KR102082898B1 - 병원균 검출을 위한 비색 검출 장치 및 그의 제조방법 - Google Patents

병원균 검출을 위한 비색 검출 장치 및 그의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 하판; 상기 하판 상에 위치하고, 반응용액이 반응하는 반응영역을 포함하는 박막; 상기 박막 상에 위치하고, 상기 반응용액이 상기 반응영역으로 유입되도록 제1 반응용액 관통구를 포함하는 중간판; 및 상기 중간판 상에 위치하고, 상기 반응영역으로 유입되는 반응용액이 통과하는 제2 반응용액 관통구를 포함하는 상판;을 포함하는 비색 검출 장치에 관한 것으로, 본 발명에 따른 비색 검출 장치는 병원균의 정량적 비색 검출이 가능하며, 기본적으로 사용하는 종래의 PCR tube에서의 반응보다 더 높은 민감도를 이루는 효과가 있다.

Description

병원균 검출을 위한 비색 검출 장치 및 그의 제조방법{COLORIMETRIC DETECTION DEVICE FOR PATHOGEN DETECTION AND METHOD FOR MANUFACTURING THE SAME}
본 발명은 포도상구균, 대장균, 살모넬라 등의 병원균에 대한 정량적 분석을 위하여 핵산의 증폭과 검출을 동시에 수행할 수 있는 비색 검출 장치 및 그의 제조방법에 관한 것이다.
최근 조류독감, 구제역 등 병원균에 의한 유행성 전염병의 증가로 각종 병원균의 감지에 대한 필요성이 크게 증가하고 있다. 이러한 유행성 전염병에 대한 빠른 대처를 위해서, 현장에서의 병원균 검출이 필요하다. 일반적으로 병원균 검출에 있어, 중합효소 연쇄 반응(Polymerase chain reaction, PCR)을 통한 핵산 검출 방식은 민감도와 선택성이 높아 주로 사용하는 검출 방식이다. PCR은 핵산의 특정 염기 서열을 연쇄적으로 복제하여 기하급수적으로 증폭하는 기술로써 생명과학, 유전공학 및 의료 분야 등의 분석 및 진단 목적으로 널리 사용되고 있다. 해당 기술은 이중가닥의 DNA를 분리하는 열변성 과정 (Denaturation), 시발체 (Primer)가 복제하고자 하는 서열 말단에 결합하는 과정 (Annealing), 그리고 DNA를 합성하는 중합과정 (Polymerization)의 과정을 거쳐 핵산을 증폭한다. 각 과정은 각기 다른 온도에서 진행이 되어야 하며, 이는 현장 진단 적용에 어려움을 야기한다.
이러한 어려움을 극복하기 위하여 재조합효소-중합효소 증폭법 (Recombinase polymerase amplification), 회전환 증폭법 (Rolling cycle amplification), 헬리카제-의존형 증폭법 (Helicase-dependent amplification), 고리-매개 등온증폭법 (Loop-mediated isothermal amplification) 등을 포함한 하나의 열원을 이용한 증폭법들이 개발 되어왔다. 그 중 고리-매개 등온증폭법은 반응의 부산물로 나오는 피로인산염과 용액내의 마그네슘 이온과 불용성 침전물을 형성하며, 이는 실시간 핵산 증폭 및 검출에 용이하다.
기존의 현장 진단을 위한 플랫폼으로써, 지난 20년 동안 마이크로 타스 (μTAS: Micro total analysis systems), 랩온어칩 (LOC: Lab on a chip), 종이기반 미세유체 분석 장비 (μPAD: Microfluidic paper-based analytical devices) 에 관한 많은 연구가 있어왔다. 그 중, 종이기반 미세유체 분석장비는 사용의 용이성 및 휴대성의 장점이 있어 각광을 받고 있다.
하지만 보고된 핵산 검출용 종이기반 플랫폼에서는 핵산의 증폭과정과 핵산의 검출과정을 따로 실시하고, 검출 시 또 다른 검출 기기가 필요한 형광을 검출 하는 방법으로 결과를 보는 것이 일반적이다. 때문에 핵산의 증폭과 동시에 복잡한 기기가 필요로 하지 않는 검출을 위한 종이기반 핵산 검출 장비가 필요하다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 목적은 다공성 박막을 포함하는 비색 검출 장치를 이용하여 병원균의 유무에 따른 핵산 증폭에 의한 색의 변화를 검지하고, 사용자의 눈으로 검출의 여부를 확인할 수 있는 간편한 병원균 검출 장치 및 그의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양상은, 하판; 상기 하판 상에 위치하고, 반응용액이 반응하는 반응영역을 포함하는 박막; 상기 박막 상에 위치하고, 상기 반응용액이 상기 반응영역으로 유입되도록 제1 반응용액 관통구를 포함하는 중간판; 및 상기 중간판 상에 위치하고, 상기 반응영역으로 유입되는 반응용액이 통과하는 제2 반응용액 관통구를 포함하는 상판;을 포함하는 비색 검출 장치에 관한 것이다.
