KR102076340B1 - 미생물 유래 효소 매개 탄산칼슘 침전을 이용한 친환경 지반 보강 방법 - Google Patents
미생물 유래 효소 매개 탄산칼슘 침전을 이용한 친환경 지반 보강 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 환경오염의 우려가 있는 비 토착 미생물을 사용하지 않으면서도 활성도가 높은 미생물 유래 요소분해효소를 사용하므로 토양 미생물 생태계의 교란 없이 합성수지 및 시멘트를 대체하여 경사지 또는 지반을 친환경적으로 보강할 수 있는 장점이 있다.
또한 본 발명은 미생물에 대비하여 크기가 작고 수용성인 요소분해효소를 고농도로 포함하는 추출액을 사용하므로 토양공극을 통한 침투가 유리하며 세립토가 포함된 경사지 또는 연약 혼합토 지반에서도 지반 깊숙이 침투하여 탄산칼슘 침전반응을 통한 지반 고결이 가능한 장점이 있다. 특히, 상기 세립토가 포함된 경사지 또는 혼합토 지반에 적용되면 압축강도 및 연성은 증가시키는 반면 투수도는 감소시켜 지반을 보강하는 효과가 있다.
또한 본 발명은 미생물에 대비하여 크기가 작고 수용성인 요소분해효소를 고농도로 포함하는 추출액을 사용하므로 토양공극을 통한 침투가 유리하며 세립토가 포함된 경사지 또는 연약 혼합토 지반에서도 지반 깊숙이 침투하여 탄산칼슘 침전반응을 통한 지반 고결이 가능한 장점이 있다. 특히, 상기 세립토가 포함된 경사지 또는 혼합토 지반에 적용되면 압축강도 및 연성은 증가시키는 반면 투수도는 감소시켜 지반을 보강하는 효과가 있다.
Description
본 발명은 종래의 미생물 매개 탄산칼슘 침전법(Microbially Induced Calcium carbonate Precipitation, MICP)을 이용한 경사지반 및 천연시멘트(biocement) 제작 방법의 단점을 보완하기 위하여 상기 요소분해효소 활성 미생물에서 요소분효소만을 추출하여 탄산칼슘을 석출하는 미생물 유래 효소 매개 탄산칼슘 침전법(Bacteria Enzyme Induced Calcium carbonate Precipitation, BEICP)을 이용한 경사지 또는 지반의 보강 방법에 관한 것이다.
시멘트는 현재 지반공학을 포함한 토목공학 전 분야에서 사용되고 있는 가장 유용한 고결재료이다. 그러나 시멘트의 원료인 석회석을 채취하는 과정에서 발생하는 삼림파괴와 시멘트 제조 과정에서 발생하는 대기 오염으로 인해 시멘트 이용에 대한 다양한 환경적인 문제점이 제기되고 있는 실정이다. 최근 이를 보완하기 위하여 친환경 고결 재료들이 이용되고 있으며 특히, 요소분해효소 활성 미생물 (urease producing bacteria or enzyme producing bacteria)에 의해 유도되는 탄산칼슘(calcium carbonate, CaCO3)을 석출하는 방법인 미생물 매개 탄산칼슘 침전법(Microbially Induced Calcium carbonate Precipitation, MICP)이 미국, 네덜란드, 일본, 중국 등에서 활발히 연구되고 있다. 상기 방법은 요소분해효소 활성 미생물에 의해 요소(urea)가 암모늄 이온(NH4+)과 탄산염 이온(CO3 2-)으로 분해되고, 상기 분해된 탄산염 이온(CO3 2-)이 칼슘이온(Ca2+)과 반응하여 탄산칼슘(CaCO3)을 생성하는 기술로서 상기 기술을 경사지 또는 지반에서 수행하게 되면 경사지 또는 지반내에서 상기 탄산칼슘이 생성되어 보강되는 것을 특징으로 한다.
상기 MICP 방법은 기본적으로 요소분해효소 활성 미생물 (urease activity bacteria)를 사용한다. 상기 미생물은 대표적으로 스포로사르시나 파스테우리(Sporosarcina Pasteurii), 스포로사르시나 우레에(Sporosarcina Ureae), 프로테우스 불가리스(Proteus Vulgaris), 바실러스 스파에리쿠스(Bacillus Sphaericus), 믹스코커스 잔토스(Myxococcus Xanthus), 프로테우스 미라빌리스(Proteus Mirabilis), 헬리코박터 파이로리(Helicobacter Pylori) 등의 미생물을 이용한다.
그러나 상기 MICP에 사용하는 미생물은 지반에 서식하는 토착 미생물이 아니다. 따라서 지반 보강을 위하여 상기 미생물을 살포하는 경우 외래 미생물에 의한 지반내 미생물 생태계의 교란이 우려된다. 또한 상기 MICP 방법은 0.75㎜ 이하의 입자의 크기를 가진 세립토가 포함된 혼합토 지반에서는 지반 보강 효과가 미미한 한계가 있었다.
한국등록특허 10-1030761에는 스포로사르시나 파스테우리(Sporosarcina Pasteurii) 배양액을 고결제로 사용한 것이 개시되어 있다. 상기 스포로사르시나 파스테우리 배양액은 조립토에 해당하는 모래(sand)와 세립토에 해당하는 실트질토(황토, silt soil)가 혼합된 토양에 처리되어 탄산칼슘을 생성하므로 토양을 보강하는 효과가 있다.
또한 한국등록특허 10-1152295에는 콩에 존재하는 요소분해효소를 이용한 지반의 고결화(cementation) 방법으로서 콩 추출액을 고결제로 사용하여 토양을 보강하는 방법이 개시되어 있다. 그러나 상기 한국등록특허 10-1030761 및 10-1152295는 모두 토양을 실험접시 위에 담은 후 상기 고결제를 살포하여 토양 표면의 고결화 정도만을 확인한 것으로 실제 지반에 적용하는 것과는 그 차이가 확연하다.
상기 고결제를 실제 경사지나 지반에 적용하기 위해서는 상기 고결제가 지반의 일정 깊이까지 침투한 후 탄산칼슘을 생성하여야만 지반을 보강하는 효과가 나타나게 된다. 특히, 세립토가 포함된 혼합토 지반의 경우 투수도가 낮아 고결제가 침투되는 시간이 지체된다. 상기 고결제가 침투되는 동안 탄산칼슘이 침전되어 고결되면 토양 공극이 사라지게 된다. 상기 토양 공극이 사라지면 더 이상 고결제가 침투 할 수 없게 되므로 지반의 표면에서만 고결화가 진행되어 지반을 보강하는 효과가 사라지게 된다.
상기 등록특허들은 모두 상기 미생물 배양액의 지반 침투에 대한 고려 없이 토양의 표면에서 발생한 고결제 용액에 의한 고결화를 확인하는 수준에 머무르고 있어 실제 지반에서 상기 미생물 배양액을 이용한 지반 고결화가 가능한지에 대한 실험적 검증이 더 필요한 상황이다.
상기 한국등록특허 10-1152295는 미생물을 사용하지 않고 식물의 요소분해효소를 포함하는 콩추출액을 사용하므로 미생물의 성장에 필요한 조건을 유지할 필요가 없고 미생물의 투입으로 인한 지반 내 미생물 생태계의 교란을 우려할 필요가 없는 장점이 있다. 그러나 상기 식물 유래 요소분해효소는 토양환경에서 상기 효소의 활성이 유지되기 어려우며 특히, 황토와 같은 세립토가 포함된 혼합토에 대한 고결화 효과가 개시되어 있지 않아 실제 경사지나 지반에 적용이 어려운 한계가 있다.
본 명세서에서 언급된 특허문헌 및 참고문헌은 각각의 문헌이 참조에 의해 개별적이고 명확하게 특정된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참조로 삽입된다.
Oliveira, P. J. V., Freitas, L. D., and Carmona, J. P. S. F. 2016. Journal of Materials in Civil Engineering, 29(4), 1-7.
Mitchell, A. C., and Ferris, F. G. 2005. Geochimica et Cosmochimica Acta, 69(17), 4199-4210.
Mitchell, A. C., and Ferris, F. G. 2006a. Environmental Science and Technology, 40(3), 1008-1014.
Mitchell, A. C., and Ferris, F. G. 2006b. Geomicrobiology Journal, 23(3-4), 213-226.
본 발명은 상기 문제를 해결하기 위한 것으로 활성이 높은 미생물 유래 요소분해효소 추출액을 사용함으로써 비 토착 미생물의 살포로 인한 미생물 생태계 교란 문제를 해결하고 세립토를 포함하는 혼합토 지반으로 구성된 경사지 또는 지반에 대한 보강을 친환경적으로 수행하는데 그 목적이 있다.
본 발명의 다른 목적 및 기술적 특징은 이하의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 구체적으로 제시된다.
본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여 다음의 단계를 포함하는 미생물 유래 효소 매개 탄산칼슘 침전법을 이용한 경사지 또는 지반의 보강 방법을 제공한다:
요소분해효소활성 미생물 배양액을 제조하는 제 1 단계; 상기 요소분해효소활성 미생물을 파쇄하고 불수용성 성분을 제거하여 요소분해효소 추출액을 제조하는 제 2 단계;
상기 요소분해효소 추출액을 지반에 살포하여 토양알갱이에 상기 요소분해효소가 포집되도록 하는 제 3 단계; 상기 지반의 토양알갱이에 포집되지 않은 요소분해효소를 상기 토양공극으로부터 배출시키는 제 4 단계; 상기 요소분해효소가 배출된 지반에 요소-염화칼슘 혼합액을 살포하여 탄산칼슘을 침전시키는 제 5 단계; 및 상기 탄산칼슘 침전된 지반에 물을 살포하여 수용성 부산물을 제거하고 상기 물을 배출시키는 제 6 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 미생물 유래 효소 매개 탄산칼슘 침전법을 이용한 지반 보강 방법.
상기 지반은 전체 100 중량%의 토양에 대비하여 세립토가 5 내지 80 중량%로 포함된 혼합토 지반이며 상기 요소분해효소활성 미생물은 스포로사르시나 파스테우리(Sporosarcina Pasteurii), 스포로사시나 우레에(Sporosarcina Ureae), 프로테우스 불가리스(Proteus Vulgaris), 바실러스 스파에리쿠스(Bacillus Sphaericus), 믹스코커스 잔토스(Myxococcus Xanthus), 프로테우스 미라빌리스(Proteus Mirabilis), 및 헬리코박터 파이로리(Helicobacter Pylori)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 미생물 또는 둘 이상의 미생물이다.
