KR102077229B1

KR102077229B1 - nSMase2 발현 촉진제 또는 활성화제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR102077229B1
Application number: KR1020180103885A
Authority: KR
Inventors: 김대경; 백문정; 하해찬; 정형민
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단; 건국대학교 글로컬산학협력단
Priority date: 2017-08-31
Filing date: 2018-08-31
Publication date: 2020-02-14
Also published as: KR20190024850A

Abstract

본 발명은 nSMase2 발현 촉진제 또는 활성화제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에서는 nSMase2가 자식작용을 유도 및 매개하고, 기아 또는 독성 환경에서 세포 보호 효과를 나타내며, 파킨슨 병 환자의 흑질 및 자식작용이 감소되어 있는 노화 마우스의 선조체에서 nSMase2 발현이 감소되어 있으며, nSMase2가 퇴행성 신경질환과 연관성을 갖는 것을 확인한 바, 상기와 같은 효과를 가지는 nSMase2 단백질, 상기 단백질의 발현 촉진제 또는 활성화제, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 약학조성물, 퇴행성 신경질환 진단용 바이오마커 조성물, 퇴행성 신경질환 진단용 키트, 자식작용 유도용 시약조성물 등으로 유용하게 활용될 수 있다.

Description

nSMase2 발현 촉진제 또는 활성화제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating neurodegenerative disease comprising inducer or activator of nSMase2}

본 발명은 nSMase2(Neutral sphingomyelinase 2, Sphingomyelin phosphodiesterase 3, SMPD3) 단백질, 상기 단백질의 발현 촉진제 또는 활성화제, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

자식작용(autophagy)은 세포 내의 물질을 라이소좀(lysosome)을 이용하여 분해하는 작용으로써, 세포의 정상적인 기능 및 생존에 필수적인 과정이다. 자식작용은 세포 내 영양분이 부족한 기아(starvation), 허혈(ischemia) 등의 환경에서 세포가 자신의 불필요한 단백질, 노화 또는 손상된 세포 소기관 등을 지질 이중층으로 구성된 자식포(membrane vacuole, autophagosome)로 둘러싼 후, 라이소좀과 합쳐져 둘러싸인 내부 물질을 분해하도록 유도함으로써 세포 내 영양분을 재공급하는 시스템으로 세포의 항상성 유지에 중요한 역할을 한다.

이러한 자식작용의 억제 또는 활성화는 단순한 세포 활성 뿐만 아니라, 상기 세포를 포함하는 생체 내 생리학적 또는 병리학적 변화에 큰 영향을 미친다. 자식작용의 감소는 변형 단백질(misfolded protein)의 축적을 증가시킴으로써 신경변성의 원인이 된다. 자식작용의 상향조절은 응집된 단백질의 수준 및 신경변성 질환의 증상을 모두를 감소시키는 것으로 보고된 바 있다. 따라서, 세포의 자식작용을 향상시키는 작용제는 신경변성 질환의 예방 또는 치료를 위한 치료제로서 작용할 수 있다.

그러나 자식자용의 분자적 기전에 대해서는 오직 몇몇의 조절자만 보고되어 있고, 아직 밝혀야 할 부분이 많은 실정이다. 자식작용을 조절하는 물질 및 기전의 발굴은 새로운 작용점을 타겟으로 하여 퇴행성 신경질환의 치료제 개발에 매우 중요한 역할을 할 것으로 기대된다.

대한민국 등록특허 제10-1130030호 (2012.03.16 등록)