본 발명의 일 구현예에 따른 비색 검출 장치에 있어서, 상기 박막은 상기 제1 반응용액 관통구로 삽입된 볼록부와, 상기 하판과 상기 중간판 사이에 위치한 고정부를 포함할 수 있다.
또한, 상기 볼록부가 다공성일 수 있다.
또한, 상기 볼록부는 기공의 평균 크기가 0.1 내지 100㎛일 수 있다.
또한, 상기 고정부는 비다공성(non-porosity)이거나 또는 기공의 평균 크기가 0.001 내지 1㎛일 수 있다.
또한, 상기 반응용액의 확산속도가 상기 고정부에서 보다 상기 볼록부에서 더 큰 것일 수 있다.
또한, 상기 볼록부가 친수성인 것일 수 있다.
또한, 상기 볼록부가 상기 반응영역을 포함하는 것일 수 있다.
또한, 상기 비색 검출 장치는 상기 다공성 박막의 볼록부가 상기 볼록부의 삽입 방향과 수직방향으로 상기 제1 반응용액 관통구를 형성하는 표면과 접하여 형성된 계면을 포함하는 것일 수 있다.
또한, 상기 박막이 폴리에테르술폰, 니트로셀룰로스, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리에틸렌테레프탈레이트, 폴리부틸렌테레프탈레이트, 폴리에틸렌나프탈레이트, 폴리에스터, 폴리아크릴레이트, 폴리카보네이트, 폴리아릴레이트, 폴리이미드, 폴리아미드, 폴리테트라플루오로에틸렌, 나일론 및 셀룰로오스로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다.
또한, 상기 볼록부의 높이(단차)는 상기 고정부를 기준으로 40 내지 170㎛일 수 있다.
또한, 상기 하판, 중간판 및 상판이 각각 독립적으로 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리에틸렌테레프탈레이트, 폴리부틸렌테레프탈레이트, 폴리에틸렌나프탈레이트, 폴리에스터, 폴리아크릴레이트, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에테르술폰, 폴리카보네이트, 폴리아릴레이트, 폴리이미드, 폴리아미드, 유리, 폴리에텔에텔 케톤 및 폴리스티렌로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
또한, 상기 반응용액이 디옥시뉴클레오티드트리포스페이트(deoxy-nucleotide tri-phosphate, dNTP), 에리오크롬 블랙 T(Eriochrome black t), 황산마그네슘(MgSO4), 주형 디옥시리보핵산 (template DNA), Bst DNA 중합효소, 올리고뉴클레오티드 프라이머(oligonucleotide primer), 트리스 버퍼 (Tris-HCl buffer), 황산 암모늄 ((NH4)2SO4), 염화칼륨 (KCl) 및 트윈계 계면활성제 (Tween®　20)를 포함하는 것일 수 있다.
또한, 상기 제2 반응용액 관통구가 상기 제1 반응용액 관통구의 일단부와 대응하는 위치에 형성될 수 있다.
또한, 상기 상판은 제1 반응용액 관통구의 타단부와 대응하는 위치에 공기의 출입 또는 상기 반응용액의 배출을 위한 관통구를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 상기 상판의 상기 제2 반응용액 관통구는 상부 직경이 하부 직경보다 큰 깔대기 형상일 수 있다.
본 발명의 또 하나의 양상은, 상기와 같은 비색 검출 장치; 및 상기 비색 검출 장치를 투과하는 광자수를 측정하는 CMOS 이미지 센서를 포함하는 비색 검출 시스템에 관한 것이다.
본 발명의 또 하나의 양상은, (a) 하판과 제1 반응용액 관통구를 포함하는 중간판 사이에 다공성 박막을 위치시켜 하판/다공성 박막/중간판을 준비하는 단계; (b) 상기 하판/다공성 박막/중간판을 가압함으로써 다공성 박막을 엠보싱하여 상기 제1 반응용액 관통구에 삽입된 블록부와, 상기 하판과 중간판 사이에 위치한 고정부를 포함하는 패턴된 다공성 박막을 갖는 하판/패턴된 다공성 박막/중간판을 제조하는 단계; 및 (c) 상기 하판/패턴된 다공성 박막/중간판의 중간판 상에 제2 반응용액 관통구를 포함하는 상판을 위치시키고 접합시켜 하판/패턴화된 다공성 박막/중간판/상판을 제조하는 단계;를 포함하는 비색 검출 장치의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 구현예에 따른 비색 검출 장치의 제조방법에 있어서, 상기 단계 (b)의 가압이 800 내지 1,400MPa의 압력으로 수행될 수 있다.
