KR102075391B1 - 아스피린을 함유하는 랜덤 공중합체를 포함하는 나노입자 및 이의 용도 - Google Patents

아스피린을 함유하는 랜덤 공중합체를 포함하는 나노입자 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 아스피린을 포함하는 랜덤 공중합체에 관한 것이다.
본 발명의 아스피린을 포함하는 랜덤 공중합체는 H2O2를 쉽게 제거하는 것으로 잘 알려져있는 퍼옥살레이트 에스터 결합을 이용하여 H2O2를 빠르게 소거시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 공중합체; 및 피브린에 특이적으로 결합하는 펩티드가 결합된 지질펩티드;를 포함하는 나노입자 및 이를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환용 또는 혈관질환용 약학적 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 나노입자에 형광염료를 더 포함하는 나노입자 및 이를 유효성분으로 포함하는 초음파용 또는 광음향용 조영제에 관한 것이다.

Description

아스피린을 함유하는 랜덤 공중합체를 포함하는 나노입자 및 이의 용도{NANOPARTICLES COMPRISING RANDOM COPOLYMER CONTAINING ASPIRIN AND USE THEREOF}
본 발명은 아스피린을 함유하는 공중합체, 상기 공중합체; 및 피브린에 특이적으로 결합하는 펩티드가 결합된 지질펩티드를 포함하는 나노입자, 상기 나노입자를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 또는 혈전 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 혈전 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물 및 상기 나노입자에 형광염료를 더 포함시킨 나노입자를 유효성분으로 포함하는 초음파용 또는 광음향용 조영제에 관한 것이다.
혈액순환(circulation of blood)이란 혈액이 심장을 중심으로 혈관을 따라 신체를 순환하는 것으로, 각 기관 및 조직에 산소와 영양을 공급하고 탄산가스와 대사산물을 방출하며, 여러 내분비선에서의 호르몬 운반을 통한 특정기관의 기능 조절, 그 밖에 병원균 조절작용과 체온 조절, 삼투압 조절, 수분 조절 등의 기능을 수행하는 과정이다.
혈액순환 장애란 우리 온몸의 구석구석에 뻗어 있는 혈관이 탄력을 잃고 내벽에 콜레스테롤 등이 침착되어 혈관 내강이 좁아져 혈액 순환이 원활이 이루어지지 못하는 것을 말한다. 혈액순환 장애는 손발 차고 저림, 뒷목 당김, 어깨 결림, 기억력 감퇴, 무기력, 집중력 약화, 현기증 및 만성 피로 증상을 유발하여 정상적인 생활을 영위하는데 어려움이 많게 된다. 또한 혈액순환 장애로 인해 고혈압, 동맥경화증, 심근 경색증, 뇌졸중 등이 발생할 수 있으므로 예방 및 관리가 필요하다.
상기 혈액순환 장애의 주요 발병원인 중 하나로 혈전(thrombus)이 알려져 있다. 혈전이란 과다한 혈소판 응집에 의해 매개되는 병리현상으로 인식되고 있다. 혈관에 상처가 생기면 혈관은 수축하게 되며, 상처부로 드러나게 된 콜라겐 섬유(collagen gibrers)에 혈소판이 점착(adhension)되어 활성화(activation)되고, 혈소판에서 분비되는 세로토닌 (serotonin), 아데노신 디포스페이트(adenosine dephosphate, ADP) 및 트롬복산 A2(Thromboxane A2) 등이 혈소판의 응집(aggregation)을 유도한다. 상기 ADP는 더 많은 혈소판들이 달라붙게 하며, 트롬복산 A2(thromboxane A2)는 혈소판들이 응집되도록 작용하여 혈관이 수축하게 된다. 이와 같이 일차적으로 지혈이 진행된 후, 내인성 경로(intrinsic pathway), 외인성 경로(extrinsic pathway) 및 공통 경로(common pathway)로 혈액 응고계가 활성화되어 급속히 혈전이 생성된다. 과도하게 생성된 혈전은 혈관 벽에 붙어 굳어져서 혈류의 흐름을 방해하고 혈액의 점도를 낮추어 혈액순환을 원활하지 못하게 하여 혈액 순환 장애의 원인이 되는 혈전증(thrombosis)이 발생하게 된다.
혈전증의 진행에서 H2O2는 혈소판 활성화 및 내피 기능 장애와 같은 핵심적인 역할을 수행한다. 고농도의 H2O2는 내피 세포 내 종양 괴사 인자-α (Tumor Necrosis Factor-α, TNF)와 같은 전염증 단백질의 발현을 매개하고 혈소판 내피 상호작용을 촉진하여 혈전 형성을 유도한다. 따라서 고농도의 H2O2를 제거하는 것은 혈소판 활성화를 억제하고 혈전 형성을 예방하는 유망한 치료 전략 중 하나이다.
현재 혈전 질환의 예방과 치료에는 항혈소판제, 항응고제, 형성된 혈전을 치료하기 위한 혈전용해제 등이 사용되고 있으나. 대표적인 항혈소판제제인 아스피린은 효과는 뛰어나지만 위장관 출혈과 소화성 궤양 등의 부작용을 일으키는 것으로 알려져 있다. 또한, 그 외의 항응고제나 혈전 용해제 치료제로 쓰이는 약물들은 대부분 경구투여가 불가능하며, 혈전에 대한 선택성이 적어 장기간 복용 시 용혈현상, 면역반응, 발열, 알러지 등의 다양한 부작용을 나타내고 있다. 따라서, 혈소판의 활성화 및 응고의 억제, 혈전의 용해 활성 등의 혈전생성 저해에 대한 높은 선택성을 가지는 동시에 부작용을 최소화시키는 치료제의 개발이 요구되고 있다.
Q. Q. Yang et al., ACS applied Materials, 8(21), 13251-13261, 2016
본 발명의 발명자들은 이러한 한계를 극복하기 위해 H2O2에 의해 빠르게 산화되고 H2O2를 쉽게 제거하는 것으로 잘 알려져있는 퍼옥살레이트 에스터 결합을 이용하여 H2O2를 빠르게 소거시킬 수 있는 아스피린을 포함하는 공중합체를 개발하였다.
그러므로 본 발명에서는 상기 공중합체 및 피브린에 특이적으로 결합하는 펩티드가 결합된 지질펩티드를 포함하는 나노입자 및 이를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환용 또는 혈전 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목표로 한다.
또한, 본 발명에서는 상기 나노입자에 형광염료를 더 포함하는 나노입자 및 이를 유효성분으로 포함하는 초음파용 또는 광음향용 조영제를 제공하는 것을 목표로 한다.
또한, 본 발명에서는 상기 나노입자를 유효성분으로 포함하는 혈전 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것을 목표로 한다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는
하기 구조식 1로 표현되는 랜덤 공중합체:
[구조식 1]
-Am-Bn-
상기 식에서, A는 하기 화학식 1의 구조를 가지며, B는 하기 화학식 2의 구조를 가지며,
상기 공중합체에서 A와 B의 몰 분획은 0.2:0.8 내지 0.8:0.2이고,
상기 m 및 n 은 1 내지 500의 정수인 값을 가지며,
상기 Am 및 Bn 은 교차하여 반복되는 것인 랜덤 공중합체;
[화학식 1]
Figure 112019011689672-pat00001
[화학식 2]
Figure 112019011689672-pat00002
.
본 발명의 상기 랜덤 공중합체는 아스피린 구조인 에틸 살리실산이 폴리(HEMA((2-Hydroxyethyl Methacrylate)-co-MMA(Methyl-Methacrylate)) 고분자구조와 퍼옥살레이트 에스터 결합으로 결합되어 있으며, 혈전 근처에 고농도로 존재하는 과산화수소에 의해 퍼옥살레이트 에스터 결합이 분해됨에 따라 아스피린을 용이하게 방출할 수 있다.
상기 화학식 1의 화합물은 메틸-메타크릴레이트(Methyl-Methacrylate, MMA)이며 이하에서 A로 지칭한다. 상기 화학식 2의 화합물은 2-하이드록시에틸 메타크릴레이트(2-Hydroxyethyl Methacrylate, HEMA)에 에틸 살리실산이 퍼옥살레이트 에스터 결합으로 결합되어 있는 것이며, 이하에서 B로 지칭한다.
