KR102093065B1

KR102093065B1 - 항산화물질의 함량이 증진된 고추냉이의 배양방법

Info

Publication number: KR102093065B1
Application number: KR1020190053348A
Authority: KR
Inventors: 우성민; 김선일; 신의철
Original assignee: (주) 한주산업
Priority date: 2019-05-07
Filing date: 2019-05-07
Publication date: 2020-03-24
Also published as: KR20190075013A

Abstract

본 발명은 고추냉이의 정단분열조직을 채취하는 단계; 채취된 정단분열조직을 액체배양하여 신초를 유도하는 단계; 기내에서 배양된 고추냉이를 상토에서 순화하는 단계; 상기 상토를 이용한 고추냉이 배양체를 순화한 후 수경재배하되, 수경재배조건으로 광원은 LED 또는 형광등의 백색광하에 1일 16-20시간 조사하고, 배지의 온도는 8~15℃를 유지하는 것을 특징으로 하는 항산화물질의 함량이 증진된 고추냉이의 배양방법을 제공한다.

Description

항산화물질의 함량이 증진된 고추냉이의 배양방법{The Mass Production Method of Wasabia japonica}

본 발명은 항산화물질의 함량이 증진된 고추냉이의 배양방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 시니그린(sinigrin) 및 알릴 이소 티오시아네이트(AITC) 함량이 일반 고추냉이 대비 증진되어 강력한 항산화력을 제공하고, 이에 의해 추출된 오일을 향미유 제조시 첨가함으로써 관능성을 증진시키고 산패를 지연시켜 보존성을 크게 개선할 수 있으며, 수경재배를 이용하여 빠른 시일 내에 저렴한 비용으로 연중 안정적인 생산이 가능한 항산화물질의 함량이 증진된 고추냉이의 배양방법에 관한 것이다.

최근 식품산업의 발전과 더불어 식생활의 패턴이 변화하면서 각종 가공식품 및 인스턴트 식품의 섭취가 늘고 있으며, 다른 한편으로는 유기농 제품과 같은 프리미엄 식품산업의 시장이 확대되고 있는 추세이다. 이에 각 식품제조업체는 다양한 식품의 제조방법에 따라 제품의 가치를 상승시키기 위하여 여러 가지 첨가제 사용량이 증가하고 있다.

식품의 산패 및 부패는 온도, 빛, 산소, 수분, 금속 등의 물리화학적 요인 및 식품 자체의 효소 작용 등에 의해 일어나며, 이를 방지하기 위하여 건조, 염장, 당장 등의 방법이 이용되고 있으나 적용범위가 제한적이기 때문에 합성 보존료를 사용하여 저장성을 높이고 있다.

특히 합성 식품 보존료는 미생물의 증식에 의해 일어날 수 있는 식품의 변질, 부패 및 이화학적 변화를 방지하기 위해 사용되는 식품산업의 필수 물질이지만, 과량 섭취시 인체에 유해할 수 있다.

국내에서 이용되는 대표적인 합성 식품보존료는 소르빈산, 데히드로초산, 안식향산, 프로피온산 및 파라옥시향산부틸 등이며 제품의 식품의 종류에 따라 다양하게 이용된다.

합성 식품 보존료는 이용의 간편성과 경제성 등에 입각하여 두루 사용되지만 최근 음료에 첨가된 안식향산나트륨이 비타민 C와 반응하며 발암물질인 벤젠이 형성되는 사건이 발생하기도 하였고, 유아의 과잉행동장애를 유발시키거나 심화시킨다는 최근 연구결과 등이 발표되면서 2008년 미국 코카콜라사는 안식향산나트륨 저감 정책을 발표하기도 하였다.

상기와 같은 부작용 때문에 식품의약안전처는 개별 보존료에 대한 적정 허용량을 명시하고 있으나, 독성 및 안정성에서 완전히 자유롭지 못하며 이에 대한 소비자의 심리적 저항감은 매우 높은 편이다.

최근 식품안전에 대한 소비자 관심 증가와 합성첨가물에 대한 부정적 인식의 확산으로 인해 고품질 천연 식품 안전 소재에 대한 니즈(needs)가 지속적으로 증가되고 있으며 천연 보존료의 필요성 또한 증가하고 있다.

식품업계 또한 인공 합성보존료의 사용을 가능한 제한하려는 추세이고, 안전성이 확보된 천연 항균성 물질을 식품의 보존에 이용하고자 하는 연구가 활발히 이루어지고 있다.

특히 천연항산화제 및 천연항균물질 등의 개발 및 이용은 합성 보존료 사용의 부정적인 측면을 해소하고 소비자의 기피현상을 유발하지 않으면서 제품의 저장성과 안정성을 확보할 수 있는 좋은 대안이다.

현재 다양한 소재를 활용하여 천연 식품보존료의 개발이 확대되고 있으며, 이러한 천연 식품 첨가물 중 고추냉이(Wasabia japonica)는 기능성 및 활용성 면에서 매우 적합한 천연소재이다.

알릴이소시아네이트(AITC)는 고추냉이에 풍부하게 함유된 향미성분으로 식욕증진, 비타민 B1 합성 증강, 베타아밀라제 활성 촉진, 항산화 활성, 항균활성 등의 효과가 있는 유용물질이다.