또한, 상기 단계 (c)의 접합이 열융착(thermal bonding)으로 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 비색 검출 장치는, 마그네슘 이온 및 비색 검출을 위한 인지자의 농도를 최적화한 LAMP 용액을 이용하여 병원균의 핵산 농도에 비례한 색 변화를 검지하여 병원균의 정량적 비색 검출이 가능하여, 핵산의 증폭과 검출이 동시에 수행 가능하며, 종래에 기본적으로 사용하던 PCR tube에서의 반응보다 더 높은 민감도를 이루는 효과가 있다.
또한 본 발명에 따른 비색 검출 장치는, COMS(Complementary metal-oxide-semiconductor) 이미지 센서 시스템과 결합하여 사용함으로써 정량적인 핵산 분석이 가능한 효과가 있다.
도 1a는 본 발명의 일 구현예에 따른 비색 검출 장치의 정단면도이고, 도 1b는 도 1a에 따른 비색 검출 장치의 분해사시도이다.
도 2a는 종래에 사용되는 PCR tube에서의 반응을 설명하기 위한 도면이고, 도 2b는 본 발명에 따른 비색 검출 장치에서의 반응을 설명하기 위한 도면이다.
도 3은 EBT를 이용한 비색 검출 원리를 설명하기 위한 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 구현예에 따른 비색 검출 시스템을 간략히 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명에 따른 비색 검출 장치의 제조방법을 설명하기 위한 모식적 도면이다.
도 6a는 압력에 따른 엠보싱의 단차를 도시한 그래프이고, 도 5b는 그에 대한 LSM(Laser scanning microscopy) 이미지이다.
도 7은 압착 압력에 따른 누수 프로파일 사진이다.
도 8a는 종래 기술에 따른 tube와 본 발명에 따른 비색 검출 장치에서의 반응 전후 색 사진이고, 도 8b는 tube에서의 DNA 농도별 시간대 별 색이고, 도 8c는 본 발명에 따른 비색 검출 장치에서의 DNA 농도별 시간대 별 색이고, 도 8d는 전기영동 결과 사진이다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예를 상세히 설명하도록 한다.
그러나, 이하의 설명은 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
또한, 이하에서 사용될 제1, 제2 등과 같이 서수를 포함하는 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되지는 않는다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소도 제1 구성요소로 명명될 수 있다
또한, 어떤 구성요소가 다른 구성요소 상에 "형성되어" 있다거나 "적층되어" 있다고 언급된 때에는, 그 다른 구성요소의 표면 상의 전면 또는 일면에 직접 부착되어 형성되어 있거나 적층되어 있을 수도 있지만, 중간에 다른 구성요소가 더 존재할 수도 있다고 이해되어야 할 것이다.
이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명하기로 한다. 다만, 이는 예시로서 제시되는 것으로, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않으며 본 발명은 후술할 청구범위의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
도 1a는 본 발명에 따른 비색 검출 장치의 정단면도이고, 도 1b는 도 1a에 따른 비색 검출 장치의 분해사시도이다.
도 1a 및 1b를 참조하면, 본 발명에 따른 비색 검출 장치(100)는 하판(110), 상기 하판(110) 상에 위치하고, 비색 검출용액인 반응용액이 반응하는 반응영역을 포함하는 박막(120), 상기 박막(120) 상에 위치하고, 상기 반응용액이 상기 반응영역으로 유입되도록 제1 반응용액 관통구(131)를 포함하는 중간판(130) 및 상기 중간판(130) 상에 위치하고, 상기 반응영역으로 유입되는 반응용액이 통과하는 제2 반응용액 관통구(141)를 포함하는 상판(140)을 포함한다,
본 발명의 일 구현예에 따른 비색 검출 장치(100)에 있어서, 상기 박막(120)은 상기 제1 반응용액 관통구(130)로 삽입된 볼록부(121)와, 상기 하판(110)과 상기 중간판(130) 사이에 위치한 고정부(122)를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 볼록부(121)는 다공성일 수 있다. 이에 의하여 용액의 수송이 볼록부(121)의 모세관력을 이용하여 수행되기 때문에 종래에 사용되는 PCR tube에서의 반응보다 더 높은 민감도를 이룰 수 있게 된다.
도 2a는 종래에 사용되는 PCR tube에서의 반응을 설명하기 위한 도면이고, 도 2b는 본 발명에 따른 비색 검출 장치(100)에서의 반응을 설명하기 위한 도면이다.
