KR102076475B1 - Use for DSCR1 regulating hippocampal adult neurogenesis - Google Patents

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KR102076475B1
KR102076475B1 KR1020180094433A KR20180094433A KR102076475B1 KR 102076475 B1 KR102076475 B1 KR 102076475B1 KR 1020180094433 A KR1020180094433 A KR 1020180094433A KR 20180094433 A KR20180094433 A KR 20180094433A KR 102076475 B1 KR102076475 B1 KR 102076475B1
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민경태
최치열
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울산과학기술원
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Abstract

The present invention relates to a use of Down syndrome critical region 1 (DSCR1) regulating adult neurogenesis. More specifically, according to the present invention, it is discovered that DSCR1 regulates miRNA-124 and TET1 which are known to be involved in the process of adult neurogenesis. Thus, it is expected that DSCR1 can be usefully employed in the treatment of neurological disorders such as Alzheimer′s disease, Parkinson′s disease, and the like in which adult neurogenesis is impaired, as DSCR1 regulates the miRNA-124/TET1 regulatory axis.

Description

성체 신경 발생을 조절하는 DSCR1의 용도{Use for DSCR1 regulating hippocampal adult neurogenesis}Use for DSCR1 regulating hippocampal adult neurogenesis

본 발명은 성체 신경 발생을 조절하는 다운증후군 위험 영역 1(Down syndrome critical region 1; DSCR1)의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to the use of Down syndrome critical region 1 (DSCR1) to regulate adult neurogenesis.

성체 신경 발생(adult neurogenesis)은 성체 신경전구체로부터 새로운 신경세포들이 만들어지는 과정으로, 성인 뇌 해마의 치상회(dentate gyrus) 부분과 측 뇌실(lateral ventricle)의 뇌실 하대(subventricular zone)에서 국한적으로 일어나게 된다. 새롭게 만들어진 신경세포들은 해마의 학습 그리고 기억 능력의 형성에 중요한 역할을 하며, 최근에는 이런 성체 신경 발생의 정도가 알츠하이머 병, 파킨슨 병 등의 신경퇴행성 질환에서 줄어든 것이 확인되고 있다. 하지만 어떤 생리학적, 병리학적인 기전에 의해 성체 신경 발생이 조절되고 있는지에 대해 알려진 것은 미미한 편이다. Adult neurogenesis is the process by which new neurons are made from adult neural precursors, localized in the dentate gyrus of the adult brain hippocampus and in the subventricular zone of the lateral ventricle. Get up. Newly formed neurons play an important role in the formation of the hippocampus's learning and memory, and recently, the extent of adult neurogenesis has been reduced in neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's. However, little is known about which physiological and pathological mechanisms regulate adult neurogenesis.

다운증후군(Down syndrome; DS)은 약 800명당 1명의 확률로 가장 흔하게 발생하는 선천적 장애로서, 21번 염색체의 부분 또는 전체의 불균형한 유전자량으로 인해 야기되는 복합 장애이다. 다운증후군은 21번 염색체 상에 여분의 염색체가 존재하여 유발되는데, 다운증후군 환자에서 지적장애를 유발하는 특정 유전자는 여전히 불명확하다. 다운증후군 위험 영역 1(Down syndrome critical region 1; DSCR1, 또는 RCAN1로도 불림)은 인간의 21번 염색체에 위치하며, 뇌에서 높게 발현되고, 해마 신경세포에 특히 풍부하다. DSCR1은 칼시프레신(calcipressins)이라고 불리는 칼시뉴린(calcineurin; CaN) 억제제의 진화적으로 보존된 패밀리에 속하며, 여기에는 초파리의 네뷸라(nebula)와, 마우스 및 인간의 DSCR1가 포함된다. DSCR1이 학습 및 기억에 필수적이라는 것이 알려졌는데, 이는 DSCR1이 다운증후군 환자의 지적장애에 주요한 역할을 할 수도 있다는 것을 뒷받침한다.Down syndrome (DS) is a congenital disorder most commonly occurring with a probability of about 1 in about 800 people, which is a complex disorder caused by unbalanced gene mass in part or all of chromosome 21. Down syndrome is caused by the presence of an extra chromosome on chromosome 21. The specific genes that cause intellectual disability in patients with Down syndrome are still unclear. Down syndrome critical region 1 (also called DSCR1, or RCAN1) is located on human chromosome 21 and is highly expressed in the brain and is particularly abundant in hippocampal neurons. DSCR1 belongs to an evolutionarily conserved family of calcineurin (CaN) inhibitors called calcipressins, including nebula in Drosophila, and DSCR1 in mice and humans. It is known that DSCR1 is essential for learning and memory, supporting that DSCR1 may play a major role in intellectual disability in patients with Down syndrome.