본 발명의 목적은 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 다른 목적은 퇴행성 신경질환 진단용 바이오마커조성물 또는 퇴행성 신경질환 진단용 키트를 제공하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 퇴행성 신경질환 진단을 위한 정보 제공 방법 또는 퇴행성 신경질환 치료를 위한 약물 스크리닝 방법을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 자식작용 유도용 시약조성물 또는 시험관 내에서 (in vitro) 자식작용을 유도하는 방법을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 자식작용 분석용 바이오마커 조성물, 도파민성 뉴런 동정용 바이오마커 조성물, 또는 도파민성 뉴런 활성 분석용 바이오마커 조성물을 제공하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 nSMase2 단백질, 상기 단백질의 발현 촉진제 또는 활성화제, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 nSMase2 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 nSMase2 단백질의 발현 또는 활성 수준, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 검출할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 진단용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 대상체와 정상 대조군으로부터 분리된 시료로부터 nSMase2 단백질의 발현 또는 활성 수준, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 비교하는 단계를 포함하는, 대상체의 퇴행성 신경질환을 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 퇴행성 신경질환이 의심되는 대상체로부터 분리된 시료에 후보 약물을 처리하는 제 1단계; 상기 후보 약물의 투여 전과 후의 nSMase2 단백질의 발현 또는 활성 수준, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제 2단계; 및 정상 대조군 시료와 비교하여 상기 nSMase2 단백질의 발현 또는 활성 수준, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 증가시키는 후보 약물을 선별하는 제 3단계;를 포함하는 퇴행성 신경질환 치료를 위한 약물 스크리닝 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 nSMase2 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 자식작용 유도용 시약조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 nSMase2 단백질, 상기 단백질의 발현 촉진제 또는 활성화제, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 처리하여 시험관 내에서 (in vitro) 자식작용을 유도하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 nSMase2 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 자식작용 분석용 바이오마커 조성물, 도파민성 뉴런 동정용 바이오마커 조성물, 또는 도파민성 뉴런 활성 분석용 바이오마커 조성물을 제공한다.

본 발명에서는 nSMase2가 자식작용을 유도 및 매개하고, 기아 또는 독성 환경에서 세포 보호 효과를 나타내며, 파킨슨 병 환자의 흑질 및 자식작용이 감소되어 있는 노화 마우스의 선조체에서 nSMase2 발현이 감소되어 있으며, nSMase2가 퇴행성 신경질환과 연관성을 갖는 것을 확인한 바, 상기와 같은 효과를 가지는 nSMase2 단백질, 상기 단백질의 발현 촉진제 또는 활성화제, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 약학조성물, 퇴행성 신경질환 진단용 바이오마커 조성물, 퇴행성 신경질환 진단용 키트, 자식작용 유도용 시약조성물 등으로 유용하게 활용될 수 있다.

도 1(A)는 세라마이드(ceramide)를 생성하는 효소들 중 자식작용을 조절하는 효소를 동정하기 위하여 사용된 세라마이드 생성 효소 및 각 효소의 저해제를 나타낸 것이며, 도 1(B) 및 도 1(C)는 nSMase2에 의한 자식작용 유도 및 매개 효과를 nSMase2 저해제를 이용하여 LC3 회전량(LC3 turnover) 및 LC 반점(LC puncta) 형성으로 확인한 것이다.
도 2는 nSMase2에 의한 자식작용 유도 및 매개 효과를 (A) nSMase2의 과발현 및 (B) 발현 저하(nSMase2 siRNA)를 이용하여 LC3 회전량, LC 반점 형성 및 p62 분해량으로 확인한 것이다.
도 3(A) 및 도 3(B)는 nSMase2에 의한 세포 보호 효과를 유전자 변조(nSMase2 siRNA)를 이용하여 각각 LDH 방출 및 PI 염색으로 확인한 것이다.
도 4(A)는 마우스 뇌의 부위별 nSMase2의 발현량을 측정하여 도파민성 뉴런 분포와의 연관성을 확인한 것이며, 도 4(B)는 도파민성 독성 상태에서 nSMase2에 의한 세포 보호 효과를 LDH 방출로 확인한 것이다.
도 5는 nSMase2에 의한 세포 보호 효과가 자식작용에 의존적임을 LDH 방출로 확인한 것이다.
도 6은 정상인 및 파킨슨 병 환자의 흑질에서 nSMase2 유전자 및 자식작용 관련 유전자의 발현량을 확인한 것이다.
도 7은 정상인 및 파킨슨 병 환자의 흑질에서 nSMase2 유전자의 발현과 자식작용 관련 유전자(ATG9B, ATG10) 발현이 양의 상관관계임을 확인한 것이다.
도 8은 노화 마우스 및 어린 마우스의 선조체에서 nSMase2의 발현 및 자식작용과의 연관성을 확인한 것이다.

본 발명의 발명자들은 자식작용을 조절하는 효소로 nSMase2를 동정하였으며, 상기 nSMase2의 발현이 파킨슨 병 환자의 흑질 및 자식작용이 감소되어 있는 노화 마우스의 선조체에서 감소되어 있고, 퇴행성 신경질환과 연관성 분석을 통해 nSMase2를 퇴행성 신경질환의 치료제로써 활용이 가능함을 확인하며 본 발명을 완성하였다.