도 2a 및 2b를 참조하면, 본 발명에 따른 비색 검출 장치(100)에서의 반응이 tube에서의 반응에 비해 빠른 이유로 같은 농도의 물질이 들어갈지라도 박막(120)의 다공성 구조에 들어감에 따라, 반응에 필요한 요소간의 물리적 거리가 가까워지는 걸 들 수 있다. 필요한 요소들의 거리가 가까워짐에 따라, 반응의 빈도수가 높아지며, 이는 증폭의 속도가 빨라짐을 의미한다. 또한 비록 낮은 DNA 농도일지라도, 다공성 구조 안에 들어가면서, 구조 안에서의 DNA농도가 높아져 낮은 농도의 DNA를 검출 가능해진다.
본 발명에 있어서, 상기 반응용액은 디옥시뉴클레오티드트리포스페이트(deoxy-nucleotide tri-phosphate, dNTP), 에리오크롬 블랙 T(Eriochrome black t), 황산마그네슘(MgSO4), 주형 디옥시리보핵산 (template DNA), Bst DNA 중합효소, 올리고뉴클레오티드 프라이머(oligonucleotide primer), 트리스 버퍼 (Tris-HCl buffer), 황산 암모늄 ((NH4)2SO4), 염화칼륨 (KCl) 및 트윈계 계면활성제 (Tween®　20)를 포함할 수 있다.
또한, 상기 볼록부(121)의 기공의 평균 크기는 0.1 내지 100㎛, 보다 바람직하게는 1 내지 10㎛일 수 있다. 기공의 크기가 0.1㎛ 미만이면 상기 반응용액의 요소들이 여과되어 바람직하지 않고, 100㎛를 초과하면 용액수송에 불충분한 모세관력 및 불완전한 엠보싱 공정 때문에 바람직하지 않다. 이때, 상기 고정부(122)는 비다공성(non-porosity)이거나 또는 기공의 평균 크기가 0.001 내지 1㎛일 수 있다.
본 발명에 있어서, 반응용액의 확산속도는 고정부(122)에서 보다 볼록부(121)에서 더 클 수 있다. 또한 반응용액이 볼록부(121)에서 확산되고 고정부(122)에서 확산되지 않을 수 있다. 여기에서, 상기 볼록부(121)의 높이(h)는 고정부(122)를 기준으로 40 내지 170㎛일 수 있다. 상기 높이(h)가 40㎛ 미만이면 불완전한 엠보싱 공정으로 인한 누수로 인하여 바람직하지 않고 170㎛를 초과하면 용액주입 후 상기 볼록부의 불투명성 때문에 바람직하지 않다.
본 발명에 따른 비색 검출 장치(100) 있어서, 상기 볼록부(121)는 친수성일 수 있다. 이때 볼록부(121)는 반응영역을 포함할 수 있다. 또한, 상기 다공성 박막(120)의 볼록부(121)가 볼록부(121)의 삽입 방향과 수직방향으로 상기 제1 반응용액 관통구(131)를 형성하는 표면과 접하여 형성된 계면을 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 박막(120)은 폴리에테르술폰, 니트로셀룰로스, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리에틸렌테레프탈레이트, 폴리부틸렌테레프탈레이트, 폴리에틸렌나프탈레이트, 폴리에스터, 폴리아크릴레이트, 폴리카보네이트, 폴리아릴레이트, 폴리이미드, 폴리아미드, 폴리테트라플루오로에틸렌, 나일론 및 셀룰로오스로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 하판(110), 중간판(130) 및 상판(140)은 각각 독립적으로 광투과성 물질로 이루어질 수 있다. 여기에서, 상기 하판(110), 중간판(130) 및 상판(140)은 각각 독립적으로 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리에틸렌테레프탈레이트, 폴리부틸렌테레프탈레이트, 폴리에틸렌나프탈레이트, 폴리에스터, 폴리아크릴레이트, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에테르술폰, 폴리카보네이트, 폴리아릴레이트, 폴리이미드, 폴리아미드, 유리, 폴리에텔에텔 케톤 및 폴리스티렌로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 상판(140)에는 제2 반응용액 관통구(142)가 상기 제1 반응용액 관통구(131)의 일단부와 대응하는 위치에 형성될 수 있다. 또한, 상기 상판(140)은 제1 반응용액 관통구(131)의 타단부와 대응하는 위치에 공기의 출입 또는 상기 반응용액의 배출을 위한 관통구(142)를 추가로 포함할 수 있다. 이때. 상기 상판(140)의 상기 제2 반응용액 관통구(141)는 상부 직경이 하부 직경보다 큰 깔대기 형상일 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 비색 검출 장치(100)는 고리-매개 등온증폭법(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)에 적용될 수 있다. 본 발명에서의 비색 검출 시약은 루프-매개 증폭법의 부산물인 피로인산과 용액 내의 마그네슘 이온이 만나 불용성 침전물 형성으로 인한 용액 내의 마그네슘 이온의 감소를 비색적으로 검출이 가능하다.