MicroRNAs(miRNAs)는 단백질을 코딩하지 않는 작은 RNAs (~22 nucleotides)로서, 여러 생물학적 과정에 관련되어 있다. miRNAs는 표적 mRNAs의 3' 미번역 영역(untranslated regions; UTRs) 내에서 상보적 서열과 불완전 또는 완전한 염기쌍을 이루어, 유전자 발현의 전사 후 조절자로서 작용한다. 각각의 miRNA는 수십만 개의 개별적인 표적 RNAs를 표적으로 할 수 있는데, 이는 miRNAs 발현 조절이 여러 표적 유전자들을 조절하는데 중요하다는 것을 나타낸다. 뇌에 가장 많은 microRNAs 중 하나는 microRNA-124(miR-124)로서, 이는 mRNA 스플라이싱(splicing), 발달, 시냅스 형성 및 신경 분화와 같은 많은 생물학적 과정에 관여한다. 하지만, miR-124의 전사가 어떻게 조절되는지는 알려지지 않고 있다.MicroRNAs (miRNAs) are small RNAs (~ 22 nucleotides) that do not encode proteins and are involved in many biological processes. miRNAs form incomplete or complete base pairs with complementary sequences in 3 'untranslated regions (UTRs) of target mRNAs, acting as post-transcriptional regulators of gene expression. Each miRNA can target hundreds of thousands of individual target RNAs, indicating that regulation of miRNAs expression is important for regulating several target genes. One of the most microRNAs in the brain is microRNA-124 (miR-124), which is involved in many biological processes such as mRNA splicing, development, synapse formation, and neuronal differentiation. However, how the transcription of miR-124 is regulated is unknown.

DNA 메틸트랜스퍼레이즈(methyltransferase)에 의한 DNA 메틸화는 많은 유전자들의 전사를 조절하는 것으로 알려졌다. 반대로, Tet1(Ten-eleven translocation methylcytosine dioxygenase) 효소는 5-메틸시토신(5-methylcytosine; 5mC)의 산화를 통해 메틸화된 DNA의 탈메틸화에 주요한 역할을 한다. 최근에, Tet1은 성체 해마 신경 발생의 조절에 관여하는 것으로 보고되었다. Tet1 결핍은 성체 신경줄기세포(neural stem cells; NSCs)의 증식을 억제하고, Galanin, Ng2 및 Neirglobin (Ngb)를 포함하는 증식 및 신경 보호에 관여하는 유전자들의 DNA 과메틸화를 야기하는데, 이는 결과적으로 신경 발생을 감소시키는 결과를 나타낸다. 또한, Tet1 KO 마우스는 공간 학습 및 기억에 손상을 나타내는데, 이는 Tet1-매개 DNA 탈메틸화가 학습 및 기억을 조절하는데 중요하고, 성체 신경 발생의 조절에도 관련되어 있음을 나타낸다.DNA methylation by DNA methyltransferase is known to regulate transcription of many genes. In contrast, Ten-eleven translocation methylcytosine dioxygenase (Tet1) enzymes play a major role in the demethylation of methylated DNA through oxidation of 5-methylcytosine (5mC). Recently, Tet1 has been reported to be involved in the regulation of adult hippocampal neurogenesis. Tet1 deficiency inhibits proliferation of neural stem cells (NSCs) and results in DNA hypermethylation of genes involved in proliferation and neuroprotection, including Galanin, Ng2 and Neirglobin (Ngb), which in turn result in nerve Results in reducing outbreaks. In addition, Tet1 KO mice exhibit impaired spatial learning and memory, indicating that Tet1-mediated DNA demethylation is important for regulating learning and memory and is also involved in the regulation of adult neurogenesis.

한국등록특허 제10-1716114호 (2017.03.08. 등록)Korea Patent Registration No. 10-1716114 (registered on March 8, 2017)

본 발명의 목적은 다운증후군 위험 영역 1(Down syndrome critical region 1; DSCR1) 단백질을 유효성분으로 포함하는 시험관 내(in vitro) miR-124 또는 TET1 발현 조절용 시약 조성물을 제공하는데 있다.An object of the present invention is to provide a reagent composition for controlling in vitro miR-124 or TET1 expression comprising Down syndrome critical region 1 (DSCR1) protein as an active ingredient.

