KR102073353B1 - Method for accelerating fish skin wound healing using light emitting diode(LED) - Google Patents
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Abstract
본 발명은 LED 조사를 이용한 어류의 피부 상처 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 어류의 피부 상처 치료 방법은 LED 광원을 어류를 포함하는 수중 환경에 조사하여 수행됨으로써, 친환경적이고 경제적이며, 어류의 생산성 증대는 물론 포르말린 또는 항생제 사용으로 인한 비용을 절감시킬 수 있는 효과가 있다. The present invention relates to a method for treating skin wounds of fish using LED irradiation. The skin wound treatment method of the fish according to the present invention is carried out by irradiating an LED light source to the aquatic environment including the fish, which is environmentally friendly and economical, and can increase the productivity of the fish as well as reduce the cost of using formalin or antibiotics There is.
Description
본 발명은 LED를 이용한 어류의 피부 상처 치료 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for treating skin wounds of fish using LEDs.
오늘날 양식 산업은 가장 급속히 성장하는 수산업의 한 분야로서 급증하는 수산물의 수요에 따라 세계적으로 경제적 중요성이 인정되고 있다. 우리나라는 삼면이 바다로서 연안의 거의 모든 면적이 양식업으로 이용되고 있는 실정이다. 일반적으로 양식어류는 밀도가 높게 사육되고 있어, 물리적 상처가 쉽게 나는 편이며, 그 부위를 통해 세균이나 기생충 등의 병원체 침입으로 인하여 질병이 발생할 가능성이 높다. 따라서, 물리적 상처를 빠른 시간 내에 회복시키는 것은 질병의 피해를 줄일 수 있는 측면에서 매우 중요하다.Today, the aquaculture industry is one of the fastest growing fisheries industries, and its economic importance is recognized worldwide due to the growing demand for aquatic products. In Korea, the three sides are the sea and almost all of the coastal area is used for aquaculture. In general, farmed fish are densely reared, and physical wounds tend to be easy, and disease is more likely to occur due to pathogens such as bacteria or parasites. Therefore, the recovery of physical wounds in a short time is very important in terms of reducing the damage of the disease.
이러한 질병 치료, 감염 예방 및 상처를 치료하기 위해, 현재 여러 종류의 항생제들이 국내에서는 단독 또는 사료에 첨가되어 사용되고 있으나, 식품 안전 측면과 과다한 항생 물질의 사용에 의한 내성 미생물의 증가를 초래할 수 있다는 측면에서 문제가 있다. 결국 출현한 내성균은 해당 유전인자를 인체 병원체에 전파할 수 있어 최근 들어 보다 심각한 문제로 인식하고 있다.In order to treat such diseases, prevent infections, and treat wounds, various kinds of antibiotics are currently used alone or in addition to feeds in Korea, but they may cause an increase in resistant microorganisms due to food safety and the use of excessive antibiotics. There is a problem. Eventually, resistant bacteria have been recognized as a more serious problem in recent years because they can transmit the genetic factors to human pathogens.
한편, LED는 발광다이오드(Light Emittign Diode)의 약자로 LED 광원은 기존의 형광등 및 백열등에 비해 적은 전력을 소모하면서도 더 많은 빛을 낼 수 있다는 장점이 있어 산업적으로 널리 이용되고 있다. 또한, 이러한 장점은 광역학 치료법(photodynamic therapy, PDT)에 있어서도 획기적인 발전을 할수 있게 되는 밑거름이 되었다. PDT라 함은 광감각 물질을 이용하여 수술없이 암 등의 난치병을 치료하는 기술을 일컫는다. 특히 암 치료에 사용되는 PDT는 특정 암세포에서만 생성하거나 흡수할 수 있는 광감각 물질을 넣어준 후, 빛을 조사하여 그로 인한 산소분자(O2)를 활성산소로 변화시키거나, 새로운 라디칼 또는 화학종을 만들어 암세포만을 선택적으로 죽인다. 이러한 PDT 방법은 암세포뿐 만 아니라 광감각물질을 생성하는 병원체에서도 이용이 가능하다. 그러나, 현재의 PDT 치료는 인간을 그 대상으로 하고 있고, 아직까지 수산생물에 대해서는 적용한 예가 전무할 뿐만 아니라, 종의 특이성 때문에 기존의 사람에게 적용되는 방법을 그대로 사용하는 것은 어려운 실정이다.On the other hand, LED is an abbreviation of light emitting diode (Light Emittign Diode), LED light source is widely used in the industry because it has the advantage that it can emit more light with less power than conventional fluorescent and incandescent. In addition, this advantage is the basis for a breakthrough in photodynamic therapy (PDT). PDT refers to a technique for treating intractable diseases such as cancer without surgery using photosensitive materials. In particular, PDT used in the treatment of cancer is injected with a photosensitive material that can be produced or absorbed only in specific cancer cells, and then irradiates with light to change the resulting oxygen molecules (O 2 ) into free radicals, or new radicals or chemical species. To kill only cancer cells selectively. This PDT method can be used not only for cancer cells but also for pathogens that produce photosensitive materials. However, the current treatment of PDT targets humans, and there have been no examples of aquatic organisms yet, and due to the specificity of species, it is difficult to use the same method applied to existing humans.
따라서, 항생제를 대체할 수 있고, 양식 환경에 해를 끼치지 않는 빛을 이용한 친환경적 상처 회복 치료 방법의 개발이 절실하다. Therefore, there is an urgent need to develop an eco-friendly wound recovery method using light that can replace antibiotics and does not harm the aquaculture environment.
본 발명자들은 어류의 피부 상처의 치료 방법에 대해 탐색하던 중, 유효 파장의 LED 광원을 어류를 포함하는 수중 환경에 조사할 경우, 어류에게 포르말린 또는 항생제를 사용하지 않고 유해한 영향을 미치지 않으면서 친환경적으로 피부 상처를 치료할 수 있는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다. The inventors of the present invention, while searching for a method of treating skin wounds of fish, when irradiating an LED light source having an effective wavelength to the aquatic environment containing the fish, do not use formalin or antibiotics on the fish and do not have a harmful effect on the environment. By confirming that the skin wound can be treated, the present invention has been completed.