상기 공중합체에서 A와 B의 몰 분획이 0.2:0.8 내지 0.8:0.2인 것이 사용될 수 있으나 이에 반드시 제한되는 것은 아니다. 다만, HEMA에 아스피린 화합물이 퍼옥살레이트 에스터 결합으로 결합되어 있으므로 HEMA의 비율이 높을수록 랜덤 공중합체의 아스피린 화합물의 전달 능력은 증가하나, HEMA의 화학적 입체 장애가 MMA에 비해 크기 때문에 폴리(HEMA-co-MMA) 고분자에 아스피린 화합물을 결합시키는 것이 어렵다는 문제점이 존재한다. 상기 문제점을 고려할 때 가장 바람직한 일 실시 양태는 A와 B의 몰 분획이 0.4 : 0.6 내지 0.6 : 0.4인 것이다.
상기 m 및 n은 1 내지 500의 정수인 값을 가질 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며 랜덤 공중합체 또는 하기의 나노입자로 사용되기에 적절한 임의의 값을 가질 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는 하기 구조식 1로 표현되는 랜덤 공중합체; 및 피브린에 특이적으로 결합하는 펩티드가 결합된 지질펩티드;를 포함하는 것인 나노입자:
[구조식 1]
-Am-Bn-
상기 식에서, A는 하기 화학식 1의 구조를 가지며, B는 하기 화학식 2의 구조를 가지며,
상기 공중합체에서 A와 B의 몰 분획은 0.2:0.8 내지 0.8:0.2이고,
상기 m 및 n 은 1 내지 500의 값을 가지며,
상기 Am 및 Bn 은 교차하여 반복되는 것인 나노입자:
[화학식 1]
Figure 112019011689672-pat00003
[화학식 2]
Figure 112019011689672-pat00004
.
상기 랜덤공중합체의 각 단량체, 각 단량체의 몰 분획 및 m 및 n에 대한 정의는 앞서 정의하였던 것과 동일하다.
본 발명의 상기 나노입자는 피브린에 특이적으로 결합하는 펩티드가 결합된 지질펩티드를 포함한다. 피브린은 혈전의 주된 성분으로 피브린에 특이적으로 결합하는 펩티드가 결합된 지질펩티드를 포함함으로써 본 발명의 나노입자는 혈전에 특이적으로 결합할 수 있다.
혈전 표적용 펩티드를 포함하는 본 발명의 마이셀은 피브린을 표적할 수 있다. 피브린은 혈액 응고 과정에 작용하는 단백질로 혈액이 응고할 때, 단백질 분해효소인 트롬빈이 혈장 중에 녹아 있는 피브리노겐에 작용했을 때에 생기는 불수용성의 단백질이다.
본 발명에서 용어 "혈전"은 생체의 혈관 내에서 혈액이 굳어진 상태를 의미하는바, 혈전은 혈관내피의 손상, 혈류의 침체, 혈액성분의 변화 등에 의해서 발생하고, 이러한 혈전에 의하여 일어나는 병태를 혈전증(thrombosis)이라고 한다. 또한, 상처가 복구될 때 생체내의 복잡한 생성기작에 의하여 활성화된 트롬빈(thrombin)이 혈액 중에 존재하는 피브리노겐(fibrinogen)을 피브린(fibrin)으로 변화시켜 불용성의 중합체를 형성하면서 생성되는데, 피브린 단량체는 수소결합에 의하여 결집되어 부드러운 혈병(soft clot)을 형성하고 이 혈병은 여러 요인에 의하여 딱딱한 혈병(hard clot)으로 전환되어 혈전을 생성하게 된다.
본 발명에서 지질펩티드는 인지질, 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylene glycol, PEG) 및 혈전 표적용 펩티드로 구성된다.
상기 인지질은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DSPE), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, DOPE), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine, DOPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스페이트(1수화물염)(1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphate(Monosodium Salt), DOPA ), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-[포스포-rac-(1-글리세롤)](나트륨 염)(1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-rac-(1-glycerol)](Sodium Salt), DOPG) 및 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(염소염)(1,2-Dioleoyl-3-Trimethylammonium-Propane(Chloride Salt), DOTAP)일 수 있으나 이에 한정하지 않으며, 바람직하게는 DSPE이다.
상기 혈전 표적용 펩티드는 GPRPP, CREKA 및 GPRPPC 펩티드를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 GPRPP이다.
상기 GPRPP, CREKA 및 GPRPPC 펩티드는 피브린과 특이적으로 결합하는 피브린 표적 단백질이며, GPRPP 및 CREKA 는 5개의 아미노산을 함유한 펜타펩티드(pentapeptide)이며, GPRPPC 펩티드는 6개의 아미노산을 함유한 헥사펩티드(Hexapeptide)로서, 각각 하기 서열번호 1, 2 및 3으로 표시될 수 있다.
[서열번호 1]
glycine-proline-arginine-proline-proline
[서열번호 2]
cysteine-arginine-glutamic acid-lysine-alanine
[서열번호 3]
glycine-proline-arginine-proline-proline-cysteine
본 발명의 상기 나노입자는 형광 염료가 추가로 결합될 수 있다. 형광 염료가 결합될 경우 특정 파장의 빛을 해당 형광 염료가 흡수하여 음향적 반응을 나타내고 그 결과 상기 나노입자가 존재하는 부위에서 광음향 신호를 관측할 수 있어 상기 나노입자는 광음향용 조영제로 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 형광 염료는 고분자와 결합하면서 부작용을 발생시키지 않는 어떠한 형광 염료도 사용 가능하다. 상기 형광 염료는 Cl기 또는 Br기가 결합된 것이 바람직하며, 그 예로는 IR780, IR820 및 IR1061 등이 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니며 인도시아닌 그린(Indocyanine green), 시아닌5 카복실산(Cyanine5 carboxylic acid), 시아닌7 카복실산(Cyanine7 carboxylic acid) 등의 형광염료 또한 사용될 수 잇다.
본 발명의 상기 나노입자는 과산화수소 하에서 에틸 살리실산(Ethyl salicylate)을 생성하는 것을 특징으로 한다. 아스피린 구조인 에틸 살리실산이 폴리(HEMA((2-Hydroxyethyl Methacrylate)-co-MMA(Methyl-Methacrylate)) 고분자구조와 퍼옥살레이트 에스터 결합으로 결합되어 있으며, 혈전 근처에 고농도로 존재하는 과산화수소에 의해 퍼옥살레이트 에스터 결합이 분해됨에 따라 아스피린을 용이하게 방출한다.
본 발명의 상기 나노입자는 항산화 효과를 나타내는 것을 특징으로 한다. 과산화수소는 활성산소종의 역할을 하는데, 퍼옥살레이트 에스터 결합이 분해되면서 과산화수소를 제거하여 항산화 효과를 나타낸다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 나노입자를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어 "염증성 질환"은 아토피 피부염, 부종, 피부염, 알레르기, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스 열루푸스, 섬유근통(fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome) 및 다발성 경화증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 용어 "예방"은 상기 조성물의 투여에 의해 염증성 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 있어서, 용어 "치료"는 상기 조성물의 투여에 의해 염증성 질환을 낫게 하는 행위를 모두 의미하는 것으로, 질환, 질환의 증상, 질병 또는 질환의 2차 질환, 또는 이에 대한 소인(predisposition)을 치료, 경감, 완화, 요법(remedy), 또는 향상하기 위한 목적과 함께 질환, 질환의 증상, 질병 또는 질환의 2차 질환, 또는 이에 대한 소인을 갖는 피험자(인간 또는 동물)에게 상기 나노입자를 포함하는 조성물의 적용 또는 투여로 정의된다.
본 발명의 약학적 조성물은 총 조성물의 중량 대비 상기 나노입자를 0.0001 내지 80 중량%로 포함할 수 있으며, 구체적으로 0.01 중량% 내지 40 중량%로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있고, 상기 담체는 비자연적 담체(non-naturally occuring carrier)를 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
상기 "약학적으로 허용가능한"은 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다.
구체적으로, 상기 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 약학적으로 허용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다. 또한, 필요한 경우 항산화제, 완충액 및/또는 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가하여 사용할 수 있으며, 희석제, 분산제, 계면 활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제 등으로 제제화하여 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 투여 방식은 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방식에 따를 수 있다. 상기 투여 방식의 비제한적인 예로, 조성물을 경구 투여 또는 비경구 투여 방식으로 투여할 수 있다. 또한, 본 발명의 염증성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물은 목적하는 투여 방식에 따라 다양한 제형으로 제조될 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 나노입자를 유효성분으로 포함하는 혈전 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어 "혈전 질환"은 혈전증, 동맥경화증, 고혈압, 협심증, 심근경색, 허혈성 심장질환, 심부전, 뇌경색, 뇌출혈 및 뇌졸중으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
이때, 상기 예방, 치료, 혈전 및 약학적 조성물에 대한 정의는 상기에서 설명한 바와 같다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 나노입자를 유효성분으로 포함하는 혈전 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
이때, 상기 예방 및 혈전에 대한 정의는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 용어, "개선"은 본 발명의 조성물의 투여로 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 용어, "식품"은 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료, 비타민 복합제, 건강 기능 식품 및 건강 식품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.