특히 본 발명에 따르면, 마그네슘 이온 및 비색 검출을 위한 인지자의 농도를 최적화한 LAMP 용액을 이용하여 병원균의 핵산 농도에 비례한 색 변화를 검지하여 병원균의 정량적 비색 검출이 가능하여, 핵산의 증폭과 검출이 동시에 수행 가능한 효과가 있다.
본 발명에 있어서, 상기 비색 검출 시약으로는 Eriochrome black T(EBT)를 사용할 수 있다. 도 3은 EBT를 이용한 비색 검출 원리를 설명하기 위한 도면이다. 도 3을 참조하면, 반응 전 마그네슘 이온과 결합하여 보라색을 띠는 Mg-EBT 결합물은 고리-매개 등온증폭법의 부산물인 피로인산(Pyrophosphate)이 생성됨에 따라 Mg-EBT 결합물의 결합을 끊고 마그네슘과 불용성 침전물을 형성되며 동시에 하늘색을 띠는 유리 EBT가 생성된다. 본 비색 검출 시약은 고리-매개 등온증폭법에 의하여 증폭이 되면 하늘색을 증폭이 되지 않는 다면 보라색을 띠어 증폭의 유무를 확인 가능하다.
본 발명의 또 하나의 양상은 상기와 같은 본 발명에 따른 비색 검출 장치를 포함하는 비색 검출 시스템에 관한 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 비색 검출 시스템을 개략적으로 나타낸 도면이다. 도 4를 참조하면 본 발명에 따른 비색 검출 시스템(1)은 비색 검출 장치(100) 및 상기 비색 검출 장치(100)를 투과하는 광자수를 측정하는 CMOS 이미지 센서(CIS, CMOS Image Sensor, 5)를 포함한다.
상기 CMOS 이미지 센서(5)는 광신호를 검출하여 디지털 전기 신호로 변환하는 센서로서, 구동 방식이 간편하고 다양한 스캐닝(scanning) 방식으로 구현할 수 있으며 신호 처리 회로를 단일칩에 집적할 수 있어 제품의 소형화가 가능하다. 또한 CMOS 공정 기술을 호환하여 사용할 수 있어 제조 단가를 낮출 수 있으며, 전력 소모 또한 매우 낮아 배터리 용량이 제한적인 제품에도 적용이 용이하다. 도 4에서 화살표는 빛의 방향을 의미한다. 이때 상기 CMOS 이미지 센서(5)는 스마트폰 및 카메라로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상에 장착될 수 있다.
본 발명의 또 하나의 양상은, 상기와 같은 비색 검출 장치의 제조방법에 관한 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 비색 검출 장치의 제조방법을 설명하기 위한 도면이다. 도 5를 참조하면, 본 발명에 따른 비색 검출 장치의 제조방법은 (a) 하판과 제1 반응용액 관통구를 포함하는 중간판 사이에 다공성 박막을 위치시켜 하판/다공성 박막/중간판을 준비하는 단계; (b) 상기 하판/다공성 박막/중간판을 가압함으로써 다공성 박막을 엠보싱하여 상기 제1 반응용액 관통구에 삽입된 블록부와, 상기 하판과 중간판 사이에 위치한 고정부를 포함하는 패턴된 다공성 박막을 갖는 하판/패턴된 다공성 박막/중간판을 제조하는 단계; 및 (c) 상기 하판/패턴된 다공성 박막/중간판의 중간판 상에 제2 반응용액 관통구를 포함하는 상판을 위치시키고 접합시켜 하판/패턴화된 다공성 박막/중간판/상판을 제조하는 단계;를 포함한다.하는 비색 검출 장치의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 구현예에 따른 비색 검출 장치의 제조방법에 있어서, 상기 단계 (b)의 가압이 800 내지 1,400MPa의 압력으로 수행될 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 단계 (c)의 접합이 열융착(thermal bonding)으로 수행될 수 있다. 이때, 하판/패턴된 다공성 박막/중간판을 열융착한 후, 상판을 올려놓고 추가로 열융착하여 제조할 수도 있다.