따라서, 본 발명은 LED 광원을 어류를 포함하는 수중 환경에 조사하는 단계를 포함하는, 어류의 피부 상처 치료 방법을 제공하는 데 있다. Accordingly, the present invention is to provide a method for treating skin wounds of fish, comprising the step of irradiating an LED light source to an aquatic environment including the fish.
또한, 본 발명은 LED 광원을 어류를 포함하는 수중환경에 조사하는 시스템을 포함하는, 어류의 상처 치료 장치를 제공하는 데 있다.The present invention also provides an apparatus for treating a wound of fish, comprising a system for irradiating an LED light source to an underwater environment including fish.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 피부 상처가 있는 어류를 포함하는 수중환경에, 광감각 물질(photosensitizer) 처리 없이, 500 내지 650 nm 범위의 파장을 갖는 LED 광원을 6~12:18~12시간 (L:D) 조건의 광주기로 조사하는 단계를 포함하는, 어류의 피부 상처 치료 방법을 제공한다. According to an aspect of the present invention, the present invention provides an LED light source having a wavelength in the range of 500 to 650 nm in an aquatic environment including a fish with a skin wound, without treatment with a photosensitizer, 6-12: 18-. Provided is a method for treating skin wounds of fish, comprising the step of irradiating with a photoperiod in a 12 hour (L: D) condition.
어류의 양식산업에서는 여러 가지 사육시스템의 개발을 통해 생산성을 높이고, 질병을 예방 또는 치료하고자 하나, 양식어가에서는 최소의 투자비용으로 최대의 생산성을 낼 수 있는 방안이 요구되고 있다.In the fish farming industry, various breeding systems have been developed to increase productivity and prevent or cure diseases. However, fish farming is required to produce maximum productivity with minimum investment cost.
본 발명에 따른 어류의 상처 치료 방법은 특정 파장의 LED 광원을 어류를 포함하는 수중 환경에 조사함으로써, 어류에는 어떠한 생리학적 및 물리적 손상을 입히지 않고 피부 상처를 치료할 수 있는 것을 특징으로 한다. The wound healing method of fish according to the present invention is characterized by being able to treat a skin wound without causing any physiological and physical damage to the fish by irradiating an underwater environment including the fish with an LED light source of a specific wavelength.
상기 엘이디(LED)는 일반 조명뿐만 아니라 살균, 노광 및 감식을 위한 광원으로써, 식물재배나 해충의 퇴치를 위한 조명, 바다에서 어류를 유인하기 위한 광원, 의료용 및 피부미용을 위한 광원, 심리 치료를 위한 특수한 목적으로 주로 사용되고 있다. 이러한 LED는 여러가지 색광(Red, Blue, Green, White, Yellow)을 조사하는데, 상기와 같은 색광을 통해 어류의 스트레스에 대한 내성 강화가 가능함과 동시에 어류의 성장을 촉진시키고 어류 질병을 예방 또는 치유시킬 수 있다The LED is a light source for sterilization, exposure and identification as well as general lighting, lighting for plant cultivation or pest control, light source for attracting fish from the sea, light source for medical and skin care, psychotherapy It is mainly used for special purpose. These LEDs irradiate a variety of color light (Red, Blue, Green, White, Yellow), which can enhance the fish's resistance to stress while promoting fish growth and preventing or curing fish diseases. Can
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 LED 광원은 하나 이상일 수 있으며, 500 내지 650 nm 범위의 파장이며, 보다 바람직하게는 500 내지 550 nm 또는 630 내지 650 nm이고, 가장 바람직하게는 520 nm이다.According to a preferred embodiment of the invention, the LED light source may be one or more, it is a wavelength in the range of 500 to 650 nm, more preferably 500 to 550 nm or 630 to 650 nm, most preferably 520 nm.
또한, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 LED 광원은 10 내지 1500 μㆍmolㆍm-2ㆍs-1 범위의 광량으로 유지된다. 구체적으로는, 520nm 파장에 대해서는 10 내지 50 μㆍmolㆍm-2ㆍs-1 범위의 광량으로 유지되는 것이 바람직하다. In addition, according to a preferred embodiment of the present invention, the LED light source is maintained at an amount of light in the range of 10 to 1500 μ · mol · m −2 · s −1 . Specifically, for the 520 nm wavelength, it is preferable to maintain the amount of light in the range of 10 to 50 µ · mol · m −2 · s −1 .
상기 LED 광원의 파장 및 광량의 범위는 이에 제한하는 것은 아니나, 면역반응의 활성화 및 상피세포의 증식을 유도하여 피부의 재생을 촉진함으로써 어류의 피부에 발생한 상처를 치료하면서, 어류에는 추가적으로 어떠한 물리적인 피해를 입히지 않고, 또한 스트레스 관련 인자의 발현을 유발하지 않는 LED 광원의 파장 및 광량의 범위에 해당한다. The wavelength and the amount of light of the LED light source are not limited thereto, but the treatment of wounds on the skin of fish by inducing activation of immune response and proliferation of epithelial cells to promote regeneration of the skin, and in addition to any physical It corresponds to a range of wavelengths and amounts of light of an LED light source that do not cause damage and do not cause the expression of stress related factors.
상기 LED 광원의 광 주기는 6~12:18~12시간 (L:D)의 조건인 것이 바람직하다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 광 주기 12:12시간 (L:D)의 광을 24일간 조사한 경우, 높은 생존율을 나타내었다.It is preferable that the light period of the said LED light source is the conditions of 6-12: 18-12 hours (L: D). According to one embodiment of the present invention, when irradiated with light of 12:12 hours (L: D) for 24 days, it showed a high survival rate.