본 발명에서 사용된 용어 "nSMase2(Neutral sphingomyelinase 2, Sphingomyelin phosphodiesterase 3, SMPD3)"는 스핑고지질(sphingolipid) 대사 반응에 관여하는 가수분해 효소 중 하나로 스핑고미엘린(sphingomyelin; SM)을 포스포콜린(phosphocholine)과 세라마이드(ceramide)로 분해하는 역할을 한다.

본 발명에서 사용된 용어 "바이오마커"는 퇴행성 신경질환이 발생한 대상체의 조직 또는 세포를 정상 대조군의 조직 또는 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 대조군에 비하여 질환이 발생한 대상체의 조직 또는 세포에서 증가 또는 감소 양상을 보이는 단백질 또는 핵산, 지질, 당지질, 당단백질 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다.

본 발명에서 사용된 용어 "시료"는 nSMase2 단백질의 발현 또는 활성 수준, 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준에 있어서 정상 대조군과 차이가 나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

본 발명에서 사용된 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3 말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 또한, 프라이머는 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산으로서, DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "프로브"는 mRNA외 특이적으로 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무, 발현량을 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중쇄DNA(double strand DNA)프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적절한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당해 기술 분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택할 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "항체"는 항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 면역 글로불린을 의미하며, 본 발명에서의 항체는 nSMase2에 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 당해 기술분야의 통상적인 방법에 따라 제조된 것 또는 시판되어 구입한 것이 모두 사용 가능하다. 또한, 상기 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 에피토프(epitope)와 결합할 수 있는 단편 등을 포함한다. 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태를 의미하며, 또한, 인간화 항체 등 특수 항체도 포함한다.

또한, 본 발명의 키트는 마커 성분에 특이적으로 결합하는 항체, 기질과의 반응에 의해서 발색하는 표지체가 접합된 2차 항체 접합체(conjugate), 상기 표지체와 발색 반응할 발색 기질 용액, 세척액 및 효소반응 정지용액 등을 포함할 수 있으며, 사용되는 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

본 명세서에서 용어 "펩타이드"는 표적 물질에 대한 결합력 높은 장점이 있으며, 열/화학 처리시에도 변성이 일어나지 않는다. 또한, 분자 크기가 작기 때문에 다른 단백질에 붙여서 융합 단백질로의 이용이 가능하다. 구체적으로 고분자 단백질 체인에 붙여서 이용이 가능하므로 진단 키트 및 약물전달 물질로 이용될 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "앱타머(aptamer)"는 그 자체로 안정된 삼차구조를 가지면서 표적분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 단일가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형핵산)이다. 앱타머는 고유의 높은 친화성(보통 pM 수준)과 특이성으로 표적분자에 결합할 수 있다는 특성 때문에 단일 항체와 비교가 되고, 특히 "화학 항체"라고 할 만큼 대체 항체로서의 높은 가능성이 있다.

이에, 본 발명은 nSMase2 단백질, 상기 단백질의 발현 촉진제 또는 활성화제, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

상기 퇴행성 신경질환은 파킨슨 병, 알츠하이머 병, 루게릭 병, 헌팅턴 병, 크로이츠펠트-야콥 병, 근위축성 측석 경화증, 다발성 경화증, 면역계이상 뇌기능 부전, 진행성 신경퇴행질환, 대사성 뇌질환, 니만-픽 병, 뇌 허혈 및 뇌출혈로 인한 치매, 건망증, 뇌졸중 및 중풍으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

상기 nSMase2 단백질, 상기 단백질의 발현 촉진제 또는 활성화제, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자는 자식작용을 유도 및 매개하고, 기아 또는 독성 환경에서 세포를 보호할 수 있다.

상기 nSMase2 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자는 퇴행성 신경질환에서 발현 또는 활성 수준이 감소되어 있는 특징을 가진다.

본 발명의 조성물은 투여를 위하여, 상기 기재한 성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 상세하게는 제형화할 경우 통상 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 고형 제제는 상기 유효성분 외에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 첨가하여 조제될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 과제를 포함한다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로솔, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물의 적합한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 시간에 따라 다르지만, 당 업자에 의해 적절하게 선택될 수 있는 바, 상기 조성물의 일일 투여량은 바람직하게는 0.01 mg/kg 내지 50 mg/kg이며, 필요에 따라 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.