AITC의 전구물질인 글루코시놀레이트(glucosinolate)는 식물체 내에서는 향과 맛이 없는 안정된 화합물 상태로 존재하지만 식물세포가 물리적인 힘에 의해 파괴되면 마이로시나아제(myrosinase) 작용으로 AITC가 생성되며 강력한 항산화 및 항균, 항진균 작용을 하며, 항균스펙트럼이 넓은 특징을 가진다.

또한 산업적 이용을 위해서는 원료 소재인 고추냉이의 안정적인 공급이 무엇보다 중요한 선결과제이다.

고추냉이는 배추과 (Brassicaceae)에 속하는 숙근성 다년생 식물로 원산지는 일본이며, 산업 및 의학용 분야 등에 응용범위가 매우 커 시장수요가 높은 고부가가치 작물이다.

고추냉이에 대한 일반적인 이용은 초밥과 생선회로 국한되어 있으며, 이러한 고추냉이의 이용 목적은 생선의 비린내를 줄이며 자연에 가까운 생선의 맛과 향을 제공함이 목적이다.

소득 증대와 식생활 문화의 발달을 통해 고추냉이의 수요가 증가하면서 단순한 생선요리의 첨가로 쓰이는 용도에서 더욱 다양한 용도의 사용이 요구되며, 이러한 다양한 용도로의 사용은 고추냉이의 산업적 적용을 통해 이루어져야 할 필요가 있다.

현재 국내의 고추냉이의 재배수준은 재배면적도 부족하며, 생산량도 산업화를 위해서는 부족한 상황이다.

고추냉이는 일반 작물과는 달리 맑고 차가운 물이 흐르고 일조량이 적으며 서늘한 기온을 유지하는 경사도 5-15도 정도의 산간계곡 (해발 200-800m) 등에서 자라며 재배환경이 매우 까다로운 작물이다.

고추냉이의 생육 온도 범위는 8-18℃이며, 생육 적온은 12-15℃이고 25℃이상 올라가게 되면 고온피해를 받으며 3-5℃에서는 생육이 지연되고 -3℃ 이하에서는 동해가 발생하는 특성이 있다.

원산지인 일본에서도 비교적 겨울 기온이 온화한 나가노현, 시즈오카현 등 에서 재배되고 있으나 최근 기상이변에 따른 고온현상, 연작피해, 바이러스 병 등으로 인하여 재배면적이 지속적으로 감소하고 있는 실정이다.

이러한 원인들로 인하여 원료소재인 고추냉이의 안정적인 생산을 위해서는 환경제어형 시설에서 연중 생산하는 시스템을 구축할 필요가 있다.

이에 본 발명자들은 상기한 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 그 목적은 시니그린(sinigrin) 및 알릴 이소 티오시아네이트(AITC) 함량이 일반 고추냉이 대비 증진되어 강력한 항산화력을 제공하고, 이에 의해 추출된 오일을 향미유 제조시 첨가함으로써 관능성을 증진시키고 산패를 지연시켜 보존성을 크게 개선할 수 있으며, 수경재배를 이용하여 빠른 시일 내에 저렴한 비용으로 연중 안정적인 생산이 가능한 항산화물질의 함량이 증진된 고추냉이의 배양방법을 제공함에 있다.

상기한 바와 같은 본 발명의 기술적 과제는 다음과 같은 수단에 의해 달성되어진다.

(1) 고추냉이의 정단분열조직을 채취하는 단계; 채취된 정단분열조직을 액체배양하여 신초를 유도하는 단계; 기내에서 배양된 고추냉이를 상토에서 순화하는 단계; 상기 상토를 이용한 고추냉이 배양체를 순화한 후 수경재배하되, 수경재배조건으로 광원은 LED 또는 형광등의 백색광하에 1일 16-20시간 조사하고, 배지의 온도는 8~15℃를 유지하는 것을 특징으로 하는 항산화물질의 함량이 증진된 고추냉이의 배양방법.

(2) 상기 (1)에 있어서,

수경재배시 상부의 온도는 20~26℃를 유지하는 것을 특징으로 하는 항산화물질의 함량이 증진된 고추냉이의 배양방법.

(3) 상기 (1)에 있어서,

고추냉이의 정단분열조직을 1.0~1.5mm의 크기로 채취하는 것을 특징으로 하는 고추냉이의 배양방법.

(4) 상기 (1)에 있어서,

채취된 정단분열조직을 0.5~1.0 mg/L BA, 0.05~0.10 mg/L NAA, 및 수크로즈 4~6%(w/w)를 함유한 MS배지에서 액체배양하여 신초를 유도하는 것을 특징으로 하는 고추냉이의 배양방법.

(5) 상기 (1) 내지 (4) 중 선택된 어느 하나의 방법에 따라 배양된 고추냉이.

(6) 상기 (5)의 고추냉이로부터 추출된 고추냉이 오일.

상기와 같이 본 발명에 의하면, 시니그린(sinigrin) 및 알릴이소티오시아네이트(AITC) 함량이 일반 고추냉이 대비 증진되어 강력한 항산화력을 제공하고, 이에 의해 추출된 오일을 향미유 제조시 첨가함으로써 관능성을 증진시키고 산패를 지연시켜 보존성을 크게 개선할 수 있으며, 수경재배를 이용하여 빠른 시일 내에 저렴한 비용으로 연중 안정적인 생산이 가능한 항산화물질의 함량이 증진된 고추냉이를 배양한다.