상기 어류는 치료 대상이 될 수 있는 모든 종류를 포함하며, 양식어 또는 관상어 등일 수 있다. 구체적으로는 넙치, 복어, 잉어, 민어, 뱀장어, 송어, 고등어, 삼치, 임연수, 가자미, 열갱이, 강도다리, 조피볼락, 우럭, 도루묵, 명태, 대구, 꽁치, 청어, 장어, 정어리, 연어, 참치, 가다랭이, 멸치, 갈치, 홍게, 조기 등일 수 있으며, 넙치인 것이 바람직하다. The fish includes all kinds that can be treated, and may be farmed or ornamental fish. Specifically, flounder, puffer fish, carp, freshfish, eel, trout, mackerel, mackerel, limyeonsu, flounder, grains, robber, seaweed, cod, saury, herring, eel, sardine, salmon, tuna , Bonito, anchovy, cutlass, red crab, premature, and the like, and is preferably a flounder.
본 발명에서 상처는 절상, 박리, 찰과상, 열상(박리), 자상, 결출상 및 관통상으로 이루어진 군으로부터 선택된다.In the present invention, the wound is selected from the group consisting of cuts, peels, abrasions, tears (peeleds), cuts, grains, and penetratings.
본 발명에서 '상처(wound)' 또는 '창상'은 생체가 손상된 상태를 의미하며, 생체 내부 또는 외부 표면을 이루는 조직, 예를 들면 피부, 근육, 신경조직, 뼈, 연조직, 내부기관 또는 혈관조직이 분단 또는 파괴된 병리학적 상태를 포괄한다. In the present invention, 'wound' or 'wound' refers to a state in which the living body is damaged, and tissues forming an internal or external surface of the living body, for example, skin, muscle, nerve tissue, bone, soft tissue, internal organ or vascular tissue. It encompasses this segmented or destroyed pathological state.
물리적 상처의 예로는, 이들로 한정하는 것은 아니지만, 비-치유 외상성 창상, 방사선조사에 의한 조직의 파괴, 찰과상 (abrasion), 골괴저, 열상 (박리), 자상, 결출상 (avulsion), 관통상 (penetrated wound), 총상(gunshot wound), 절상, 화상, 동상, 타박상 (contusion or bruise), 피부궤양, 피부건조, 피부각화증, 갈라짐, 터짐, 피부염, 피부사상균증에 의한 통증, 수술상, 혈관질환 창상, 각막창상 등의 창상, 욕창, 와창, 당뇨성피부 미란과 같은 당뇨병 및 순환불량에 관련된 상태, 만성궤양, 성형수술 후 봉합부위, 척추상해성 창상, 부인과적 창상, 화학적 창상 및 여드름 등을 포함하며 개체의 어떠한 부분에 대한 손상이 포함될 수 있다.Examples of physical wounds include, but are not limited to, non-healing traumatic wounds, destruction of tissues by irradiation, abrasions, bone fractures, lacerations (peelings), cuts, avulsions, penetrating wounds ( penetrated wounds, gunshot wounds, cuts, burns, frostbite, contusion or bruise, skin ulcers, dry skin, keratosis, cracking, bursting, dermatitis, pain caused by dermatophytosis, surgical wounds, vascular disease wounds Injuries related to diabetes and poor circulation, such as corneal wounds, pressure sores, ulcers, diabetic skin erosions, chronic ulcers, sutures after plastic surgery, spinal injury wounds, gynecological wounds, chemical wounds and acne And damage to any part of the entity.
상기 수중 환경은 어항, 수족관, 양식장, 연못, 사육장 또는 해양 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. The underwater environment may be a fish tank, an aquarium, a farm, a pond, a kennel or an ocean, but is not limited thereto.
또한, 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 LED 광원을 어류를 포함하는 수중환경에 조사하는 시스템을 포함하는, 어류의 스쿠티카증의 예방 또는 치료 장치를 제공한다.In addition, according to another aspect of the present invention, the present invention provides an apparatus for preventing or treating skutikaosis of fish, including a system for irradiating an LED light source to an underwater environment including fish.
상처 치료에 대해서는 종래 포르말린 또는 항생제를 사료와 함께 투입하여 어류에 경구투여 방법으로 치료하여 왔으나, 이는 세균성 질병이 발병하면 병원균이 장관내에 정착하여 증식하고 반복적으로 발생해 치료가 잘 되지 않으며, 항생제의 사용은 내성이 생긴 병원체를 양산할 가능성이 높다. 이에 반해. 본 발명의 LED를 이용한 피부 상처 치료방법을 이용할 경우, 어떠한 부작용이 없이도 어류의 창상을 치료할 수 있는 장점이 있다.Conventionally, wound treatment has been treated with oral administration to fish by adding formalin or antibiotics with feed, but when a bacterial disease develops, pathogens settle in the intestinal tract and proliferate and occur repeatedly. Use is likely to produce resistant pathogens. On the contrary. When using the skin wound treatment method using the LED of the present invention, there is an advantage that can treat the wound of fish without any side effects.
본 발명에 따른 어류의 상처 치료 방법은 LED 광원을 어류를 포함하는 수중 환경에 조사하여 수행됨으로써, 친환경적이고 경제적이며, 어류의 생산성 증대는 물론 포르말린 또는 항생제 사용으로 인한 비용을 절감시킬 수 있는 효과가 있다. The wound healing method of the fish according to the present invention is carried out by irradiating an LED light source to the aquatic environment including the fish, which is environmentally friendly and economical, it is possible to increase the productivity of the fish as well as to reduce the cost of using formalin or antibiotics have.
도 1은 다양한 LED 광원의 파장(465, 520 및 640nm) 영역을 나타내는 도이다.
도 2는 다양한 LED 파장(465, 520 및 640nm) 및 다양한 광량(0, 10, 20, 40, 80 and 160 μ·mol·m-2·s-1)의 조사시간에 따른 상대적인 EPC 증식률을 나타내는 도이다. * 유의차(P - 0.05), ** 유의차(P - 0.01), *** 유의차 (P - 0.001)
도 3은 대상 어종인 넙치 피부에 인위적으로 유발한 절상을 보여준다.
도 4는 인위적 절상 대조구 및 LED 조사구의 누적폐사율을 보여준다.
도 5는 인위적 절상 대조구 및 LED 조사구의 TNF-α, g-lysozyme 및 TGF-βR2의 mRNA 발현 정도를 보여준다.