상기 제제는 프라이머, 프로브, 항체, 펩타이드 및 앱타머로 이루어지는 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

상기 제 2단계의 nSMase2 단백질의 발현 또는 활성 수준, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR), 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 방사능면역분석(radioimmunoassay), 면역조직화학(immunohistochemistry), 마이크로어레이(microarray), 웨스턴 블랏(western blotting) 및 유세포 분석법(FACS)으로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나 이상으로 측정할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1 : nSMase2의 자식작용 유도 및 매개 효과

세라마이드(ceramide)를 생성하는 효소들 중 자식작용을 조절하는 효소를 확인하기 위하여, 도 1(A)와 같이, PC12 세포(ATCC)에 각 효소의 저해제를 1시간 동안 처리하고, 배양액을 아미노산과 성장인자가 결핍된 HBSS(Hank’s balanced salt solution)로 교환한 후, 클로로퀸(chloroquine; CQ)(50 μM) 존재 또는 부재 하에 2시간 동안 배양하여 기아(starvation) 유도 자식작용의 정도를 분석하였다. nSMase2의 저해제로는 GW4869(5 μM), 세라마이드 합성효소(ceramide synthase)의 저해제로는 FB1(10 μM), 세린-팔미토일 전이효소(serine-palmitoyltransferase)의 저해제로는 미리오신(myriocin)(5 μM), 산성 스핑고미엘린 분해효소(acidic sphingomyelinase)의 저해제로는 데시프라민(desipramine)(10 μM)을 이용하였다.

자식작용의 정도(autophagic flux)는 자식작용 중 특이적으로 형성되는 LC3 II의 분해 정도를 리소좀 억제제(lysosomal inhibitor)인 클로로퀸을 이용하여 측정하였다. 같은 조건 하에서 클로로퀸의 유무에 따른 LC3 II의 분해 정도를 비교하면, 자식작용에 의해 분해된 LC3 II의 정도 즉, LC3 회전량(LC3 turnover)을 측정할 수 있다. 웨스턴 블랏을 통해 LC3 회전량을 측정한 결과, 도 1(B)와 같이, nSMase2의 저해제인 GW4869를 처리하였을 때, LC3 회전량이 저해되는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 자식작용 중 특이적으로 형성되는 오토파고좀(autophagosome) 혹은 오토라이소좀(autolysosome)을 LC3 반점(puncta)으로 측정한 결과, 도 1(C)와 같이, 기아에 의해 유도되는 LC3 반점이 GW4869 처리에 의해 억제되는 것을 확인하였다. 따라서, 세라마이드 생성 경로에 있는 효소 중에 nSMase2가 자식작용을 유도하는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과는 nSMase2 저해제뿐만 아니라 유전자 변조(gene modulation)를 통한 조절로도 확인하였다. PC12 세포를 1 μg의 플라스미드 코딩 V5-태그 nSMase2 또는 공벡터로 형질감염시켰다. 또한, PC12 세포를 50 nM의 nSMase2 siRNA(siSmpd3)(RSS331830 및 RSS331831의 혼합액, Stealth siRNA, Thermo Fisher Scientific) 또는 비표적화 음성 대조군 siRNA(siControl)(#12935-300)로 형질감염시켰다.

그 결과, 도 2(A)를 참조하여 보면, nSMase2를 과발현(over expression)시켰을 때, 기아 상태와 유사하게 LC3 반점이 관찰되는 것으로 보아 자식작용이 유도되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, nSMase2에 의한 자식작용 유도는 LC3 회전량 및 p62 분해량을 통해서도 확인할 수 있었다. p62는 자식작용에 의해 분해되는 기질(substrate)로써, 상기 p62가 분해되는 양을 이용하여 자식작용의 정도를 분석할 수 있다. LC3 회전량 및 p62 분해량 분석 결과, nSMase2 과발현에 의해 자식작용이 유도되는 것을 확인할 수 있었다.

반대로 도 2(B)와 같이, nSMase2 siRNA를 이용하여 nSMase2를 넉다운(knock down)시킨 결과, LC3 반점 형성, LC3 회전량 및 p62 분해량을 통해 기아 유도 자식작용이 억제되는 것을 확인할 수 있었다.

따라서, 상기의 결과들로부터 nSMase2가 자식작용을 유도 및 매개한다는 것을 확인하였다.