본 발명의 식품 조성물은 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 높은 염증성 질환 개선 효과를 기대할 수 있으므로, 건강 증진 목적으로 매우 유용하게 사용될 수 있다.
상기 건강 기능(성) 식품(functional food)이란, 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)과 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미한다. 여기서 '기능(성)'이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 상기 식품의 제형은 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 천연물을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나므로, 본 발명의 식품은 염증성 질환의 개선 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.
상기 건강 식품(health food)은 일반식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품(health supplement food)은 건강보조 목적의 식품을 의미한다. 경우에 따라, 건강 기능 식품, 건강식품, 건강보조식품의 용어는 호용된다.
구체적으로, 상기 건강 기능 식품은 본 발명의 추출물을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품 소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용이 없는 장점이 있다.
상기 식품 조성물은 생리학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는데, 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다.
또한, 상기 식품 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu), 크륨(Cr) 등의 미네랄; 및 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다.
또한, 상기 식품 조성물은 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 포함할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물의 일 예로 건강음료 조성물로 사용될 수 있으며, 이 경우 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드; 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강음료 조성물 100 mL 당 일반적으로 약 0.001 ~ 0.4 g, 구체적으로 약 0.002 ~ 0.3 g이 될 수 있다.
상기 외에 건강음료 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산, 펙트산의 염, 알긴산, 알긴산의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 또는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일주스, 과일주스 음료, 또는 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강음료 조성물 100 중량부당 0.001 ~ 0.10 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는
(1) 메틸-메타크릴레이트(Methyl-Methacrylate, MMA) 및 2-하이드록시에틸 메타크릴레이트(2-Hydroxyethyl Methacrylate, HEMA)를 몰 분획 0.2:0.8 내지 0.8:0.2로 중합하여 랜덤 공중합체인 폴리(HEMA-co-MMA)를 수득하는 단계;
(2) 에틸 살리실산과 옥살릴 클로라이드를 반응시켜 에틸 2-(2-클로로-2-옥소아세톡시) 벤조에이트를 수득하는 단계; 및
(3) (1) 단계의 폴리(HEMA-co-MMA) 및 (2) 단계의 에틸 2-(2-클로로-2-옥소아세톡시) 벤조에이트를 반응시켜 아스피린을 포함하는 랜덤 공중합체를 수득하는 단계;
를 포함하는 랜덤 공중합체의 제조 방법을 제공한다.
상기 제조방법에 있어서, HEMA, MMA, 몰분획 및 에틸 살리실산에 관한 정의는 앞서 정의하였던 것과 동일한 의미를 갖는다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 제조방법으로 제조된 랜덤 공중합체 및 피브린에 특이적으로 결합하는 펩티드가 결합된 지질펩티드를 포함하는 폴리비닐 알콜 용액을 혼합하고 유화시키는 단계;
(2) (1) 단계의 생성물을 폴리비닐 알콜 용액에 첨가하고 균질화하는 단계;
를 포함하는 나노입자의 제조 방법으로서.
상기 지질펩티드는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DSPE), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, DOPE), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3- Phosphocholine, DOPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스페이트(1수화물염)(1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphate(Monosodium Salt), DOPA ), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-[포스포-rac-(1-글리세롤)](나트륨 염)(1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-rac-(1-glycerol)](Sodium Salt), DOPG) 및 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(염소염)(1,2-Dioleoyl-3-Trimethylammonium Propane(Chloride Salt), DOTAP)으로 구성된 군으로부터 선택된 인지질, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol) 및 GPRPP 펩티드로 구성되는 지질펩티드(lipopeptide);를 포함하는 것으로, 상기 GPRPP 펩티드는 서열번호 1로 표시되는 것인 나노입자의 제조 방법을 제공한다.
상기 제조방법에 있어서 지질펩티드 및 지질펩티드에 포함된 인지질 및 GPRPP 펩티드에 관한 정의는 앞서 정의하였던 것과 동일한 의미를 갖는다.
상기 제조방법에 있어서 (1) 단계의 폴리비닐 알콜은 형광염료를 더 포함하는 것일 수 있으며, 상기 형광염료는 인도시아닌 그린(Indocyanine green), 시아닌5 카복실산(Cyanine5 carboxylic acid), 시아닌7 카복실산(Cyanine7 carboxylic acid), IR780, IR820 및 IR1061으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다. 따라서 상기 제조방법에 의해 제조된 나노입자는 형광 염료에 의해 체내에서 광음향 또는 초음파용 또는 광음향용 조영제로서 사용될 수 있다.
중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생락하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.
본 발명은 아스피린을 포함하는 랜덤 공중합체에 관한 것이다.
본 발명의 아스피린을 포함하는 랜덤 공중합체는 H2O2를 쉽게 제거하는 것으로 잘 알려져있는 퍼옥살레이트 에스터 결합을 이용하여 H2O2를 빠르게 소거시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 공중합체; 및 피브린에 특이적으로 결합하는 펩티드가 결합된 지질펩티드;를 포함하는 나노입자 및 이를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환용 또는 혈관질환용 약학적 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 나노입자에 형광염료를 더 포함하는 나노입자 및 이를 유효성분으로 포함하는 초음파용 또는 광음향용 조영제에 관한 것이다.
도 1은 혈전성 혈관 질환에 대한 H2O2 활성 치료제로서 T-APP를 제조하는 과정에 대한 개략도이다.
도 2는 아스피린 공중합체의 합성과정에 대한 반응식을 나타낸 것이다.
도 3의 (a)는 동적 광 산란법에 의해 측정한 APP의 크기 분포를 나타낸 것이며 (b)는 APP의 SEM 이미지를 나타낸 것이며 (c)는 APP에 의해 H2O2가 제거되는 것을 시간 대비로 나타낸 것이며 (d)는 APP로부터 ESA가 방출되는 역학을 그래프로 나타낸 것이며 (e)는 APP의 존재 또는 부재에 따른 과산화수소에 의해 활성화되는 동맥 내피 세포를 공초점 형광 현미경으로 나타낸 것이며 (f)는 APP의 존재 또는 부재에 따른 과산화수소 처리된 세포의 생존 가능성을 그래프로 나타낸 것이며 (g)는 LPS에 의해 활성화된 RAW264.7 세포 내 TNF-α 수준에 대한 APP의 효과를 그래프로 나타낸 것이며 (h)는 활성화된 혈소판 내 sCD40L의 수준에 대한 APP의 효과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 4의 (a)는 동적 광 산란법에 의해 측정한 T-APP의 크기 분포를 나타낸 것이며 (b)는 T-APP의 SEM 이미지를 나타낸 것이며 (c)는 T-APP의 UV-vis 스펙트라를 그래프로 나타낸 것이며 (d)는 T-APP의 형광 방출 스펙트라를 그래프로 나타낸 것이며 (e)는 T-APP로 처리한 혈전의 형광 이미지를 나타낸 것이며 (f)는 (e)의 혈전의 정량화된 형광 신호를 나타낸 것이다.
도 5의 (a)는 출혈분석 과정에 대한 개략도를 나타낸 것이며 (b)는 ESA 및 T-APP 투여에 따른 출혈 시간을 그래프로 나타낸 것이며 (c)는 절개한 꼬리에서 방출된 출혈량을 그래프로 나타낸 것이며 (d)는 APP 또는 T-APP를 정맥 주사한 마우스의 절개한 꼬리의 형광 이미지를 나타낸 것이다.