도 6은 대상 어종인 넙치 피부에 인위적으로 유발한 박리를 보여준다.
도 7은 인위적 박리 대조구 및 LED 조사구의 상피 증생 효과를 보여준다.
도 8은 인위적 박리 대조구 및 LED 조사구에서의 IL-1, PoDaK, HSP70, IL-8, TNF-α 및 MMP-13 mRNA 발현 정도를 보여준다. (P < 0.05)
도 9는 인위적 박리 후 10, 20, 30 일에 다양한 조건의 LED 조사 후 임상 징후를 보여준다.
도 10은 인위적 박리 대조구 및 LED 조사구의 폐사율을 보여준다. (* P - 0.05, ** P - 0.01 )
도 11은 대상 어종인 넙치 피부에 인위적으로 유발한 표피 박리를 보여준다.
도 12는 인위적 표피 박리 대조구 및 LED 조사구의 누적폐사율을 보여준다.
도 13, 14, 15, 16 및 17은 표피 박리 후 1, 3, 7, 14 및 28일째에 상처에서 일어나는 조직병리학적 변화로서 재-상피화 및 결합조직(connective tissue)인 콜라겐 층(collagen layer)의 형성 정도를 보여준다. 각 도면은 각 날짜 조건하에서의 (a) 표피 박리 대조구, (b) 표피 박리 520nm 조사구 및 (c) 표피 박리 640nm 조사구에서의 H&E (왼쪽 패널) 및 Masson-trichrome (오른쪽 패널) 염색 이미지를 보여준다. 또한, 각 도면은 각 날짜 조건하에서의 (d) 표피 두께 및 (e) 콜라겐 층의 밀도를 측정한 결과를 보여준다(P < 0.05).
도 18은 인위적 표피 박리 대조구 및 LED 조사구의 3주와 4주째 상처 회복정도를 확인한 결과를 보여준다.
도 19는 인위적 표피 박리 대조구 및 LED 조사구에서의 MMP-13, TNF-α, g-lysozyme, IL-1 및 HSP 70 유전자 발현 수준을 보여준다.1 is a diagram illustrating wavelengths (465, 520, and 640 nm) regions of various LED light sources.
FIG. 2 shows the relative EPC propagation rates with different LED wavelengths (465, 520 and 640 nm) and irradiation time of various amounts of light (0, 10, 20, 40, 80 and 160 μ · mol · m −2 · s −1 ). It is also. * Significant difference ( P -0.05), ** Significant difference ( P -0.01), *** Significant difference ( P -0.001)
Figure 3 shows the artificially induced cuts in the skin of the flounder, a target fish species.
Figure 4 shows the cumulative mortality of the artificial raise control and LED irradiation.
Figure 5 shows the mRNA expression levels of TNF-α, g-lysozyme and TGF-βR2 in artificial raise control and LED irradiation.
Figure 6 shows the artificially induced peeling of the flounder skin of the fish species.
Figure 7 shows the epithelial proliferation effect of artificial exfoliation control and LED irradiation.
Figure 8 shows the expression levels of IL-1, PoDaK, HSP70, IL-8, TNF-α and MMP-13 mRNA in artificial exfoliation control and LED irradiation. ( P <0.05)
9 shows clinical signs after LED irradiation of various conditions at 10, 20, 30 days after artificial exfoliation.
10 shows mortality of the artificial exfoliation control and LED irradiation. (* P -0.05, ** P -0.01)
FIG. 11 shows an artificially induced epidermal detachment on the skin of the flounder, a fish species of interest.
12 shows the cumulative mortality of the artificial epidermal exfoliation control and LED irradiation.
13, 14, 15, 16 and 17 are collagen layers that are re-epithelial and connective tissue as histopathological changes occurring in wounds on
Figure 18 shows the results confirmed the wound recovery at 3 and 4 weeks of artificial epidermal peeling control and LED irradiation.
FIG. 19 shows MMP-13, TNF-α, g-lysozyme, IL-1 and HSP 70 gene expression levels in artificial epidermal detachment control and LED irradiation.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, preferred examples are provided to aid in understanding the present invention. However, the following examples are merely provided to more easily understand the present invention, and the contents of the present invention are not limited by the examples.
실시예 1. LED 파장에 따른 어류 상피 유래 세포주에서의 증식 효과 확인Example 1. Confirmation of proliferation effect in fish epithelial-derived cell line according to the LED wavelength
본 발명자들은 대상 어종의 물리적 상처치료를 위한 유효 파장의 LED를 선별하기 위해, 잉어의 상피세포유래 세포인 EPC (Epithelioma papulosum cyprinid)를 이용하여 청색 (465nm), 녹색 (520nm), 적색 (640nm) 파장의 LED를 다양한 광량 (0, 10, 20, 40, 80, 160 μ·mol·m-2·s-1)으로 5 일간 조사한 후 세포의 증식속도를 관찰하였다.In order to screen LEDs of effective wavelengths for the physical wound treatment of fish species of the subject, the inventors of the carp epithelioma papulosum cyprinid (EPC) epithelioma papulosum cyprinid (blue) (465nm), green (520nm), red (640nm) The wavelength of the LED was irradiated for 5 days at various light quantities (0, 10, 20, 40, 80, 160 μ · mol · m −2 · s −1 ), and then the growth rate of the cells was observed.
1-1. LED 광원의 준비1-1. Preparation of the LED Light Source
LED 광원으로 발광다이오드(light emitting diode, LED) 광원은 부경대학교 LED-해양융합기술 연구센터에서 제공받은 청색(465nm), 녹색(520nm) 및 적색(640nm) 파장의 다양한 LED 광원을 이용하여, 다양한 광량(0, 10, 20, 40, 80, 160 μ·mol·m-2·s-1)으로 5 일간 조사하였다. 광원은 각 120개의 개별 LED로 구성되어 있으며, 각 광원에 대한 스펙트럼은 도 1에 나타내었으며, Laboratory Radiometer(Biospherical Instruments Inc., USA)로 465, 520, 640nm 광원의 최대 광량을 측정한 결과 각각 516, 303, 586 μ·mol·m-2·s-1로 확인되었다.Light emitting diode (LED) light source is a LED light source using a variety of LED light source of blue (465nm), green (520nm) and red (640nm) wavelength provided from the LED-Marine Fusion Technology Research Center of Pukyong National University, It irradiated for 5 days with the light quantity (0, 10, 20, 40, 80, 160 micrometers mol-m - 2s- 1 ). The light source is composed of 120 individual LEDs, and the spectrum of each light source is shown in FIG. 1, and the maximum amount of light of 465, 520, and 640 nm light sources was measured using a Laboratory Radiometer (Biospherical Instruments Inc., USA). , 303, 586 μ · mol · m −2 · s −1 .