도 1은 본 발명에 따른 고추냉이의 정단분열조직을 액체배양하여 신초를 유도한 결과를 보여주는 사진이다.
도 2는 본 발명의 고추냉이 유묘의 순화과정을 보여주는 사진이다.
도 3은 본 발명에 사용된 고추냉이의 수경재배실의 사진이다.
도 4는 본 발명의 방법에 따라 재배된 고추냉이의 맛 성분 분석 결과이다.
도 5a, 5b는 본 발명의 방법에 따라 재배된 고추냉이의 항균력 시험결과이다.
도 6은 본 발명의 방법에 따라 재배된 고추냉이의 AITC의 함량측정결과이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따른 고추냉이의 배양방법은,

고추냉이의 정단분열조직을 채취하는 단계; 채취된 정단분열조직을 액체배양하여 신초를 유도하는 단계; 기내에서 배양된 고추냉이를 상토에서 순화하는 단계; 상기 상토를 이용한 고추냉이 배양체를 순화한 후 수경재배하되, 수경재배조건으로 광원은 LED 또는 형광등의 백색광하에 1일 16-20시간 조사하고, 배지의 온도는 8~15℃를 유지하는 것을 특징으로 한다.

상기와 같은 조건하에서 본 발명에 의하면 수경재배시 배지의 온도를 8~15℃를 유지하는 것만으로도 지상부의 온도가 25℃ 이상이 되어도 고온피해가 없이 생육이 잘 진행되어지는 바, 상부의 온도를 20~26℃ 정도로 유지할 수 있어 별도의 에어컨디셔너 설비를 가동하지 않더라도 재배가 가능하게 된다.

이하, 본 발명의 내용을 단계별로 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

1. 정단분열조직의 채취

정단분열조직은 그 특성상 2mm 이하의 작은 크기로 적출되는데, 이때 분열조직의 크기를 작게 할수록 바이러스 등의 감염율을 낮출 수 있다. 하지만 크기가 작아질수록 적출시 데미지 등으로 인하여 재분화율이 감소하는 경향이 있어 적정 수준을 유지하는 것이 중요하다. 본 발명에서는 0.3mm 이하로 정단분열조직 적출시 재분화율이 10% 가량으로 낮았으며, 0.3~0.5mm 일 때 32%, 0.5~0.8mm 일 때 63%, 1.0~1.5mm 이상일 때 71% 가량으로 확인되어, 바람직하게는 1.0~1.5mm로 한다.

2. 신초의 유도

본 발명에서는 상기와 같이 채취된 정단분열조직을 액체배양하여 신초를 유도한다(도 1). 고추냉이 신초를 유도하기 위한 최적의 고추냉이 유묘 조직배양법은 배지는 MS배지가 가장 효율적이고, 바람직하게는 식물생장조절제로 0.5~1.0 mg/L BA, 0.05~0.10 mg/L NAA, 및 탄소원으로 수크로즈 4~6%(w/w)를 함유한 MS배지가 사용된다. 보다 바람직하게는 상기 식물생장조절제로 0.5~1mg/L BA + 0.05mg/L NAA를 함유하고, 탄소원은 수크로즈(sucrose) 5%(w/w)가 가장 신초 유도율 및 생중량에서 우수한 것으로 나타났다.

탄소원 농도에 따른 고추냉이 생육반응(배양 4주 후 결과)

수크로즈(%)	신초길이(cm)	뿌리길이(cm)	생중량(g)
수크로즈(%)	신초길이(cm)	뿌리길이(cm)	지상부	지하부
2	4.0	5.7	0.93	0.31
3	4.1	5.2	0.91	0.29
4	4.6	5.4	0.96	0.31
5	5.3	6.9	1.04	0.35
6	4.7	5.2	0.97	0.29
7	4.4	5.8	0.93	0.34
8	3.3	4.9	0.85	0.25

3. 고추냉이 유묘의 순화 본 발명에서는 기내에서 배양된 고추냉이를 순화하기 위하여 일차적으로 시중에서 판매하고 있는 상토를 이용한다. 상기 상토를 이용한 고추냉이 배양체의 순화율은 약 88~91% 수준으로 매우 양호한 수준이였다(도 2).

4. 고추냉이 배양체의 수경재배

본 발명에서는 상기 상토를 이용한 고추냉이 배양체를 순화한 후 NFT 방식을 이용하여 수경재배한다. 본 발명에서 항산화물질의 함량이 증진되도록 수경재배조건으로 광원은 LED 또는 형광등의 백색광하에 1일 16-20시간 조사하고, 배지의 온도는 8~15℃를 유지하고, 상부의 온도는 20~26℃를 유지하는 것이 바람직하다.

