KR102078820B1 - 이온성 이황화물과 이로 가교된 양쪽성 고분자로 구성된 환원응답성 마이크로스피어 - Google Patents

Abstract

본 발명은 양쪽성 고분자가 이온성 이황화물에 의해 정전기적 인력으로 가교되어 형성된 환원응답성 마이크로스피어에 관한 것이다. 본 발명은 마이크로스피어의 양쪽성 고분자들이 이온성 이황화물에 의해서 정전기적 인력으로 가교되어 있기 때문에 비환원매질에서는 탑재된 내용물을 비교적 적게 방출하고, 환원매질에서는 탑재된 내용물의 방출이 촉진되는 효과가 발휘된다.

Description

이온성 이황화물과 이로 가교된 양쪽성 고분자로 구성된 환원응답성 마이크로스피어 {Reduction-responsive microsphere composed of ionic disulfide and ionic disulfide-crosslinked amphoteric polymer}

본 발명은 양쪽성 고분자(amphoteric polymer)가 이온성 이황화물(ionic disulfide compound)에 의해 정전기적 인력으로 가교되어 형성된 환원응답성 마이크로스피어(reduction-responsive microsphere)에 관한 것이다.

1950년대에는 분석기기가 발달되지 않아서 혈중약물농도를 정확하게 파악할 수 없었다. 그 후 분광법, HPLC, ELISA 등 분석기법이 발달함에 따라, 시간 경과에 따른 혈중약물농도를 연구하는 약물동태학(pharmacokinetics)이 발달하였으며 약물농도와 약물효능의 상관관계를 밝히는 약역학(pharmacodynamics)도 활발히 연구되었다[Ambrose, P. G., Bhavnani, S. M., Rubino, C. M., Louie, A., Gumbo, T., Forrest, A., & Drusano, G. L. (2007). Pharmacokinetics-pharmacodynamics of antimicrobial therapy: it's not just for mice anymore. Clinical Infectious Diseases, 44(1), 79-86.].

이로 인하여 시간 경과에 따른 혈중 약물농도를 조절하여 약효를 극대화하고자 하는 연구가 시도 되었고, 이를 목적으로 약물 송달학이 발달하여 이를 실체화한 약물전달시스템(Drug Delivery System)이 개발되었다. 초기 개발된 약물전달시스템은 주로 0차방출의 특성을 지닌 것으로, 시간 경과에 따라 약물의 방출속도를 장기간 일정하게 유지시킴으로써, 혈중약물농도를 장기간 일정하게 유지하려는 목적이었다.

이와 같은 0차방출 특성을 보이는 서방형 약물전달시스템은 현재도 널리 상용화되어있다. 서방형 약물전달체는 특정 약물의 약효를 지속시키는 지효성을 나타내기는 하지만, 약물의 부작용 및 독성을 감소시키면서 약효를 극대화하는 효과는 발휘하지 못한다. 상기와 같은 단점을 극복하기 위하여 특이한 병리현상(내부자극) 또는 외부자극에 대해 필요할 때만 약물 방출이 촉진되는 자극응답성 약물전달시스템에 대한 관심이 높아지고 있다. 온도가 체온 이상으로 상승하면 약물을 방출하는 온도응답성 약물전달체, pH값에 따라 약물을 방출하는 pH응답성 약물전달체, 및 빛이 조사되면 약물을 방출하는 광응답성 약물전달체가 대표적인 자극응답성 약물전달체라고 할 수 있다[Mura, S., Nicolas, J., & Couvreur, P. (2013). Stimuli-responsive nanocarriers for drug delivery. Nature materials, 12(11), 991.].

온도응답성 약물전달체는 정상세포보다 온도가 2~3℃ 높은 종양조직에서만 항암제를 방출시키거나, 종양조직을 레이저 등으로 가열하여 종양조직에서만 항암제를 방출시키는 항암제 전달체로 사용될 수 있다. pH응답성 약물전달체는 정상세포보다 pH값이 낮은 종양조직에서만 항암제를 방출시키거나, 세포내부의 산성을 띠는 endosome에서 약물전달체가 파괴되어 세포내부에서만 약물을 방출시키는 약물전달체로 사용될 수 있다[Schmaljohann, D. (2006). Thermo-and pH-responsive polymers in drug delivery. Advanced drug delivery reviews, 58(15), 1655-1670.]. 광응답성 약물전달체는 병소부위에 광을 조사하면 조사부위에서만 약물을 방출시키는 약물전달체로 사용될 수 있다[Alvarez-Lorenzo, C., Bromberg, L., & Concheiro, A. (2009). Light-sensitive intelligent drug delivery systems. Photochemistry and photobiology, 85(4), 848-860.].

한편, 세포내부는 세포외부보다 글루타치온의 농도가 높아서 환원력이 더 높은 것으로 알려져 있다[Cheng, R., Feng, F., Meng, F., Deng, C., Feijen, J., & Zhong, Z. (2011). Glutathione-responsive nano-vehicles as a promising platform for targeted intracellular drug and gene delivery. Journal of controlled release, 152(1), 2-12.]. 이는 피부 외용제나 화장품의 유효성분을 효율적으로 전달하기 위해 고려될 수 있는 사항이다. 이에 따라, 세포내부로 약물을 효율적으로 전달하기 위해 환원응답성 약물전달시스템의 개발에 대한 관심이 높아지고 있다.