또한, 본 발명의 목적은 시험관 내에서(in vitro) DSCR1 단백질을 신경세포에 처리하는 단계를 포함하는 miR-124 또는 TET1 발현 조절 방법을 제공하는데 있다.It is also an object of the present invention to provide a method of regulating miR-124 or TET1 expression comprising treating neurons with DSCR1 protein in vitro.

본 발명은 다운증후군 위험 영역 1(Down syndrome critical region 1; DSCR1) 단백질을 유효성분으로 포함하는 시험관 내(in vitro) miR-124 발현 조절용 시약 조성물을 제공한다.The present invention provides a reagent composition for controlling in vitro miR-124 expression comprising Down syndrome critical region 1 (DSCR1) protein as an active ingredient.

또한, 본 발명은 DSCR1 단백질을 유효성분으로 포함하는 시험관 내(in vitro) TET1 발현 조절용 시약 조성물을 제공한다.The present invention also provides a reagent composition for controlling in vitro TET1 expression comprising the DSCR1 protein as an active ingredient.

또한, 본 발명은 시험관 내에서(in vitro) DSCR1 단백질을 신경세포에 처리하는 단계를 포함하는 miR-124 발현 조절 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for regulating miR-124 expression comprising treating neurons with DSCR1 protein in vitro.

또한, 본 발명은 시험관 내에서(in vitro) DSCR1 단백질을 신경세포에 처리하는 단계를 포함하는 TET1 발현 조절 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for regulating TET1 expression comprising treating neurons with DSCR1 protein in vitro.

본 발명은 성체 신경 발생을 조절하는 다운증후군 위험 영역 1(Down syndrome critical region 1; DSCR1)의 용도에 관한 것으로서, 특히, DSCR1이 성체 신경 발생 과정에 관여하고 있는 것으로 알려진 miRNA-124와 TET1을 조절함을 처음으로 밝혔으며, DSCR1이 miRNA-124-TET1 regulatory axis를 조절함으로써 성체 신경 발생에 문제가 있는 알츠하이머 병, 파킨슨 병 등의 신경장애 질환 치료에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.The present invention relates to the use of Down syndrome critical region 1 (DSCR1) for regulating adult neurogenesis, in particular the regulation of miRNA-124 and TET1, which DSCR1 is known to be involved in the adult neurogenesis process. It is expected that DSCR1 may be useful for the treatment of neurological disorders such as Alzheimer's disease and Parkinson's disease, which are problematic for adult neurogenesis by regulating the miRNA-124-TET1 regulatory axis.