재배실 환경은 도 2에 도시한 바와 같은 시스템이 이용되었으며, 본 발명에서는 광조건을 충족시키기 위해 요인실험베드 (인공광의 높이 조정 가능)에 장착된 형광등과 LED 등을 이용하고, 습도는 65±5% 로 제어하는 것이 바람직하다. 이와 같이, 기존에 알려진 고추냉이의 생육 적온은 15℃ 내외이나 본 발명에서는 근권부의 온도를 8~15℃로 유지하고, 지상부의 온도는 20~26℃로 유지하는 것이 항산화물질의 함량증진에 있어서 매우 중요한 요소임을 확인하였다. 이를 위해 본 발명에서는 근권부의 온도는 양액탱크에 설치된 쿨러 유닛으로 조정할 수 있으며, 지상부는 에어콘 시스템으로 조정하는 것이 바람직하다. 이때, 단위면적당 생산량을 극대화할 수 있도록 바람직하게는 재식밀도는 3cm*3cm~20cm*20cm로 한다(도 3).

이하 본 발명의 내용을 실시예를 참조하여 보다 상세하게 설명하고자 하나 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명의 권리범위가 한정되는 것으로 해석되어져서는 아니된다.

[실시예 1] 고추냉이의 배양

고추냉이의 정단분열조직을 1.5mm의 크기로 채취하였다. 채취된 정단분열조직을 0.5~1mg/L BA, 0.05mg/L NAA, 및 수크로즈 5%(w/w)를 함유한 MS배지에서 액체배양하여 신초를 유도하였다. 기내에서 배양된 고추냉이를 순화하기 위하여 일차적으로 시중에서 판매하고 있는 상토를 이용하였으며, 상기 상토를 이용한 고추냉이 배양체의 순화율은 약 90% 수준으로 매우 양호한 수준이였다. 고추냉이 배양체는 순화 후 환경제어가 가능한 시설에서 NFT 방식으로 수경재배하였다. 수경재배조건으로 광원은 LED 또는 형광등의 백색광하에 1일 16-20시간 조사하고, 배지의 온도는 8~15℃를 유지하고, 상부의 온도는 20~26℃를 유지하였다. 재배기간 중 대조구 양액은 야마자키(yamazaki)액을 이용하였다.

[실험예 1] 고추냉이의 일반성분분석

일반성분 분석은 Association of Official Analytical Chemists (AOAC) 방법에 준하여 실시하였다. 수분은 상압가열건조법, 회분은 muffle furnace를 이용하여 550℃에서 실시하였고, 조단백질은 Kjeldahl 법, 조지방은 soxhlet 추출법으로 분석하고, 조섬유는 Neutral Detergent Fiber (NDF) 법으로 분석하였다(표 2).

고추냉이의 부위별 일반성분

	함량(g/100 g of wet basis)
	잎	엽병	근경
수분	92.50±0.24	94.37±0.5	81.35±0.23
조단백	3.21±0.36	2.45±0.14	2.33±0.35
조지방	0.32±0.01	0.13±0.01	0.10±0.01
조회분	1.72±0.01	2.07±0.35	0.98±0.36
탄수화물	2.26±0.58	0.98±0.36	15.48±0.28

[실험예 2] 고추냉이의 아미노산 및 무기성분 분석(1) 유리아미노산 : 동결건조한 시료 1 g에 에탄올 20 mL을 가한 후 homogeniger로 10분간 교반하여 3,000 rpm에서 20분간 원심분리 하였고, 상층액을 감압 농축한 후 sample dilution buffer 25 mL로 용해시키고, sulfosalicyclic acid 20 mg을 첨가하여 4℃에서 1시간동안 방치시킨 다음 다시 3,000 rpm에서 20분간 원심분리한 후 membrane filter (0.2 μm)로 여과시켜 아미노산 분석기로 정량 분석하였다(표 3)

(2) 구성 아미노산: 동결 건조한 시료 0.1 g을 18 mL test tube에 칭량하여 6 N HCl 3mL를 가하여 감압 밀봉한 후 110 ℃에서 24시간 이상 가수분해하였다. 50 ℃에서 Rotary evaporator로 산을 제거한 후 sodium dilution buffer로 50 mL 정용한 다음, 이중 1 mL를 취하여 membrane filter 0.2 μm로 여과시켜 아미노산 분석기로 정량 분석하였다(표 3, 표 4).

고추냉이의 부위별 단백질 구성 아미노산 조성

아미노산	조성(%)
아미노산	잎	엽병	근경
Essential amino acid
Lysine	7.17±1.24	8.51±1.07	6.15±1.36
Methionine	1.50±0.12	0.17±0.05	1.61±0.09
Leucine	7.79±1.47	6.60±1.26	4.56±0.95
Phenylalanine	7.27±0.87	6.80±1.05	5.03±0.74
Valine	4.06±0.58	4.56±0.69	5.04±0.77
Histidine	3.73±0.64	4.05±0.45	3.05±0.38
Threonine	4.96±0.48	5.19±0.57	5.57±0.74
Isoleucine	2.02±0.09	2.39±0.13	1.79±0.14
Non-essential amino acid
Arginine	7.16±1.05	4.84±0.69	10.24±1.36
Glutamic acid	18.61±2.35	23.27±2.98	20.47±3.05
Aspartic acid	12.97±3.24	12.95±3.14	17.72±2.99
Alanine	7.33±1.21	7.95±1.36	6.71±1.45
Glycine	6.53±2.05	6.13±1.22	4.90±1.07
Serine	5.96±0.94	6.58±0.87	5.87±1.08^a
Tyrosine	2.93±0.15	0.00±0.00	1.29±0.08^b
%Essential amino acid	38.51±4.17	38.27±5.02	32.80±4.56
%Non-essential amino acid	61.49±6.62	61.73±8.54	67.20±7.13
%총아미노산	100.00	100.00	100.00