도 6의 (a)는 FeCl3 처리 경동맥 혈전증(carotid arterial thrombosis) 마우스 모델을 제조하는 과정을 개략도로 나타낸 것이며 (b)는 주사 30분 후의 APP 및 T-APP를 주사한 후의 경동맥의 형광 이미지를 나타낸 것이며 (c)는 (b)에서 얻은 형광 이미지의 형광 강도를 정량화한 그래프를 나타낸 것이며 (d)는 IR780이 탑재된 T-APP를 이용한 경동맥의 시간 경과에 따른 형광 이미지를 나타낸 것이며 (e)는 (c)의 정량화된 형광 강도를 정규화하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 7의 (a)는 혈중 TNF-α 수준에 대한 T-APP의 효과를 그래프로 나타낸 것이며 (b)는 sCD40L의 수준에 대한 T-APP의 효과를 그래프로 나타낸 것이며 (c)는 FeCl3 처리 경동맥의 조직 검사 결과를 이미지로 나타낸 것으로 윗부분은 H&E로 염색된 혈관의 단면을 나타낸것이며 아랫부분은 DHE로 염색된 혈관의 단면을 나타낸 것이다.
도 8은 에틸-2-(2-클로로-2-아세톡시) 벤조에이트를 NMR 스펙트로스코피로 동정한 것이며 (a)는 1H NMR 스펙트럼을 나타낸 것이며 (b)는 13C NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 9는 폴리(HEMA-co-MMA)를 NMR 스펙트로스코피로 동정한 것이며 (a)는 1H NMR 스펙트럼을 나타낸 것이며 (b)는 13C NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 10은 화합물의 분자량을 측정한 것으로 (a)는 폴리(HEMA-co-MMA)의 GPC 자취를 나타낸 것이며 (b)는 아스피린 폴리컨쥬게이트의 GPC 자취를 나타낸 것이다.
도 11은 아스피린 폴리컨쥬게이트가 과산화수소와 만나 분해되는 반응식 및 아스피린 폴리컨쥬게이트를 과산화수소(100 마이크로몰) 용액 내에서 24시간 동안 가수분해한 후 얻은 분해 산물의 1H NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 12는 APP 및 T-APP로 처리한 쥐의 절개한 꼬리에서 확인한 정량화된 형광 강도를 나타낸 것이다.
도 13은 건강한 마우스를 이용하여 T-APP의 생체 독성을 연구한 이미지로서 (a)는 ALT의 수준을 나타낸 것이며 (b)는 H&E로 염색된 주요 장기의 이미지이다.
도 14는 PBS, 0.5mM 과산화수소 및 1mM 과산화수소에서의 아가로스 겔 영상(phantom)에서의 T-APP의 광음향 영상과 광음향 강도를 나타낸 것이다.
도 15는 PBS, 1mM 과산화수소 및 5mM 과산화수소에서의 아가로스 겔 영상(phantom)에서의 T-APP의 광음향 영상과 광음향 강도를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
재료 및 시약
2-하이드록시메틸 메타크릴레이트 (2-Hydroxyethyl Methacrylate, HEMA, 99%) 2-사이아노-2-프로필 도데실 트리티오카보네이트 (2-Cyano-2-propyl Dodecyl Trithiocarbonate, CTA, 97%) 및 IR780 아이오다이드 (98%)를 시그마-알드리치(St. Louis, MO, USA) 사로부터 구입하였다. 메틸 메타크릴레이트 (Methyl methacrylate, MMA, 99%), 옥살릴 클로라이드 (Oxalyl chloride, 98%), 에틸 살리실레이트 (Ethyl salicylate, 99%) 및 AIBN (Azobisisobutylronitrile)을 Alfa Aser 사로부터 구입하였다. 피리딘을 Showa (japan) 사로부터 구입하였다. HEMA 및 MMA 내 억제제는 염기성 알루미나 컬럼을 통과시켜 제거하였다. 테트라하이드로퓨란(Tetrahydrofuran, THF) 및 디클로로메탄(Dichloromethane, DCM)을 사용 전에 정제하였다.
또한, GPRPP 펩티드는 CEM 사(Matthews, NC, 미국)으로부터 구입한 9-플루오레닐메틸옥시카보닐(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl, Fmoc)-보호된 아미노산 및 MerckChemicals 사(Nottingham, 영국)로부터 구입한 링크(rink) 아마이드인 4-메틸벤지드릴아민 수지를(4-Methylbenzhydrylamine resin, MBHA resin)을 이용하여 Liberty Microwave Peptide synthesizer (CEM Co., Matthews, NC, 미국)으로 제조하였다.
실시예 1. APP의 합성
APP를 합성하는 과정을 도 2에 나타내었다. 이하 각 단계별로 합성과정을 설명한다.
(1) 폴리(HEMA-co-MMA)의 합성 (도 2의 화합물 1)
폴리(HEMA-co-MMA)를 두 단량체의 공급 비율을 달리하여 합성하였다. 예를 들어, HEMA 70% 및 MMA 30%인 폴리(HEMA-co-MMA)를 얻기 위해, HEMA (33.60 mmol, 4.087 mL), MMA (14.04 mmol, 1.534 mL), CTA (0.3 mmol, 103.7 mg) 및 AIBN (0.60 mmol, 98.5 mg)을 자석 교반 막대가 달린 슈링크(Schlenk) 플라스크에서 혼합하고 THF 10mL를 첨가하였다. 플라스크 내 기체를 3회의 동결-펌프-해동 사이클을 거쳐 제거하였다. 기계적 교반하에 65℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 반응 혼합물을 과량의 냉각된 헥산에 농축시키고 침전시켰다. 침전물을 여과하여 수득하였고 진공 오븐 내에 밤새 건조시켰다. 수득한 폴리(HEMA-co-MMA)의 화학 구조를 NMR(JNM EX-400, JEOL, 일본)을 사용하여 확인하였고, 분자량은 굴절률(Refractive Index, RI)을 갖는 GPC(Gel permeation chromatography)를 사용하여 확인하였다. GPC 분석을 Waters 2414 시차(differential) RI 검출기 및 Waters 1515 이소크래틱 펌프가 장착된 Waters breeze (Waters Corp., Milford, MA, USA) 분리 모듈을 사용하여 수행하였고 그 결과를 도 10의 (a)에 나타내었다.
(2)에틸-2-(2-클로로-2-옥소아세톡시)벤조에이트 (Ethyl-2-(2-chloro-2-oxoacetoxy)benzoate)의 합성 (도 2의 화합물 2)
에틸 살리실산(Ethyl Salicylate, ESA) (5.0 mmol)를 10 mL의 무수 디클로로메탄 내에 용해시켰다. 옥살릴 클로라이드 (15.0 mmol)를 용액에 적가하였다. 혼합물을 얼음 욕조 내에 냉각시키고 5 mL의 디클로로메탄 내에 피리딘 (15.0 mmol)을 기계적으로 교반하면서 적가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 피리딘 하이드로클로라이드(Pyridine hydrochloride)를 여과하여 제거하였고, 여과물을 회전 증발기를 사용하여 농축시켰다. 헥산(150 mL)을 잔류물에 첨가하였고, 혼합물을 다시 여과하여 잔류 피리딘 하이드로클로라이드를 제거하였다. 진공 하에 헥산을 증발시킨 후, 에틸 2-(2-클로로-2-옥소아세톡시) 벤조에이트를 무색 유성 액체로 수득하고 정제 없이 추가 조작에 사용하였다. 수득한 에틸-2-(2-클로로-2-옥소아세톡시)벤조에이트의 화학 구조를 1H 및 13C NMR 스펙트로스코피를 사용하여 확인하였고, 그 결과를 각각 도 8의 (a) 및 (b)에 나타내었다. 1H NMR (400MHz, CDCl3): δ=1.35 (t: 3H), 4.35 (m: 2H), 7.29 (d: 1H), 7.43 (t: 1H), 7.64 (t: 1H), 8.13 (d: 1H). 13C NMR (400MHz, CDCl3): δ= 163.7, 160.5, 154.0, 149.5, 134.3, 132.2, 127.4, 123.1, 122.2, 61.8, 14.0.
(3) 아스피린 폴리컨쥬게이트(APP, Aspirin Polyconjugate)의 합성 (도 2의 화합물 3)
10 mL 건조 THF 내에 화합물 1 (1.00 g, 61.0 μmol)을 가열하여 화합물 1을 완전히 용해시켰다. 2 mL 건조 THF 내 화합물 2 (1.28 g, 5.0 mmol)를 용액에 첨가하였다. 혼합물을 얼음 욕조 내에 냉각시키고, 1 mL의 THF 중 피리딘 (404.4 μL, 5.0 mmol)을 기계적으로 교반하면서 적가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 과량의 에탄올 침전으로 피리딘 하이드로 클로라이드를 3회 제거하였다. 침전물을 여과하여 수집하고 진공 오븐 내에 밤새 건조시켰다. 분자량은 GPC로 결정하였고 그 결과를 도 10의 (b)에 나타내었으며, 수득한 APP의 화학 구조를 1H 및 13C NMR 스펙트로스코피를 사용하여 확인하였고, 그 결과를 각각 도 9의 (a) 및 (b)에 나타내었다. 13C NMR(400MHz, CDCl3): δ= 177.9, 176.9, 163.8, 156.6, 155.3, 149.5, 134.1, 132.0, 126.9, 123.2, 122.6, 64.1, 61.9, 61.4, 54.3, 51.7, 44.8, 44.4, 28.4, 18.7, 16.4, 14.0.