한국등록특허 제10-1547634호(2015.08.20.)는 약물 전달용 환원성 폴리뉴클레오타이드 고분자 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 뉴클레오타이드를 이용하여 합성된 환원성 고분자 및 이의 제조방법과, 이를 포함하는 약물 전달용 고분자 조성물을 제공한다. 뉴클레오타이드를 이용하여 다이설파이드 결합으로 잘 깨어지게 만든 환원성 고분자를 합성하여 (-)전하 고분자를 얻은 후, 이를 (+)전하 단백질이나 펩타이드와 결합시켜 정전기적 인력에 의해 단백질이나 펩타이드를 표적 부위로 전달하는 약물 전달체로서, 신규 발명된 환원성 고분자를 포함하는 비바이러스성 약물전달체에서 발명된 고분자가 수소이온 완충 활성으로 인해 전달된 약물을 엔도솜에서 세포 내 다른 소기관으로 탈출시킬 수 있는 효과적인 약물 전달체에 대한 것이다. 한국등록특허 제10-1563173호(2015.10.20.)는 pH감응성 고분자와 글루코스 산화 효소가 고정화된 모노올레인 큐빅상 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 글루코스의 농도에 따라, 큐빅상 내부에 포집되어 있는 목적물질의 방출거동을 제어할 수 있는 효과가 발휘되는 점에 특징이 있다.

약물전달시스템으로 주로 사용되고 있는 것은 0차방출 특성을 지닌 서방형 약물전달시스템이다. 이는 특정 약물의 약효를 지속시키는 지효성을 나타내기는 하지만, 약물의 부작용 및 독성을 감소시키면서 약효를 극대화하는 효과는 발휘하지 못한다. 상기와 같은 단점을 극복하기 위하여 특이한 병리현상(내부자극) 또는 외부자극에 대해 필요할 때만 약물 방출이 촉진되는 자극응답성 약물전달시스템을 개발할 필요가 있다.

한편, 피부 외용제나 화장품의 유효성분은 화학적 안정성이 낮기 때문에 장기간 보관할 경우 유효성분의 효능이 발휘되지 못하는 문제점이 있다. 이를 해결하기 위해 유효성분을 환원응답성 마이크로스피어에 봉입하면, 피부 외용제나 화장품을 피부에 도포하기 전에는 마이크로스피어로부터 유효성분이 거의 방출되지 않고, 화학적으로 안정화시킬 수 있어서 장기간 보관에 용이하다. 또한, 이를 피부에 도포하면, 환원응답성 마이크로스피어가 피부와 접촉하게되고, 피부의 생체환원제인 글루타치온에 의해 유효성분이 방출되어 효과를 발휘할 수 있다.

따라서, 본 발명에서는 환원응답성 마이크로스피어를 개발하여 제공하고자 한다.

본 발명은 양쪽성 고분자(amphoteric polymer)가 이온성 이황화물(ionic disulfide compound)에 의해 정전기적 인력으로 가교되어 형성된 환원응답성 마이크로스피어(reduction-responsive microsphere)를 제공한다.

본 발명의 환원응답성 마이크로스피어(reduction-responsive microsphere)에 있어서, 상기 양쪽성 고분자는, 일 예로 알부민(albumin), 젤라틴(gelatin), 글로불린(globulin), 히스톤(histone), 피브린(fibrin), 파라카제인(paracasein) 중 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.

본 발명의 환원응답성 마이크로스피어(reduction-responsive microsphere)에 있어서, 상기 이온성 이황화물은, 일 예로 시스타민(cystamine), 다이싸이오디글리콜릭 산(dithiodiglycolic acid), 다이싸이오디프로피오닉 산(dithiodipropionic acid), 다이싸이오디뷰틸릭 산(dithiodibutyric acid) 및 다이싸이오디아닐린(dithiodianiline) 중 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.

본 발명은 양쪽성 고분자(amphoteric polymer)와 이온성 이황화물(ionic disulfide compound)을 수용성 용매에 용해시켜 수상 혼합액을 제조하는 단계 (a);상기 단계 (a) 후, 상기 수상 혼합액을 오일 및 계면활성제가 첨가되어 있는 유상에 첨가하여 W/O 에멀션(emulsion)을 제조하는 단계 (b); 상기 단계 (b) 후, 상기 W/O 에멀션을 균질화하여 수상 액적(droplet)을 제조하는 단계 (c); 상기 단계 (c) 후, 제조된 수상 액적을 응고시키기 위해 상기 W/O 에멀션을 급냉시키는 단계 (d);를 포함하는 것을 특징으로 하는 환원응답성 마이크로스피어(reduction-responsive microsphere)의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 환원응답성 마이크로스피어(reduction-responsive microsphere)의 제조방법에 있어서, 상기 환원응답성 마이크로스피어의 제조방법은, 바람직하게 상기 단계 (d) 후, 상기 W/O 에멀션 2~6 ℃에서 교반하면서 수상 액적을 고화시키는 단계 (e);를 더 포함하는 것이 좋다. 또한, 더욱 바람직하게 상기 단계 (e) 후, 냉각된 에멀션에 에틸 아세테이트(ethyl acetate)를 첨가한 후, 고화된 마이크로스피어를 분리하는 단계 (f);를 더 포함하는 것이 좋다.

본 발명의 환원응답성 마이크로스피어(reduction-responsive microsphere)의 제조방법에 있어서, 상기 양쪽성 고분자는, 일 예로 알부민(albumin), 젤라틴(gelatin), 글로불린(globulin), 히스톤(histone), 피브린(fibrin), 파라카제인(paracasein) 중 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.

본 발명의 환원응답성 마이크로스피어(reduction-responsive microsphere)의 제조방법에 있어서, 상기 이온성 이황화물은, 일 예로 시스타민(cystamine), 다이싸이오디글리콜릭 산(dithiodiglycolic acid), 다이싸이오디프로피오닉 산(dithiodipropionic acid), 다이싸이오디뷰틸릭 산(dithiodibutyric acid) 및 다이싸이오디아닐린(dithiodianiline) 중 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.

본 발명의 환원응답성 마이크로스피어(reduction-responsive microsphere)의 제조방법에 있어서, 상기 양쪽성 고분자와 이온성 이황화물은, 바람직하게 양쪽성 고분자와 이온성 이황화물이 3:1 ~ 50:1의 무게 비로 혼합되는 것이 좋다.