고추냉이의 부위별 단백질을 구성하지 않는 유리 아미노산

아미노산	조성(%)
아미노산	잎	엽병	근경
Aspartic acid	1.27±0.05	0.76±0.08	0.74±0.09
ρ-Serine	0.00±0.00	0.33±0.05	0.00±0.00
Threonine	6.37±0.14	7.38±0.21	11.02±0.32
Serine	4.20±0.11	4.77±0.13	3.18±0.14
Glutamic acid	6.90±0.14	7.64±0.24	3.58±0.18
Glycine	0.38±0.07	0.41±0.09	1.70±0.08
Alanine	12.49±0.43	19.55±0.61	8.75±0.25
Valine	8.81±0.17	9.25±0.31	10.08±0.33
Cysteine	0.00±0.00	0.47±0.08	0.68±0.09
Methionine	0.11±0.02	0.24±0.03	0.26±0.04
Isoleucine	3.67±0.25	3.41±0.12	3.95±0.15
Leucine	3.73±0.19	2.28±0.09	3.75±0.18
Tyrosine	2.64±0.15	1.03±0.05	2.71±0.10
Phenylalanine	5.64±0.24	2.65±0.07	2.14±0.06
β-alanine	2.08±0.11	1.16±0.08	1.00±0.07
γ-Aminobutylic acid	33.29±0.97	33.37±1.06	26.82±1.15
Lysine	1.30±0.07	0.55±0.10	0.76±0.06
Histidine	1.15±0.04	3.85±0.11	5.77±0.15
Arginine	5.97±0.22	0.90±0.07	13.12±0.47
총계	100.00	100.00	100.00

(3) 무기질 분석:고추냉이의 부위별 무기질 함량 분석은 식품공전에 준하여 microwave acid digestion(Titan MPS, Perkin Elmer Co., Waltham, MA, USA)을 이용하여 전처리를 시행하였다. 시료 0.5 g을 정확히 칭량하여 전처리 용기에 넣고, 10 mL의 질산을 가한 후 15분 간 180℃에서 가열하고, 600 W 에너지를 가하여 시료를 분해하였다. 전처리가 완료된 시료의 용기를 100 mL 메스플라스크에 정용하고, 0.45㎛ 필터를 사용하여 시료를 필터링 한 후 분석용 시료로 사용하였다. 분해된 샘플의 무기질 분석은 유도결합플라즈마 분광광도계/ICP-OES(Inductively Coulpled Plasma-Optical Emission Spectrometer, 5300DV, Perkin Elmer Co., Waltham, MA, USA)를 사용하였다.

고추냉이의 부위별 무기질 조성

무기성분	조성(%)
무기성분	잎	엽병	근경
P(phosphorus)	9.11±0.87	5.34±0.56	6.75±0.69
S(Sulfur)	20.44±1.97	6.89±0.74	14.92±1.22
K(potassium)	43.75±4.35	65.02±4.21	57.93±3.23
Ca(calcium)	19.66±1.21	18.99±2.09	16.15±1.43
Mg(magnesium)	6.61±0.43	3.24±0.33	4.02±0.29
Fe(iron)	0.15±0.04	0.08±0.02	0.06±0.02
As(arsenic)	0.05±0.03	0.06±0.03	0.04±0.03
Zn(zinc)	0.08±0.02	0.04±0.01	0.08±0.03
Mn(manganese)	0.15±0.02	0.14±0.03	0.04±0.02
Al(aluminum)	0.01±0.00	0.19±0.03	0.01±0.00
Total	100.00	100.00	100.00

[실험예 3] 고추냉이의 수용성 비타민 분석비타민 C :　동결 건조한 시료 1 g에 동량의 10% 메타인산　1 mL을 가하여 현탁시킨 후, 5% 메타인산 19 mL을 넣어 20 mL로 정용하였다. 이를 1분간 잘 혼합하고 20분간 방치한 후 1000　rpm에서 10분간 원심분리하였다. 상층액을 취해 HPLC용 0.2 μm 막필터로 여과하여 HPLC 분석시료로 사용하였다. 컬럼은 μ-bondapack C18을 사용하며, 이동상은 0.05M KH₂PO₄ : 아세토나이트릴(60 : 40)을 흘러주었다. 유속은 1.0mL/min이며, 시료는 10 μL 주입하여 254 nm 파장에서 측정하였다. 표준물질은 L-아스코빈산을 사용하여 500-2000 μg/mL의 농도로 용해시켜 분석하며, 비타민 C 함량은 건조중량 100 g 당 mg 함량으로 나타내었으며, 그 결과는 하기 표 6과 같다.