도 1은 DSCR1이 결손된 쥐와 과발현된 쥐는 치상회에서 손상된 해마의 성체 신경 발생을 보여준다. DSCR1 결손 쥐와 과발현 쥐에서의 BrdU 및 Ki67 이중 양성 세포(n=3 pairs of mice)를 나타낸다. 수치는 mean ±s.e.m로 나타냈고, one-way ANOVA로 분석하였다. *P < 0.05; **P < 0.01.
도 2는 DSCR1이 miR-124 프로모터의 탈메틸화를 억제함으로써 miR-124 발현을 조절한다는 것을 나타낸다. (A-C) WT, DSCR1 TG 및 DSC1 KO 마우스의 해마에서 pri-, pre- 및 성숙 형태의 miR-124의 양을 qRT-PCR로 분석하였다(n　= 3 pairs of mice). ***P　< 0.001. **P　< 0.01. (D) miR-124의 프로모터와 연결된 루시퍼레이즈 유전자의 루시퍼레이즈 분석 결과를 나타낸다. 결과는 mean　± SD (n = 3)로 나타냈다. ***P　< 0.001. **P　< 0.01. *P　< 0.05. (E) WT, DSCR1 TG, DSCR1 KO 마우스의 miR-124 프로모터에서의 프로모터 메틸화를 유전자-특이적 중아황산염 서열분석을 통해 확인한 결과를 나타낸다(n　= 6 pairs of mice). 흰색 또는 검은색 원은 각각 비메틸화 및 메틸화된 CpG 사이트를 나타낸다.
도 3은 DSCR1이 TET1을 하향조절한다는 것을 나타낸다. (A) WT, DSCR1 TG 및 DSC1 KO 마우스의 해마에서 TET1의 양을 qRT-PCR로 분석하였다(n = 3 pairs of mice). **P < 0.01. *P < 0.05. (B) 해마에서 TET1 표지된 세포를 DAPI로 대비염색한 결과를 나타낸다. (C) WT, DSCR1 TG 및 DSCR1 KO 마우스의 치상회(dentate gyrus; DG)에서 상대 TET1 발현을 정량화한 결과를 나타낸다(n = 3 pairs of mice). (D) TET1의 프로모터와 연결된 루시퍼레이즈 유전자의 루시퍼레이즈 분석 결과를 나타낸다. 결과는 mean　± SD (n = 3)로 나타냈다. NS, 유의성 없음. (E) miR-124의 프로모터와 연결된 루시퍼레이즈 유전자의 루시퍼레이즈 분석 결과를 나타낸다. 결과는 mean　± SD (n = 3)로 나타냈다. *P < 0.05.
도 4는 DSCR1이 TET1 pre-mRNA에 특이적으로 결합하고, mRNA 스플라이싱(splicing)을 조절한다는 결과를 나타낸다. (A) WT, DSCR1 TG 및 DSC1 KO 마우스의 해마에서 TET1의 Pre-mRNA를 qRT-PCR로 분석하였다(n = 3 pairs of mice). NS, 유의성 없음. (B) DSCR1 유무에 따라 형질감염된 N2a 세포를 액티노마이신(actinomycin) D로 처리 후, 표시된 시간에 전체 RNA를 추출하여 qRT-PCR로 분석한 결과이다. (C) 비오틴화된 RNA/단백질 풀-다운 분석 결과를 나타낸다. (D) N2a 세포 추출물을 비오틴화 또는 미비오틴화된 TET1 exon1, intron1과 혼합하여 경쟁 분석을 수행한 결과를 나타낸다.1 shows adult neurogenesis of damaged hippocampus in the dentate gyrus of mice lacking DSCR1 and overexpressed mice. BrdU and Ki67 double positive cells (n = 3 pairs of mice) in DSCR1 deficient mice and overexpressed mice. Values were expressed as mean ± sem and analyzed by one-way ANOVA. * P <0.05; ** P <0.01.
2 shows that DSCR1 regulates miR-124 expression by inhibiting demethylation of the miR-124 promoter. (AC) The amounts of pri-, pre- and mature forms of miR-124 in the hippocampus of WT, DSCR1 TG and DSC1 KO mice were analyzed by qRT-PCR (n = 3 pairs of mice). *** P <0.001. ** P <0.01. (D) The results of the luciferase analysis of the luciferase gene linked to the promoter of miR-124 are shown. The results are expressed as mean ± SD (n = 3). *** P <0.001. ** P <0.01. * P <0.05. (E) Promoter methylation in miR-124 promoter of WT, DSCR1 TG, DSCR1 KO mice is confirmed by gene-specific bisulfite sequencing (n = 6 pairs of mice). White or black circles represent unmethylated and methylated CpG sites, respectively.
3 shows that DSCR1 downregulates TET1. (A) The amount of TET1 in the hippocampus of WT, DSCR1 TG and DSC1 KO mice was analyzed by qRT-PCR (n = 3 pairs of mice). ** P <0.01. * P <0.05. (B) The results of counterstaining of DET1 labeled cells with DAPI in hippocampus. (C) Relative TET1 expression is quantified in dentate gyrus (DG) of WT, DSCR1 TG and DSCR1 KO mice (n = 3 pairs of mice). (D) The result of the luciferase analysis of the luciferase gene linked with the promoter of TET1 is shown. The results are expressed as mean ± SD (n = 3). NS, no significance. (E) The results of the luciferase analysis of the luciferase gene linked to the promoter of miR-124 are shown. The results are expressed as mean ± SD (n = 3). * P <0.05.
4 shows that DSCR1 specifically binds to TET1 pre-mRNA and regulates mRNA splicing. (A) Pre-mRNA of TET1 was analyzed by qRT-PCR in hippocampus of WT, DSCR1 TG and DSC1 KO mice (n = 3 pairs of mice). NS, no significance. (B) N2a cells transfected with or without DSCR1 were treated with actinomycin D, and total RNA was extracted at the indicated time and analyzed by qRT-PCR. (C) Biotinylated RNA / protein pull-down assay results are shown. (D) N2a cell extracts were mixed with biotinylated or unbiotinylated TET1 exon1, intron1 to show the results of a competition assay.

본 발명은 다운증후군 위험 영역 1(Down syndrome critical region 1; DSCR1) 단백질을 유효성분으로 포함하는 시험관 내(in vitro) miR-124 발현 조절용 시약 조성물을 제공한다. The present invention provides a reagent composition for controlling in vitro miR-124 expression comprising Down syndrome critical region 1 (DSCR1) protein as an active ingredient.