특히, 본 발명의 요소분해효소 추출액은 미생물을 포함하지 않아 미생물 생태계 교란 우려가 없으며, 본 발명에 의해 보강된 경사지 또는 연약 혼합토 지반은 세립토의 알갱이와 직경이 1 내지 4㎛에 해당하는 미세한 탄산칼슘 크리스탈을 포함하는 복합체가 조립토의 토양공극을 채워 경사지 또는 지반의 압축강도 및 연성이 향상되고 투수도는 감소된 것을 특징으로 한다.
본 발명은 환경오염의 우려가 있는 비 토착 미생물을 사용하지 않으면서도 활성도가 높은 미생물 유래 요소분해효소를 사용하므로 토양 미생물 생태계의 교란 없이 합성수지 및 시멘트를 대체하여 경사지 또는 지반을 친환경적으로 보강할 수 있는 장점이 있다.
또한 본 발명은 미생물에 대비하여 크기가 작고 수용성인 요소분해효소를 고농도로 포함하는 추출액을 사용하므로 토양공극을 통한 침투가 유리하며 세립토가 포함된 경사지 또는 연약 혼합토 지반에서도 지반 깊숙이 침투하여 탄산칼슘 침전반응을 통한 지반 고결이 가능한 장점이 있다. 특히, 상기 세립토가 포함된 경사지 또는 혼합토 지반에 적용되면 압축강도 및 연성은 증가시키는 반면 투수도는 감소시켜 지반을 보강하는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 미생물 배양액과 요소분해효소 추출액의 광학현미경 관찰결과를 보여준다. 패널 (a)는 초음파 처리전의 미생물 배양액을 보여주며 상기 패널 (b)는 요소분해효소 추출액을 보여준다.
도 2는 본 발명의 조립토, 제 1 혼합토 및 제 2 혼합토의 알갱이 크기 분포를 보여준다.
도 3은 본 발명의 토양컬럼의 구조와 순환투수공정을 보여준다.
도 4는 본 발명의 MICP 조립토 컬럼과 BEICP 조립토 컬럼의 탄산칼슘 침전에 따른 압축강도의 변화를 보여준다.
도 5는 본 발명의 MICP 조립토 컬럼과 BEICP 조립토 컬럼의 탄산칼슘 침전에 따른 투수도의 변화를 보여준다.
도 6은 본 발명의 MICP 조립토 컬럼과 BEICP 조립토 컬럼 처리 사이클에 따른 압축강도 증가 및 투수도 감소 정도를 보여준다. 패널 (a)는 압축강도의 변화효율을 보여주며 패널 (b)는 투수도 감소효율을 보여준다.
도 7은 본 발명의 MICP 조립토 컬럼과 BEICP 조립토 컬럼의 공극사이에 형성된 탄산칼슘 침전물을 주사전자현미경으로 관찰한 결과 및 그 그림을 보여준다.
도 8은 본 발명의 MICP 조립토 컬럼과 BEICP 조립토 컬럼의 X-선 회절 분석결과를 보여준다. 패널 (a)는 MICP 조립토 컬럼의 결과를 보여주며 패널(b)는 BEICP 조립토 컬럼의 결과를 보여준다.
도 9는 본 발명의 8 사이클로 처리한 BEICP 제 2 혼합토 컬럼을 보여준다.
도 10은 본 발명의 BEICP 조립토 컬럼, BEICP 제1 혼합토 및 BEICP 제 2 혼합토의 탄산칼슘 침전 정도에 따른 압축강도의 변화를 보여준다.
도 11은 본 발명의 MICP 조립토 컬럼, BEICP 조립토 컬럼, BEICP 제 1 혼합토 컬럼 및 BEICP 제 2 혼합토 컬럼의 응력변형곡선 분석결과를 보여준다.
도 12는 본 발명의 BEICP 조립토 컬럼, BEICP 제 1 혼합토 컬럼 및 BEICP 제 2 혼합토 컬럼의 탄산칼슘 침전 정도에 따른 투수도의 변화를 보여준다.
도 13은 본 발명의 BEICP 제 1 혼합토 컬럼과 BEICP 제 2 혼합토 컬럼의 공극사이에 형성된 탄산칼슘 침전물을 주사전자현미경으로 관찰한 결과 및 그 그림을 보여준다. 패널 (a)는 BEICP 제 1 혼합토 컬럼에서 탄산칼슘 침전물이 조립토 알갱이 사이의 직접적인 브릿지에 의해 결속되며 세립토 알갱이 및 탄산칼슘 침전물이 공존하는 것을 보여주며 패널 (b)는 BEICP 제 2 혼합토 컬럼에서 조립토 알갱이가 조립토 알갱이-세립토 알갱이-탄산칼슘 침전물 매트릭스에 의해 결속되는 것을 보여준다.
도 14는 본 발명의 혼합토에 대한 X-선 회절 분석결과를 보여준다. 패널 (a)는 아무런 처리를 하지 않은 혼합토의 분석결과를 보여주며, 패널 (b)는 BEICP 제 1 혼합토에 대한 분석결과를 보여주며, 패널(c)는 BEICP 제 2 혼합토에 대한 분석결과를 보여준다.
도 15는 본 발명의 MICP 또는 BECIP 처리된 토양에 대한 주사전자현미경 분석결과를 보여준다. 패널 (a)는 8 사이클 처리한 MICP 조립토의 결과를 보여주며, 패널 (b)는 8 사이클 처리한 BEICP 조립토의 결과를 보여주며, 패널 (c)는 16 사이클 처리한 BEICP 조립토의 결과를 보여주며, 패널 (d)는 8 사이클 처리한 BEICP 제 2 혼합토의 결과를 보여주며, 패널 (e)는 16 사이클 처리한 BEICP 제 2 혼합토의 결과를 보여준다.
도 2는 본 발명의 조립토, 제 1 혼합토 및 제 2 혼합토의 알갱이 크기 분포를 보여준다.
도 3은 본 발명의 토양컬럼의 구조와 순환투수공정을 보여준다.
도 4는 본 발명의 MICP 조립토 컬럼과 BEICP 조립토 컬럼의 탄산칼슘 침전에 따른 압축강도의 변화를 보여준다.
도 5는 본 발명의 MICP 조립토 컬럼과 BEICP 조립토 컬럼의 탄산칼슘 침전에 따른 투수도의 변화를 보여준다.
도 6은 본 발명의 MICP 조립토 컬럼과 BEICP 조립토 컬럼 처리 사이클에 따른 압축강도 증가 및 투수도 감소 정도를 보여준다. 패널 (a)는 압축강도의 변화효율을 보여주며 패널 (b)는 투수도 감소효율을 보여준다.
도 7은 본 발명의 MICP 조립토 컬럼과 BEICP 조립토 컬럼의 공극사이에 형성된 탄산칼슘 침전물을 주사전자현미경으로 관찰한 결과 및 그 그림을 보여준다.
도 8은 본 발명의 MICP 조립토 컬럼과 BEICP 조립토 컬럼의 X-선 회절 분석결과를 보여준다. 패널 (a)는 MICP 조립토 컬럼의 결과를 보여주며 패널(b)는 BEICP 조립토 컬럼의 결과를 보여준다.
도 9는 본 발명의 8 사이클로 처리한 BEICP 제 2 혼합토 컬럼을 보여준다.
도 10은 본 발명의 BEICP 조립토 컬럼, BEICP 제1 혼합토 및 BEICP 제 2 혼합토의 탄산칼슘 침전 정도에 따른 압축강도의 변화를 보여준다.
도 11은 본 발명의 MICP 조립토 컬럼, BEICP 조립토 컬럼, BEICP 제 1 혼합토 컬럼 및 BEICP 제 2 혼합토 컬럼의 응력변형곡선 분석결과를 보여준다.
도 12는 본 발명의 BEICP 조립토 컬럼, BEICP 제 1 혼합토 컬럼 및 BEICP 제 2 혼합토 컬럼의 탄산칼슘 침전 정도에 따른 투수도의 변화를 보여준다.
도 13은 본 발명의 BEICP 제 1 혼합토 컬럼과 BEICP 제 2 혼합토 컬럼의 공극사이에 형성된 탄산칼슘 침전물을 주사전자현미경으로 관찰한 결과 및 그 그림을 보여준다. 패널 (a)는 BEICP 제 1 혼합토 컬럼에서 탄산칼슘 침전물이 조립토 알갱이 사이의 직접적인 브릿지에 의해 결속되며 세립토 알갱이 및 탄산칼슘 침전물이 공존하는 것을 보여주며 패널 (b)는 BEICP 제 2 혼합토 컬럼에서 조립토 알갱이가 조립토 알갱이-세립토 알갱이-탄산칼슘 침전물 매트릭스에 의해 결속되는 것을 보여준다.
도 14는 본 발명의 혼합토에 대한 X-선 회절 분석결과를 보여준다. 패널 (a)는 아무런 처리를 하지 않은 혼합토의 분석결과를 보여주며, 패널 (b)는 BEICP 제 1 혼합토에 대한 분석결과를 보여주며, 패널(c)는 BEICP 제 2 혼합토에 대한 분석결과를 보여준다.
도 15는 본 발명의 MICP 또는 BECIP 처리된 토양에 대한 주사전자현미경 분석결과를 보여준다. 패널 (a)는 8 사이클 처리한 MICP 조립토의 결과를 보여주며, 패널 (b)는 8 사이클 처리한 BEICP 조립토의 결과를 보여주며, 패널 (c)는 16 사이클 처리한 BEICP 조립토의 결과를 보여주며, 패널 (d)는 8 사이클 처리한 BEICP 제 2 혼합토의 결과를 보여주며, 패널 (e)는 16 사이클 처리한 BEICP 제 2 혼합토의 결과를 보여준다.
본 발명은 미생물 유래 효소 매개 탄산칼슘 침전법을 이용한 지반 보강 방법을 제공한다. 본 발명의 보강방법은 요소분해효소활성 미생물 배양액을 제조하는 제 1 단계; 상기 요소분해효소활성 미생물을 파쇄하고 불수용성 성분을 제거하여 요소분해효소 추출액을 제조하는 제 2 단계; 상기 요소분해효소 추출액을 지반에 살포하여 토양알갱이에 상기 요소분해효소가 포집되도록 하는 제 3 단계; 상기 지반의 토양알갱이에 포집되지 않은 요소분해효소를 상기 토양공극으로부터 배출시키는 제 4 단계; 상기 요소분해효소가 배출된 지반에 요소-염화칼슘 혼합액을 살포하여 탄산칼슘을 침전시키는 제 5 단계; 및 상기 탄산칼슘 침전된 지반에 물을 살포하여 수용성 부산물을 제거하고 상기 물을 배출시키는 제 6 단계로 구성된다.