	Wasabia japonica Matsum.
	잎	엽병	근경
비타민 C (mg/100 g)	108.09±2.25	64.72±1.79	94.17±2.04

[실험예 4] 고추냉이의 총페놀화합물 분석총 폴리페놀 화합물 분석은 Folin-Ciocalteu 방법을 이용하여 총폴리페놀 함량을 분석하였다. 샘플을 1 mg/mL의 농도로 녹인 시료 40 μL에 증류수 200μL를 가한 다음, 2 N Folin-Ciocalteu 페놀 시약 200 μL을 넣은 후 교반하였다. 이 용액에 포화 30% Na₂CO₃ 600 μL와 증류수 160 μL를 가한 후 2시간 동안 상온에서 반응시켜 분광광도계를 이용하여 765 nm에서 흡광도를 측정하였다. 갈산(Gallic acid)을 표준물질로 사용하며, 0-500 μg/mL 농도로 녹여 표준 검량 곡선을 작성하여, 총 폴리페놀 함량은 1 g 건조중량에 대한 mg gallic acid equivalents(GAE)로 환산하여 표시하였고, 그 결과는 하기 표 7과 같다.

	Wasabia japonica Matsum.
	잎	엽병	근경
총페놀함량 (mg/100 g)	1,275.0±170.8	420.0±81.7	382.2±60.6

[실험예 5] 고추냉이의 향기성분 분석휘발성을 가지는 성분의 추출에는 Likens & Nickerson형 동시증류추출장치(SDE)를 이용하여 분석하였다. 샘플 10 g을 플라스크에 넣고 1 L의 순수(deionized water)를 가한 뒤 맨틀히터로 가열 (100℃) 하여 휘발성 증류를 유도하여 재증류한 100 mL의 다이에틸이써로 3시간 동안 추출하였다. 무수황산나트륨으로 수분을 제거한 후 여과를 거쳐 1 mL 까지 농축하여 시료로 사용하였다. 추출된 휘발성 물질은　mass selective detector가 장착된 GC/MSD를 이용하여 휘발성 성분을 분석하였다. HP-5MS bonded-phase fused-silica capillary column (30 m × 0.25 mm, 0.25 μm film thickness)을 사용하여 오븐 온도는 50℃에서 210℃까지 분당 2℃로 승온, 인젝터 온도는 300℃로 설정하며, 질량분석기의 이온소스 온도는 200℃, 인터페이스 온도는 280℃, 그리고 MS 이온화 전압은 70 eV로 설정하였다. 휘발성 성분 확인은 RI(Retention Index)값과 mass fragmentation pattern을 이용하여 확인한다(표 8).

고추냉이의 부위별 향기성분

화합물	RT (min)¹⁾	RI²⁾	함량(ug/1 g)
화합물	RT (min)¹⁾	RI²⁾	잎	엽병	근경
Acids
2-Hydroxy benzene methanol	5.43	<800	0.34±0.49	ND	ND
Dimethyl silanediol	5.81	<800	ND	7.71±10.90	ND
Trifluorolacticacid	18.81	1144	ND	0.08±0.11	ND
3-2-Methyl phenyl pentanoic acid	27.26	1452	0.10±0.14	ND	ND
2-Tridecyl ester methoxy acetic acid	27.90	1481	0.69±0.98	ND	ND

Alcohols
1,8-Cineole	16.29	1061	1.81±2.55	ND	ND
2,5-Dimethyl-2,5-Hexanediol	16.42	1065	ND	2.02±2.86	ND

Aldehydes
2-1-Phenanthryl benzaldehyde	14.58	1005	0.27±0.39	ND	ND
2-Hexenal	19.26	1159	ND	0.08±0.11	ND
3-Hexene-1,6-dialdehyde	24.82	1361	1.17±1.65	9.42±13.32	ND

Hydrocarbons
Ethyl-1,3-dithio isoindoline	8.51	827	5.71±8.08	0.64±0.90	ND
2-Methyl-5-dibenzazepine	9.52	858	0.64±0.91	ND	4.47±6.32
1-Heptadecene	19.10	1154	0.05±0.07	ND	ND
Azulene	20.13	1187	ND	1.22±1.73	ND
Nonadecane	25.74	1396	ND	1.08±1.52	ND
Tridecane	26.39	1411	0.86±1.22	ND	ND

Heterocyclic
2-4'-Nitro-2'-thienyl pyrimidine	8.65	832	ND	1.73±2.45	ND
Isopropyl isothiocyanate	9.91	869	ND	ND	1.37±1.93
3-Methyl isothiazole	11.11	901	4.93±1.32	2.84±4.01	8.67±12.26
Allyl isothiocyanate	11.50	914	71.51±8.14	8.99±12.71	117.80±166.60
Diethyl-1-propanamine	12.25	938	0.99±1.39	ND	ND
4-Isothiocyanato-1-butene	13.94	987	3.01±1.74	ND	3.59±5.08
Dihydro-5,5-dimethyl-2-furanone	14.12	991	ND	2.51±3.55	ND
2-Ethyl-3-methyl-4-phenyl-6-chloroquinoline	15.36	1032	0.32±0.45	ND	ND
6'-Formyl-6-trimethyl silyl ethynyl-2,2'-bipyridine	15.66	1041	ND	0.12±0.17	ND
Paromomycin	18.84	1145	ND	ND	0.36±0.52
2-Chloro-3,4-diphenyl benzofuro pyridine	20.26	1192	ND	0.09±0.13	ND
3',4',5,5',7-Pentamethoxy flavone	21.19	1226	ND	0.39±0.55	ND
Tetramethyl pyrazine	22.50	1273	0.09±0.13	ND	ND

Ketone
1,7,7-Trimethyl icyclo-2.2.1-heptan-2-one	19.75	1175	46.63±65.95	ND	ND

¹⁾RT: retention time²⁾ RI: Retention index

[실험예 6] 고추냉이의 맛 성분 분석

전자센서를 통한 고추냉이의 맛 성분을 평가하였다. 전자센서는 Electronic tongue(E-tongue)이라고 불리는 전자혀 시스템을 적용하였다. 전자혀 센서에는 단맛, 신맛, 감칠맛, 쓴맛, 짠맛과 같은 기본 5가지 맛을 측정하여 도 4에 나타내었다.