이하에서는 본 발명을 실시예를 들어 더욱 상세하게 설명하도록 한다. 그러나 이는 예시를 위한 것으로서 이에 의하여 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
제조예 1: DNA 스탠다드의 제조
Purified DNA standards가 LAMP assays를 위하여 제조되었다. 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus, S. aureus, ATCC 33591)이 배양되었고, 상기 DNA는 HiGene Genomic DNA Prep Kit (BIOFACT, Korea)를 사용하여 추출되었다. NanoDrop 2000 spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, USA)가 DNA 농도를 결정하기 위하여 사용되었다. S. aureus를 증폭하고자 하는 목표 gene으로 타게팅하여 6개의 oligonucleotide primers가 LAMP designer software(Optigen, Horsham, UK)를 사용하여 디자인되었다; forward inner primer (FIP), 5'-TAACCGTATCACCATCAATCGAGTATACAGTGCAA CTTCAACT-3'; backward inner primer (BIP), 5'-GTCAAACAATGACATTCAGACTG GACCATATTTCTCTACACCTTT-3'; forward outer primer (FP), 5'-AGAAGTGATTCTGAAGATCCAAC-3'; backward outer primer (BP), 5'-TATCAGTTCTTTGACCTTTGTCA-3'; loop forward primer (LF), 5'-TTAATTAATGTCGCAGGTTCTT-3'; loop backward primer (LB), 5'-GATACACCTGAAACAAAGCATC-3' (Genotech Corp., Daejeon, SouthKorea).
제조예 2 : 비색 검출 용액의 제조
비색 검출 용액인 반응용액의 최종 부피를 25μL로 목표하였고, 제조예 1의 forward inner primer(FIP), backward inner primer (BIP), forward outer primer(FP), backward outer primer(BP), loop forward primer(LF), loop backward primer(LB)를 사용하여 비색 검출 용액을 다음과 같이 제조하였다. 10 x isothermal amplification buffer(New England BioLabs, USA), 2.5 mM MgSO4(Sigma-Aldrich, USA), 1.4 mM dNTP(New England BioLabs, USA), 0.2μM FP, 0.2μM BP, 1.6μM FIP, 1.6μM BIP, 0.4μM LF, 0.4 μM LB, Bst 2.0 DNA polymerase(New England BioLabs)를 최종 부피의 8 U, 240μM eriochrome black T(EBT) (Sigma-Aldrich, USA) 및 S. aureus DNA template를 포함하는 비색 검출 용액 25μL를 제조하였다.
실시예 1
도 1a 및 도 1b를 참고하여 설명하면, 각각 가로 20 mm, 세로 20 mm, 두께 2mm 인 상판, 중간판, 하판 총 3 종류의 메틸메타크릴레이트(PMMA) 틀을 Computerized numerical control(COMCON CM-3525) 절삭 기계를 이용하여 가공하였다. 상판에는 용액의 주입 시의 편리함을 위하여 깔때기 모양의 제2 반응용액 관통구(상부 직경: 5 mm, 하부 직경: 3mm)과, 용액의 주입 후 용액의 전달을 위하여, 관통구(직경: 1 mm)을 가공하였다. 또한 중간판에는 3 mm x 8.5 mm의 관통구를 가공하였다.
이어서 중간판과 하판 사이에 가로 20 mm, 세로 20 mm인 다공성 폴리에테르술폰 멤브레인을 샌드위치 모양으로 적층하고 상온에서 340MPa의 압력으로 3분동안 가압하여 엠보싱 하였다. 이때 다공성 PES 멤브레인은 기공 직경이 5.0 ㎛인 것을 사용하였다.
그 다음, 100℃에서 25분 동안 57 MPa의 압력으로 열융착하여 폴리에테르술폰 멤브레인을 중간판과 하판을 이용하여 밀봉하였다. 그 뒤, 다시 상판을 상기와 같이 조립된 조립체의 중간판 상에 올려 놓고 상기와 동일한 조건으로 열융착하여 최종적으로 비색 검출 장치를 제조하였다.
실시예 2
중간판과 하판 사이에 폴리에테르술폰 멤브레인을 적층하고 340MPa의 압력으로 가압하여 엠보싱한 것 대신에 중간판과 하판 사이에 폴리에테르술폰 멤브레인을 적층하고 510MPa의 압력으로 가압한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 비색 검출 장치를 각각 제조하였다.
실시예 3
중간판과 하판 사이에 폴리에테르술폰 멤브레인을 적층하고 340MPa의 압력으로 가압하여 엠보싱한 것 대신에 중간판과 하판 사이에 폴리에테르술폰 멤브레인을 적층하고 680MPa의 압력으로 가압한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 비색 검출 장치를 각각 제조하였다.
실시예 4
중간판과 하판 사이에 폴리에테르술폰 멤브레인을 적층하고 340MPa의 압력으로 가압하여 엠보싱한 것 대신에 중간판과 하판 사이에 폴리에테르술폰 멤브레인을 적층하고 850MPa의 압력으로 가압한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 비색 검출 장치를 각각 제조하였다.
실시예 5
중간판과 하판 사이에 폴리에테르술폰 멤브레인을 적층하고 340MPa의 압력으로 가압하여 엠보싱한 것 대신에 중간판과 하판 사이에 폴리에테르술폰 멤브레인을 적층하고 1020MPa의 압력으로 가압한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 비색 검출 장치를 각각 제조하였다.