1-2. 어류 세포주의 준비1-2. Preparation of Fish Cell Lines
잉어 유래의 세포주인 EPC (Epithelioma papulosum cyprinid)를 10%의 FBS (Fetal Bovine Serum) 및 1%의 P/S (Penicillin, Streptomycin)가 첨가된 Leibovitz (L-15; Sigma, Korea) 배지에 배양하였다. 배양 후 EPC 세포주의 단일층이 형성된 것을 확인한 후, 세포 배양액을 버리고 Trypsin-EDTA를 3ml 첨가하여 28℃에서 5분간 배양하여 부착된 세포를 떼어내고, 12ml의 L-15 배지를 추가로 넣어주었다. 이어서, 3,000g에 5분간 원심분리 후, 상청액을 제거하고 다시 5ml의 L-15+10% FBS+1% P/S를 넣어 세포를 재부유시켜 이후의 실험에 사용하였다. Carp-derived cell line EPC ( Epithelioma papulosum cyprinid ) was cultured in Leibovitz (L-15; Sigma, Korea) medium containing 10% FBS (Fetal Bovine Serum) and 1% P / S (Penicillin, Streptomycin) . After culturing and confirming that a single layer of EPC cell line was formed, the cell culture was discarded, and 3 ml of Trypsin-EDTA was added thereto, followed by incubation at 28 ° C. for 5 minutes to detach the attached cells, and 12 ml of L-15 medium was further added. Subsequently, after centrifugation at 3,000 g for 5 minutes, the supernatant was removed and 5 ml of L-15 + 10% FBS + 1% P / S was resuspended to resuspend the cells and used in subsequent experiments.
1-3. 다양한 광조건의 LED에 따른 EPC 배양1-3. EPC culture according to LED under various light conditions
5 x 104 세포수의 EPC 1ml을 L-15+10%FBS+1% P/S에 부유시켜 24웰의 투명한 마이크로플레이트에 접종한 뒤, 세포를 부착시키기 위해 25℃에서 하루동안 배양하였다. 배양된 EPC는 LED 조명 3.5cm위에 놓여졌으며, 465, 520, 640nm의 파장이 0, 5, 10, 20, 40, 80 and 160 μ·mol·m-2·s-1의 광량으로 조절되게 하여 5일간 25℃에서 조사한 뒤, 증식된 세포의 양을 확인하기 위해 크리스탈 바이올렛 세포 증식 실험 (Crystal Violet Cell Proliferation Assay)을 실시하였다.1 ml of 5 × 10 4 cell numbers of EPC was suspended in L-15 + 10% FBS + 1% P / S and inoculated in a 24-well clear microplate, followed by incubation at 25 ° C. for one day to attach the cells. The cultured EPC was placed on a 3.5 cm LED light, and the wavelengths of 465, 520, and 640 nm were adjusted to 0, 5, 10, 20, 40, 80, and 160 μ · mol · m −2 · s −1 . After irradiating at 25 ° C. for 5 days, a crystal violet cell proliferation assay was performed to confirm the amount of proliferated cells.
1-4. 크리스탈 바이올렛 세포 증식 실험 (Crystal Violet Cell Proliferation Assay)1-4. Crystal Violet Cell Proliferation Assay
5 일간 배양한 각 구간별 EPC 세포 배양액을 모두 제거한 뒤, 70%의 Et-OH를 이용하여 10분간 고정시켰다. 0.5% 크리스탈 바이올렛을 이용하여 20분간 고정된 세포를 염색시킨 후 PBS (Phosphate Buffered Saline; pH = 7.2 - 7.4)를 이용하여 3번 세척하였다. 마지막으로 10%의 SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)를 이용하여 세포에 염색된 크리스탈 바이올렛을 용출하여 흡광도를 540nm에서 측정하였다. After removing all the EPC cell culture solution for each section incubated for 5 days, it was fixed for 10 minutes using 70% Et-OH. Stained cells were stained for 20 minutes with 0.5% crystal violet and washed three times with PBS (Phosphate Buffered Saline; pH = 7.2-7.4). Finally, the absorbance was measured at 540 nm by eluting crystal violet stained cells using 10% SDS (Sodium Dodecyl Sulfate).
1-5. 통계분석1-5. Statistical analysis
다양한 광조건의 LED에 따른 EPC 증식 정도는 Trimmed means ± standard deviation (S.D.)로 나타내었으며, Two-tailed Student′s t-test를 이용하여 유의 확률(P-value)이 0.05 미만일 때 유의적인 변화가 있다고 판단하였다.The degree of EPC propagation according to the LED under various light conditions was shown as Trimmed means ± standard deviation (SD), and there was a significant change when the P-value was less than 0.05 using the Two-tailed Student's t-test. Judging.
상기 다양한 광조건의 변화에 따른 EPC의 상대증식률을 확인한 결과는 도 2에 나타내었다.The results of confirming the relative growth rate of the EPC according to the change of the various light conditions are shown in FIG.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 465nm LED 조사의 경우 160 μ·mol·m-2·s-1에서 약간 증가한 것을 제외하고는 모든 구간에서 유의적은 변화가 확인되지 않았다. As a result, as shown in FIG. 2, no significant change was observed in all sections except for a slight increase at 160 μ · mol · m −2 · s −1 for 465 nm LED irradiation.