본 발명의 환원응답성 마이크로스피어(reduction-responsive microsphere)의 제조방법에 있어서, 상기 수상 혼합액은, 바람직하게 양쪽성 고분자와 이온성 이황화물을 합한 농도가 0.1 ~ 20% (w/v)인 것이 좋다.

본 발명은 양쪽성 고분자가 이온성 이황화물에 의해 정전기적 인력으로 가교되어 형성된 환원응답성 마이크로스피어에 관한 것이다. 마이크로스피어의 양쪽성 고분자들이 이온성 이황화물에 의해서 정전기적 인력으로 가교되어 있기 때문에 비환원매질에서는 탑재된 내용물을 비교적 적게 방출하고, 환원매질에서는 탑재된 내용물의 방출이 촉진되는 효과가 발휘된다.

도 1은 환원응답성 방출을 나타내는 마이크로스피어의 모식도이다.
도 2는 일정한 카르복실기/아미노기의 비율(1/2)에서 젤라틴/시스타민 혼합용액(pH4.0~10.0)의 광산란 강도(○) 및 일정한 pH값(pH9.0)에서 젤라틴/시스타민 혼합용액(카르복실기/아미노기의 비율이 1/0, 1/0.5, 1/1, 1/2)의 광산란강도(●)를 측정한 결과이다.
도 3은 대조군 젤라틴 마이크로스피어(a)와 본 발명 젤라틴/시스타민 마이크로스피어(b)의 SEM 현미경 사진이다.
도 4는 대조군 젤라틴 마이크로스피어(a)와 본 발명 젤라틴/시스타민 마이크로스피어(b)의 EDS 스펙트럼을 나타낸다.
도 5는 젤라틴(a), 시스타민(디하이드로클로라이드가 결합되어 있는 염형태)(b), 대조군 젤라틴 마이크로스피어(c) 및 본 발명 젤라틴/시스타민 마이크로스피어(d)의 시차주사열량곡선이다.
도 6은 DTT 농도가 0 mM(●), 2 mM(○) 및 10 mM(▼)일 때 대조군 젤라틴 마이크로스피어(A) 및 본 발명 젤라틴/시스타민 마이크로스피어(B)에 탑재된 염료의 방출 프로파일이다.

본 발명에서는 양쪽성 고분자(amphoteric polymer)가 이온성 이황화물(ionic disulfide compound)에 의해서 정전기적 인력으로 가교되어 형성된 환원응답성 마이크로스피어(reduction-responsive microsphere)를 개발하였다(도 1). 양쪽성 고분자인 젤라틴과 이온성 이황화물인 시스타민(cystamine)은 정전기적 인력으로 가교되어 있기 때문에 마이크로스피어가 환원매질(reductive medium)에 놓이면 시스타민의 이황화결합이 파괴되어 마이크로스피어에 탑재된 내용물의 방출이 촉진되는 특징이 있다.

본 발명의 환원응답성 마이크로스피어는, 양쪽성 고분자(amphoteric polymer)와 이온성 이황화물(ionic disulfide compound)을 수용성 용매에 용해시켜 수상 혼합액을 제조하는 단계 (a); 상기 단계 (a) 후, 상기 수상 혼합액을 오일 및 계면활성제가 첨가되어 있는 유상에 첨가하여 W/O 에멀션(emulsion)을 제조하는 단계 (b); 상기 단계 (b) 후, 상기 W/O 에멀션을 균질화하여 수상 액적(droplet)을 제조하는 단계 (c); 상기 단계 (c) 후, 제조된 수상 액적을 응고시키기 위해 상기 W/O 에멀션을 급냉시키는 단계 (d);를 포함하여 제조하였다. 이때, 바람직하게는 상기 단계 (d) 후, 상기 W/O 에멀션 2~6 ℃에서 교반하면서 수상액적을 고화시키는 단계 (e);를 더 포함하는 것이 좋다. 또한, 더욱 바람직하게는 상기 단계 (e) 후, 냉각된 에멀션에 에틸 아세테이트(ethyl acetate)를 첨가한 후, 고화된 마이크로스피어를 분리하는 단계 (f);를 더 포함하는 것이 좋다.

한편, 상기 양쪽성 고분자는, 바람직하게 알부민(albumin), 젤라틴(gelatin), 글로불린(globulin), 히스톤(histone), 피브린(fibrin), 파라카제인(paracasein) 중 선택되는 어느 하나 이상인 것이 좋다. 또한, 상기 이온성 이황화물은, 바람직하게 시스타민(cystamine), 다이싸이오디글리콜릭 산(dithiodiglycolic acid), 다이싸이오디프로피오닉 산(dithiodipropionic acid), 다이싸이오디뷰틸릭 산(dithiodibutyric acid) 및 다이싸이오디아닐린(dithiodianiline) 중 선택되는 어느 하나 이상인 것이 좋다.

한편, 환원응답성 마이크로스피어의 제조방법에 있어서, 상기 양쪽성 고분자와 이온성 이황화물은, 바람직하게 양쪽성 고분자와 이온성 이황화물이 3:1 ~ 50:1의 무게 비로 혼합되는 것이 좋다. 더욱 바람직하게는, 1:1 ~ 30:1인 것이 좋다. 가장 바람직하게는, 2:1 ~ 20:1인 것이 좋다. 이보다 낮은 비율에서는 양쪽성 고분자의 양이 너무 적어서 마이크로스피어가 형성되지 않고, 이보다 높은 비율에서는 이온성 이황화물의 양이 너무 적어서 환원매질에 따른 방출특성을 나타내기 어렵다.

