8). CD16A mRNA에 대한 ROC 곡선하 면적(곡선하 면적 = 0.580, 95% 신뢰구간 = 0.319-0.841)과 식별 라인(identity line)하 면적 사이에 유의적인 차이가 관찰되지 않았다(p=0.545). 이 시험에서 양성으로 여성을 정의하기 위한 역치로서 GAPDH-정상화된 혈액 CD16A mRNA 농도 > 438를 사용하여, 본 발명자들은 30.0% 민감도 및 90.0% 특이도로 34주보다 이른 출산을 나타내는 여성을 식별할 수 있었다. CD16A mRNA에 대한 양성 예측도 및 음성 예측도는 각각 75.0% 및 56.3%이다.

표 2에 열거되지 않은 CD62L mRNA를 타겟팅하는 qRT-PCR 어세이로부터의 데이터. GAPDH-정상화된 혈액 CD62L mRNA 농도의 중간값(제일사분위수-삼사분위수)은 시험군 및 기준군에서 각각 69.6 (59.7-112) 및 76.7 (71.4-91.7) 이었다(도 9). 시험군 중 이 정상화된 CD62L mRNA 농도는 기준군과 유의적으로 다르지 않았다(p=0.678, 만-휘트니 순위합 검정).

CD62L mRNA의 예측 능력을 시각화하기 위해, 그의 ROC 곡선을 계획하였다(도 10). CD62L mRNA에 대한 ROC 곡선하 면적(0.560, 95% CI = 0.288-0.832)과 식별 라인(identity line)하 면적(0.500, p=0.650) 사이에 유의적인 차이가 관찰되지 않았다. 이 시험에서 양성으로 여성을 정의하기 위한 역치로서 GAPDH-정상화된 혈액 CD62L mRNA 농도 > 62.4를 사용하여, 본 발명자들은 30.0% 민감도 및 90.0% 특이도로 34주보다 이른 출산을 나타내는 여성을 식별할 수 있었다. CD62L mRNA에 대한 양성 예측도 및 음성 예측도는 각각 75.0% 및 56.3%이다.

논의

본 연구에 있어서, 엑손 어레이 기법을 사용하여, 본 발명자들은 엑손 수준의 해상으로 자궁 수죽의 존재 동안 임신 여성의 혈액 전사체를 프로파일링 하였다. 자궁 수축 동안 혈액 세포에 대한 유전체-영역(genome-wide) RNA 발현 데이터는 상호 심사 문헌으로 전에 공개된 적이 없다. 또한, 본 발명자들은 처음으로, 34 임신주보다 이른 출산을 나타내는 여성과, 37 주 또는 그 이후의 출산을 나타낸 여성 사이의 차등적으로 발현된 RNA 전사체를 체계적으로 비교하였다. 또한, RNA 발현 수준의 > 1.4 백만 데이터 포인트 중, 출산을 예측하는데 유용한 마커 RNA 전사체의 전략적 선택을 위한 방법이 고안되었다. 이들 신규 데이터 및 방법은 조사자가 이 기술 분야에서 > 30,000 인간 유전자 중 모계 말초혈의 분자적 분석을 통한 조산을 예측하는데 유용한, 32 RNA 전사체의 패널(표 2)을 최종후보로 선발할 수 있게 한다.

본 발명자들은 우리의 최종 후보로 선발된 마커 RNA 전사체, 즉, B3GNT5 mRNA, CLC mRNA, 및 GBP3 mRNA(표 2로부터)를 타겟팅하는 qRT-PCR 어세이의 임상적 유용성을 증명하였다. 이들의 농도는 34주보다 이른 출산을 나타내는 여성(시험군)과 37주 또는 그 이후의 출산을 나타낸 여성(기준군; 만-휘트니 검정, B3GNT5 mRNA, CLC mRNA, 및 GBP3 mRNA에 대하여 각각 p 값 = 0.002, 0.011 및 0.0173) 사이에 유의하게 상이하였다. 뿐만 아니라, 세 개의 시험된 마커 중 두 개, B3GNT5 mRNA, 및 CLC mRNA의 농도의 사분위수 범위(interquartile range)는 두 군 사이에 겹치지 않았다.

본 연구에서 최종 후보로 선발된 마커 RNA 전사체(표 2로부터)를 타겟팅하는 qRT-PCR 어세이와 유사하게, 본 발명자들은 또한 표 2에 열거되지 않은 RNA 전사체를 타겟팅하는 어세이에 의해 참여자의 두 군의 혈액 RNA 시료를 분석하였다. 대조적으로, 두 군 사이에 GAPDH-정상화된 농도는 유의적으로 다르지 않았다(만 휘트니 검정, CD16A mRNA 및 CD62L mRNA에 대하여 각각 p 값 = 0.571 및 0.678).

유망한 결과에 기반하여, 마커의 예측 능력은 ROC 분석을 사용하여 검사하였다. 본 연구에서 개발된 각 마커(예를 들면, 표 2에 열거된 것들)에 대하여, ROC 곡선하 면적은 식별 라인(identity line)하 면적(x = y)에 비해 유의적으로 크고, 이것은 예측에 대한 잠재적 사용을 증명한다. 상세하게는, B3GNT5 mRNA, 및 CLC mRNA의 곡선하 면적은 각각 0.915, 0.840, 및 .0.820 이었다.

대조적으로, CD16A mRNA 및 CD62L mRNA의 ROC 곡선하 면적은 각각 0.580 및 0.560이었다. 이들 면적은 식별 라인하 면적(각각 p=0.545 및 0.650)인 0.500과 유의적으로 다르지 않았다. 이것은 표 2로부터 개발되지 않은 이들 어세이가 출산을 예측하기 위한 잠재성이 없다는 것을 의미한다.