반면, 520nm의 경우 160 μ·mol·m-2·s-1 에서 160% 이상의 세포증식속도를 나타냈으며 640nm구간에서는 40-80 μ·mol·m-2·s-1 에서 160%이상의 세포증식속도를 나타냈다. On the other hand, the cell growth rate of 160 μ · mol · m −2 · s −1 was more than 160% at 520 nm and more than 160% at 40-80 μ · mol · m -2 · s -1 at 640 nm. Indicated the speed.
결론적으로 in vitro 상에서 상피세포의 증식을 유도하는 파장은 520nm와 640nm이며, 유효 파장대에서도 광량에 따라 그 증식속도가 달라질 수 있음을 확인하였다. In conclusion, the wavelengths of inducing epithelial cell proliferation in vitro were 520 nm and 640 nm, and the rate of proliferation could be changed depending on the amount of light even in the effective wavelength range.
실시예 2. Example 2. In vivo In vivo 상 물리적 상처 유발 어류에서의 유효 LED 파장에 따른 회복 효과Recovery Effect According to Effective LED Wavelength in Fish-induced Physical Wounds
본 발명자들은 상기 실시예 1에서 선별된 In vitro상에서 확인된 유효 파장의 조사가 실제 대상 어종(넙치)의 상처 치료를 가속화할 수 있는지 확인하기 위해, 대상 어종에 인위적으로 물리적 상처를 낸 후 유효파장(520, 640nm)에서의 상처의 회복 정도를 임상증상, 폐사율, 조직병리학적 분석방법 및 관련 상처치료 및 면역관련 유전자 발현 수준 정량으로 확인하였다. In order to confirm whether the irradiation of the effective wavelength identified on the in vitro screened in Example 1 can accelerate the wound treatment of the actual fish species (flounder), the present inventors artificially wound the target fish species and then make effective wavelengths. The extent of wound recovery at (520, 640 nm) was confirmed by clinical symptoms, mortality, histopathological analysis, quantification of related wound treatment and immune-related gene expression levels.
또한, 다양한 실험 조건으로 반복실험을 실시하여 해당 데이터의 재현성을 확인하였다.In addition, repeated experiments were carried out under various experimental conditions to confirm the reproducibility of the data.
모든 실험디자인은 부경대학교의 동물실험윤리위원회의 매뉴얼에 따라 실시되었으며, 넙치 (Paralichthys olivaceus)는 거제도소재의 양식장에서 구매하였다. 구매한 넙치는 부경대학교의 사육수조동에서 최소 2 주간 순치되었다. All experimental designs were carried out according to the manual of the Animal Experimental Ethics Committee of Pukyong National University, and halibut ( Paralichthys olivaceus ) was purchased from aquaculture farm. The flounder purchased was kept for at least 2 weeks in the breeding tank of Pukyong National University.
본 실시예에서는 520 및 640nm 광원의 LED를 사용했으며, 도 2에 나타낸 것과 동일한 조명을 사용하였다. In this embodiment, LEDs of 520 and 640 nm light sources were used, and the same illumination as shown in FIG. 2 was used.
2-1. 물리적 상처(창상)로서 인위적 절상에 따른 LED 조사 효과2-1. LED irradiation effect due to artificial wound as a physical wound
2-1-1. 실험방법2-1-1. Experiment method
면도날(Razor)로 14마리의 넙치를 인위적 절상을 도 3에 나타낸 같이 유발시킨 후, 70L의 유리수조(35x50x45 cm3)에 순치시킨 뒤 Room light, 520nm 및 640nm를 조사해 주었으며 광주기를 12시간 광조사: 12시간 암흑 (12L: 12D)으로 유지하였고, 매일 반량의 물을 환수해 주고 폐사율을 관찰하였다. 이 때, 520nm 광원의 평균 방출 광량은 229 μ·mol·m-2·s-1이였고, 수면 위 도달광량은 대략 58μ·mol·m-2·s-1 이였으며, 640nm의 광원에서 평균 방출 광량은 86 μ·mol·m-2·s-1 이고 수면 위 도달광량은 약 24 μ·mol·m-2·s-1 이였다. 인위적 상처를 유발시키고 3일 및 7일 후에 각 3 마리씩 MS-222로 안락사시켰다. 각 환부를 샘플링하여 RNA later에 넣어준 뒤, -80℃에 보관하였다. After the artificial flounder was induced with razor blades as shown in Fig. 3, the flounder was incubated in a 70L glass bath (35x50x45 cm 3 ), and then irradiated with room light, 520 nm and 640 nm. : 12 hours dark (12L: 12D) was maintained, and half of the water was returned daily and the mortality was observed. At this time, the average amount of emitted light of the 520 nm light source was 229 μ · mol · m −2 · s −1 , and the amount of light reached on the water surface was approximately 58 μ · mol · m −2 · s -1, which was averaged at a 640 nm light source. The amount of emitted light was 86 μ · mol · m −2 · s −1 and the amount of light reaching the water surface was about 24 μ · mol · m −2 · s −1 . Artificial wounds were induced and 3 and 7 days after each were euthanized with MS-222. Each affected area was sampled, put into RNA later, and stored at -80 ° C.
2-1-2. 총 RNA 추출 및 cDNA합성2-1-2. Total RNA Extraction and cDNA Synthesis
총 RNA의 추출은 Trizol을 이용한 방법을 사용하였으며, 제조사에서 제시한 방법과 같이 RNA를 추출하였다(Life technologiesTM). 대략적으로 RNA later에 보관되어있던 조직을 Trizol과 함께 마쇄한 뒤, chloroform을 넣어 섞어 주어 12,000g에서 15분간 4℃로 원심분리하였다. 이후 상청액을 따로 분리하여 한번 chloroform으로 세척한 후 isoprophyl alcohol에 섞어주고 10분간 반응시켰다. 그 후 12,000g에서 10분간 저온으로 원심분리하고 75% Et-OH로 한번 세척해주는 방법으로 RNA를 추출했다. 추출된 RNA는 1μg이 되도록 Nano-vue로 정량하여 MMLV 역전사방법을 제조사가 제시한 방법대로 실시하여 cDNA를 합성하였다 (Bioneer, Korea).Total RNA was extracted using the Trizol method, RNA was extracted according to the manufacturer's method (Life technologies TM ). The tissue stored in RNA later was triturated with Trizol, and then mixed with chloroform and centrifuged at 12,000g for 15 minutes at 4 ° C. Then, the supernatant was separated and washed once with chloroform, mixed with isoprophyl alcohol and reacted for 10 minutes. Thereafter, RNA was extracted by centrifugation at 12,000 g for 10 minutes at low temperature and washing once with 75% Et-OH. The extracted RNA was quantified by Nano-vue to 1 μg, and cDNA was synthesized by performing the MMLV reverse transcription method according to the method suggested by the manufacturer (Bioneer, Korea).