제 1 단계: 요소분해효소 활성 미생물의 배양 단계
본 발명은 미생물 유래 효소 매개 탄산칼슘 침전법에 사용하기 위한 미생물을 배양한다. 상기 미생물은 요소분해효소(urease)의 활성을 가지는 미생물로서 스포로사르시나 파스테우리(Sporosarcina Pasteurii), 스포로사시나 우레에(Sporosarcina Ureae), 프로테우스 불가리스(Proteus Vulgaris), 바실러스 스파에리쿠스(Bacillus Sphaericus), 믹스코커스 잔토스(Myxococcus Xanthus), 프로테우스 미라빌리스(Proteus Mirabilis), 및 헬리코박터 파이로리(Helicobacter Pylori)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 미생물 또는 둘 이상의 미생물일 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 요소분해효소 활성 미생물은 스포로사르시나 파스테우리이다.
상기 미생물은 토양에서 요소분해효소를 주위로 분비하여 요소를 암모니아 이온(NH4+)과 탄산이온(CO3 2-)으로 분해한다. 이때 상기 탄산이온은 주위의 칼슘이온(Ca2+)과 반응하여 탄산칼슘(CaCO3)을 생성하게 되는데 이는 시멘트의 고결화 과정 중 수산화칼슘이 이산화탄소와 반응하여 탄산칼슘을 생성하여 시멘트를 경화시키는 과정과 동일한 것으로 미생물 주위의 토양을 고결화(cementation) 시킨다. 본 발명은 상기 미생물의 요소분해효소를 이용하여 혼합토로 구성된 경사지 또는 연약 지반에서 상기 탄산칼슘을 생성시켜 지반을 보강하는 것에 관한 것이다.
본 발명의 미생물은 요소분해효소를 발현하고 이를 분비하는 미생물들로서 토착 미생물과 차이가 있을 수 있다. 상기 토착 미생물은 지역의 특징적인 미생물 생태계를 반영하는 것으로서 그 균형이 깨지게 되면 병충해가 증가하게 되어 농업 생산성을 저하시키는 문제점이 있다. 따라서 토착 미생물 생태계를 교란할 수 있는 미생물 제제의 사용은 극히 제한적이어야 한다.
종래의 미생물 매개 탄산칼슘 침전법(Microbially Induced Calcium carbonate Precipitation, MICP)을 이용한 지반 보강 방법은 상기 요소분해효소 활성 미생물을 직접 토양에 살포하고 이를 배양하므로 지반을 강화시키는 방법이었다. 상기 MICP에 사용하는 미생물은 상기 미생물에 국한되므로 토착 미생물의 균형을 파괴할 우려가 있었다. 이에 본 발명은 상기 미생물을 사용하는 대신 미생물로부터 요소분해효소를 추출한 용액을 토양에 살포하는 방법으로 상기 문제점을 해결하였다.
상기 요소분해효소 추출액을 제조하기 위하여 먼저 상기 미생물을 배양하였다. 상기 미생물은 액체배지에서 실시하였으며 공기 중의 미생물이 함께 배양되는 것을 방지하기 위하여 배양플라스크의 입구를 밀폐한 후 항온배양기에서 배양하였다.
상기 요소분해활성 미생물은 유전적 조작이 없는 자연 그대로의 미생물일 수 있으며 상기 요소분해효소의 발현을 증가시키기 위하여 유전자 재조합 방법으로 유전자가 조작된 미생물일 수도 있다.
제 2 단계: 요소분해효소 추출액의 제조
상기 요소분해효소 활성 미생물의 배양액으로부터 요소분해효소 추출액을 제조하였다. 상기 요소분해효소 추출액은 상기 요소분해효소가 미생물로부터 배양액으로 모두 방출되어 미생물 내부에 존재하지 않는 상태를 의미한다. 이를 위하여 본 발명에서는 상기 미생물 배양액에 존재하는 미생물을 파쇄하였다. 상기 미생물 파쇄방법에는 세포를 얼렸다가 녹이는 과정을 반복하여 세포벽을 파괴하여 파쇄시키는 방법, 호모게나이저를 이용하여 세포벽을 물리적을 파괴하여 파쇄시키는 방법, 초음파를 가하여 세포벽을 파괴하여 파쇄시키는 방법, 계면활성제를 이용하여 세포벽을 파괴하여 파쇄시키는 방법 등이 있으며 요소분해효소의 활성을 저해하지 않는 수준에서 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 본 발명에서 초음파로 처리하여 모든 미생물의 세포벽을 파괴하는 파쇄하는 방법을 사용하였다. 세포벽이 파괴된 미생물은 더 이상 성장할 수 없는 상태가 되고 미생물 내부의 요소분해효소는 배양액으로 방출되게 된다. 따라서 본 발명의 요소분해효소 추출액은 미생물의 성장이 더 이상 이루어지지 않는 상태이므로 토양에 살포되어도 토착 미생물의 균형을 파괴하지 않는 장점이 있다. 상기 미생물 배양액을 초음파로 처리하게 되면 미생물의 세포벽이 파괴되면서 미생물 내부의 수용성 성분과 불수용성 성분이 모두 배양액으로 방출되게 된다. 상기 수용성 성분은 본 발명의 요소분해효소를 포함하게 되며 상기 불수용성 성분은 미생물의 유전체, 세포벽 성분들을 포함하게 된다. 특히 상기 미생물의 유전체는 점성이 높아 이를 제거하지 않으면 토양에 살포되어도 토양의 공극을 통해 토양내부로 침투되지 않는다. 따라서 본 발명에서는 상기 유전체등을 포함하는 불수용성 성분을 제거하기 위하여 원심분리를 수행한다. 특히, 상기 원심분리를 수행하게 되면 초음파 처리를 통해 세포벽이 파괴되지 않아 성장이 가능한 미생물을 침전물로서 완벽히 제거 할 수 있다.
제 3 단계: 토양알갱이에 의한 요소분해효소의 포집
상기 요소분해효소 추출액을 보강이 필요한 경사지나 지반에 살포하는 방법으로 요소분해효소를 토양알갱이에 포집시킨다. 상기 요소분해효소 추출액은 원심분리를 수행하여 불용성 성분이 모두 제거된 상태이므로 종래의 액체 살포방법을 사용하여 살포가 가능하다.
상기 경사지 또는 지반은 전체 100중량%의 토양에 대비하여 세립토가 5 내지 80중량%로 포함된 혼합토 지반이다. 바람직하게는 전체 100중량%의 토양에 대비하여 세립토가 5 내지 40중량%로 포함되며 보다 바람직하게는 세립토가 10 내지 20중량%로 포함된다. 상세하게는 상기 혼합토 지반은 조립토(coarse-grained soil)와 세립토가 혼합된 것을 특징으로 한다. 상기 조립토 및 세립토는 통일분류법(KSF 2324)에 의해 정의되는 것으로 각각 200번 체거름시 50% 이상이 체에 남는 토양 및 200번 체거름시 50% 미만이 체에 남는 토양을 의미한다. 본 발명의 혼합토는 조립토와 세립토가 혼합되어 있어 상기 통일분류법에 의해 SM 또는 SP-SM으로 분류되는 토양이다. 본 발명의 혼합토는 조립토 토양알갱이 공극에 세립토 토양 알갱이가 위치하고 있어 투수도가 낮고 연성이 높은 특징이 있다.
본 발명은 상기 요소분해효소 추출액을 충분히 살포하여 상기 지반의 토양공극 내부를 흐를 수 있도록 하므로 상기 요소분해효소가 토양알갱이의 표면에 포집되도록 한다. 바람직하게는 상기 지반의 토양공극 내부에서 분당 1 내지 50mM의 요소분해효소가 30분 내지 10시간동안 흐르도록 살포하여 토양알갱이의 표면에 상기 요소분해효소가 포집되도록 한다. 보다 바람직하게는 상기 지반의 토양공극 내부에서 분당 4 내지 5mM/min의 요소분해효소가 2시간 내지 4시간동안 흐르도록 살포하여 토양알갱이의 표면에 상기 요소분해효소가 포집되도록 한다. 상기 살포정도가 부족하여 상기 토양알갱이의 표면에 요소분해효소가 포집되지 않으면 요소분해효소의 양이 적어 탄산칼슘 침전이 미미할 수 있다. 또한 상기 세립토의 양이 5중량% 미만으로 함유된 혼합토는 투수도가 높아 상기 살포조건보다 짧은 시간 동안 실시하여도 토양알갱이에 의한 요소분해효소 포집이 포화상태에 이를 수 있으며 상기 세립토의 양이 80중량%를 초과하게 되면 투수도가 너무 낮아 지반의 깊은 곳까지 상기 요소분해효소 추출액이 도달하는데 시간이 더 오래 걸리므로 더 긴 시간 동안 수행하여야 상기 토양알갱이의 요소분해효소 포집이 포화상태에 이르게 된다.
제 4 단계: 토양알갱이에 포집되지 않은 요소분해효소의 배출
상기 토양알갱이의 표면에 포화되지 않은 여분의 요소분해효소는 중력을 이용하여 모두 배출시킨다. 상기 여분의 요소분해효소가 배출되지 않으면 상기 요소분해효소의 기질인 요소와 염화칼슘이 공급되는데 비효율적일 수 있다. 특히, 상기 요소분해효소는 토양알갱이의 표면에서 탄산칼슘 침전을 유도하여 상기 토양알갱이의 결속력을 향상시키기 때문에 토양의 공극사이에서 탄산칼슘이 침전되어 공극이 막히게 되면 지반의 표면에서만 고결화가 진행되어 지반 보강효과가 반감될 수 있다. 따라서 상기 요소분해효소가 토양알갱이의 표면에 포집되어 존재하도록 여분의 요소분해효소는 중력을 이용하여 배출하는 것이 필요하다.
제 5 단계: 요소-염화칼슘 혼합액의 살포 및 탄산칼슘의 침전
상기 여분의 요소분해효소가 배출된 지반에 상기 요소분해효소의 기질인 요소와 염화칼슘을 공급하면 상기 토양알갱이의 표면에서부터 탄산칼슘이 침전되어 지반이 보강된다. 상기 탄산칼슘의 침전은 하기의 두 단계를 거치게 된다.