상세하게는, 상기 조성물은 miR-124 프로모터의 활성을 감소시켜, miR-124 발현을 하향조절할 수 있으며, 상기 miR-124 프로모터의 활성 감소는 miR-124 프로모터 영역 내 CpG 사이트의 탈메틸화를 억제하는 것일 수 있다.Specifically, the composition can reduce the activity of the miR-124 promoter, thereby downregulating miR-124 expression, and reducing the activity of the miR-124 promoter inhibits demethylation of CpG sites in the miR-124 promoter region. It may be.

또한, 본 발명은 DSCR1 단백질을 유효성분으로 포함하는 시험관 내(in vitro) TET1 발현 조절용 시약 조성물을 제공한다.The present invention also provides a reagent composition for controlling in vitro TET1 expression comprising the DSCR1 protein as an active ingredient.

상세하게는, 상기 조성물은 TET1 pre-mRNA 스플라이싱(splicing)을 조절하여, TET1 발현을 하향조절할 수 있다.Specifically, the composition can downregulate TET1 expression by regulating TET1 pre-mRNA splicing.

또한, 본 발명은 시험관 내에서(in vitro) DSCR1 단백질을 신경세포에 처리하는 단계를 포함하는 miR-124 발현 조절 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for regulating miR-124 expression comprising treating neurons with DSCR1 protein in vitro.

상세하게는, 상기 방법은 miR-124 프로모터의 활성을 감소시켜, miR-124 발현을 하향조절할 수 있으며, 상기 miR-124 프로모터의 활성 감소는 miR-124 프로모터 영역 내 CpG 사이트의 탈메틸화를 억제하는 것일 수 있다.Specifically, the method can reduce the activity of the miR-124 promoter, thereby downregulating miR-124 expression, and reducing the activity of the miR-124 promoter inhibits demethylation of CpG sites in the miR-124 promoter region. It may be.

또한, 본 발명은 시험관 내에서(in vitro) DSCR1 단백질을 신경세포에 처리하는 단계를 포함하는 TET1 발현 조절 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for regulating TET1 expression comprising treating neurons with DSCR1 protein in vitro.

상세하게는, 상기 방법은 TET1 pre-mRNA 스플라이싱(splicing)을 조절하여, TET1 발현을 하향조절할 수 있다.Specifically, the method can downregulate TET1 expression by regulating TET1 pre-mRNA splicing.

본 발명에 있어서, DSCR1 단백질은 Gene ID 1827일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the DSCR1 protein may be Gene ID 1827, but is not limited thereto.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.Hereinafter, examples will be described in detail to help understand the present invention. However, the following examples are merely to illustrate the content of the present invention is not limited to the scope of the present invention. The embodiments of the present invention are provided to more completely explain the present invention to those skilled in the art.

<< 실시예Example 1> 성체 신경 발생 과정에서의  1> During adult neurogenesis DSCR1의Of DSCR1 역할 role

성체 신경 발생(Adult neurogenesis)은 성체 신경줄기세포(adult neuronal stem cell)와 간세포(progenitor cell)들의 증식(proliferation), 분화(differentiation), 성숙(maturation) 그리고 새로운 신경세포들이 기존 신경세포들과 연결망을 형성하는 통합(integration)의 과정을 포함한다. 본 발명자들은 브로모데옥시우리딘(bromodeoxyuridine; BrdU) 주입을 통하여 치상회 간세포의 증식을 살펴본 결과, DSCR1이 결손된 쥐(DSCR1 KO mice)와 과발현된 쥐(DSCR1 TG mice)에서 증식이 줄어든 것을 확인하였다. 이는 정상적인 DSCR1의 발현이 신경 간세포들의 정상적인 증식에 필수적임을 보여준다(도 1). Adult neurogenesis involves the proliferation, differentiation, maturation and maturation of adult neuronal stem and progenitor cells into new neurons. It involves a process of integration that forms. The present inventors examined the proliferation of dentate hepatic hepatocytes through bromodeoxyuridine (BrdU) injection, and found that the proliferation was reduced in mice lacking DSCR1 (DSCR1 KO mice) and overexpressed mice (DSCR1 TG mice). It was. This shows that normal DSCR1 expression is essential for normal proliferation of neural stem cells (FIG. 1).