가장 중요하게는, 상기 전략에 의해 확인된 세 마커 중 두 개는 고 민감도 및 고 특이도로 출산을 예측한다. 특히, B3GNT5 mRNA에 대한 민감도 및 특이도는 각각 90.0% 및 90.0%이었고, CLC mRNA에 대해서는 각각 88.9% 및 81.8% 이었다. 이들 두 개의 신규 마커의 능력은 경질 자궁 경부 길이의 능력(민감도 및 특이도는 각각 63.6% 및 85.7% 이었다)와 유리하게 대비되거나, 적어도 태아 피브로넥틴의 그것(민감도 및 특이도는 각각 81.7% 및 82.5%)(Lockwwod et al. 1991)과 동등하다.

경질 초음파검사 및 태아 피브로넥틴에 대하여 본 연구에서 최종 후보로 선발된 혈액 마커의 또 다른 중요한 이점은 이들은 검사되어야 하는 임신 여성에 의해 항상 견딜만 하지 않은 골반 검사를 요구하지 않는다는 것이다. 요약하여, 본 발명자들은 현행 마커 대비 더 나은 또는 동등한 능력을 갖는, 34주 보다 이른 인간 출산의 예측에 유용한 32개의 말초 혈액 RNA 전사체의 패널을 본 연구를 통해 만들어내었다.

본 출원에서 인용된 모든 특허 문헌, 특허 출원, 및 GenBank Accession Number를 포함하는 다른 공개 문헌은 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로서 포함된다.

참고 문헌 리스트

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Claims

(a) 임신 여성으로부터 수득된 혈액 시료 중 마커의 mRNA 수준을 측정하는 단계로서, 상기 마커는 B3GNT5, CLC, 또는 GBP3 인 단계; 및
(b) 상기 단계 (a)에서 얻어진 mRNA 수준을 표준 대조군과 대비하는 단계로서, 상기 표준 대조군과 대비할 때, 상기 B3GNT5 수준의 증가, 또는 상기 CLC 또는 GBP3의 mRNA 수준의 감소는 조산의 증가된 위험을 갖는 여성을 지시하는 것인 단계를 포함하는 조산의 위험을 결정하기 위한 정보를 제공하기 위한 마커를 검출하는 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 시료는 전혈인 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 시료는 분리된 혈액 세포인 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 시료는 혈장인 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 시료는 혈청인 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 마커는 B3GNT5이고, 표준 대조군 대비 mRNA 수준의 증가는 조산의 증가된 위험을 갖는 여성을 지시하는 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 마커는 CLC 또는 GBP3이고, 표준 대조군 대비 mRNA 수준의 감소는 조산의 증가된 위험을 갖는 여성을 지시하는 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 mRNA 수준은 상기 단계 (b) 전에 동일한 시료 중 기준 유전자(reference gene)의 mRNA 수준에 대하여 정상화된 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 단계 (a)는 질량분석, 또는 마이크로어레이에의 혼성화, 형광 프로브, 또는 분자 비콘(molecular beacon)을 포함하는 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 단계 (a)는 증폭 반응을 포함하는 것인 방법.
청구항 10에 있어서, 상기 증폭 반응은 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction: PCR)인 것인 방법.
청구항 11에 있어서, 상기 PCR은 역전사효소-PCR(RT-PCR)인 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 단계 (a)는 검출가능한 모이어티(detectable moiety)를 포함하는 폴리뉴클레오티드 프로브를 활용하는 폴리뉴클레오티드 혼성화 어세이를 포함하는 것인 방법.
청구항 13에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 혼성화 어세이는 서던 블랏 분석(Southern Blot analysis), 노던 블랏 분석(Northern Blot analysis), 또는 인 시투(in situ) 혼성화 어세이인 것인 방법.
청구항 8에 있어서, 상기 기준 유전자는 GAPDH인 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 하나 이상의 마커 유전자의 mRNA 수준은 측정되고, 그들 각각의 표준 대조군과 대비되어 조산의 위험이 결정되는 것인 방법.
(1) 마커 유전자 mRNA의 평균 수준을 제공하는 표준 대조군; 및
(2) 상기 마커 유전자 mRNA를 특이적으로 및 정량적으로 식별하는 제제를 포함하고, 상기 마커는 B3GNT5, CLC, 또는 GBP3 인 조산 위험을 결정하기 위한 키트.
청구항 17에 있어서, 상기 제제는 마커 유전자 mRNA와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드 프로브인 것인 키트.
청구항 18에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 프로브는 검출가능한 모이어티를 포함하는 것인 키트.
청구항 17에 있어서, 증폭 반응 중 마커 유전자 cDNA 또는 그의 상보체(complement)의 하나 이상의 세그먼트(segment)를 특이적으로 증폭하기 위한 두 개의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 더 포함하는 것인 키트.
청구항 17에 있어서, 지시 매뉴얼을 더 포함하는 것인 키트.
하기를 포함하는 임신 여성에서 조산의 위험을 감소시키기 위한 약학적 조성물:
(1) 마커 유전자 B3GNT5 에 대한 안티센스 폴리뉴클레오티드 서열 또는 siRNA; 또는
(2) 마커 유전자 CLC 또는 GBP3 의 cDNA 서열을 포함하고, 그 마커 유전자의 전사를 지시하는 발현 카세트.
청구항 22에 있어서, 상기 발현 카세트는 마커 cDNA 서열과 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 것인 조성물.