실시예 2 : nSMase2의 세포 보호 효과

자식작용을 유도 및 매개하는 nSMase2가 세포에 보호적인 역할을 하는지를 확인하기 위하여, nSMase2 siRNA를 이용하여 nSMase2의 발현을 저하시켰을 때 기아 상태 유도 세포 독성 정도를 분석하였다.

PC12 세포를 50 nM의 nSMase2 siRNA(siSmpd3) 또는 비표적화 음성 대조군 siRNA(siCON)로 형질감염시켰다. 형질감염 후 48시간 뒤에, 세포를 HBSS로 7시간 또는 10시간 배양하였다. 배지에 방출된 젖산탈수소효소(lactate dehydrogenase; LDH)의 수준과 총 LDH를 정량하여 세포 독성을 측정하였다. 또한, siRNA로 형질감염된 PC12 세포는 PI(propidium iodide) 및 Hoechst 3334로 이중 염색하였다. 사멸 세포는 PI에 대해 양성을 나타내며, 총 세포는 Hoechst 33342로 표지된다.

그 결과, 도 3(A)와 같이, LDH 방출을 통해 세포 독성을 확인한 결과, 기아 상태에서 nSMase2의 발현을 넉다운시켰을 때(si-Smpd3), 대조군(si-Control)에 비하여 세포사멸이 증가하는 것을 확인하였다.

또한, 도 3(B)와 같이, PI를 이용하여 세포 염색을 수행한 결과, nSMase2의 발현을 넉다운시켰을 때(si-Smpd3), 대조군(si-Control)에 비하여 세포사멸이 증가하는 것을 확인하였다.

nSMase2는 뇌 조직 및 뼈 조직에 많이 발현되는 것으로 알려져 있는데, 뇌 중에서도 어느 부분에서 주로 발현되고 있는지를 확인하기 위해 C57BL/6 마우스(6주령)의 뇌를 부위별로 박리(dissection)하여, nSMase2의 발현을 면역블로팅으로 분석하였다. 그 결과, 도 4(A)와 같이, 도파민성 뉴런이 많이 분포하고 있는 선조체(striatum)와 중뇌(midbrain)에 특히 많이 발현되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 티로신 수산화효소(tyrosine hydroxylase; TH)는 도파민성 뉴런에서 발현되는 효소로서, TH 발현을 통해 뇌 부위별 실제 도파민성 뉴런의 분포를 확인할 수 있다.

따라서, 도파민성 독성 자극 하에서도 nSMase2가 세포 보호 효과를 나타내는지를 확인하기 위하여, PC12 세포에 nSMase2의 siRNA를 형질감염시킨 후, 높은 농도의 도파민 혹은 미토콘드리아 짝풀림제(mitochondrial uncoupler)인 카르보닐 시아니드 m-클로로페닐하이드라존(carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone; CCCP)을 처리한 후, 세포 독성 정도를 LDH 방출을 통해 분석하였다. CCCP 처리는 도파민성 뉴런의 손실이 특징적으로 나타나는 퇴행성 신경질환인 파킨슨 병의 in vitro 질환모델에서 많이 사용되는 방법이다.

그 결과, 도 4(B)를 참조하여 보면, 도파민 혹은 CCCP에 의한 독성에 있어서, nSMase2의 발현을 넉다운시켰을 때(si-Smpd3), 대조군(si-Control)에 비하여 세포사멸이 증가하는 것을 확인하였다. 이는 nSMase2가 해당 독성들에 대해 세포 보호 효과를 갖는다는 것을 의미한다. 또한, 해당 독성 자극들에 노출된 세포는 클로로퀸 존재 하에서 더 많이 사멸하는 것으로 보아 자식작용이 해당 독성 자극들에 대해 세포 보호적으로 효과를 나타낸다는 것을 확인할 수 있었다.

이러한 nSMase2의 세포 보호 효과가 자식작용에 의존적으로 나타나는지를 확인하기 위해 자식작용 억제제 클로로퀸 존재 하에서 해당 실험을 수행하였다. siRNA로 형질감염된 세포를 50 μM의 클로로퀸 존재 또는 부재 하에 기아 상태로 7시간 또는 20 μM의 CCCP로 24시간 동안 처리하였다. 세포 독성은 LDH 방출을 통해 분석하였다.