<< 실시예Example 2>  2> miRmiR -124에 대한 메틸화-의존 침묵을 유발하는 To cause methylation-dependent silencing for -124 DSCR1DSCR1

microRNA는 non-coding RNA로서 다양한 생물학적 과정에 참여하며, 성체 신경 발생 과정에서도 몇몇 마이크로 RNA가 연관되어 있다. 그 중에서도 특히 miR-124는 뇌의 모든 영역에서 많이 발현되며 신경발달에 주도적 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 본 발명자들은 DSCR1과 miR-124가 상호적으로 작용을 하고 있는 것을 밝혔다. 본 발명자들은 DSCR1의 3’UTR에 miR-124 결합사이트가 있다는 것을 확인하였다. DSCR1이 miR-124를 하향 조절하는지 확인하기 위해서, 본 발명자들은 DSCR1 TG 및 DSCR1 KO 마우스의 해마를 사용하여 qRT-PCR을 수행하였다. DSCR1 TG에서는 pri-miR-124, pre-miR-124 및 성숙 miR-124 발현이 감소되는 것으로 나타났다. 반대로 DSCR1 KO에서는 pri-miR-124, pre-miR-124 및 성숙 miR-124 발현이 증가하는 것으로 나타났다(도 2A 내지 도 2C). 이는 DSCR1이 miR-124 성숙 과정에는 관여하지 않고 전사 조절에 관여할 수도 있다는 것을 나타낸다. DSCR1이 miR-124의 전사를 조절하는지 확인하기 위해서, 본 발명자들은 miR-124 프로모터를 포함하는 루시퍼레이즈 구조체를 사용하여 N2A 세포에서 전사 분석을 수행하였다. DSCR1의 과발현은 miR-124 프로모터의 활성을 상당히 감소시킨 반면, DSCR1의 감소는 miR-124 프로모터의 활성을 향상시켰다. 이러한 결과는 DSCR1이 miR-124의 전사를 조절한다는 것을 뒷받침한다(도 2D). 한편, 본 발명자들은 miR-124에 메틸화 사이트가 존재할 수 있고, DSCR1이 이를 조절할 수도 있다고 추정하였다. 이러한 점을 확인하기 위해서, 본 발명자들은 miR-124 프로모터 영역에서의 후성유전적인(epigenetic) 변화를 확인하였다. 본 발명자들은 miR-124 프로모터 영역 내 CpGs의 메틸화 상태를 확인하기 위해서 중아황산염 서열분석(bisulfite sequencing)을 수행하였다. 대조군과 비교하여, DSCR1 TG의 miR-124 프로모터 영역 내 CpGs에서 메틸화가 상당히 증가된 것을 확인하였다. 하지만, DSCR1 KO 프로모터 내의 시토신(cytosine) 대부분은 탈메틸화된 시토신(cytosine)이었다(도 2E). microRNAs are non-coding RNAs that participate in a variety of biological processes, and several microRNAs are involved in adult neurogenesis. Among them, miR-124 is particularly expressed in all areas of the brain and is known to play a leading role in neurodevelopment. The inventors found that DSCR1 and miR-124 interacted with each other. The present inventors confirmed that miR-124 binding site exists at 3'UTR of DSCR1. To confirm that DSCR1 downregulates miR-124, we performed qRT-PCR using hippocampus of DSCR1 TG and DSCR1 KO mice. In DSCR1 TG, pri-miR-124, pre-miR-124 and mature miR-124 expression was shown to be reduced. In contrast, the expression of pri-miR-124, pre-miR-124 and mature miR-124 was increased in DSCR1 KO (FIGS. 2A-2C). This indicates that DSCR1 may be involved in transcriptional regulation without being involved in the miR-124 maturation process. To confirm that DSCR1 modulates transcription of miR-124, we performed transcriptional analysis in N2A cells using a luciferase construct comprising the miR-124 promoter. Overexpression of DSCR1 significantly reduced the activity of the miR-124 promoter, whereas reduction of DSCR1 improved the activity of the miR-124 promoter. These results support that DSCR1 regulates the transcription of miR-124 (FIG. 2D). On the other hand, the present inventors estimated that methylation sites may exist in miR-124, and DSCR1 may regulate it. To confirm this, the inventors have identified epigenetic changes in the miR-124 promoter region. We performed bisulfite sequencing to confirm the methylation status of CpGs in the miR-124 promoter region. Compared with the control, it was confirmed that methylation was significantly increased in CpGs in the miR-124 promoter region of DSCR1 TG. However, most of the cytosine in the DSCR1 KO promoter was demethylated cytosine (FIG. 2E).