제 1 단계는 요소가 요소분해효소에 의해 분해되는 단계로서 하기 반응식 1로 표현되며 제 2 단계는 상기 탄산이온이 탄산칼슘으로 침전되는 단계로서 하기 반응식 2로 표현된다.
상기 단계를 통해 생성되는 탄산칼슘 침전물은 결정형에 따라 칼사이트(calcite), 아라고나이트(aragonite), 또는 바테라이트(vaterite)로 분류될 수 있다. 본 발명의 탄산칼슘 침전물은 칼사이트(calcite), 아라고나이트(aragonite), 및 바테라이트(vaterite)으로 구성된 탄산칼슘 침전물 중 어느 하나 또는 둘 이상이 혼합된 탄산칼슘 침전물일 수 있으며 바람직하게는 칼사이트(calcite)이다.
상기 요소와 염화칼슘을 공급은 요소-염화칼슘 용액을 상기 지반에 살포하는 방법으로 수행한다. 상기 요소-염화칼슘 혼합액은 요소와 염화칼슘을 혼합하여 제조하며 바람직하게는 1:1의 몰비로 혼합하여 제조한 혼합액을 사용한다. 상기 요소-염화칼슘 용액은 상기 요소분해효소 추출액과 동일하게 상기 지반의 토양공극 내부를 흐르도록 살포한다. 바람직하게는 상기 지반의 토양공극 내부에서 분당 50 내지 700mM의 요소이온 및 염화칼슘이온이 흐를 수 있도록 살포하며 보다 바람직하게는 상기 지반의 토양공극 내부에서 분당 250 내지 350mM의 요소이온 및 염화칼슘이온이 흐를 수 있도록 살포한다. 상기 살포방법보다 낮은 농도의 요소이온 및 염화칼슘이온이 흐르도록 하면 상기 요소분해효소에 대한 기질 공급이 부족하여 지반을 보강할 만큼의 탄산칼슘 침전물을 형성하는 데 시간이 더 소요되며 상기 살포방법보다 높은 농도의 요소이온 및 염화칼슘이온이 흐르도록 하더라도 상기 요소분해효소에 의한 탄산칼슘 침전물 생성 속도는 더 증가하지 않는다.
상기 제 3 내지 5 단계는 탄산칼슘 침전물이 형성되는 단계로서 일정 회수 반복되어 진행될 수도 있다. 다만, 요소분해효소의 반응으로 인해 생성된 수용성 부산물(NH4+)이 축적되며 요소분해효소의 활성이 저하되므로 하기 제 6 단계와 같은 수용성 부산물의 제거 단계가 필요할 수 도 있다.
제 6 단계: 수용성 부산물의 제거단계
상기 제 5 단계의 반응을 통해 생성된 탄산칼슘은 토양알갱이 사이에 촘촘한 탄산칼슘 네트워크를 형성하여 지반의 강도를 향상시키게 된다. 그러나 상기 반응 중 생성된 수용성 부산물(NH4+)은 그 농도가 증가하게 되면 상기 요소분해효소에 의한 요소분해반응을 억제하는 역할을 하게 되므로 이를 상기 토양공극으로부터 적절히 제거해 주어야 할 필요가 있다. 이를 위하여 본 발명에서는 상기 탄산칼슘 침전이 이루어진 지반에 물을 살포하여 토양공극 내부에 존재하는 수용성 부산물을 제거한다. 상기 물의 살포는 토양공극 내부 부피를 1 내지 2회 이상 세척하는 수준이면 충분하다.
상기 수용성 부산물을 제거하기 위해 사용한 물은 중력을 이용하여 배출한 후 상기 제 3 단계 및 제 6 단계를 반복하여 탄산칼슘의 지속적인 침전을 유도하는 방법으로 지반을 더 보강할 수도 있다. 상기 탄산칼슘의 침전은 결정(크리스탈)의 형태로 이루어진다. 상기 단계가 반복되어 탄산칼슘 결정이 지속적으로 형성되면 상기 결정이 점차 성장하게 되고 서로 연결되어 탄산칼슘 침전(결정) 네트워크(매트릭스)를 형성하게 된다. 상기 탄산칼슘 침전 네트워크는 토양알갱이를 서로 연결시키므로 토양의 결속력을 향상시키게 된다. 따라서 상기 과정을 반복하게 되면 상기 탄산칼슘 네트워크가 더 촘촘하게 형성되어 경사지 또는 지반의 보강효과가 더 향상될 수 있다. 상기 제 3 단계 및 제 6 단계는 2 내지 30회 반복하여 수행할 수 있으며 바람직하게는 5 내지 20회 반복하여 수행 할 수 있으며, 보다 바람직하게는 7회 내지 15회 반복하여 수행할 수 있다.
본 발명의 상기 지반 보강 방법을 통해 보강된 경사지 또는 연약 지반의 혼합토는 토양공극에 세립토의 알갱이와 탄산칼슘 침전물의 복합체를 포함하여 압축강도 및 연성이 향상되고 투수도는 감소하는 것을 특징으로 한다. 상기 경사지 또는 지반의 혼합토는 전체 100중량%의 토양에 대비하여 세립토가 5 내지 80중량%로 포함된 혼합토 지반이다. 바람직하게는 전체 100중량%의 토양에 대비하여 세립토가 5 내지 40중량%로 포함되며 보다 바람직하게는 세립토가 10 내지 20중량%로 포함된다. 상기 조립토는 모래일 수 있으며 상기 세립토는 황토(실트)일 수 있다. 특히, 상기 혼합토는 상지 조립토과 세립토가 혼합되며 조립토 사이의 토양공극에 상기 세립토가 위치하게 된다. 상기의 지반 보강 방법에 따라 요소분해효소 추출액과 요소-탄산칼슘 혼합액을 살포하게 되면 상기 조립토 및 세립통의 표면에서 요소분해효소에 의한 요소분해 및 탄산칼슘의 침전이 진행된다. 상기 요소분해효소는 요소분해효소 활성 미생물로부터 추출하며 상기 요소분해효소 활성 미생물은 스포로사르시나 파스테우리(Sporosarcina Pasteurii), 스포로사시나 우레에(Sporosarcina Ureae), 프로테우스 불가리스(Proteus Vulgaris), 바실러스 스파에리쿠스(Bacillus Sphaericus), 믹스코커스 잔토스(Myxococcus Xanthus), 프로테우스 미라빌리스(Proteus Mirabilis), 및 헬리코박터 파이로리(Helicobacter Pylori)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 미생물 또는 둘 이상의 미생물인 것을 특징으로 하며 바람직하게는 스포로사르시나 파스테우리이다.
상기 탄산칼슘의 침전은 탄산칼슘이 토양알갱이의 표면에서 고체화 상태로 성장하는 것을 의미하며 크리스탈의 형상의 탄산칼슘 크리스탈(calcite)을 포함하는 탄산탈슘 침전물일 수 있다. 상기 탄산칼슘 침전물은 조립토와 상기 조립토의 토양공극 사이에 위치하는 세립토의 표면에 포집된 요소분해효소에 의해 요소가 분해되고 그 과정에서 생성된 탄산이온이 칼슘이온과 반응하여 생성된다. 따라서 조립토만으로 이루어진 토양의 공극에서 생성되는 탄산칼슘 침전물과 본 발명의 탄산말슘 침전물은 그 물성에서 차이점이 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 본 발명의 조립토와 세립토의 혼합토 토양공극에서 형성되는 탄산칼슘 침전물은 그 직경이 1 내지 4㎛인 탄산칼슘 침전물로서 미세한 크기를 가진다. 이에 반하여 조립토만으로 이루어진 토양공극에서 형성된 탄산칼슘 침전물은 그 직경이 8 내지 10㎛인 것으로 확인된다. 이는 상기 세립토가 상기 조립토의 토양공극 사이에 위치하여 토양공극을 협소하게 하므로 탄산칼슘 침전물이 생성되는 공간이 작아 작은 크기의 침점물들이 형성되기 때문으로 판단된다. 상기 미세한 탄산칼슘 침전물들은 조립토 알갱이와 세립토 알갱이의 표면에서 성장하여 서로 연결된 네트워크를 형성하게 된다. 특히 본 발명의 직경 1 내지 4㎛인 탄산칼슘 침전물은 그 크기가 작아 상기 조립토와 세립토 알갱이 사이의 공극에서 토양알갱이를 서로 연결하는 세밀한 탄산칼슘 침전물 네트워크를 형성할 수 있다. 따라서 본 발명의 경사지 또는 지반의 혼합토는 압축강도와 연성이 향상되고 그 투수도가 감소하게 된다. 하기 실시예를 통해 본 발명을 더 상세히 설명한다.
실시예
1. 실험재료
1) 미생물의 배양
본 발명은 미국 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 제공받은 스포로사르시나 파스테우리(Sporosarcina pasteurii)를 원료 생물체(biomass)로 사용하였다. 오염을 방지하기 위하여 클린벤치에서 멸균 파이펫을 이용하여 상기 미생물(원료 생물체)을 액체배지(ammonium-trypticase soy broth, NH4-TSB)에 접종하였다. 상기 액체배지는 대두 성분을 트립톤으로 처리한 배지(tryptic soy broth) 20 g/ℓ, 황산암모늄(ammonium sulfate) 10 g/ℓ, 완충용액(Tris buffer) 0.13 ㏖/ℓ을 혼합하여 제조하였으며 pH는 9.0으로 적정하여 사용하였다. 배양 플라스크는 입구를 멸균된 스폰지로 밀봉하여 공기중 미생물에 의한 오염을 억제하였다. 진탕배양기(Innova Model 4000, New Brunswick Scientific)를 이용하여 30 ℃에서 160 rpm의 속도로 48시간 교반하여 배양하였다. 배양된 미생물은 4 ℃에서 보관하였다.
2) 미생물에 대한 초음파 처리 및 요소분해효소 추출액의 제조
본 발명은 요소분해효소(urease) 추출액의 제조를 위하여 상기 배양된 미생물 배양액을 초음파 처리하였다. 상기 초음파 처리는 10분간 초음파 처리 후 10분간 냉각시키는 단계를 반복하는 반복순환 런-쿨링 초음파 처리방법(cyclic run-cool method)을 적용하였다. 초음파 처리조(sonication bath, Bransonic Model 220; 120 volt, 125W, and 50/60kHz)에 상기 미생물 배양액을 넣고 2시간 동안 6번의 초음파 사이클을 적용하였다.