그 결과 도 5와 같이, 기아 혹은 CCCP에 의한 독성에 있어서, nSMase2 넉다운(si-Smpd3)에 의한 세포 사멸 증가 효과가 나타나지 않는 것을 확인하였다. 이는 nSMase2의 이들 독성 자극에 대한 세포 보호 효과가 자식작용에 의존적이라는 것을 반영한다.

따라서, 상기 결과들로부터 nSMase2가 자식작용을 통해 독성 자극으로부터 세포 보호 효과를 나타내는 것을 확인하였다.

실시예 3 : nSMase2와 퇴행성 신경질환과의 연관성 확인

자식작용을 유도 및 매개하며, 세포 보호적 효과를 나타내는 nSMase2에 대하여, 퇴행성 신경질환과의 연관성을 확인하기 위하여, 파킨슨 병(Parkinson's disease, PD) 환자 및 정상인의 흑질에서 nSMase2의 발현량을 GEO 데이터베이스 중 GSE 7621를 이용하여 분석하였다.

그 결과, 도 6을 참조하여 보면, 정상인에 비해 파킨슨 병 환자의 흑질에서 nSMase2의 발현량이 감소되어 있는 것을 확인하였다. 또한, 자식작용 관련 유전자들의 발현 역시 감소되어 있는 것을 확인하였다.

해당 질환에서 nSMase2의 발현량과 자식작용 관련 유전자와의 연관성을 분석한 결과, 도 7과 같이, nSMase2의 발현 정도와 ATG9B 혹은 ATG10 발현 정도가 유의적으로 양의 상관관계(positive correlation)를 보이는 것을 확인하였다.

또한, 퇴행성 뇌질환의 가장 주요한 위험 요소(risk factor)가 노화인 바, 한국생명공학연구원으로부터 분양 받은 노화 C57BL/6 마우스(20개월령) 및 어린 C57BL/6 마우스(6주령)의 선조체를 이용하여 nSMase2의 발현 수준을 분석하였다. 그 결과, 도 8과 같이, 노화 마우스에서 nSMase2의 발현량이 감소하고, 자식작용에 의해 분해되는 기질인 p62의 축적이 증가하는 것을 확인하였다. 즉, 자식작용이 저하되어 있는 노화 마우스에서 자식작용을 매개하는 nSMase2가 감소되어 있는 것을 확인하였으며, 이는 nSMase2가 퇴행성 신경질환과 연관성을 갖는 것을 의미한다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술한 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

nSMase2 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하며, 상기 nSMase2 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자는 자식작용을 유도 및 매개하고, 기아 또는 독성 환경에서 세포를 보호하는 것을 특징으로 하는 파킨슨 병 예방 또는 치료용 약학조성물.
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제 1항에 있어서, 상기 nSMase2 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자는 파킨슨 병에서 발현 또는 활성 수준이 감소되어 있는 것을 특징으로 하는 파킨슨 병 예방 또는 치료용 약학조성물.
nSMase2 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 파킨슨 병 진단용 바이오마커 조성물.
nSMase2 단백질의 발현 또는 활성 수준, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 검출할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 파킨슨 병 진단용 키트.
제 6항에 있어서, 상기 제제는 프라이머, 프로브, 항체, 펩타이드 및 앱타머로 이루어지는 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 파킨슨 병 진단용 키트.
대상체와 정상 대조군으로부터 분리된 시료로부터 nSMase2 단백질의 발현 또는 활성 수준, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 비교하는 단계를 포함하는, 대상체의 파킨슨 병을 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법.
파킨슨 병이 의심되는 대상체로부터 분리된 시료에 후보 약물을 처리하는 제 1단계;
상기 후보 약물의 투여 전과 후의 nSMase2 단백질의 발현 또는 활성 수준, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제 2단계; 및
대조구 시료와 비교하여 상기 nSMase2 단백질의 발현 또는 활성 수준, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 증가시키는 후보 약물을 선별하는 제 3단계;
를 포함하는 파킨슨 병 치료를 위한 약물 스크리닝 방법.
제 9항에 있어서, 상기 제 2단계의 nSMase2 단백질의 발현 또는 활성 수준, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR), 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 방사능면역분석(radioimmunoassay), 면역조직화학(immunohistochemistry), 마이크로어레이(microarray), 웨스턴 블랏(western blotting) 및 유세포 분석법(FACS)으로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나 이상으로 측정하는 것을 특징으로 하는 파킨슨 병 치료를 위한 약물 스크리닝 방법.
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