[실험예 7] 항균력 시험

고추냉이의 부위에서 가장 높은 시니그린(sinigrin)과 그에 의해 생성되는 AITC 함량을 가진 근경(rhizome)을 이용하여 항균력 시험을 실시하였고, 최적 추출조건을 확인하기 위해 실온에서의 증류수로 1시간 추출한 추출물, 증류수를 이용하여 100도씨에서 가열을 통해 1시간 환류 추출한 추출물, 50% 아세토니트릴(ACN)을 이용한 실온에서의 1시간 추출물, 50% 아세토니트릴을 이용한 100도씨에서 가열을 통해 1시간 환류 추출한 추출물을 통해 항균력을 시험하였다. 추출물의 함량은 식품의 1%를 주입하였다. 항균력 실험은 다음과 같다.

1. 실험전 피펫팁, 시험관(증류수 9mL), 샘플병(증류수 90mL), 등 필요한 기구는 오토클레이브에 121℃에서 15분간 멸균한다. 획분별로 추출액을 샘플에 1%상당 넣고 믹서기로 균질화 시킨다. 균질화된 샘플 10g을 샘플병에 넣고 교반한다. 10배, 100배, 1,000배로 희석한다. 희석된 용액을 시험관에 1mL 넣고 희석한다. 페트리필름에 1mL 접종 후 누름판으로 눌러준다. 인큐베이터에 35±1℃ 배양한다 (일반세균 : 48시간, 대장균 : 24시간 ). 샘플을 35±1℃ 에서 2~3시간 배양 후 순차적으로 측정한다.

1) 두부를 이용한 실험 결과

가열 50% ACN을 이용한 추출물에 의한 항균효과가 가장 우수(표 9, 도 5a)

	콜로니수(X 10²희석)
	대조군	실온 물추출	가열 물추출	실온 50% ACN추출	가열 50% ACN추출
일반세균	21	18	37	14	8

2) 어묵을 이용한 실험 결과가열 50% ACN을 이용한 추출물에 의한 항균효과가 가장 우수(표 10, 도 5b)

	콜로니수(X 10²희석)
	대조군	실온 물추출	가열 물추출	실온 50% ACN추출	가열 50% ACN추출
일반세균	81	62	148	53	39

[실험예 8] 란시매트(Rancimat) 측정을 통한 향미유지의 산소 유도기간 측정고추냉이 오일의 산화도를 확인하고자 산화안정성을 비교하였다. 실험을 위해 란시매트 장비를 이용하였다. 유지 3g을 란시매트 튜브에 넣고 산화 안정성을 확인하였다. 강제산화를 유도하기 위해 유지가 포함된 튜브에 20L/hr의 조건으로 공기를 주입하여 120℃의 온도에서 실험을 진행하였다. 산화과정을 통해서 발생된 포름산, 케톤, 알데히드, 카르복시산과 같은 산화생성물을 측정하는 센서를 통해서 산소유도기간을 측정하고 그 결과는 하기 표 11과 같다.

고추냉이 부위별 유지의 산소유도기간 효과

시료	산소유도기간(hr)
대두유	1.84±0.16
대두유 + 근경	1.36±0.01
대두유 + 잎	1.91±0.04

[실험예 9] 지방산 분석지방산 조성을 알아보기 위해 6% 황산을 이용한 유도체화를 진행하였다. 약 100 mg의 지질을 내부표준물질 헵타데카논산 (C17:0)과 함께 Reacti-vial™ 반응 바이알에 옮긴 후, 2 mL의 트랜스메틸화제인 6% H₂SO₄/CH₃OH을 이용하여 70℃의 온도에서 16시간 동안 유도체화하였다. 물과 헥산을 첨가하여 1분간 보텍스시킨 후 헥산층을 수집한 후, 질소가스를 이용하여 헥산을 제거한 후 샘플을 다시 1 mL의 헥산에 녹여 지방산 분석을 위한 실험에 사용하였다. 지방산 분석을 위해서 사용된 가스크로마토그래피 장치는 분석 컬럼으로 SP-2560 캐필러리 칼럼(100 m × 0.25 mm i.d., 0.25-μm 필름두께)이 사용되고, 운반가스로 헬륨(2.7 mL/min)이 이용되었다. 주입구 및 검출기 온도는 모두 250℃이었으며, 스플릿율은 50:1이며, 오븐 온도는 초기 130℃에서 5분간 머문 후 분당 4℃ 증가시켜 240℃까지 상승시켜 15분간 유지시켰다. 분석된 결과는 지방산 표준품을 이용하여 각각의 머무름 시간을 이용하여 각각의 지방산을 확인하고, 그 결과를 하기 표 12에 나타내었다.