상기 반복순환 초음파 처리방법을 통한 요소분해효소 추출의 정도를 분석하기 위하여 동일한 미생물 배양액에 대하여 지속적 초음파 처리방법을 수행하고 그 결과를 비교하였다. 본 발명에서는 반복순환 런-쿨링 초음파 처리방법을 적용하여 32 내지 34℃ 미만의 온도를 유지하면서 미생물에 대한 초음파 처리가 이루어지도록 하는 방법으로 요소분해효소의 활성이 최대화 되도록 하였다. 초음파 처리를 수행하는 동안 각 샘플의 부피, 온도, 및 pH를 확인하였으며 OD600을 측정하여 초음파 처리 후 미생물이 얼마 존재하는지 확인하였다. 도 1은 초음파처리 전후의 세포용해정도를 보여준다. 초음파 처리된 미생물 세포 용해 용액에 대하여 20분간 5500RCF로 원심분리를 수행하여 수용성 성분만을 수득하는 방법으로 요소분해요소를 추출하였다. 상기 수득된 요소분해효소에 대하여 요소분해능을 측정하고 적절히 희석하였다.
본 발명의 표 1 에 따르면 상기 지속적 초음파 처리방법을 통해 미생물 배양액을 수행한 결과, 요소분해효소가 미생물 내부에서 배양액으로 방출되어 요소분해효소의 농도가 점진적으로 증가하는 것이 확인되었으며 초음파 처리로 인해 배양액이 증발되어 부피가 20% 정도 줄어드는 것이 확인되었다. 초음파 처리 전 미생물에 의해 배양액으로 방출된 요소분해효소의 활성과 초음파 처리로 인해 미생물 내부의 요소분해효소가 배양액으로 방출된 요소분해효소 추출액의 효소활성을 측정하고 이를 비교한 결과 요소분해효소 추출액의 효소활성이 2배 이상 높은 것으로 확인되었다.
| 초음파 처리방법 | 초음파 처리 전 | 초음파 처리 후 |
| 초음파 처리시간 | 0 분 | 60 분 |
| OD600 | 1.25 | 0.34 |
| pH | 8 | 7.92 |
| 온도 | 30℃ | 34℃ |
| 부피감소율 | 0% | 20% |
| 요소분해효소 활성 | 12.1 mM/min | 25.4 mM/min |
2. 실험방법
1) 요소분해요소 활성 미생물의 배양 및 요소분해효소의 활성
요소분해효소활성 미생물의 배양정도는 가시광선을 이용한 OD600을 측정하여 결정하였다. 상기 요소분해효소 활성 미생물은 세포 주변에 상기 요소분해효소를 방출하여 자신을 보호하게 된다. 따라서 상기 요소분해효소활성 미생물의 배양액에는 요소분해효소가 존재하게 된다. 요소분해효소의 활성 측정은 요소가 분해되면서 방출되는 암모늄이온에 의한 전도도의 변화를 측정하는 방법으로 수행하였다. 상기 측정은 미생물 배양액 뿐 아니라 상기 미생물 배양액에 초음파를 처리하여 요소분해효소만을 추출한 용액에 대하여도 실시하였다. 상기 측정은 미생물 배양액과 요소분해효소 추출액 5㎖에 대하여 각각 실시하였다.
2) 조립토, 세립토 및 혼합토
조립토(coarser soil)로서 ASTM C778(2014)에 게재되어 있는 오타와 20/30 실리카 모래를 사용하였다. 상기 조립토는 실리카(SiO2)를 98.7% 이상을 포함한다. 상기 조립토의 비중, 최대 공극비, 최소 공극비는 각각 2.65, 0.74, 및 0.51이었다. 상기 조립토는 증류수를 이용하여 수용성 불순물을 모두 제거하였으며 105℃에서 24시간 동안 건조한 후 사용하였다.
세립토(fine-grained soil)로서 아이오와산 천연황토(natural loess)를 사용하였다. 먼저, 상기 세립토에 대하여 체분석(sieve analysis)과 비중계 분석(hydrometer analysis)을 수행하여 토양알갱이의 크기를 분석하였다. 분석결과 상기 세립토의 알갱이는 모래 0.7%, 실트(silt) 86.5%, 황토 12.8%로 구성된 것이 확인되었다. 상기 세립토는 직경이 0.075 ㎜인 U.S. Sieve No. 200을 이용하여 체가름하여 실트(silt)와 황토 입자만을 수득하였다. 참고로 상기 세립토는 통일분류법(KSF 2324)에 의해 정의되는 세립토 즉, 상기 200번 체(U.S. Sieve No. 200)거름 시 50% 미만이 체에 남는 토양과 혼용하여 사용될 수 있다.
상기 조립토와 세립토를 혼합하여 혼합토를 제조하고 토양 테스트용 컬럼에 팩킹하였다. 상기 혼합토는 조립토로서 상기 오타와산 모래와 세립토로서 상기 오븐 건조한 천연황토(실트질토)를 혼합하여 제조하였다. 세립토의 함량(%)는 전체 건조 중량에 대한 실트질토(silt soil)의 건조중량을 의미한다. 상기 혼합토의 조성은 하기 표 2와 같다.
| 모래 | 황토+실트질토 | |
| 조립토(100-0) | 100중량% | 0중량% |
| 제 1 혼합토(90-10) | 90중량% | 10중량% |
| 제 2 혼합토(80-20) | 80중량% | 20중량% |
상기 조립토는 모래 100중량%만을 사용하였으며, 상기 제 1 혼합토는 모래 90중량%와 황토 10중량%를 혼합한 것이며, 상기 제 2 혼합토는 모래 80중량% 및 황토 20중량%를 혼합한 것이다. 상기 모래만을 포함하는 조립토는 통일분류법(Unified Soil Classification System, USCS; ASTM 2010)의 기준에 따라 입도분포가 불량한 SP로에 해당하며, 상기 제 1 혼합토 및 제 2 혼합토는 SP-SM 및 SM에 해당한다. 상기 혼합토는 아터버그 한계 (Atterberg limit)에 기반하여 저가소성 토양으로 평가될 수 있으며 상기 두 혼합토의 아터버그 한계는 서로 유사하다. 액성한계 (liquid limit, LL)와 소성한계(plastic limit, PL)는 ASTM D4318-17 표준에 따라 수행되며 상기 표준은 No. 40 체의 지름(0.42㎜)보다 더 작은 지름을 가지고 있어야 한다. 따라서 상기 오타와 모래 #20-30의 99%는 No. 40 체를 통과하지 못하는 반면, 세립천연황토는 입도가 0.075㎜보다 작아 LL 또는 PL로 분류된다. 따라서 본 발명의 제 1 혼합토와 제 2 혼합토는 각각 유사 LL 및 PL로 분류되었다 (표 3 참조).
| 시료명 | 분류 | 팩킹방법 | e | D10 | D50 | FC | LL | PL | CaCO3 |
| 조립토 | SP | wet tamping | 0.58 ∼0.61 | 0.58㎜ | 0.72㎜ | 0% | 비가소성(NP) | 비가소성(NP) | 0% |
| 제 1 혼합토 | SP-SM | wet tamping | 0.58 ∼0.61 | 0.06㎜ | 0.7㎜ | 10% | 34.5% | 27.3% | 0.8% |
| 제 2 혼합토 | SM | wet tamping | 0.58 ∼0.61 | 0.028㎜ | 0.67㎜ | 20% | 34.5% | 27.3% | 1.6% |
3) 토양충진 컬럼
상기 토양에 대한 안정성 테스트를 수행하기 위해 PVC 컬럼을 준비하였다. 상기 조립토, 제1 혼합토, 및 제 2 혼합토를 상기 PVC 컬럼에 충진한 후 미생물 매개 탄산칼슘 침전법(MICP) 또는 미생물 유래 효소 매개 탄산칼슘 침전법(BEICP)을 적용하여 고결화에 따른 압축강도 및 투과도의 변화를 비교분석하였다. 상기 토양시료에 대하여 상기 MICP 또는 BEICP를 8-사이클(cycle), 12-사이클 또는 16-사이클 수행하였다.
상기 PVC 컬럼에 대한 조립토, 제1 혼합토, 및 제 2 혼합토의 충진은 보습저장법(moist-tamping method)을 사용하였다. 상기 PVC 컬럼은 50㎜의 지름을 가지며 100㎜의 높이를 가지는 컬럼이다. 컬럼 내부의 각 토양층에서 모두 유사한 비중을 가지도록 토양을 순차적으로 첨가하여 10㎜ 두께의 동일한 층 10개가 형성 되도록 하였다. 각 컬럼의 하부에는 자갈이 충진된 플라스틱 하부 뚜껑을 추가로 설치하여 안정화 되지 않은 토양이 손실되지 않도록 하였다. 도 3은 토양이 충진된 본 발명의 PVC 컬럼을 보여준다.
4) 미생물 매개 탄산칼슘 침전법 및 미생물 유래 효소 매개 탄산칼슘 침전법
MICP와 BEICP를 상기 충진된 토양컬럼에 적용하여 고결화로 인한 안정화 정도를 평가하였다. 이를 위하여 부분 포화 상태에서 토양이 충진된 상기 컬럼에 대하여 순환투수공정(circulated-percolation process)을 수행하였다(도 3 참조). MICP는 요소분해효소 활성 미생물이 포함되어 있으며 초음파 처리를 하지 않은 미생물 배양액을 사용하였으며 BEICP는 요소분해효소 활성 미생물 배양액을 초음파 처리하고 원심분리하여 제조한 요소분해효소 추출액을 사용하였다.
먼저 상기 미생물 배양액 또는 요소분해효소 추출액을 펌프를 이용하여 상기 컬럼의 상부에 공급하였다. 상기 공급된 용액은 중력에 의해 컬럼 하부로 배출되도록 하였다. 상기 컬럼에 충진된 토양의 60%가 포화되면 토양입자의 표면에 미생물 또는 요소분해효소가 포집된다. 이를 위하여 실리콘 튜브를 연결한 정량펌프(Masterflex Model 77202-50)로 3시간 동안 0.8 내지 5㎖/min의 속도로 미생물 배양액 또는 요소분해효소 추출액을 흘려주어 컬럼내 토양의 60%가 공급된 용액에 의해 포화되도록 하였다. 특히, BEICP 방법을 위한 요소분해효소 용액의 경우, 상기 용액이 증류수에 의해 희석되어 분당 4 내지 5mM의 요소분해효소가 컬럼 내부에 지속적으로 흐르도록 하였다.
미생물 배양액 또는 요소분해효소 추출액을 3시간동안 흘려준 후 토양 알갱이 사이의 공극에 남아있는 여분의 미생물 배양액 또는 요소분해효소 추출액을 컬럼으로부터 배출되도록 하였다.