<< 실시예Example 3>  3> TET1을TET1 음성적으로 조절하는  Negatively controlled DSCR1DSCR1

TET1이 결손된 마우스를 사용한 기존 연구에서 신경줄기세포의 증식과 신경보호와 연관되어 있는 유전자들의 과잉 메틸화에 의해 신경줄기세포의 증식이 감소되었으며 이로 인해 성체 신경 발생 또한 감소하였음을 보였다. 그리고 다운증후군 환자의 DNA 메틸화가 정상인에 비해 다르게 일어나는 것으로 알려졌으며, 이러한 차이로 인하여 신경 발생에 문제가 생기는 것으로 보인다.Previous studies using mice lacking TET1 have shown that neural stem cell proliferation was reduced by over-methylation of genes associated with neural stem cell proliferation and neuroprotection, thereby reducing adult neurogenesis. DNA methylation in Down syndrome patients is known to occur differently than normal patients, and this difference seems to cause neurogenesis.

흥미롭게도, DSCR1이 TET1 발현에 특이적으로 영향을 미쳤다. 본 발명자들은 DSCR1 TG 및 DSCR1 KO 마우스의 해마에서 TET1 수준 변화를 qRT-PCR을 통해 확인하였다(도 3A). 다음으로, 본 발명자들은 DSCR1 TG 및 DSCR1 KO 마우스의 치상회(dentate gyrus; DG)에서 TET1의 단백질 수준을 면역조직화학분석을 통해 확인하였다. TET mRNA 수준과 일치하게, TET1 단백질 수준도 DSCR1 수준과 음성적으로 관련되어 있었다(도 3B 및 도 3C). 다만, DSCR1은 TET1의 프로모터 활성을 변화시키지는 않았다(도 3D). 이후, 본 발명자들은 TET1이 miR-124 발현을 조절하는지 확인하였다. TET1과 함께 DSCR1을 녹다운시키면, 증가된 miR-124 프로모터 활성이 되돌아갔다(도 3E). 종합하면, 상기 결과는 DSCR1이 TET1을 변형시켜 miR-124를 조절한다는 것을 뒷받침한다.Interestingly, DSCR1 specifically affected TET1 expression. We confirmed changes in TET1 levels in the hippocampus of DSCR1 TG and DSCR1 KO mice via qRT-PCR (FIG. 3A). Next, the inventors confirmed the protein level of TET1 in the dentate gyrus (DG) of DSCR1 TG and DSCR1 KO mice by immunohistochemistry. Consistent with TET mRNA levels, TET1 protein levels were also negatively associated with DSCR1 levels (FIGS. 3B and 3C). However, DSCR1 did not change the promoter activity of TET1 (FIG. 3D). The inventors then confirmed whether TET1 regulates miR-124 expression. Knocking down DSCR1 with TET1 reversed the increased miR-124 promoter activity (FIG. 3E). Taken together, the results support that DSCR1 modulates TET1 to regulate miR-124.

하지만, 본 발명자들은 DSCR1 TG 및 DSCR1 KO 마우스의 해마에서, DSCR1이 TET1 pre-mRNA 발현 수준에는 영향을 미치지 않는다는 것을 qRT-PCR을 통해 확인하였다(도 4A). DSCR1이 TET1 발현을 어떻게 조절하는지 확인하기 위해서, 본 발명자들은 먼저 TET1 mRNA의 안정성에 있어 DSCR1의 영향을 확인하였다. 본 발명자들은 N2A 세포에서 전사 억제제인 액티노마이신 D(actinomycin D; Act D)를 20시간 동안 처리하였다. TET1 mRNAs는 대조군과 유사한 정도로 감소하였다(도 4B). 다음으로, DSCR1이 TET1 pre-mRNA 스플라이싱(splicing)을 조절하는지 확인하였다. 결국, 본 발명자들은 비오틴-표지된 TET1 pre-mRNAs을 제작하였다. 미비오틴화 또는 비오틴화된 TET1 exon1, intron1 및 intron2을 N2A 세포 용해물과 함께 처리하였고, 스트렙타비딘(streptavidin)-접합된 비드로 풀다운시켰다. DSCR1는 TET1 intron1 및 intron2에는 직접 결합하였으나, TET1 exon1에는 결합하지 않았다(도 4C). DSCR1이 TET1 pre-mRNA의 스플라이싱 과정에 있어서, 직접 또는 간접적으로 결합 친화도에 영향을 미치는지 확인하기 위해서, U1 snRNA 및 U2 snRNA 존재시 DSCR1 및 TET1 intron1 간의 상호작용을 관측하였다. intron1과 DSCR1 결합 세기는 U1 snRNA 및 U2 snRNA의 증가에 따라 감소하였다(도 4D). 종합하면, 상기 결과는 DSCR1이 스플라이싱 과정에 직접적으로 경쟁함으로써 스플라이싱에 영향을 미친다는 것을 뒷받침하고 있다.However, we confirmed via qRT-PCR that, in the hippocampus of DSCR1 TG and DSCR1 KO mice, DSCR1 did not affect TET1 pre-mRNA expression levels (FIG. 4A). To confirm how DSCR1 regulates TET1 expression, we first identified the effect of DSCR1 on the stability of TET1 mRNA. We treated 20% of the actinomycin D (act D), a transcription inhibitor, in N2A cells. TET1 mRNAs were reduced to a similar extent as the control (FIG. 4B). Next, it was confirmed that DSCR1 regulates TET1 pre-mRNA splicing. In the end, we produced biotin-labeled TET1 pre-mRNAs. Mibiotinylated or biotinylated TET1 exon1, intron1 and intron2 were treated with N2A cell lysate and pulled down to streptavidin-conjugated beads. DSCR1 binds directly to TET1 intron1 and intron2, but not to TET1 exon1 (FIG. 4C). In order to determine whether DSCR1 affects binding affinity directly or indirectly in the splicing process of TET1 pre-mRNA, the interaction between DSCR1 and TET1 intron1 in the presence of U1 snRNA and U2 snRNA was observed. Intron1 and DSCR1 binding intensity decreased with increasing U1 snRNA and U2 snRNA (FIG. 4D). Taken together, the results support that DSCR1 influences splicing by directly competing for the splicing process.