한편, 환원응답성 마이크로스피어의 제조방법에 있어서, 상기 수상 혼합액은, 바람직하게 양쪽성 고분자와 이온성 이황화물을 합한 농도가 0.1 ~ 20%(w/v)인 것이 좋다. 더욱 바람직하게는 0.2 ~ 10%(w/v)인 것이 좋다. 가장 바람직하게는 0.5 ~ 5%(w/v)인 것이 좋다. 이보다 낮은 농도범위에서는 용질의 양이 너무 적어서 마이크로스피어를 형성하기 어렵고, 이보다 높은 농도범위에서는 용질의 양이 너무 많아서 마이크로나이즈화(micronization)하기 어렵다.

본 발명의 환원 매질에 따른 방출특성을 지닌 환원응답성 마이크로스피어는 피부 외용제나 기능성 화장품의 핵심원료로 사용 가능하다. 환원응답성 마이크로스피어 내부에 유효성분이 탑재되면, 피부 외용제나 화장품을 피부에 도포하기 전에는 마이크로스피어로부터 유효성분이 거의 방출되지 않고, 화학적으로 안정화시킬 수 있어서 장기간 보관에 용이하다.

한편, 세포 내부는 세포 외부보다 글루타치온의 농도가 높아서 환원력이 더 높은 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 환원응답성 마이크로스피어를 피부에 도포하면 이것이 피부와 접촉하게 되고, 세포 내에 도입되면, 생체환원제인 글루타치온에 의해 유효성분이 방출되는 효과를 발휘할 수 있게 된다.

이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 들어 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

[실시예 1 : 젤라틴과 시스타민의 정전기적 인력 관찰]

본 실시예에서는 젤라틴과 시스타민의 정전기적 인력을 관찰하기 위해 광산란강도를 측정하였다.

(1) 젤라틴/시스타민 혼합용액의 제조

젤라틴을 완충액 (pH 4.0-10.0)에 용해시켜 농도가 2 % (w/v)인 젤라틴 용액을 제조하였다. 한편, 시스타민을 완충액(pH 4.0-10.0)에 용해시켜 농도가 0.4 % (w/v) 인 시스타민 용액을 제조 하였다. 젤라틴 용액 1.017ml를 10 ml 바이알에 담겨 있는 시스타민 용액 0.915ml에 첨가하였다. 이때, 시스타민의 아미노기에 대한 젤라틴의 카르복실기의 몰비는 1:2이었고 총 농도(젤라틴 + 시스타민)는 1.2 % (w/v)이었다.

(2) 광산란세기의 측정

젤라틴/시스타민 혼합용액을 Vortex mixer로 30 초간 vortexing 한 후에 상온 (20 ~ 23℃)에서 10 분간 정치시킨 후 dynamic light scattering equipment (Plus 90, Brookheaven instrument, USA)를 이용하여 광산란세기를 측정하였다.

젤라틴과 시스타민의 정전기 착물 형성(electrostatic complexation)에 미치는 카르복실기/아미노기의 몰비의 영향을 조사하기 위해, 가변양의 젤라틴 용액 (2 %(w/v), pH 9.0)을 시스타민 용액 (0.4 % (w/v), pH9.0)과 글리신 완충액 (30 mM, pH 9.0)과 혼합하여 젤라틴의 카르복시기와 시스타민의 아미노기의 몰비가 1:0, 1:0.5, 1:1, 1:2가 되게 하였고 총농도(젤라틴 + 시스타민)는 1.2%(w/v)로 일정하게 유지되게 하였다.

한편, 매질의 pH 값이 pH 4.0, pH 9.0 및 pH 10.0 일 필요가 있는 경우에는 글리신 완충액 (30 mM)을 사용하였고, pH 5.0 및 pH 6.0 일 필요가 있는 경우에는 MES 완충액 (30 mM)을 사용하였고, pH 7.0 및 pH 8.0 일 필요가 있는 경우에는 HEPES 완충액 (30 mM)을 사용하였다.

각각의 젤라틴/시스타민 혼합물 용액의 광산란 강도를 3 회 측정하고 평균하여 실험자료를 아래에 보고하였다.

(3) 관찰 결과

일정한 카르복실기/아미노기의 비율(1/2)에서 젤라틴/시스타민 혼합용액 (pH 4.0 ~ 10.0)의 광산란 강도, 일정한 pH 값(pH9.0)에서 젤라틴/시스타민 혼합용액(카르복실기/아미노기의 비율이 1/0, 1/0.5, 1/1, 1/2)의 광산란 강도를 측정한 결과를 도 2에 나타내었다.

카르복시기와 아미노기의 비율이 일정 할 때, 광 산란 강도는 매질의 pH 값이 4.0에서 9.0으로 증가함에 따라 43.4에서 58.2 Kcps로 증가했다. 젤라틴은 일종의 단백질이며 젤라틴의 등전점 (A 형)은 pH 7.0-9.0으로 알려져있다. 매질의 pH값이 4.0 및 5.0(등전점보다 훨씬 낮음)인 경우, 젤라틴의 순 전하는 강하게 양성되고, 시스타민(양으로 대전된 이황화물)에 거의 정전기적으로 흡착되지 않는다. 즉 시스타민은 젤라틴을 정전기적으로 가교시키지 못한다. 정전기적 상호 인력이 없기 때문에 산성 pH값에서 광산란 강도가 상대적으로 낮은 것이었다. 시스타민의 한 분자는 양 말단에 각각 2 개의 아미노기를 가지므로, 아미노기 및 카르복시기의 이온화 정도가 가교 결합을 위해 충분히 높으면, 젤라틴 2 분자를 가교 결합시킬 수 있다.