그 다음으로 요소(urea)와 염화칼슘(calcium chloride)을 1:1의 몰비로 혼합하여 요소-염화칼슘 용액을 제조하고 각각이 0.3M 농도가 되도록 상기 요소-염화칼슘 용액을 상기 컬럼에 투입하였다. 상기의 순서에 따라 9 내지 12시간동안 순환시켰다. 상기 순환은 요소분해효소의 반응에 의해 생성된 수용성 부산물(NH4+)이 요소분해효소의 활성을 저해하지 않는 수준을 고려하여 순환하였다.
상기 순환이 끝나면 상기 정량펌프를 이용하여 2시간동안 증류수를 투여하여 수용성 부산물을 제거한 후 약 10시간동안 잔여용액을 모두 배출시켰다. 상기 처리 후에 새로운 사이클로서 새로운 미생물 배양액 또는 요소분해효소 추출액과 새로운 요소-염화칼슘 용액을 상기와 같이 순차적으로 투입하였다.
상기 사이클은 하루에 1번 수행하였으며 8일, 12일, 16일간 반복적으로 수행하였다. 제 1 혼합토 및 제 2 혼합토에 대한 MICP는 12사이클 후에 멈추었다. 그 이유는 MICP의 경우 12 사이클 이후 컬럼 내부의 고결화가 더 이상 진행되지 않았기 때문이다. 그 이유는 MICP의 경우, 탄산칼슘의 침전이 상부 약 30㎜ 수준에서만 진행되어 표면 부위의 투수도가 저하되었으므로 사이클을 더 적용되더라도 컬럼의 중간부위와 하부까지 용액이 침투할 수 없어 토양의 고결화가 더 이상 진행되지 않기 때문이다.
5) 투수도, 압축강도, 탄산칼슘 침전물 함량분석 및 탄산칼슘 침전물의 형상 분석
먼저, MICP 또는 BEICP를 통해 고결화된 컬럼내 토양의 투수도 평가를 실시하였다. 상기 투수도 시험은 정수두 투수시험장치(ASTM D2434-68)를 이용하여 수행하였다. 필터를 이용하여 여과한 물 2ℓ를 15kPa이하의 배압으로 통과시켜 시료 공극의 공기를 모두 제거한 후 물로 완전히 포화시켰다. 상기 포화 후 유압전도도의 변화가 없을 때까지 투수도 시험을 진행하였다.
고결화된 컬럼내 토양의 압축강도시험은 ASTM D4219-08 기준에 부합하는 압축강도시험을 수행하였다. 상기 투수도 시험을 실시한 젖은 상태의 시료로부터 PVC 몰드를 제거하고 48시간동안 건조 한 후 압축강도를 측정하였다.
상기 압축강도시험이 끝난 시료에 대하여 탄산칼슘 침전물의 함량분석을 수행하였다.
먼저 상기 시료를 증류수로 세척하여 염분을 제거한 후 시료의 중간부위에서 5g의 탄산칼슘 침전물 함량분석용 시료를 채취하였다. 상기 채취한 시료는 105℃에서 12시간동안 건조한 후 측정전 중량을 측정하였다. 상기 건조된 시료에 1M 염산을 첨가하여 탄산칼슘 침전물을 완전히 용해시켰다. 상기 산처리된 시료를 물로 세척하여 용해된 탄산칼슘 침전물을 모두 제거한 후 건조하였다. 상기 건조한 시료의 중량을 측정하여 상기 측정 전 중량과 비교하여 탄산칼슘 침전물의 양(백분위 중량분율)을 산정하였다.
탄산칼슘 침전물의 형상분석은 전자현미경과 X선 회절분석을 통해 수행하였다. 상기 전자현미경 분석은 FEI Quanta-250 FE 전자현미경을 사용하였으며 상기 X-선 회절분석은 Siemens Model D500 회절분석기를 사용하였다.
3. 실험결과
1) 요소분해효소의 추출 결과
상기 표 1에는 요소분해효소 활성 미생물 배양액 및 요소분해효소 추출액의 온도, 부피감소 정도, 광학밀도를 보여준다. 특히, 요소분해효소의 활성도는 반복순환 런-쿨링 초음파 처리방법의 특징적인 결과를 확인할 수 있었다. 초음파를 처리하면 온도가 약간 상승하게 되며 초음파 처리 60분 후에 pH값이 일정한 것이 확인된다. 또한 광학밀도(OD600)값은 급격히 저하(>70%)되는 것이 확인되는데 이는 미생물이 초음파에 의해 분쇄되었기 때문으로 판단된다. 상기 초음파 처리에 의한 요소분해효소 활성 미생물의 분쇄정도는 도 1을 통해 확인할 수 있다. 미생물 배양액에 초음파 처리를 수행하지 않은 도 1의 패널 (a)에는 막대 모양의 미생물이 관찰되는 반면, 초음파가 처리된 도 1의 패널 (b)에는 미생물이 관찰되지 않는 것이 확인된다(도 1 참조).
본 발명의 반복순환 런-쿨링 초음파 처리방법이 적용된 요소분해효소 추출액은 미생물 배양액에 대비하여 2배 가량 향상된 요소분해효소 활성도를 보여준다. 초음파를 처리하게 되면 용액이 증발하여 부피가 20% 가량 줄어든다. 따라서 정확한 비교를 위해서는 상기 증발된 양만큼 희석한 후 이를 비교하여야 한다. 요소분해효소의 활성변화를 확인하기 위하여 반복순환 런-쿨링 초음파 처리방법이 적용된 요소분해효소 추출액을 150㎖로 다시 희석한 후 요소분해효소의 활성을 측정하였다. 그 결과 미생물 배양액에 대비하여 75%정도 향상된 요소분해활성(20.3mM/min)을 보이는 것이 확인되었다. 상기 효소활성의 증가는 세포가 분쇄되면서 기질의 이동을 억제하는 세포벽이 제거되어 배양액으로 방출되었기 때문으로 판단된다. 본 발명의 요소분해효소의 활성도는 종래의 미생물 매개 탄산칼슘 침전법이나 효소 매개 탄산칼슘 침전법에 사용한 효소보다 월등히 높은 활성도이다.
상기 반복순환 런-쿨링 초음파 처리방법이 적용된 요소분해효소 추출액을 현미경으로 관찰한 결과 미생물의 대부분이 제거된 것이 확인되었다. 그러나 상기 결과는 요소분해활성 미생물들이 소수라도 포함되어 있을 가능성이 있다. 본 발명에서는 잔여 미생물을 완벽히 제거하기 위하여 원심분리를 수행하였다. 상기 원심분리후 측정한 요소분해활성은 원심분리전에 대비하여 1%미만의 차이를 보였다. 상기 원심분이를 통해 여분의 미생물이 모두 제거된 것으로 판단된다. 이는 상기의 방법으로 제조된 요소분해효소 추출액이 사용된 BEICP으로 고결화된 조립토의 경우, MICP에서 전형적으로 나타나는 토양 표면의 탄산칼슘 침전이 관찰되지 않는 것에 의해 지지된다(도 7 참조).
2) MICP 및 BEICP를 이용한 조립토의 고결화
(1) 압축강도(unconfined compressive strength)
도 4에 따르면 MICP를 적용한 조립토 컬럼(MICP 조립토 컬럼)의 압축강도가 BEICP를 적용한 조립토 컬럼(BEICP 조립토 컬럼)의 압축강도에 비하여 더 우수한 것이 확인되며 이는 탄산칼슘의 침전정도와 일치하는 것이 확인된다.
16-사이클 후, MICP 조립토 컬럼의 압축강도 및 BEICP 조립토 컬럼의 압축강도는 각각 1960kPa 및 1691kPa에 달하는 것으로 확인된다(표 4 참조).
상기 표 4의 sample ID에서 첫 알파벳 B는 BEICP를 의미하며 M은 MICP를 의미한다. 또한 첫 번째 숫자(100, 90, 80)는 조립토의 함량을 의미하여 두 번째 숫자(0, 10, 20)은 세립토의 함량을 의미하며, 세 번째 숫자(8, 12, 16)은 사이클의 수를 의미한다. 또한 알파벳 U는 비처리(un-treated)를 의미한다.
MICP 조립토 컬럼의 압축강도와 탄산칼슘 침전정도가 BEICP 조립토 컬럼에 대비하여 높은 것은 MICP에 사용한 미생물이 BEICP의 요소분해효소에 비하여 입자 크기가 더 커 모래알갱이에 더 많이 포집되고 이는 더욱 효율적인 탄산칼슘의 침전으로 이어졌기 때문으로 판단된다. 추가적인 데이터 분석에 따르면, 탄산칼슘 침전정도에 따른 압축강도의 정도 즉, 안정화 효율성에 있어서는 BEICP 조립토가 더 우수한 것이 확인 되었다.
(2) 투수도(permeability)
도 5는 탄산칼슘의 침전에 따른 MICP 조립토 컬럼 및 BEICP 조립토 컬럼의 투수도(㎝/s) 측정 결과를 보여준다. 참고로 아무런 처리를 하지 않은 사질토 컬럼은 초기 투수도가 ~10-1㎝/s이다. MICP 조립토 컬럼 및 BEICP 조립토 컬럼 모두 처리 사이클이 증가함에 따라 점진적으로 투수도가 감소하는 것이 확인된다. 이는 탄산칼슘이 조립토의 공극에 침전되어 공극을 메우기 때문으로 판단된다. 특히, MICP 조립토 컬럼은 16-사이클 처리 후에 3차 로그(3-log) 형태로 투수도가 감소하는 것이 확인된다.
이에 반하여 BEICP 조립토 컬럼의 투수도 변화는 상기 MICP 조립토 컬럼과 달리 16-사이클 처리 이후에 1차 로그(1-log) 형태의 투수도 감소 패턴을 보인다.
상기 MICP 조립토 컬럼의 처리 사이클에 따른 급진적인 투수도 감소패턴은 MICP의 한계를 보여준다. 상기와 같은 MICP의 급진적인 투수도 감소는 요소분해효소활성 미생물의 이동을 억제하게 되고 이는 샘플 전체의 고른 고결화(cementation)를 저해하는 결과를 나타내기 때문이다. 이에 반하여 BEICP 조립토 컬럼의 투수도 변화는 상기 MICP 조립토 컬럼과 달리 급진적으로 이루어지지 않으므로 오히려 더 높은 수준의 안정화가 가능한 장점이 있다.