(4) 합성된 아스피린 폴리컨쥬게이트(Aspirin Polyconjugate)의 조성 및 화학구조 분석
상기 아스피린 폴리컨쥬게이트를 설계하는 과정에서, 입체 장애를 줄이기 위해 MMA를 사용하여 부피가 큰 ESA와의 결합 반응을 촉진시켰다. ESA 컨쥬게이션의 수용 능력, 가수 분해에 대한 안정성 및 구조적 복잡성을 고려하여 공중합체의 조성을 주의깊게 결정 하였다. 높은 몰비의 HEMA를 갖는 ESA와의 결합 수준이 높기 때문에 공중합체의 치료 효과를 높힐 수 있다는 점에서는 바람직한 것으로 보일 수 있으나. 입체 장애는 근접한 ESA와의 결합을 제한하고 반응성 있는 수산화기는 퍼옥살레이트 에스터 결합을 공격할 가능성이 높기 때문에 퍼옥살레이트 에스터 결합이 절단되고 ESA가 방출된다. 또한, 퍼옥살레이트 에스터 결합의 함량이 높은 공중 합체는 수용액 조건 하에서 가수 분해에 취약하다. 따라서, 아스피린 폴리 컨쥬게이트에서의 HEMA 및 MMA의 몰비는 0.6 : 0.4가 가장 바람직하였다.
또한, 아스피린 폴리컨쥬게이트의 화학 구조는 NMR 스펙트로스코피에 의해 확인되었으며 분자량은 최대 33,000 Da로 결정되었다. 또한 아스피린폴리컨쥬게이트에서 ESA의 함량이 최대 45 중량%로 기존 약물 운반체의 약물 적재 용량보다 매우 뛰어나다는 것을 확인하였다.
실시예 2. 피브린에 특이적으로 결합하는 펩티드가 결합된 지질펩티드의 제조
피브린에 특이적으로 결합하는 지질펩티드인 GPRPP 펩티드를 아미노산 결합을 통해 제조하였다. 아미노산 각각의 결합 단계에 대하여 Fmoc-보호된 아미노산 및 결합 시약을 수지 농도에 대해 5배 몰 과량으로 첨가하였다. 펩티드의 절단 및 침전 후 Water C18 컬럼 (19 x 300 mm)을 이용한 역상 고성능 액체 크로마토그래피(Reversed Phase High-Performance Liquid Chromatography, RP-HPLC)를 통해 펩티드를 정제하였다. 정제된 GPRPP 펩티드는 디메틸 포름아마이드(Dimethyl Foramide, DMF) 내에 용해시켰고 2:1의 몰 비율인 DSPE-PEG((Distearoylphosphatidyl ethanolamine-Poly(ethylene glycol))(3.4 K)-말레이미드와 혼합하였다. 25℃에서 24시간 동안 결합을 진행한 후 반응 혼합물을 증류수로 투석하였다. GPRPP-PEG-DSPE는 동결 건조 후 -20℃에서 보관하였다.
실시예 3. 아스피린 폴리컨쥬게이트 입자(Aspirin Polyconjugate Particles, 이하 APP) 및 표적화 아스피린 폴리컨쥬게이트 입자 (Targeting Aspirin polyconjugate Particles, 이하 T-APP)의 제조
아스피린 폴리컨쥬게이트 100 mg을 함유하는 DCM(0.9 ml)을 5 (w/v)% 폴리 비닐 알콜 (PVA) 용액 20 mL에 넣었다. 혼합물을 1분 동안 초음파 분쇄기 (Fisher Scientific, Sonic Dis-membrator 500) 및 1분 동안 5 단계(17,000-24,000 rpm)의 출력 세팅을 갖는 균질기 (PRO Scientific, PRO 200)를 사용하여 유화시켰다. 에멀젼을 20 mL의 PVA 0.5 (w/v)% 용액에 첨가하였고 1분 동안 균질화시켰다. 회전식 증발기를 사용하여 남아있는 용매를 제거하고, 4℃에서 8분간 8,500g으로 원심 분리한 후, 탈이온수로 2회 세척하고 동결 건조하여 APP를 얻었다.
또한, 뛰어난 H2O2 활성화 항염증 및 항혈소판 작용으로 유망한 아스피린 폴리컨쥬게이트를 혈전-표적 리간드로서 GRPPP를 이용하여 혈전을 표적으로 하는 항혈전제제로서 T-APP로 제형화하였다. GPRPP는 혈전 표면에 풍부하게 존재하는 피브린과의 친화성이 높기 때문에 혈전의 표적 리간드로 광범위하게 사용되어왔다. T-APP의 제조를 위해, 아스피린 폴리 컨쥬게이트 100 ㎎를 함유하는 DCM (0.8 ml) 및 지질펩티드 DSPE-PEG-PPRPG (10 ㎎) 및 IR780 (10 ㎎)을 함유하는 에탄올 (0.2 ml)을 20 ml의 5 (w/v) % 폴리 비닐 알콜 (PVA) 용액에 첨가하여 T-APP를 제조하였다.
실시예 4. APP 및 T-APP의 물리적 특성 분석
APP 및 T-APP를 금속 스터브 상에 장착하고 Au-Pd로 스퍼터-코팅하였다. 전북대학교 연구 시설(CURF)에 설치되어있는 전계방사 주사전자현미경 (Field Emission-Scanning Electronic Microscope) (SUPRA40VP, Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 입자의 형태를 관찰하였다. 입자의 평균 크기 및 크기 분포를 입자 크기 분석기(90Plus, Brookhaven Instrument Corp., NY, USA)를 사용하여 동적광산란법으로 측정하였다. 그 결과 APP는 매끄러운 표면 및 탈이온수에서 300 내지 400 nm 범위의 유체역학적 직경을 갖는 둥근 구 형태였다(도 3 (a) 및 (b)).
T-APP는 광학 이미징을 위해, IR780을 형광 프로브로서 T-APP 내에 캡슐화하였다. T-APP는 GPRPP로 표면이 뒤덮이기 때문에 APP와 비교하여 약간 더 큰 유체역학적 직경을 나타내었다(도 4(a) 및 (b)). 또한 T-APP는 코어에 IR780이 존재하기 때문에 ~790 nm에서 강한 녹색 흡수와 ~820 nm에서 강한 형광 방출을 나타냄을 확인하였다(도 4(c) 및 (d)).
실시예 5. APP의 H 2 O 2 반응성 분석 - APP로부터의 ESA 방출
막 투석 튜브 (Cutoff MW1000, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)를 1 mg APP (1 mg/mL)로 로딩하였다. 튜브를 1 mM 또는 5 mM H2O2를 함유하는 45 mL의 PBS 용액에 침지시켰고 37 ℃에서 기계적으로 교반하였다. 적절한 시간 간격으로, 1 mL의 용액을 수집하였고 같은 부피의 신선한 완충액으로 대체하였다. APP로부터 방출된 ESA의 양은 ESA의 표준 용액과 비교하여 360nm에서 자외선 분광계(S-3100, SINCO, Korea)를 사용하여 결정하였다. APP로부터 ESA의 H2O2 의존성 방출 동역학을 조사한 결과 APP는 높은 농도의 H2O2 용액에서 ESA의 더욱 빠른 누적 방출 역학을 나타내었으며(도 3(d)), 이는 H2O2에 의해 유발된 ESA 방출을 명백하게 확인하였다. 아스피린 폴리컨쥬게이트로부터의 ESA의 방출된다는 사실은 아스피린 폴리컨쥬게이트의 H2O2 매개 가수분해 생성물의 1H NMR 스펙트럼으로 더욱 뒷받침되었다. ESA의 강한 하이드록실 양성자 피크는 ~ 11 ppm에서 나타났다(도 11).