실시예 6
중간판과 하판 사이에 폴리에테르술폰 멤브레인을 적층하고 340MPa의 압력으로 가압하여 엠보싱한 것 대신에 중간판과 하판 사이에 폴리에테르술폰 멤브레인을 적층하고 1190MPa의 압력으로 가압한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 비색 검출 장치를 각각 제조하였다.
실시예 7
중간판과 하판 사이에 폴리에테르술폰 멤브레인을 적층하고 340MPa의 압력으로 가압하여 엠보싱한 것 대신에 중간판과 하판 사이에 폴리에테르술폰 멤브레인을 적층하고 1360 MPa의 압력으로 가압한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 비색 검출 장치를 각각 제조하였다.
시험예 1: 비색 검출 장치의 누수 시험
340, 510, 680, 850, 1020, 1190 및 1360 MPa의 압력으로 상온에서 3분간 압착한 실시예 1 내지 7의 폴리에테르설폰 멤브레인인 다공성 박막의 볼록부의 엠보싱의 단차를 Laser scanning microscopy(OLYMPUS)를 사용하여 측정하였다(도 6a 및 도 6b). 이때 다공성 PES 멤브레인은 기공 직경이 5.0 ㎛인 것을 사용하였다.
850 MPa 이상의 엠보싱 압력에서 단차에 많은 영향이 있었다. 또한 850 MPa의 엠보싱 압력이 엠보싱된 영역에서 기공을 전혀 손상시키지 않고 기준면과 비교하여 단차를 확보하는데 충분함을 확인할 수 있었다.
한편 도 7은 각각의 압착 압력에 따른 누수 프로파일 사진이다. 1020 MPa 이상의 압력에서 누수가 방지됨을 확인할 수 있었다.
시험예 2: 본 발명에 따른 비색 검출 장치에서의 비색 분석
제조예 2의 비색 검출 용액을 실시예 1의 비색 검출 장치에 주입한 뒤, PCR tape로 상판을 밀봉시킨 후 63℃의 oven에 1시간 동안 넣은 뒤, 83℃의 oven에 5분 동안 넣어 비활성화 시켰다.
종래 기술에 따른 tube와 본 발명에 따른 비색 검출 장치에서의 반응 전, 후 반응용액의 색 변화를 관찰하여 도 8a에 도시하였다. 또한 종래 기술에 따른 tube와 본 발명에 따른 비색 검출 장치에서의 매 15분 마다 컬러 이미지를 추출하여 각각 도 8b 및 도 8c에 도시하였다. 이를 통하여 본 발명에 따른 비색 검출 장치에서의 반응이 종래 기술에 따른 tube에서의 반응보다 더 빠르며, 더 낮은 농도의 DNA를 비색법으로 검출 가능함을 확인할 수 있었다.
또한 추가적으로 검증하기 위하여 전기영동을 하였으며(도 8d), 비색법과 동일한 결과를 얻을 수 있었다. 도 8d에서, Lane 1,6은 100 pg/㎕, Lane 2,7은 1 pg/㎕, Lane 3,8은 10 fg/㎕, Lane 4,9은 1 fg/㎕, Lane 5, 10은 Negative control이며, Lane M은 100 bp DNA ladder를 도시한다.