(3) 압축강도 향상효율 및 투수도 감소효율
도 6은 MICP 조립토 컬럼과 BEICP 조립토 컬럼의 압축강도 향상 효율 및 투수도 감소효율을 보여준다. 도 6의 패널 (a)에 따르면 압축강도(USC)의 증가정도는 탄산칼슘의 함유정도에 비례하는 것으로 확인되며, 도 6의 패널 (b)에 따르면 투수도(permeability)의 감소정도는 탄산칼슘의 함유정도에 반비례하는 것으로 확인된다.
상기 압축강도 향상 효율 및 투수도 감소효율은 하기의 수학식에 의해 계산한다.
상기 식의 A 및 B는 사이클의 수를 의미한다.
본 발명의 실시예에 따르면,
조립토에서의 압축강도 향상 효율은 BEICP 조립토 컬럼이 MICP 조립토 컬럼에 대비하여 1.5 내지 2 배가량 더 높은 것으로 확인된다(도 6의 패널 (a) 참조). 이에 반하여, 조립토에서의 투수도 감소효율은 MICP 조립토 컬럼이 BEICP 조립토 컬럼보다 더 높은 것이 확인되며 처리 사이클수가 증가할수록 그 격차는 더 커진다. MICP 조립토 컬럼의 투수도 감소효율이 사이클수가 증가할수록 더 향상되는 것은 모래의 공극에 탄산칼슘의 침전량이 증가되었기 때문으로 판단된다.
(4) 전자현미경 및 X-선 회절분석
도 7은 MICP 및 BEICP를 각각 8-사이클 및 16-사이클 처리한 MICP 조립토 컬럼 및 BEICP 조립토 컬럼에 대한 전자현미경 분석결과를 보여준다. 상기 도 7의 패널 (a)는 8-사이클 처리한 MICP 조립토 컬럼을 보여주며, 패널 (b)는 16-사이클 처리한 MICP 조립토 컬럼을 보여주며, 패널 (c)는 8-사이클 처리한 BEICP 조립토 컬럼을 보여주며, 패널 (d)는 16-사이클 처리한 BEICP 조립토 컬럼을 보여준다.
도 7에 따르면, MICP 조립토 컬럼의 탄산칼슘 침전정도가 BEICP 조립토 컬럼의 탄산칼슘 침전정도에 대비하여 더 많은 것이 확인된다. 상기 결과는 MICP 조립토 컬럼이 BEICP 조립토 컬럼에 대비하여 더 높은 압축강도와 투수도 저하정도를 보인다는 상기의 결과와 일치된다. 상기 결과는 MICP의 요소분해활성 미생물이 BEICP의 요소분해효소에 대비하여 크기가 크고 미생물 세포 외부에 존재하는 다당류 폴리머가 모래알갱이의 표면과의 부착을 촉진하므로 더 효율적인 탄산칼슘의 침전이 수행된다는 것을 보여준다. 또한 탄산칼슘의 침전량이 증가하게 되면 이에 따라 표면적 또한 증가되므로 미생물의 부착이 더 향상되는 선순환의 효과가 있는 것으로 판단된다.
도 7의 패널 (a) 및 (b)에 따르면, MICP 조립토 컬럼의 탄산칼슘 침전은 세 군데에서 이루어진다. 첫 번째는 모래 알갱이의 접촉부위이며 두 번째는 내부공극부위이며, 세 번째는 모래알갱이의 주위이다. 상기 부위에서 형성되는 탄산칼슘의 침전은 크리스탈(crystal)의 형태로 수행된다. 모래알갱이의 접촉부위에 형성되는 크리스탈은 압축강도를 향상시키는 것으로 판단되며 모래알갱이 사이의 공극에 형성되는 어두운 색의 크리스탈 침전은 컬럼의 투수도를 저하시키는 역할을 한다. 특히 MICP 조립토 컬럼의 탄산칼슘 침전은 8-사이클만 실시하여도 상기 모래 알갱이의 접촉부위 및 내부공극부위 모두에서 형성되는 특징이 있다.
이와 달리 BEICP 조립토 컬럼은 초기 8-사이클의 경우, 모래 알갱이의 접촉부위에서만 탄산칼슘의 침전물이 형성된다. 이는 BEICP에 사용한 요소분해효소(urease)가 상기 접촉부위에서만 작용하였기 때문이다. 따라서 8-사이클을 수행한 BEICP 조립토 컬럼은 투수도가 높은 상태로 존재하게 되어 공극내부의 용액이 모두 씻겨나게 된다. 사이클수가 증가하게 되면 상기 접촉부위 뿐 아니라 공극부위에도 탄산칼슘의 침전물이 증가하게 되고 이는 투수도의 감소로 이어지게 된다(도 7의 패널 (c) 및 (d) 참조).
도 8은 MICP 조립토 컬럼과 BEICP 조립토 컬럼의 X-선 회절분석 결과를 보여준다. 분석결과, MICP 조립토 컬럼과 BEICP 조립토 컬럼 모두에서 탄산칼슘의 피크가 강하게 나타나는 것을 확인할 수 있으며 이는 미생물로부터 추출한 요소분해효소를 사용한 본 발명의 BEICP가 종래의 MICP와 같이 경사지 또는 지반 강화에 사용 가능하다는 점을 의미한다.
3) MICP 및 BEICP를 이용한 혼합토의 안정화
먼저 상기 표 4와 같이 조립토 컬럼(조립토 100중량% + 세립토 0중량%), 제 1 혼합토(조립토 90중량% + 세립토 10중량%) 컬럼, 제 2 혼합토(조립토 80중량% + 세립토 20중량%) 컬럼을 제조하고 MICP와 BEICP를 각각 12-사이클로 적용하였다. 적용결과 MICP는 세립토가 혼합된 컬럼에서는 탄산칼슘의 침전으로 인한 효과가 미미한 것으로 확인되었다. 특히, 상기 세립토가 혼합된 컬럼 모두에서 상기 탄산칼슘의 침전은 미생물 배양액이 투입된 입구 부근(컬럼의 표면)에서만 진행되었으며 내부에서는 전혀 이루어지지 않은 것이 확인되었다. 이는 상기 입구부분에서 탄산칼슘이 먼저 형성되면서 내부공극이 막혀 투수도가 감소되므로 상기 미생물 배양액이 컬럼 내부까지 침투할 수 없었기 때문으로 판단된다. 따라서 상기 제 1 또는 제 2 혼합토와 같이 세립분이 포함된 토양에서는 MICP보다 BEICP가 더 효과적인 것으로 판단된다.
하기에서는 BEICP를 12- 내지 16-사이클 적용한 제 1 또는 제 2 혼합토 컬럼에 대한 압축강도, 투수도 및 전자현미경 및 X-선 회절분석 결과를 설명한다.
(1) 압축강도(unconfined compressive strength)
BEICP로 인한 제 1 또는 제 2 혼합토 컬럼의 압축강도변화는 사이클이 증가함에 따라 압축강도 역시 증가한다는 점에서 조립토 컬럼과 유사하다(도 10 참조). BEICP로 인한 제 1 또는 제 2 혼합토 컬럼의 압축강도 테스트에 대한 결과를 요약하면 다음과 같다.
첫 번째, BEICP 혼합토 컬럼(BEICP 처리된 제 1 또는 제 2 혼합토 컬럼)의 압축강도는 BEICP 조립토 컬럼(BEICP 처리된 조립토 컬럼)의 압축강도에 대비하여 낮은 값을 보인다.
두 번째, 세립토의 함량이 증가하면 압축강도에 따른 사이클의 간격이 증가하게 된다.
세 번째, BEICP 혼합토 컬럼의 압축강도는 탄산칼슘의 침전이 증가함에도 불구하고 16-사이클 이후에 감소하게 된다. 이는 BEICP 조립토 컬럼보다 더 많은 탄산칼슘이 침전되었음에도 불구하고 확인되는 결과이며, 16-사이클로 적용된 BEICP 제 1 혼합토 컬럼의 평균 압축강도가 1118KPa임에 반하여 16-사이클로 적용된 BEICP 제 2 혼합토 컬럼의 평균 압축강도가 842KPa인 결과에 의해 지지된다.
종래의 식물 유래 효소를 이용한 방법인 EICP(free Enzyme Induced Calcium carbonate Precipitation)에 대한 선행 결과(Oliveira 등 , 2016)에 따르면, EICP를 사용하면 본 발명과 유사한 탄산칼슘의 침전수준(~17%)을 보이는 것으로 확인되었으며 압축강도가 ~250kPa인 혼합토만을 형성할 수 있는 것으로 확인되었다. 따라서 본 발명의 BEICP는 종래의 EICP에 대비하여 세립분이 혼합된 혼합토에서 탄산칼슘의 침전에 의한 압축강도 향상효과가 더 우수한 것으로 판단된다.
도 11은 본 발명의 BEICP가 12-사이클로 적용된 컬럼에 대한 응력변형곡선(stress strain curve)을 보여준다. MICP 조립토 컬럼 및 BEICP 조립토 컬럼은 압축강도에 있어서 큰 피크를 보인 후 급격히 저하되는 패턴을 보이는 것이 확인되었다. 이는 저탄성 물질(brittle material)의 전형적인 응력변형곡선 패턴이다.
이에 반하여 BEICP 혼합토 컬럼의 경우 상기 MICP 조립토 컬럼 및 BEICP 조립토 컬럼과 전혀 다른 응력변형곡선을 보이는 것이 확인되었다. BEICP 혼합토 컬럼의 압축강도는 초기 급격한 증가를 보이다가 최고점에 이른 후 급격히 감소하지 않고 서서히 감소하는 패턴을 보인다. 이는 세립토 입자가 조립토 알갱이의 공극에 존재하고 있다가 순차적으로 분리되기 때문인 것으로 판단된다. 정리하면, 상기 모래와 같은 조립분이 주를 이루는 토양에서 실트질토와 같은 세립분의 함량이 증가하게 되면 고결체의 압축강도는 감소하나 연성(ductibility)은 증가하게 된다.
(2) 투수도
도 12는 본 발명의 BEICP가 다양한 사이클로 적용된 조립토 컬럼 및 제 1 또는 제 2 혼합토 컬럼에 대한 투수도(permeability) 측정 결과를 보여준다. 또한 도 12에서는 아무런 처리를 하지 않은 조립토 컬럼 및 제 1 또는 제 2 혼합토 컬럼에 대한 투수도를 표시하여 서로 비교할 수 있게 하였다.