pH값이 상승하면 젤라틴의 카르복실기의 이온화 정도, 젤라틴과 시스타민의 정전기적 인력 및 가교도가 증가하여 광산란 강도가 증가한다. 시스타민으로 가교결합된(cytamine-crosslinked) 젤라틴 분자로 구성된 입자는 젤라틴 분자보다 광을 더 효율적으로 산란시킬 수 있기 때문에, 산란 강도는 시스타민에 의해서 얼마나 많은 젤라틴 사슬들이 가교 결합되었는지를 나타내는 척도로 사용될 수 있다.

pH값이 pH 9.0에서 10.0으로 증가 할 때 광산란 강도는 58.2에서 53.0 Kcps로 감소했다. 시스타민의 아미노 그룹의 pK 값(약 10.5)은 pH 10.0에 가깝고, 따라서 pH 변화(즉, pH 9.0에서 10.0으로 상승)에 따라서 양성자화 정도가 현저하게 감소할 것이다. 그 결과로 인하여, 정전 인력 및 가교도가 감소하여 광산란 강도가 감소하게 된다. 반면, 일정한 pH 값 (pH 9.0)에서 광산란 강도는 카르복실기/시스타민의 몰비가 1/0에서 1/1로 증가 할 때 61.2에서 70.8 Kcps로 증가했다. 시스타민의 양이 증가하면 가교결합의 정도가 증가하여 광산란 강도가 증가하는 것이다. 하지만, 카르복실기/시스타민의 몰비가 1/1에서 1/2로 증가 할 때 광산란 강도의 실질적인 증가는 관찰되지 않았다. 모든 아미노기 및 모든 카르복실기가 이온화되었다고 가정하면, 최대의 정전기적 상호작용은 1/1의 비율에서 발생하고, 시스타민의 양은 비율이 1/2 일 때 화학 양론적으로 과량인 셈이었다. 따라서, 카르복실기/시스타민의 몰비가 1/1에서 1/2로 증가하면, 가교도 및 광산란 강도는 거의 증가하지 않는다.

[실시예 2 : 시스타민으로 가교된 젤라틴의 사슬로 구성된 마이크로스피어의 제조]

본 실시예에서는 시스타민으로 가교된 젤라틴의 사슬로 구성된 마이크로스피어를 제조하였다.

카르복실기와 아미노기의 몰비가 1:1이 되도록 60 ℃로 예열된 MES 완충액 (30 mM, pH 5.0) 16 ml에 젤라틴 4 g과 시스타민 0.36 g을 함께 용해시켰다. 1:1의 몰비가 선택된 이유는 젤라틴과 시스타민 사이의 최대의 정전기적 상호작용이 등몰 비에서 일어났기 때문이다. 동시에, 65 ℃로 예열된 미네랄오일 80ml에 스판 80(span 80) 6.4ml를 녹였다. 250ml 비이커에 담겨있는 유상(약 86.4ml, 65 ℃)을 혼합기 (120V / 60Hz, PC-420D, CORNING, USA)로 1150 rpm으로 교반하면서 유상에 젤라틴/시스타민 혼합액(약 16ml, 60 ℃)을 천천히 첨가하여 W/O에멀션을 제조하였고, 5000 rpm으로 작동하는 고속 호모 믹서 (HG-15D, WiseTis, Korea)를 사용하여 W/O 에멀션 (65 ℃)을 1분간 균질화시켰다. 균질화 된 젤라틴/시스타민 혼합액에 수상액적을 응고시키기 위해 비이커를 ice bath(5.4 ℃)에 30분간 담근 채로 에멀션을 급냉시켰다. 추가적으로 24시간 동안 4 ℃에서 교반하면서 수상액적을 더욱 고화시켰다. 냉각된 에멀션에 에틸 아세테이트 3 ml를 첨가하고 여과지를 사용하여 고화된 수상액적(마이크로스피어)을 여과하여 분리 하였다. 케이크를 에틸 아세테이트로 세척하여 마이크로스피어로부터 잔유를 제거 하였다. 마이크로스피어를 실온에서 24 시간 동안 공기 건조시켰다.

한편, 젤라틴/시스테인 혼합 용액 대신에 젤라틴 용액을 수상으로 사용하는 것을 제외하고는 상기와 동일한 방법으로 ‘시스타민을 함유하지 않은 마이크로스피어’를 대조시료로서 제조하였다.

[실시예 3 : 주사 전자 현미경 및 에너지분산 X선 분광법을 이용한 마이크로스피어의 조성 관찰]

본 실시예에서는 젤라틴 마이크로스피어와 젤라틴/시스타민 마이크로스피어의 조성 차이를 관찰하였다.

금속 스텁(stubs)상에 젤라틴 마이크로스피어 및 젤라틴/시스타민 마이크로 스피어를 고정화시키고 금으로 스퍼터링(sputtering)하여 마이크로스피어 표면을 코팅하였다. 금으로 코팅 된 마이크로스피어의 이미지는 주사전자현미경 (SEM, S-3500 N, 히타치 사이언스 시스템, 일본)으로 관찰하였다. 젤라틴 마이크로스피어와 젤라틴/시스타민 마이크로스피어 사이의 조성 차이를 관찰하기 위해서, 마이크로스피어를 에너지 분산 X 선 분광기 (EDS)이 장착 된 VP-FE-SEM으로 분광 분석 하였다.

도 3은 젤라틴 마이크로스피어와 젤라틴/시스타민 마이크로스피어의 SEM 현미경 사진이다. 젤라틴 마이크로스피어의 SEM 현미경 사진에서 구형 입자가 응집체와 함께 발견되었다. 응집체는 더 작은 마이크로스피어로 구성되어 있는 것으로 보여졌고, 응집체는 고온의 에멀션을 초기 급냉하는 단계(즉, 수상액적들이 완전히 응고되기 전)에서 형성된 것으로 생각되었다. 전기 이중층이 W/O 에멀션의 수상액적 주위에 덜 형성되고 따라서 수상액적들 사이의 정전기적 반발력의 세기가 약하기 때문에 W/O 에멀션의 수상액적은 O/W 에멀션의 유상액적보다 더 쉽게 응집 될 수 있다. 수상액적이 완전히 고형화되기 전에, 수상액적은 정전기적 반발력의 결핍으로 인해 응집될 것이고, 불완전한 응고로 인해 서로 달라 붙을 것이다.