Claims (10)

다운증후군 위험 영역 1(Down syndrome critical region 1; DSCR1) 단백질을 유효성분으로 포함하는 시험관 내(in vitro) miR-124 발현 하향조절용 시약 조성물.Reagent composition for down-regulation of in vitro miR-124 expression comprising Down syndrome critical region 1 (DSCR1) protein as an active ingredient. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 miR-124 프로모터의 활성을 감소시켜, miR-124 발현을 하향조절하는 것을 특징으로 하는 시약 조성물.The reagent composition of claim 1, wherein the composition reduces the activity of the miR-124 promoter to downregulate miR-124 expression. 제2항에 있어서, 상기 miR-124 프로모터의 활성 감소는 miR-124 프로모터 영역 내 CpG 사이트의 탈메틸화를 억제하는 것을 특징으로 하는 시약 조성물.The reagent composition of claim 2, wherein the decrease in activity of the miR-124 promoter inhibits demethylation of CpG sites in the miR-124 promoter region. DSCR1 단백질을 유효성분으로 포함하는 시험관 내(in vitro) TET1 발현 하향조절용 시약 조성물.In vitro TET1 expression downregulation reagent composition comprising a DSCR1 protein as an active ingredient. 제4항에 있어서, 상기 조성물은 TET1 pre-mRNA 스플라이싱(splicing)을 조절하여, TET1 발현을 하향조절하는 것을 특징으로 하는 시약 조성물.The reagent composition of claim 4, wherein the composition modulates TET1 pre-mRNA splicing to downregulate TET1 expression. 시험관 내에서(in vitro) DSCR1 단백질을 신경세포에 처리하는 단계를 포함하는 miR-124 발현 하향조절 방법.A method of downregulating miR-124 expression comprising treating neurons with an DSCR1 protein in vitro. 제6항에 있어서, 상기 방법은 miR-124 프로모터의 활성을 감소시켜, miR-124 발현을 하향조절하는 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 6, wherein the method reduces the activity of the miR-124 promoter to downregulate miR-124 expression. 제7항에 있어서, 상기 miR-124 프로모터의 활성 감소는 miR-124 프로모터 영역 내 CpG 사이트의 탈메틸화를 억제하는 것을 특징으로 하는 방법.8. The method of claim 7, wherein the reduced activity of the miR-124 promoter inhibits demethylation of CpG sites in the miR-124 promoter region. 시험관 내에서(in vitro) DSCR1 단백질을 신경세포에 처리하는 단계를 포함하는 TET1 발현 하향조절 방법.A method of downregulating TET1 expression comprising treating neurons with an DSCR1 protein in vitro. 제9항에 있어서, 상기 방법은 TET1 pre-mRNA 스플라이싱(splicing)을 조절하여, TET1 발현을 하향조절하는 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 9, wherein the method modulates TET1 pre-mRNA splicing to downregulate TET1 expression.
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