본 발명의 BEICP가 다양한 사이클로 적용한 BEICP 혼합토 컬럼은 BEICP 조립토 컬럼에 대비하여 보다 1차 로그에 가까운 형식으로 투수도가 감소하는 것이 확인된다. 또한 상기 투수도는 세립토의 함량이 증가할수록 2차 로그 및 3차 로그 형식에 가깝게 감소되며 더 많은 탄산칼슘의 침전이 필요한 것으로 확인되었다. 이는 조립토 알갱이 사이의 공극이 내부의 세립토 알갱이와 탄산칼슘이 침전이 서로 얽히어 복합적으로 작용하는 방법으로 채워지기 때문으로 판단된다.
(3) 전자현미경 및 X-선 회절분석
도 13은 BEICP를 8-사이클 적용한 BEICP 혼합토 컬럼의 전자현미경 사진을 보여준다. 상기 전자현미경 분석은 상기 혼합토 컬럼의 중간부위에서 혼합토를 채취하여 실시하였다. 상기 전자현미경 사진에 의하면 탄산칼슘이 넓은 부위에 침전된 것이 확인된다. 또한 BEICP 혼합토 컬럼은 BEICP 조립토 컬럼에 대비하여 공극에 세립토 알갱이와 침전된 탄산칼슘이 동시에 위치하는 점에서 그 차이점이 있는 것으로 확인된다. 또한 BEICP 제 1 혼합토 컬럼의 경우 공극이 일부 관찰되는 반면 BEICP 제 2 혼합토 컬럼은 공극이 세립토 알갱이에 의해 거의 완전히 채워진 것을 확인할 수 있다. 상기 세립토 알갱이와 탄산칼슘 침전물은 서로 결합되어 있으며 혼합토의 대부분을 차지하는 세립토 알갱이를 서로 연결시키는 네트워크의 역할을 하여 컬럼의 고결구조를 안정화하는 것으로 사료된다. 상기 실트 알갱이와 같은 세립분은 매개 탄산칼슘 침전법(induced calcium carbonate precipitation)의 작동원리를 변화시키게 된다. 상기 세립분의 함량이 증가하게 되면 모래 알갱이의 접촉면 사이의 직접적인 탄산칼슘침전에 의한 브릿지화가 저하되므로 압축강도가 낮아지는 반면, 공극사이에 알갱이와 탄산칼슘이 공존하게 되어 투과도가 더 낮아지는 특성이 있다.
도 14는 X-선 회절분석결과를 보여준다. 도 14에 따르면 아무런 처리를 하지 않은 제1 또는 제 2 혼합토 컬럼에 대비하여 BEICP 혼합토 컬럼에서 탄산칼슘의 피크가 월등히 높게 관찰되는 것이 확인된다.
(4) BEICP로 형성된 탄산칼슘 침전물의 형상분석
본 발명의 BEICP를 통해 탄산칼슘 침전물의 형상을 분석하였다. 분석결과는 하기와 같이 요약된다.
첫 번째, BEICP로 형성되는 탄산칼슘 침전물은 MICP의 침전물에 대비하여 작은 직경으로 형성된다. 도 15는 MICP 및 BEICP를 각각 8-사이클 적용하여 형성된 탄산칼슘 침전물에 대한 전자현미경 분석 결과를 보여준다. 도 15의 결과에 따르면, MICP에 의해 형성된 탄산칼슘 침전물의 크기는 직경 8 내지 10㎛로 BEICP를 통해 생성된 탄산칼슘 침전물(직경 1 내지 4㎛)에 대비하여 크기가 더 큰 것이 확인된다. 일반적으로 생물학적 매개 탄산칼슘 침전법은 요소분해효소활성 미생물이 형성하는 알카라인 미세환경에서 최초 결정핵이 형성된 후 분비된 요소분해효소, 요소 및 칼슘이온의 반응으로 생성된 탄산칼슘에 의해 침전물이 성장하는 것으로 알려져 있다. Mitchell 및 Ferris의 연구결과에 따르면 MICP를 하루 동안 적용한 경우 직경 4.2㎛의 크리스탈(탄산칼슘 침전물)이 형성되었고 일주일간 더 적용한 경우 7.4㎛까지 성장한 것이 보고된 바 있다. 이에 반하여 본 발명의 BEICP 8-사이클이 적용되어 효소의 주위에서 형성된 탄산칼슘 침전물은 직경이 1 내지 4㎛로 더 작은 크리스탈이다.
두 번째, 본 발명의 BEICP로 침전되는 탄산칼슘 침전물은 모래 알갱이의 접촉부위에서 형성된다는 것이다. 도 7의 패널 (a) 및 (b)에 따르면, MICP가 8-사이클에서 16-사이클로 더 적용되면 모래 알갱이의 접촉부위에서 탄산칼슘 침전물이 더 적층되어 압축강도가 향상되는 것이 확인된다. 이와 유사하게 BEICP에서도 8-사이클에서 16-사이클로 그 적용 사이클을 향상시키게 되면 유사한 압축강도의 향상 정도를 보이는 반면, 탄산칼슘의 침전정도는 크게 증가하지 않는 것으로 확인된다. 이는 BEICP가 MICP에 대비하여 낮은 투수도를 유지하게 되는 것에 의해 지지된다.
세 번째, BEICP로 형성되는 탄산칼슘 침전물은 세립토 알갱이가 아닌 조립토 알갱이 부분에서 주로 형성된다는 것이다. 상기 세립토 알갱이는 조립토 알갱이 사이의 공극에 위치하게 되어 용액의 흐름을 방해하게 된다. 이에 반하여 상기 실트가 채워지지 않은 부위는 용액의 공급이 원활하므로 요소분해효소에 의한 탄산칼슘 침전이 활성화된다.
4. 결론
본 발명의 BEICP는 미생물 유래 요소분해효소를 추출하여 세립토가 포함된 혼합토를 고결시키는 것에 관한 것이다. 상기 미생물 유래 요소분해효소는 본 발명의 반복순환 런-쿨링 초음파 처리방법(cyclic run-cool method)을 통해 효과적으로 추출이 가능하였다. 상기 추출된 요소분해효소를 이용한 본 발명의 BEICP는 가소성이 없는 조립토 컬럼, 약간의 가소성이 있는 조립토 및 세립토의 혼합토 모두에서 압축강도를 향상시켰다. 본 발명의 BEICP는 조립토 컬럼에 있어서 낮은 탄산칼슘 침전량으로도 일정 수준의 압축강도를 보였으나, 종래의 MICP에 대비하여 다소 낮은 압축강도를 보였다. 전자현미경 분석에 따르면, BEICP 조립토 컬럼의 탄산칼슘 침전은 조립토 알갱이의 접촉부위에서만 확인이 되었는데 이는 모래 알갱이 뿐 아니라 공극에서도 탄산칼슘의 침전이 확인되는 MICP 사질토 컬럼의 결과와 상이한 점이다. 또한 투수도에 있어서도, BEICP 컬럼은 종래의 MICP 컬럼에 대비하여 낮은 투수도 감소결과를 보였다. 본 발명의 BEICP는 세립토가 포함되는 경우에서도 토양의 고결화가 안정적으로 수행되는 것이 확인되었으며 세립토가 포함되지 않은 경우에 대비하여 압축강도가 약간 감소하는 것으로 확인되었다. 전자현미경 분석결과 BEICP 혼합토 컬럼은 BEICP 조립토 컬럼에 대비하여 더 넓은 범위에서 탄산칼슘이 침전된 것이 확인되며 조립토 알갱이의 접촉부위와 내부 공극 모두에서 상기 탄산칼슘의 침전이 발견되는 것으로 확인되었다. 상기 탄산칼슘 침전물의 분포확대는 투수도의 감소를 더 유도하는 것으로 확인되며 추가적인 사이클을 더 수행하면 압축강도 역시 더 상승할 수 있을 것으로 판단된다.
본 명세서에서 설명된 구체적인 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예 또는 예시를 대표하는 의미이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되지는 않는다. 본 발명의 변형과 다른 용도가 본 명세서 특허청구범위에 기재된 발명의 범위로부터 벗어나지 않는다는 것은 당업자에게 명백하다.
Claims (9)
- 미생물 유래 효소 매개 탄산칼슘 침전법을 이용한 지반 보강 방법에 있어서,
요소분해효소활성 미생물 배양액을 제조하는 제 1 단계;
상기 요소분해효소활성 미생물을 반복순환 런-쿨링 초음파 방법으로 파쇄하고 불수용성 성분을 제거하여 요소분해효소 추출액을 제조하는 제 2 단계;
상기 요소분해효소 추출액을 전체 100 중량%의 토양에 대비하여 세립토가 5 내지 80 중량%로 포함된 혼합토 지반에 분당 4 내지 5mM의 상기 요소분해효소가 토양공극 내부를 흐르도록 2 내지 4시간 살포하여 토양알갱이에 상기 요소분해효소가 포화되어 포집되도록 하는 제 3 단계;
상기 혼합토 지반의 토양알갱이에 포집되지 않은 요소분해효소를 토양공극으로부터 배출시키는 제 4 단계;
상기 요소분해효소가 배출된 혼합토 지반에 요소와 염화칼슘이 1:1의 몰비로 혼합된 요소-염화칼슘 혼합액을 분당 50 내지 700mM의 상기 요소 및 염화칼슘이 토양공극 내부를 흐르도록 살포하여 탄산칼슘을 침전시키는 제 5 단계;
상기 탄산칼슘 침전된 혼합토 지반에 물을 살포하여 수용성 부산물을 제거하고 상기 물을 배출시키는 제 6 단계; 및
상기 3 단계 및 제 6 단계를 1 사이클(cycle)로서 12 내지 16 사이클 반복하는 제 7 단계;로 구성되는 것을 특징으로 하는 미생물 유래 효소 매개 탄산칼슘 침전법을 이용한 지반 보강 방법.
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- 제 1 항에 있어서 상기 요소분해효소활성 미생물은 스포로사르시나 파스테우리(Sporosarcina Pasteurii), 스포로사시나 우레에(Sporosarcina Ureae), 프로테우스 불가리스(Proteus Vulgaris), 바실러스 스파에리쿠스(Bacillus Sphaericus), 믹스코커스 잔토스(Myxococcus Xanthus), 프로테우스 미라빌리스(Proteus Mirabilis), 및 헬리코박터 파이로리(Helicobacter Pylori)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 미생물 또는 둘 이상의 미생물인 것을 특징으로 하는 미생물 유래 효소 매개 탄산칼슘 침전법을 이용한 지반 보강 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 불수용성 성분은 요소분해효소활성 미생물을 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물 유래 효소 매개 탄산칼슘 침전법을 이용한 지반 보강 방법.
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