2-1-3. 실시간(Real-time) PCR2-1-3. Real-time PCR
면역반응 관련 유전자들인 TNF-α, g-lysozyme 및 TGF-βR2(TGF-β receptor 2)와 항존 유전자(House keeping gene)인 β-actin의 발현을 확인하기 위해 qPCR(Quantitative PCR) 수행하였으며, 프라이머의 염기서열은 하기 표 1에 나타내었다.QPCR (Quantitative PCR) was performed to confirm the expression of immune response genes TNF-α, g-lysozyme and TGF-βR2 (TGF-β receptor 2) and housekeeping gene β-actin. The base sequence of is shown in Table 1 below.
β-actin, TNF-α 및 g-lysozyme의 발현을 확인하기 위해, 2μl의 cDNA와 12.5μl의 2x SYBR green, 10pmol의 Forward primer와 Reverse primer를 각각 1μl씩 넣어주고 DEPC로 25μl가 되도록 맞춘 뒤, 94℃에서 10분 전-변성(pre-denaturation) 후, 94℃에서 15초, 59℃에서 15초, 72℃에서 15초를 40 회 반복하였다. TGF-βR2의 경우 94℃에서 1분 전-변성 후, 95℃에서 15초, 60℃에서 60초를 40 회 반복하였다. 얻어진 ct 값은 아래공식을 이용하여 Δct 값을 구하였고, 2-ΔΔct 값으로 환산하여 fold change를 계산하였다(Δct = 유전자 ct 값 - 항존유전자 ct 값).In order to confirm the expression of β-actin, TNF-α and g-lysozyme, 2μl of cDNA, 12.5μl of 2x SYBR green, 10pmol of Forward primer and Reverse primer were put in 1μl, and adjusted to 25μl with DEPC. After 10 minutes of pre-denaturation at 94 ° C., 15 seconds at 94 ° C., 15 seconds at 59 ° C., and 15 seconds at 72 ° C. were repeated 40 times. In the case of TGF-βR2, after 1 minute pre-modification at 94 ° C, 15 seconds at 95 ° C and 60 seconds at 60 ° C were repeated 40 times. The obtained ct value was calculated by using the following formula, and the fold change was calculated by converting it into 2 -ΔΔct value (Δct = gene ct value-antigenic gene ct value).
2-1-4. 결과2-1-4. result
상기 다른 파장의 LED 조사가 면도날에 의한 인위적 절상 치료에 미치는 효과를 확인한 결과는 도 4 내지 도 5에 나타내었다.The results of confirming the effect of the LED irradiation of the different wavelength on the artificial wound treatment by the razor blade are shown in Figures 4 to 5.
도 4에 나타낸 바와 같이, 인위적 절상에 따른 대조구의 누적폐사율은 36%로 나타났다. 반면, 520nm 조사구는 14%의 누적폐사율을 나타냈으며, 640nm 조사구는 21%의 누적폐사율을 나타내었다. 이를 기반으로 하여 상대생존율(RPS; Relative percent survival)을 계산하면, 520nm 및 640nm의 각 구간의 RPS는 60%, 40%의 높은 생존율을 나타냈다. As shown in FIG. 4, the cumulative mortality rate of the control group was 36%. On the other hand, the 520nm plot showed 14% cumulative mortality and the 640nm plot showed 21% cumulative mortality. Based on this, the relative percent survival (RPS) was calculated, and the RPS of each of the 520 nm and 640 nm sections showed a high survival rate of 60% and 40%.
또한, 도 5에 나타낸 바와 같이, 상처 후 3, 7일 뒤에 상처부위에서 관찰한 TNF-α, g-lysozyme 및 TGF-βR2의 mRNA 발현 정도를 확인한 결과, 상처 후 7일 뒤에 520 nm 조사 구간에서 TGF-βR2의 발현이 유의적으로 증가하였다. In addition, as shown in Figure 5, 3, 7 days after the wound was confirmed in the mRNA expression level of TNF-α, g-lysozyme and TGF-βR2 observed in the wound area, 7 days after the wound in the 520 nm irradiation section The expression of TGF-βR2 was significantly increased.
2-2. 물리적 상처로서 인위적 박리(열상)에 따른 LED 조사 효과2-2. Effect of LED Irradiation on Artificial Peeling as a Physical Wound
2-2-1. 실험방법2-2-1. Experiment method
면도날(Razor)로 12마리의 넙치의 피부에 2 x 3 x 0.5 cm3의 박리(desquamation) 상처를 도 6과 같이 인위적으로 유발한 뒤, 70L의 유리수조 (35x50x45 cm3)에 순치시켰다. 실험기간 동안 수온은 12-15℃였으며 이후 Room light, 520nm 높은 광량 (520nm-H), 520nm 낮은 광량 (520nm-L), 640nm 높은 광량 (640nm-H), 640nm 낮은 광량 (640nm-L)을 광주기가 12L: 12D가 되도록 조사하였다. 이 때, 520nm-H, 520nm-L, 640nm-H 및 640nm-L의 광원에서 조사된 평균 광량은 각각 229, 69, 372 및 86 μ·mol·m-2·s-1 이였으며, 수면 위 도달 광량은 58, 18, 105 및 24 μ·mol·m-2·s-1이였다. 매일 반량의 물을 환수해 주었으며, 3일과 7일 뒤 5마리를 안락사 시켜 상처부위를 반으로 나누어 한 부분은 RNA later에 -80℃로 보관하였고, 나머지 한 부분은 병리조직학적 분석을 실시하기 위해, Bouin′s solution에 고정하였다. 이후 남은 2마리는 계속 관찰하여 회복경과를 관찰하였다. A 2 x 3 x 0.5 cm 3 desquamation wound on the skin of 12 flounders with Razor was artificially induced as shown in FIG. 6, and then placed in a 70 L glass bath (35 x 50 x 45 cm 3 ). During the experiment, the water temperature was 12-15 ℃ and then room light, 520nm high light (520nm-H), 520nm low light (520nm-L), 640nm high light (640nm-H), 640nm low light (640nm-L) The photoperiod was examined to be 12L: 12D. At this time, the average amount of light emitted from the light sources of 520 nm-H, 520 nm-L, 640 nm-H, and 640 nm-L was 229, 69, 372, and 86 μ · mol · m −2 · s −1 , respectively. The amount of light reached was 58, 18, 105, and 24 µm mol -2 · s -1 . Half of the water was returned daily, and after 3 and 7 days, 5 animals were euthanized, and the wound was divided in half, one part was stored at -80 ° C in RNA later, and the other part was subjected to pathological analysis. , Bouin's solution. After that, the remaining two were observed continuously to observe the recovery progress.