고추냉이의 부위별 지방산 비율

지방산	조성 (중량%)
지방산	잎	엽병	근경
Palmitic acid	11.68±0.01	17.56±0.02	19.37±0.05
Stearic acid	3.68±0.01	2.25±0.03	3.04±0.09
Oleic acid(ω-9)	16.33±0.09	14.39±0.04	14.22±0.13
Linoleic acid(ω-6)	8.12±0.07	12.19±0.10	18.19±0.12
Linolenic acid(ω-3)	59.57±0.12	52.87±0.14	44.25±0.23
Arachidic acid	0.26±0.01	0.27±0.01	0.49±0.04
Gondoic acid(ω-9)	0.20±0.02	0.27±0.03	0.26±0.02
Behenic acid	0.15±0.02	0.21±0.02	0.19±0.09
%Saturated fatty acid	15.78±0.21	20.29±0.14	23.09±0.16
%Monounsaturated fatty acid	16.53±0.15	14.66±0.09	14.48±0.13
%Polyunsaturated fatty acid	67.99±0.25	65.06±0.31	62.44±0.24

[실험예 10] 항산화효과고추냉이의 부위별 항산화력은 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)를 이용하여 라디칼소거능을 이용하여 측정하였다. 건조된 고추냉이를 농도별(200, 400, 600, 800 ㎍/mL)로 희석한 후 시료용액 80 ㎕에 0.2 mM의 DPPH 용액 320 ㎕를 넣고 교반한 후 37℃에서 30분간 방치한 다음 517 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 다음의 식에 대입하여 항산화력을 측정하였다.

라디칼소거능(%) = (1 - 시료 첨가구의 흡광도/시료 무첨가구의 흡광도) × 100

또한 라디칼소거능을 토대로 IC₅₀(소거능의 50%에 해당하는 샘플의 함량)을 계산하였다.

고추냉이의 부위별 DPPH에 의한 항산화효과

	Wasabia japonica Matsum.
	잎	엽병	근경
IC₅₀(mg)	7.64±0.54	17.24±1.17	16.95±0.61

[실험예 11] 고추냉이의 부위별 Sinigrin과 AITC 함량Sinigrin과 AITC의 추출방법은 Tsao et al. (Taso R, Yu Q, Potter J, Chiba M. 2002. Direct and simultaneous analysis of sinigrin and Isothiocyanate in mustard samples by high performance liquid chromatography. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50, 4749-4753.)의 동시추출 방법 약간 변형하여 진행되었다. 고추냉이의 부위별로 1 g의 동결 건조된 샘플을 취하여 100 mL의 50% Acetonitrile/water 용액을 첨가한 후 환류 냉각장치를 이용하여 1시간 동안 100 ^oC에서 가열을 통해 sinigrin과 AITC를 추출하였다. 추출 후 HPLC를 이용하여 sinigrin과 AITC를 확인하였다. 실험에 사용된 HPLC는 Agilent 1100 series이며, PDA 검출기를 통해 sinigrin은 228 nm, AITC는 242 nm에서 검출하였다. 이동상은 0.025M NH₄OAc (pH 6.75) (용매 A)와 acetonitrile (용매B)을 gradient 조건에서 분석하였다. 세부적인 HPLC 분석 조건은 아래 표 14와 같으며, 측정결과를 표 15에 나타내었다(도 6은 지상부와 근경의 AITC 함량 측정결과).

Items Conditions	Conditions
Instrument	Agilent 1100 series
Column	C18 (Discovery C18, 25 cmㅧ4.6 mm, 5 μm,) (Supelco Co., Bellefonte, PA, USA)
Flow rate	1 mL/min
Gradient	Solvent A: 0.025M NH₄OAc (pH 6.75) Solvent B :acetonitrile 99% solvent A + 1% solvent B up to 2 min 50% solventA + 50% solvent B up to 7.5 min 99% solventA + 1% solventB up to 12 min Total running time : 12 min
Detection	sinigrin (228 nm), AITC (242 nm)
Injection volume	20 uL

	Wasabia japonica Matsum.
	잎	엽병	근경
Sinigrin(mg/g)	11.95±0.91	10.42±0.23	38.36±2.43
AITC(mg/g)	0.44±0.02	0.15±0.03	4.09±0.06

상기와 같이, 본 발명의 바람직한 실시 예를 참조하여 설명하였지만 해당 기술 분야의 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

Claims

고추냉이의 정단분열조직을 1.5mm의 크기로 채취하는 단계; 채취된 정단분열조직을 0.5~1.0 mg/L BA, 0.05 mg/L NAA, 및 수크로즈 5%(w/w)를 함유한 MS배지에서 액체배양하여 신초를 유도하는 단계; 기내에서 배양된 고추냉이를 상토에서 순화하는 단계; 상기 상토를 이용한 고추냉이 배양체를 순화한 후 NFT 방식으로 수경재배하되, 수경재배조건으로 습도는 65±5%, 광원은 LED 또는 형광등의 백색광하에 1일 16-20시간 조사하고, 배지의 온도는 8~10℃를 유지하고, 상부의 온도는 20~26℃를 유지하되, 재식밀도는 3cm*3cm~20cm*20cm로 하는 것을 특징으로 하는 항산화물질의 함량이 증진된 고추냉이의 배양방법.
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