실시예 6. APP의 H 2 O 2 반응성 분석 - APP에 의한 H 2 O 2 소거
APP가 H2O2를 활성화시킬 수 있는 항혈전제로서 개발됨에 따라, H2O2를 소거하는 능력을 조사했다. APP가 H2O2를 소거하는 능력을 퍼옥살레이트 화학 발광에 기초하여 평가하였다. 다양한 농도의 H2O2 용액(100 μM 및 10 μM)을 APP에 첨가하였다. 혼합물 내 잔류 H2O2의 수준을 형광 물질로서 루브렌(rubrene)을 함유한 디페닐옥살레이트 용액과의 반응 후 화학 발광 강도를 측정하여 결정하였다. 화학 발광 강도는 루미노미터(luminometer, FB 12, Berthold Detection Systems, 독일)를 사용하여 측정하였다.
그 결과, APP (1 mg/mL)와 배양시키는 동안, H2O2 수준은 점진적으로 감소하여 (도 3(c)), APP의 퍼옥살레이트 에스터 결합을 통한 산화 과정에서 H2O2가 소비됨을 확인하였다. 실시예 5와 더불어, APP는 H2O2에 의해 유발된 퍼옥살레이트 에스터 결합의 산화를 거쳐, H2O2 소거 및 ESA 방출을 유도한다.
실시예 7. T-APP의 생물학적 활성 측정 - 세포독성
3-(4,5-디메틸티아질-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸륨브로마이드 (MTT) 분석을 수행하여 T-APP의 세포 독성을 평가하였다. RAW 264.7 세포를 24-웰 플레이트에 24시간 동안 배양하여 ≥80%의 컨플루언시(confluency)에 도달시켰다. 세포를 24시간 동안 다양한 양의 APP로 처리하였다. 각 웰에 100 μL의 MTT 용액을 투여하고 3시간 동안 배양하였다. 디메틸 술폭사이드 (200μL)를 각 웰에 첨가하여 생성된 포르마잔(formazan) 결정을 용해시켰다. 배양 10분 후, 마이크로 플레이트 판독기 (Biotek Instruments, Winooski, VT, USA)를 사용하여 570 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 세포 생존력은 T-APP 처리 세포와 대조군 세포의 흡광도를 비교하여 결정하였다. 그 결과 APP는 H2O2 매개성 세포독성 농도를 유의하게 억제하였다. 그러나, 동등한 양의 ESA는 현저한 보호 효과를 나타내지 않았다 (도 3(f)).
실시예 8. APP 및 T-APP의 생물학적 활성 측정 - 세포 내부 ROS의 측정
동맥 내피 세포를 유리 바닥 플레이트(MatTek Corp., Ashland, MA, USA)에서 배양하고 200 μM H2O2로 처리하였고, 즉시 ESA와 APP를 첨가하였다. 세포를 24 시간 동안 배양하였고 활성 산소종(Reactive Oxygen species, ROS)에 대한 프로브로서 2,7-디클로로플루레세인 디아세테이트(2,7-dichlorfluorescein diacetate, DCFH-DA)로 30분 동안 처리하여 ROS의 세포 내 수준을 측정하였다. 세포를 신선한 배지로 세척하였고 대학 종합 연구 시설 센터(Center for University-Wide Research Facilities, CURF)에 설치된 공초점 레이저 스캐닝 현미경 (Confocal laser scanning microscope, LSM 510 Meta, Carl Zeiss, Inc., Germany)을 사용하여 관찰하였다. 그 결과, APP(100 μg/mL)는 H2O2에 의해 활성화된 동맥 내피세포에서 ROS의 세포 내 수준을 상당하게 억제하였으며, 이는 동등한 ESA (250 μM)보다 유의하게 높은 보호 효과를 나타내었다(도 3(e)).
실시예 9. APP의 항염증 효과 평가
APP의 항염증 활성을 LPS-자극 RAW264.7 세포를 사용하여 평가하였다. RAW264.7 세포와 내피 세포를 24-웰 배양 플레이트 내에 24 시간 동안 배양 하였다. 90% 이하의 컨플루언시를 가진 세포를 1 ㎍의 리포폴리사카라이드 (Lipopolysaccharide, LPS)의 존재하에 12시간 동안 ESA와 APP로 처리하였다. 그 결과 사이토카인의 수준은 제작자에 의해 권고된 마우스 TNF-α ELISA 키트 (eBioscience, San Diego, CA, USA)로 측정하였다. LPS 자극은 전염증 TNF-α의 수준을 현저하게 상승시켰다. APP는 농도 의존적 방식으로 TNF-α의 LPS-유발된 상향 조절(upregulation)을 유의하게 억제하였고 동등한 ESA보다 강한 항염증 효과를 나타냈다 (도 3(g)).
실시예 10. 항혈소판 활성 평가
활성화된 혈소판은 내피세포 상의 sCD40L과 상호 작용하여 혈전 및 염증 과정을 매개하는 순환 내 sCD40L의 주요 공급원이다. 그러므로 본 실시에에서는 APP가 혈소판 내 sCD40L의 발현에 미치는 영향을 조사했다. 혈장(plasma) (90 μL)을 항체 코팅 플레이트 내에 첨가하였다. 각 샘플은 실온에서 2 시간 동안 5 μL의 트롬빈 (0.1 U/μL) 또는 다양한 양의 ESA 및 APP와 함께 배양되었다. 제작자의 지시에 따라 sCD40L의 수준을 ELISA 키트(ab119517, Abcam, Cambridge, UK)로 측정하였다.
그 결과 트롬빈 및 CaCl2에 의한 활성화에 따라, 혈소판은 비활성화된 혈소판보다 3배 높은 sCD40L을 발현하였다(도 3(h)). ESA는 본질적인 항혈소판 효과로 인해 sCD40L의 수준을 현저히 감소시켰다. 그러나, APP는 동등한 ESA보다 sCD40L의 발현에 더 강한 억제 효과를 나타내었다. 이는 APP의 강한 항혈소판 활성은 퍼옥살레이트 에스터 결합 분해에 의한 H2O2 소거와 방출된 ESA의 결합 효과에 기인한 것일 수 있다.
실시예 11. T-APP의 생체 내 혈전(thrombus) 표적화 여부 분석
혈소판이 풍부한 플라스마를 6 웰 플레이트 내에 첨가하고 트롬빈/CaCl2의 존재하에 피브리노겐과 함께 배양하여 혈전 형성을 유도하였다. IR780을 캡슐화하는 T-APP 또는 APP를 응고 형성 개시 3분 후에 첨가하였다. 혈전을 식염수로 2회 부드럽게 씻어서 결합되지 않은 입자를 제거하였다.
T-APP가 혈전을 특이적으로 표적 할 수 있는지를 확인하기 위해, 본 실시예에서는 세포 배양 플레이트에서 형성된 혈전의 형광 이미징을 수행하였다. 형광 이미징 시스템 (FOBI, Neoscience, Korea)을 사용하여 혈전의 형광 영상을 만들었다. 혈전은 트롬빈/CaCl2의 존재하에 혈소판이 풍부한 혈장에 피브리노겐을 첨가하여 형성하였다. 혈전의 형광 이미지는 복수의 식염수 세척 후에 얻었다. 피브린 특이적 GPRPP를 갖지 않는 APP로 처리한 혈전에서는 무시할 수 있는 형광을 관찰하였다. 대조적으로, T-APP로 처리 한 혈전은 현저하게 높은 형광 신호를 나타냈다 (도 4(e) 및 (f)). T-APP의 피브린 특이적 표적화를 추가로 확인하기 위해, 본 실험에서는 유리 GPRPP로 경쟁 분석을 수행하였다. 유리 GPRPP로 혈전을 전처리하면 T-APP의 표적화를 억제하였으며 형광 신호가 현저하게 감소하였다. 이러한 결과는 T-APP가 피브린이 풍부한 혈전을 특이적으로 표적한다는 것을 명확히 보여주었다.
실시예 12. T-APP에 대한 동물 실험 - 마우스 모델의 꼬리 출혈 분석
마우스(6 주령)에 케타민과 자일라진(8 : 1 비율)의 혼합 용액을 복강 내 주사하여 마취시켰다. 꼬리를 메스로 절단 한 다음 37℃의 예열 식염수에 침지시켰다. 이전에 보고된 바와 같이 출혈 시간과 출혈량을 결정하기 위해 꼬리 출혈을 20분간 모니터링하였다. 출혈 시간은 절개된 꼬리가 단단한 응고를 형성하는데 필요한 시간으로 정의되었다. 출혈량은 마이크로 플레이트 판독기 (Biotek, Winooski, VT)를 사용하여 헤모글로빈의 농도를 측정하여 결정하여 그 결과를 나타내었다(도 5(a)).