SEM 현미경 사진에서 젤라틴 마이크로스피어의 직경은 수 ㎛에서 100 ㎛였다. 젤라틴/시스타민 마이크로스피어의 크기와 형태는 젤라틴 마이크로스피어의 크기와 형태와 크게 다르지 않았다. 따라서 시스타민이 마이크로스피어의 크기와 형태에 큰 영향을 미치지 못했다고 할 수 있다. 시스타민 분자는 젤라틴 사슬을 정전기적으로 가교 결합시킬 수 있으며 마이크로스피어의 크기와 모양에 영향을 줄 수 있다고 생각되었다. 그러나 마이크로스피어가 시스타민이 없어도 형성 될 수 있음을 고려하면 (도 3 (a)), 냉각으로 인한 젤라틴의 응고가 시스타민에 의한 가교결합보다 마이크로스피어의 형성과 유지에 더욱 결정적인 요인으로 작용하였다고 여겨진다.

도4는 젤라틴 마이크로스피어 및 젤라틴/시스타민 마이크로스피어의 EDS 스펙트럼을 나타낸다. 젤라틴 마이크로스피어의 스펙트럼에서 C, N 및 O의 신호가 발견되었고 이들은 젤라틴의 신호였다. 젤라틴/시스타민 마이크로스피어의 스펙트럼에서 C, N 및 O의 신호는 S 및 Cl의 신호와 함께 발견되었다. S 및 Cl의 신호는 이황화물(즉, 시스타민 디하이드로 클로라이드)로 부터 유래되었으며, 이것은 시스타민 분자가 젤라틴 마이크로스피어의 매트릭스에 혼입(incorporation)되었음을 의미한다. 앞에서 설명한 것처럼 시스타민은 디아민(diamine)이며 각 말단에 아미노기가 하나씩 있다. 시스타민의 한 분자는 2 개의 아미노기와 정전기적으로 상호작용하여 젤라틴 마이크로스피어 매트릭스에 고정되기 때문에, 제조 과정에서 마이크로스피어가 세척 된 후에도 마이크로스피어에 남아있을 수 있다.

EDS 분석에 따르면, 산소 함량은 17.3 %(w/w)이고 황 함량은 5.0 %(w/w)인 것으로 밝혀졌다. 젤라틴의 산소 함량이 20 %(w/w)(단백질의 산소 함량은 20-23 %(w /w)로 알려져 있음)라고 가정하면, 산소함량이 17.3%(w/w)이라고 하는 것은 젤라틴 함량이 83 %(w/w)이라는 것에 해당하였다. 젤라틴/시스타민 마이크로스피어의 제조에 사용된 혼합물 수용액에서 젤라틴/시스타민의 비율은 1:0.09(w/w)이었다. EDS 분석에서 얻은 원소 함량을 이용하여 계산 한 젤라틴/시스타민 마이크로스피어의 젤라틴/시스타민의 비율은 약 1:0.2(w/w)이었다. 상기와 같이 젤라틴/시스타민의 비율이 일치하지 않는 것은 마이크로스피어 제조 과정 중에 시스타민보다 젤라틴이 더 많이 손실되었기 때문이다. 시스타민과의 정전기적 상호작용을 하지 않는 젤라틴 사슬들은 세척단계에서보다 쉽게 젤라틴/시스타민 마이크로스피어로부터 손실 될 수 있다.

[실시예 4 : 시차 주사 열량계를 이용한 열량곡선 관찰]

본 실시예에서는 시차 주사 열량계를 이용하여 마이크로스피어의 열량곡선을 관찰했다.

각각 약 3.5mg의 젤라틴, 시스타민 (디하이드로클로라이드가 결합되어있는 염형태), 젤라틴 마이크로 스피어 및 젤라틴/시스타민 마이크로 스피어를 알루미늄 팬 (TA Instruments, USA)에 넣었다. 뚜껑을 사용하여 팬을 캡핑 한 후, 이를 밀봉하기 위해 프레스 (Tzero Sample Press Kit, TA Instruments, USA)로 가압 하였다. 시차주사열량곡선은 시차 주사 열량계 (DSC) (DSC Q200, TA instrument, 미국)에서 팬을 스캔하여 얻었는데, 스캔 온도 범위는 30 ~ 250 ℃이었고 가열 속도는 10 ℃/min이었다.