이상에서 본 발명의 바람직한 구현예들에 대하여 설명하였으나, 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서, 구성 요소의 부가, 변경, 삭제 또는 추가 등에 의해 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있을 것이며, 이 또한 본 발명의 권리범위 내에 포함된다고 할 것이다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
5 : CMOS 이미지 센서
100: 비색 검출 장치
110 : 하판
120 : 다공성 박막
121 : 볼록부
122 : 고정부
130 : 중간판
131 : 제1 반응용액 관통구
140 : 상판
141 : 제2 반응용액 관통구
142 : 관통구

Claims (20)

  1. 하판;
    상기 하판 상에 위치하고, 반응용액이 반응하는 반응영역을 포함하는 박막;
    상기 박막 상에 위치하고, 상기 반응용액이 상기 반응영역으로 유입되도록 제1 반응용액 관통구를 포함하는 중간판; 및
    상기 중간판 상에 위치하고, 상기 반응영역으로 유입되는 반응용액이 통과하는 제2 반응용액 관통구를 포함하는 상판;을 포함하고,
    상기 박막은 상기 제1 반응용액 관통구로 삽입된 볼록부와, 상기 하판과 상기 중간판 사이에 위치한 고정부를 포함하고,
    상기 볼록부가 다공성이고,
    상기 제2 반응용액 관통구가 상기 제1 반응용액 관통구의 일단부와 대응하는 위치에 형성되고,
    상기 상판은 제1 반응용액 관통구의 타단부와 대응하는 위치에 공기의 출입 또는 상기 반응용액의 배출을 위한 관통구를 포함하는 것인 비색 검출 장치.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 볼록부는 기공의 평균 크기가 0.1 내지 100㎛인 것을 특징으로 하는 비색 검출 장치.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 고정부는 비다공성(non-porosity)이거나 또는 기공의 평균 크기가 0.001 내지 1㎛인 것을 특징으로 하는 비색 검출 장치.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 반응용액의 확산속도가 상기 고정부에서 보다 상기 볼록부에서 더 큰 것을 특징으로 하는 비색 검출 장치.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 볼록부가 친수성인 것을 특징으로 하는 비색 검출 장치.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 볼록부가 상기 반응영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 비색 검출 장치.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 비색 검출장치는 상기 박막의 볼록부가 상기 볼록부의 삽입 방향과 수직방향으로 상기 제1 반응용액 관통구를 형성하는 표면과 접하여 형성된 계면을 포함하는 것을 특징으로 하는 비색 검출장치.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 박막이 폴리에테르술폰, 니트로셀룰로스, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리에틸렌테레프탈레이트, 폴리부틸렌테레프탈레이트, 폴리에틸렌나프탈레이트, 폴리에스터, 폴리아크릴레이트, 폴리카보네이트, 폴리아릴레이트, 폴리이미드, 폴리아미드, 폴리테트라플루오로에틸렌, 나일론 및 셀룰로오스로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 비색 검출장치.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 볼록부의 높이(단차)는 상기 고정부를 기준으로 40 내지 170㎛인 것을 특징으로 하는 비색 검출 장치.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 하판, 중간판 및 상판이 각각 독립적으로 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리에틸렌테레프탈레이트, 폴리부틸렌테레프탈레이트, 폴리에틸렌나프탈레이트, 폴리에스터, 폴리아크릴레이트, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에테르술폰, 폴리카보네이트, 폴리아릴레이트, 폴리이미드, 폴리아미드, 유리, 폴리에텔에텔 케톤 및 폴리스티렌으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 비색 검출장치.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 반응용액이 디옥시뉴클레오티드트리포스페이트(deoxy-nucleotide tri-phosphate, dNTP), 에리오크롬 블랙 T(Eriochrome black t), 황산마그네슘(MgSO4), 주형 디옥시리보핵산 (template DNA), Bst DNA 중합효소, 올리고뉴클레오티드 프라이머(oligonucleotide primer), 트리스 버퍼 (Tris-HCl buffer), 황산 암모늄 ((NH4)2SO4), 염화칼륨 (KCl) 및 트윈계 계면활성제 (Tween®　20)를 포함하는 것을 특징으로 하는 비색 검출 장치.
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 제1항에 있어서,
    상기 상판의 상기 제2 반응용액 관통구는 상부 직경이 하부 직경보다 큰 깔대기 형상인 것을 특징으로 하는 비색 검출 장치.
  17. 제1항에 따른 비색 검출장치; 및
    상기 비색 검출장치를 투과하는 광자수를 측정하는 CMOS 이미지 센서를 포함하는 비색 검출시스템.
  18. (a) 하판과 제1 반응용액 관통구를 포함하는 중간판 사이에 다공성 박막을 위치시켜 하판/다공성 박막/중간판을 준비하는 단계;
    (b) 상기 하판/다공성 박막/중간판을 가압함으로써 다공성 박막을 엠보싱하여 상기 제1 반응용액 관통구에 삽입된 볼록부와, 상기 하판과 중간판 사이에 위치한 고정부를 포함하는 패턴된 다공성 박막을 갖는 하판/패턴된 다공성 박막/중간판을 제조하는 단계; 및
    (c) 상기 하판/패턴된 다공성 박막/중간판의 중간판 상에 제2 반응용액 관통구를 포함하는 상판을 위치시키고 접합시켜 하판/패턴화된 다공성 박막/중간판/상판을 제조하는 단계;를 포함하고,
    상기 제2 반응용액 관통구가 상기 제1 반응용액 관통구의 일단부와 대응하는 위치에 형성되고,
    상기 상판은 제1 반응용액 관통구의 타단부와 대응하는 위치에 공기의 출입 또는 상기 반응용액의 배출을 위한 관통구를 포함하는 것인 비색 검출 장치의 제조방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 단계 (b)의 가압이 800 내지 1,400MPa의 압력으로 수행되는 것을 특징으로 하는 비색 검출 장치의 제조방법.
  20. 제18항에 있어서,
    상기 단계 (c)의 접합이 열융착으로 수행되는 것을 특징으로 하는 종이기반 비색 검출 장치의 제조방법.
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