마우스에 T-APP를 정맥 내 주사한 지 2시간 후, 꼬리를 절단하여 출혈을 유도하였고 출혈 시간을 측정하였다(도 5(b)). 대조군(치료하지 않은 마우스)에서 최대 3.5분 출혈 후, 주로 혈소판의 지혈 기능으로 인해 완전한 혈액 응고가 발생하였다. ESA는 강력한 항혈소판 작용으로 인해 과다 출혈을 동반한 출혈 시간을 용량 의존적으로 연장시켰다. T-APP로 치료한 마우스에서도 출혈 시간과 출혈량이 용량 의존적으로 증가하였다(도 5(b) 및 (c)). 5 mg/kg의 용량에서, T-APP는 대조군에 비해 5배 더 큰 출혈 시간 및 10배 이상의 출혈을 유발했다. 흥미롭게도, T-APP는 동등한 ESA보다 유의하게 높은 출혈 시간 및 출혈량을 보였다. 이러한 관찰은 혈전에 대한 T-APP의 표적화 능력으로 설명할 수 있다. 도 5(c)에 나타난 바와 같이, 강한 형광 신호를 T-APP로 처리한 마우스의 절단한 꼬리에서 관찰하였다. T-APP 처리 마우스는 APP 처리 마우스보다 절개된 꼬리에서 약 6배 높은 형광 강도를 보였다 (도 5(d) 및 도 12). 이러한 결과는 T-APP가 절개된 꼬리 내 혈전을 표적으로 강한 항혈소판 활성을 발휘하여 혈액 응고를 억제한다는 것을 명확하게 나타낸다.
실시예 13. T-APP에 대한 동물 실험 - FeCl 3 유발성 동맥 혈전증 마우스 모델
본 발명에서는 또한 경동맥 혈전증 마우스 모델을 사용하여 혈전 표적화 분자 이미지화 제제 및 항혈전제제로서의 T-APP의 가능성을 확인하였다.
케타민 및 자일라진의 혼합 용액으로 마취시킨 후, 마우스를 편평한 위치에 두었다. 경동맥을 노출시키기 위해 흉골과 턱 사이에서 중앙선 절개가 이루어졌다. 왼쪽 대퇴 동맥을 10 % FeCl3로 포화시킨 여과지로 3 분간 처리하여 혈관 손상을 유도하였다. 즉시 마우스에게 T-APP를 꼬리 정맥을 통해 정맥 내로 주사하였다. 경동맥의 형광 이미지는 FOBI 이미징 시스템 (Neoscience, Korea)을 사용하여 얻었다. 모든 동물 실험은 전북대학교 동물 보호 및 이용위원회 (CBU2017-0118)의 승인을 받았다.
경동맥 중 하나를 FeCl3에 3분간 노출시켜 혈전 형성을 유도 한 다음 T-APP를 5 mg/kg 용량으로 정맥 내 투여한 결과를 나타내었다(도 6(a)). 강한 형광 신호를 T-APP 주사 15분 후 FeCl3 처리 동맥에서 관찰하였으나 순환하는 T-APP로 인해 비 손상 동맥에서도 배경 수준의 형광을 관찰하였다(도 6(b) 및 (c)). 최대 형광 신호를 T-APP 주입 후 30분에서 60분까지 관찰하였고 그 후 신호가 감쇄하였다(도 6(d) 및 (e)). 유리 GPRPP의 예비 주입은 FeCl3 처리 동맥에 대한 T-APP의 표적화를 유의미하게 억제하였으며, 이는 유의미하게 감소한 형광 신호로 확인되었다. 이러한 결과는 T-APP가 30분 이내에 피브린이 풍부한 혈전이 있는 혈관을 특이적으로 신속하게 표적화한다는 것을 명백히 증명하였다.
실시예 14. T-APP에 대한 동물 실험 - 조직 검사
마우스에서 절삭한 경동맥을 4% 파라 포름알데하이드에 고정시키고 최적 절삭 온도 화합물(optimal cutting temperature compound) 블록에 삽입시켰다. 블록을 절단하고 헤마톡실린과 에오신(H&E)으로 염색하였다. 또한 DHE (dihydroethidium) 염색을 위해 조직을 어두운 곳에서 30분 동안 5 μM DHE로 염색한 다음 4,6-디아미디노-2-페닐인돌 (4,6-diamidino-2-phenylindole)로 처리하였다. 조직의 이미지는 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 얻었다.
그 결과 FeCl3 치료 동맥은 많은 혈소판이 혈전 혈관에 모이고 활성화되어 거대한 ROS를 생성하기 때문에 혈전과 내피에서 강한 DHE 형광을 나타내었다. FeCl3 치료는 도 7(c)와 같이 혈전 형성을 크게 일으켰다. T-APP는 5 mg/kg의 투여량에서 응고 형성을 효과적으로 방지하였지만, 동등한 ESA(2.25 mg/kg)는 보통의 효과를 나타냈다. ESA가 혈전 형성에 대해 적당한 억제 효과를 보인 반면, T-APP는 ESA의 항혈소판 기능 및 H2O2 소거 기능의 결합 효과로 인해 ROS 생성과 혈전 형성을 유의미하게 억제하였다는 것을 알 수 있었다.
실시예 15. T-APP에 대한 동물 실험 - TNF-α 및 sCD40L 발현 억제
T-APP 주입 후 2 시간 후에 마우스에서 채혈하고 항응고제 (3.8 % sodium citrate)와 혼합하였다. 혈장을 4 ℃에서 10 분 동안 x 3000g에서 혈액을 원심분리하여 얻었다. 마우스 sCD40L ELISA 키트 (ab119517, Abcam) 및 마우스 TNF-α ELISA 키트 (eBioscience, San Diego, CA, USA)를 사용하여 사이토카인의 수준을 측정하였다.
혈전 생성 혈관에 대한 T-APP의 치료 효과를 T-APP 2.5 mg/kg 또는 5.0 mg/kg 주입 24 시간 후에 TNF-α 및 sCD40L 수준을 측정하여 평가하였다. 혈액 내 전염증 TNF-α의 수준은 FeCl3 치료에 의해 유의미하게 증가하였다 (도 7(a)). ESA와 APP는 TNF-α의 발현에 대해 유의미한 억제 효과를 나타냈지만 T-APP는 TNF-α의 발현을 급격히 억제하였다. FeCl3 치료는 또한 sCD40L의 혈장 수준을 유의미하게 상승시켰다(도 7(b)). ESA는 본질적인 항혈소판 효과로 인해 sCD40L의 혈장 수준을 감소시켰다. 그러나, T-APP는 동등한 ESA보다 sCD40L의 발현에 유의미하게 강한 억제 효과를 나타내었다.
실시예 16. T-APP에 대한 동물 실험 - 생체 적합성 평가
마우스를 7일 동안 매일 5 mg/kg의 용량의 T-APP를 정맥 내 투여 처리하여 잠재적 독성을 조사하였다. 장기와 혈액을 채취하여 조직 검사와 혈청 ALT (Alanine transaminase)를 분석하였다. 혈청 ALT의 수준은 마이크로플레이트 판독기(Synergy MX, BioTek Instruments, Inc.)를 사용하여 ALT 효소 분석 키트(Asan Pharma, Korea)로 결정하였다. 장기를 파라핀 블록에 끼우고 블록을 H&E 염색을 위해 절단하였다. 조직의 이미지는 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 얻었다.
그 결과 T-APP는 간 기능에 해로운 영향을 끼치지 않았으며, 혈청 ALT(Alanine transaminase) 내 아무런 변화가 없는 것으로 확인되었다(도 13(a)). 또한 T-APP의 투여로 여러 기관 내 축적된 독성에 대한 조직학적 증거가 관찰되지 않았는데(도 13(b)), 이는 T-APP가 생체 적합성이 우수함을 입증한다.
실시예 17. T-APP의 광음향 강도 분석 실험
직접만든 아가로스 겔(3 중량%) 팬텀(phantom)을 이용하여 신체 조건을 모방하였다. T-APP를 H2O2 존재 또는 부재하에 1mg/mL의 농도로 PBS 내에 현탁시켰고 200㎕의 T-APP 현탁액을 팬텀 겔에 첨가하였다. 초음파 후방 산란 모드(Ultrasound backscatter mode, B-mode) 이미지를 14MHz용 L14-5/38 변환기(128 elements, 7.5 MHz: Center frequency)가 있는 Sonix TOUCH (Ultrasonix, 캐나다)로 수집하였다. IR780이 탑재된 T-APP 입자(1 mg/mL) 의 광음향 영상은 여기 파장(808 nm)에서 LR550 변환기(32-55 MHz)가 있는 Vevo LAZR 광음향 이미징 시스템(Visualsonics, 캐나다)을 이용하고 그 결과를 각각 도 14 및 도 15에 나타내었다.