도 5는 젤라틴, 시스타민 (디하이드로클로라이드가 결합되어있는 염형태), 젤라틴 마이크로스피어 및 젤라틴/시스타민 마이크로스피어의 시차주사열량곡선 이다. 젤라틴의 열량곡선에서는 128 ℃ 부근에서 넓은 피크가 발견되었으며 이는 젤라틴의 용융으로 인한 것이다. 시스타민 (디하이드로클로라이드가 결합되어있는 염형태)의 열량곡선에서, 147 ℃, 189 ℃ 및 221 ℃에서 흡열 피크가 발견되었다. 시스타민 디하이드로클로라이드는 시스타민과 하이드로클로라이드로 열분해 될 것이며 열 분해로 인하여 첫 번째 흡열 피크 (147 ℃)가 나타난 것이다. 시스타민의 용융에 기인하여 두 번째 흡열 피크(189 ℃)가 나타났고, 잔류 시스타민 디하이드로 클로라이드의 용융으로 인하여 세 번째 흡열 피크(221 ℃)가 나타났다. 젤라틴 마이크로 스피어의 열량곡선에서 97 ℃ 부근에서 흡열 피크가 발견되었으며 이는 젤라틴 마이크로스피어의 용융으로 인한 것이다. 젤라틴 마이크로스피어의 융점은 젤라틴보다 약 30 ℃ 낮았다. 젤라틴 마이크로스피어는 W/O 에멀션의 수상액적에 용해된 젤라틴을 재결정하여 제조 하였다. 재결정화는 후속된 어닐링(annealing)공정없이 빠른 냉각(qhenching)에 의해서 달성 되었기 때문에, 마이크로스피어 내부의 젤라틴의 결정구조는 젤라틴의 결정 구조와 상이할 것이다. 또한, 미량의 잔류 미네랄 오일 및 유기 용매 (즉, 에틸 아세테이트)는 젤라틴 사슬의 가소제로서 작용할 수 있다. 재결정화 및 잔류물은 마이크로스피어 젤라틴의 녹는 점이 원래 젤라틴의 녹는 점보다 낮은 이유가 될 수 있다. 젤라틴/시스타민 마이크로스피어의 열량곡선에서는 92 ℃와 126 ℃ 부근에서 두 개의 넓은 흡열피크가 관찰되었다. 앞에서 설명한 것처럼 시스타민은 정전기 상호작용을 통해 젤라틴 사슬을 가교 결합시킨다. 시스타민 분자와 젤라틴 사슬은 시스타민 분자가 젤라틴 사슬과 정전기적으로 상호작용할 때 서로의 결정 구조를 방해 할 수 있다. 첫 번째 흡열피크는 젤라틴이 풍부한 상(gelatin-rich phase)으로부터 유래한 것이다. 시스타민 분자에 의해서 젤라틴 사슬이 가교 결합되면, 젤라틴 사슬의 결정 구조가 변형되어서 융점이 감소한다. 실제로, 젤라틴이 풍부한 상(젤라틴과 시스타민의 혼합물)의 융점 (92 ℃)은 순수한 젤라틴 마이크로스피어의 융점(97 ℃)보다 약 5 ℃ 낮았다. 두 번째 피크 (126 ℃)는 젤라틴과 시스타민의 함량이 비등한 시스타민/젤라틴 혼합물의 융점이다. 따라서, 첨가 규칙(additive rule)이 융점에 적용될 수 있었다. 실제로 두 번째 피크 (126 ℃)는 젤라틴 마이크로스피어의 융점과 시스타민의 융점 사이에서 나타났다.

[실시예 5 : 젤라틴/시스타민 마이크로스피어에 탑재된 형광염료의 환원매질에 따른 방출 프로파일]

본 실시예에서는 본 발명 젤라틴/시스타민 마이크로스피어에 탑재된 형광염료가 환원매질에 따른 방출정도를 관찰하였다.

건조 젤라틴 마이크로스피어 (대조군) 및 건조 젤라틴/시스타민 마이크로스피어(본 발명)를 각각 30 ㎎, 15 ㎖ 용량의 원뿔 튜브에 함유 된 2 ㎖의 FITC-덱스트란 용액 (2 mg/ml, 글리신 완충액 (30 mM, pH 9.0))에 넣었다. 형광 염색제(FITC-덱스트란)를 마이크로스피어에 탑재하기 위해서 상기 분산액을 어두운 곳에서 24 시간 동안 실온 (20-23 ℃)에서 보관했다. 분산액을 원심 분리하고, 상등액을 따라 내고, 침전물을 글리신 완충액 (30 mM, pH 9.0)으로 재 분산시키고, 분산액을 반복 원심 분리하는 이러한 방식으로, 침전물(염료가 탑재된 마이크로스피어)을 3 회 세척 하였다. 마이크로스피어에 탑재된 염료의 양은, 완충용액에 분산된 세척된 마이크로스피어를 70 ℃로 가열하여 마이크로스피어를 용해시키고, 실온으로 냉각시킨 후, 형광 강도를 측정함으로써 결정 하였다. 여기 파장은 454 nm, 측정 파장은 520 nm이었다. 비탑재율(specific loading %)은 마이크로스피어의 질량에 대해서 마이크로스피어에 탑재된 염료의 질량의 퍼센트로 정의하였다.

한편, 마이크로스피어로부터의 염료 방출에 대한 환원제의 효과를 조사하기 위해서, 디씨오쓰레이톨(dithiothreitol, DTT) 용액 (농도:0mM, 2mM 및 10mM, 용매:글라이신 완충액) 각각 6 ㎖를 15 ㎖용량의 원뿔형 튜브에 함유된 90 ㎎의 마이크로스피어에 첨가하였다. 암소, 실온에서, 200 rpm으로 작동하는 롤러 믹서에서 상기 마이크로스피어 분산액을 담고 있는 원뿔형 튜브를 롤링함으로써 마이크로스피어 분산액을 교반하였다. 주어진 시간에서 마이크로스피어분산액 0.5ml을 취하여 마이크로 튜브에 넣고 원심 분리하여 마이크로스피어를 침전시켰다. 상층액의 형광 강도를 전술한 동일한 조건에서 측정하여 방출된 염료의 양을 결정 하였다. 방출 정도 (release degree) 마이크로스피어에 탑재된 염료의 총 양에 대해서 방출된 염료의 양의 백분율로 계산하여 나타내었다.