실시예 18. 통계 분석
통계 분석은 일원 분산 분석(the one-way analysis of variance) (ANOVA)을 사용하여 수행하였다. P <0.001의 값은 통계적으로 유의하다고 간주하였다. 모든 데이터는 평균 ± 표준 편차(Standard deviation, SD)로 표시하였다.
본 발명에서는 T-APP를 혈전 특이적 분자 이미지화 제제 및 H2O2-활성화 항혈전제제로서 개발했다. T-APP는 피브린이 풍부한 혈전을 특이적이고 신속하게 표적화할 수 있고 sCD40L 및 TNF-α의 발현을 억제함으로써 현저하게 혈전 형성을 억제할 수 있었다. T-APP의 잠재력 높은 항혈전 활성은 표적 특이성, 요구되는 치료 작용 및 H2O2 소거 기능과 ESA의 본질적인 항혈소판 활성의 결합 효과에 기인한 것일 수 있다. 그러므로, T-APP는 혈전증 및 죽상 동맥 경화증과 같은 다양한 H2O2 관련된 생명을 위협하는 심혈관 질환의 치료제로서 잠재력을 보유하고 있다.
이상과 같이 실시예를 통하여 본 발명을 설명하였다. 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 상술한 실험예들은 모든 면에 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해되어야 한다. 본 발명의 범위는 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> INDUSTRIAL COOPERATION FOUNDATION CHONBUK NATIONAL UNIVERSITY <120> NANOPARTICLES COMPRISING RANDOM COPOLYMER CONTAINING ASPIRIN AND USE THEREOF <130> CHONBUK1-202P <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fibrin targeting protein <400> 1 Gly Pro Arg Pro Pro 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fibrin targeting protein <400> 2 Cys Arg Glu Lys Ala 1 5 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fibrin targeting protein <400> 3 Gly Pro Arg Pro Pro Cys 1 5

Claims (18)

  1. 하기 구조식 1로 표현되는 랜덤 공중합체:
    [구조식 1]
    -Am-Bn-
    상기 식에서, A는 하기 화학식 1의 구조를 가지며, B는 하기 화학식 2의 구조를 가지며,
    상기 공중합체에서 A와 B의 몰 분획은 0.2:0.8 내지 0.8:0.2이고,
    상기 m 및 n 은 1 내지 500의 값을 가지며,
    상기 Am 및 Bn 은 교차하여 반복되는 것인 랜덤 공중합체:
    [화학식 1]
    Figure 112019011689672-pat00005

    [화학식 2]
    Figure 112019011689672-pat00006
    .
  2. 하기 구조식 1로 표현되는 랜덤 공중합체; 및 피브린에 특이적으로 결합하는 펩티드가 결합된 지질펩티드;를 포함하는 것인 나노입자:
    [구조식 1]
    -Am-Bn-
    상기 식에서, A는 하기 화학식 1의 구조를 가지며, B는 하기 화학식 2의 구조를 가지며,
    상기 공중합체에서 A와 B의 몰 분획은 0.2:0.8 내지 0.8:0.2이고,
    상기 m 및 n 은 1 내지 500의 값을 가지며,
    상기 Am 및 Bn 은 교차하여 반복되는 것인 나노입자:
    [화학식 1]
    Figure 112019011689672-pat00007

    [화학식 2]
    Figure 112019011689672-pat00008
    .
  3. 제2항에 있어서, 상기 지질펩티드는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DSPE), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, DOPE), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine, DOPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스페이트(1수화물염)(1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphate(Monosodium Salt), DOPA ), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-[포스포-rac-(1-글리세롤)](나트륨 염)(1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-rac-(1-glycerol)](Sodium Salt), DOPG) 및 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(염소염)(1,2-Dioleoyl-3-Trimethylammonium-Propane(Chloride Salt), DOTAP)으로 구성된 군으로부터 선택된 인지질, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol) 및 GPRPP 펩티드로 구성되는 지질펩티드(lipopeptide);를 포함하는 것으로, 상기 GPRPP 펩티드는 서열번호 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  4. 제2항에 있어서, 상기 나노입자는 형광염료를 더 포함하는 것인 나노입자.
  5. 제4항에 있어서, 상기 형광염료는 인도시아닌 그린(Indocyanine green), 시아닌5 카복실산(Cyanine5 carboxylic acid), 시아닌7 카복실산(Cyanine7 carboxylic acid), IR780, IR820 및 IR1061으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인 나노입자.
  6. 제2항에 있어서, 상기 나노입자는 과산화수소 하에서 에틸 살리실산(Ethyl salicylate)를 생성하는 것인 나노 입자.
  7. 제2항에 있어서, 상기 나노입자는 항산화 효과를 나타내는 것인 나노입자.
  8. 제2항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 나노입자를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 염증성 질환은 아토피 피부염, 부종, 피부염, 알레르기, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스 열루푸스, 섬유근통(fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome) 및 다발성 경화증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 제2항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 나노입자를 유효성분으로 포함하는 혈전 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 혈전 질환은 혈전증, 동맥경화증, 고혈압, 협심증, 심근경색, 허혈성 심장질환, 심부전, 뇌경색, 뇌출혈 및 뇌졸중으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인 혈전 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  12. 제4항 또는 제5항의 나노입자를 유효성분으로 포함하는 초음파용 조영제.
  13. 제4항 또는 제5항의 나노입자를 유효성분으로 포함하는 광음향용 조영제.
  14. 제2항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 나노입자를 유효성분으로 포함하는 혈전 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  15. (1) 메틸-메타크릴레이트(Methyl-Methacrylate, MMA) 및 2-하이드록시에틸 메타크릴레이트(2-Hydroxyethyl Methacrylate, HEMA)를 몰 분획 0.2:0.8 내지 0.8:0.2로 중합하여 랜덤 공중합체인 폴리(HEMA-co-MMA)를 수득하는 단계;
    (2) 에틸 살리실산과 옥살릴 클로라이드를 반응시켜 에틸 2-(2-클로로-2-옥소아세톡시) 벤조에이트를 수득하는 단계; 및
    (3) (1) 단계의 폴리(HEMA-co-MMA) 및 (2) 단계의 에틸 2-(2-클로로-2-옥소아세톡시) 벤조에이트를 반응시켜 아스피린을 포함하는 랜덤 공중합체를 수득하는 단계;
    를 포함하는 랜덤 공중합체의 제조 방법.
  16. (1) 제15항의 제조방법으로 제조된 랜덤 공중합체 및 피브린에 특이적으로 결합하는 펩티드가 결합된 지질펩티드를 포함하는 폴리비닐 알콜 용액을 혼합하고 유화시키는 단계;
    (2) (1) 단계의 생성물을 폴리비닐 알콜 용액에 첨가하고 균질화하는 단계;
    를 포함하는 나노입자의 제조 방법으로서.
    상기 지질펩티드는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DSPE), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, DOPE), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine, DOPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스페이트(1수화물염)(1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphate(Monosodium Salt), DOPA ), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-[포스포-rac-(1-글리세롤)](나트륨 염)(1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-rac-(1-glycerol)](Sodium Salt), DOPG) 및 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(염소염)(1,2-Dioleoyl-3-Trimethylammonium-Propane(Chloride Salt), DOTAP)으로 구성된 군으로부터 선택된 인지질, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol) 및 GPRPP 펩티드로 구성되는 지질펩티드(lipopeptide);를 포함하는 것으로, 상기 GPRPP 펩티드는 서열번호 1로 표시되는 것인 나노입자의 제조 방법.
  17. 제16항에 있어서, (1) 단계의 폴리비닐 알콜은 형광염료를 더 포함하는 것인 나노입자의 제조 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 형광염료는 인도시아닌 그린(Indocyanine green), 시아닌5 카복실산(Cyanine5 carboxylic acid), 시아닌7 카복실산(Cyanine7 carboxylic acid), IR780, IR820 및 IR1061으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인 나노입자의 제조 방법.
















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