도 6은 DTT 농도가 0 mM, 2 mM 및 10 mM 일 때 젤라틴 마이크로스피어 및 젤라틴/시스타민 마이크로스피어에 탑재된 염료의 방출 프로파일이다. 대조군인 젤라틴 마이크로스피어에 탑재된 염료의 방출 프로파일에 따르면 (도 6 (A)), 방출 매체가 DTT를 포함하는지 여부에 관계없이 방출 정도는 2 시간 이내에 최대치(약 40 %)에 도달했으며, 나머지 22 시간 동안 방출 정도는 눈에 띄게 증가하지 않았다. 염료는 젤라틴 매트릭스를 통한 확산을 통해 마이크로스피어로부터 방출된다. 방출의 초기 단계에서, 방출은 마이크로스피어 매트릭스와 방출 매질 사이의 농도 차이가 높기 때문에 빠르게 일어난다. 방출 정도가 증가함에 따라서 농도 차이가 감소하고 방출 속도가 느려지게 된다. 결국, 마이크로스피어 매트릭스와 방출매질 사이의 농도 평형에 도달하여 더 이상 방출하지 않게 된다. 그런데, 환원제 (즉, DTT)는 젤라틴 마이크로스피어에 탑재된 염료의 방출 정도에 거의 영향을 미치지 않았다. 이것은 젤라틴에는 환원 가능한 그룹이 없기 때문이다.

한편, 젤라틴/시스타민 마이크로스피어에 탑재된 염료의 방출 프로파일 (도 6 (B))에 따르면 환원제(DTT)가 없을 때 최대 방출정도는 약 50 % 였고, 대조군인 젤라틴 마이크로스피어에 탑재된 염료의 최대 방출정도보다 약 10 % 더 높았다. 젤라틴/시스타민 마이크로스피어에 탑재된 염료의 비탑재율(specific loading %)은 0.34 %이었고, 이는 젤라틴 마이크로스피어에 탑재된 염료의 비탑재율(0.35 %)과 현저하게 상이하지 않았다. 따라서, 마이크로스피어 매트릭스와 방출매질 사이의 초기 농도차이는 거의 동일 할 것이고 그것은 방출정도에 영향을 미치는 인자로부터 배제 될 수 있다. 시스타민 분자는 젤라틴 사슬과 정전기적으로 상호작용할 수 있으며 젤라틴 사슬의 결정 구조를 간섭할 수 있다. 따라서, 마이크로스피어에 시스타민과 같은 이황화물을 포함시키면, 젤라틴 매트릭스 내부의 형광 염료의 확산성이 증가하여 방출정도가 증가하게 된 것으로 추론할 수 있었다. 젤라틴/시스타민 마이크로스피어의 열량곡선에 따르면, 젤라틴 사슬의 결정 구조는 시스타민 분자에 의해 열화된다는 것을 알 수 있었는데(도 5), 이로부터 상기와 같은 추론이 뒷받침될 수 있다.

한편, 젤라틴 마이크로스피어와는 달리, 젤라틴/시스타민 마이크로스피어는 DTT 농도 의존적 방식으로 탑재된 염료를 방출하였다. 예를 들어, DTT 농도가 0 mM, 2 mM 및 10 mM 일 때 최대 방출정도는 각각 약 56.7 %, 72.6 % 및 80.7 % 이었다. 시스타민은 양말단에 각각 아미노기를 가지고 있기 때문에, 정전기적 상호작용을 통해 젤라틴 마이크로스피어 매트릭스에 고정화되어서 젤라틴 사슬들을 가교시킬 것이다. 마이크로스피어가 환원성 매질에 놓이면 시스타민의 이황화 결합이 깨져서 가교 밀도가 감소한다. 이러한 상황에서, 마이크로스피어 매트릭스를 통한 염료의 확산도가 증가하여 방출정도가 증가할 수 있다. 이것은 왜 젤라틴/ 시스타민 마이크로스피어가 DTT 농도 의존적 방식으로 내용물을 방출했는지에 대한 이유를 설명해주고 있다.

Claims (10)

1. 양쪽성 고분자(amphoteric polymer)가 이온성 이황화물(ionic disulfide compound)에 의해 정전기적 인력으로 가교되어 형성되며,
   상기 양쪽성 고분자는 젤라틴(gelatin)이고,
   상기 이온성 이황화물은 시스타민(cystamine)이고,
   환원 조건에서 탑재된 내용물의 방출이 촉진되는 것을 특징으로 하는 환원응답성 마이크로스피어(reduction-responsive microsphere).
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 양쪽성 고분자(amphoteric polymer)와 이온성 이황화물(ionic disulfide compound)을 수용성 용매에 용해시켜 수상 혼합액을 제조하되, 상기 양쪽성 고분자는 젤라틴(gelatin)이고, 상기 이온성 이황화물은 시스타민(cystamine)이고, 상기 젤라틴과 상기 시스타민의 카르복시기:아미노기 몰비가 1:1이 되도록 수용성 용매에 용해시켜 수상 혼합액을 제조하는 단계 (a);
   상기 단계 (a) 후, 상기 수상 혼합액을 오일 및 계면활성제가 첨가되어 있는 유상에 첨가하여 W/O 에멀션(emulsion)을 제조하는 단계 (b);
   상기 단계 (b) 후, 상기 W/O 에멀션을 균질화하여 수상 액적(droplet)을 제조하는 단계 (c);
   상기 단계 (c) 후, 제조된 수상 액적을 응고시키기 위해 상기 W/O 에멀션을 급냉시키는 단계 (d);
   상기 단계 (d) 후, 상기 W/O 에멀션을 2~6 ℃에서 교반하면서 수상 액적을 고화시키는 단계 (e); 및
   상기 단계 (e) 후, 냉각된 에멀션에 에틸 아세테이트(ethyl acetate)를 첨가한 후, 고화된 마이크로스피어를 분리하는 단계 (f);를 포함하고,
   상기 마이크로스피어는 환원 조건에서 탑재된 내용물의 방출이 촉진되는 것을 특징으로 하는 환원응답성 마이크로스피어(reduction-responsive microsphere)의 제조방법.
   
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10. 제4항에 있어서,
    상기 수상 혼합액은,
    양쪽성 고분자와 이온성 이황화물을 합한 농도가 0.1 ~ 20% (w/v)인 것을 특징으로 하는 환원응답성 마이크로스피어의 제조방법.
    

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