2-2-2. 조직병리학적 분석2-2-2. Histopathological Analysis
최소 48시간 이상 고정하고 다시 24시간 동안 재고정을 시킨 후, tissues processing (Leica TP 1020, Germany)로 포매하여 5 μm의 두께가 되도록 수직으로 박절했다. 이후, harris hematoxylin-eosin 염색하여 조직병리학적 분석을 실시하였다.After fixing for at least 48 hours and re-establishing for 24 hours, the cells were embedded in tissues processing (Leica TP 1020, Germany) and cut vertically to a thickness of 5 μm. Then, harris hematoxylin-eosin staining was performed histopathological analysis.
2-2-3. 총 RNA 추출, cDNA 합성 및 qPCR 분석2-2-3. Total RNA Extraction, cDNA Synthesis, and qPCR Analysis
총 RNA 추출 및 cDNA합성은 상기 실시예 2-1-2에 개시된 방법으로 실시하였으며, 상기 실시예 2-1-3에 개시된 방법과 동량의 SYBR green, cDNA 및 프라이머를 첨가하여 qPCR을 실시하였다. 프라이머 서열 및 PCR 조건은 하기 표 2에 나타내었다. Total RNA extraction and cDNA synthesis were performed by the method described in Example 2-1-2, and qPCR was performed by adding the same amount of SYBR green, cDNA, and primers as the method described in Example 2-1-3. Primer sequences and PCR conditions are shown in Table 2 below.
Choi (2010)
Choi (2010)
면역반응 관련 유전자들인 TNF-α, g-lysozyme, IL-1β 및 IL-8의 발현을 확인하기 위해, 2μl의 cDNA와 12.5μl의 2x SYBR green, 10pmol의 Forward primer와 Reverse primer를 각각 1μl씩 넣어주고 DEPC로 25μl가 되도록 맞춘 뒤, 94℃에서 10분 전-변성(pre-denaturation) 후, 94℃에서 15초, 59℃에서 15초, 72℃에서 15초를 40 회 반복하였다. TGF-βR2의 경우 94℃에서 1분 전-변성 후, 95℃에서 15초, 60℃에서 60초를 40 회 반복하였다. MMP-13의 경우 95℃에서 15분 전-변성 후, 94℃에서 15초, 58℃에서 30초, 72℃에서 30초를 40 회 반복하였다. 항존유전자인 HSP 70의 경우 95℃에서 5분 전-변성 후, 95℃에서 20초, 55℃에서 20초를 40 회 반복하였다.얻어진 ct 값은 아래공식을 이용하여 Δct 값을 구하였고, 2-ΔΔct 값으로 환산하여 fold change를 계산하였다(Δct = 유전자 ct 값 - 항존유전자 ct 값).In order to confirm the expression of immune response genes TNF-α, g-lysozyme, IL-1β and IL-8, 2μl cDNA, 12.5μl 2x SYBR green, 10pmol Forward primer and Reverse primer 1μl each After 10 minutes of pre-denaturation at 94 ° C., 15 seconds at 94 ° C., 15 seconds at 59 ° C., and 15 seconds at 72 ° C. were repeated 40 times. In the case of TGF-βR2, after 1 minute pre-modification at 94 ° C, 15 seconds at 95 ° C and 60 seconds at 60 ° C were repeated 40 times. For MMP-13, after 15 minutes pre-modification at 95 ° C., 15 seconds at 94 ° C., 30 seconds at 58 ° C., and 30 seconds at 72 ° C. were repeated 40 times. In the case of HSP 70, the antigenic gene, after 5 minutes pre-modification at 95 ° C., 20 seconds at 95 ° C. and 20 seconds at 55 ° C. were repeated 40 times. The obtained ct value was obtained by using the following formula. The fold change was calculated in terms of -Δct values (Δct = gene ct value-anti-gene ct value).
2-2-4. 면도날(Razor)에 의한 인위적 박리에 따른 폐사율 확인2-2-4. Confirmation of mortality due to artificial peeling by Razor
상기 실시예 2-2에 개시된 방법과 동일하게 박리 상처를 유발시켜 같은 수조에 14마리씩 순치시킨 뒤, room light, 520nm-H, 640nm 중간 광량 (640nm-M; 평균 방출 광량 = 229 μ·mol·m-2·s-1/ 수면 위 도달광량 = 64 μ·mol·m-2·s-1)으로 조사하여, 폐사율을 관찰하였다. 이때, 3번 반복실험을 동시에 실시하였다. 매일 반량의 물을 환수해 주었으며 사육수의 온도는 16-17℃로 유지하였다. In the same manner as in the method described in Example 2-2, peeling wounds were induced and placed in the
2-2-5. 결과2-2-5. result
상기 다른 파장의 LED 조사가 면도날에 의한 인위적 박리 치료에 미치는 효과를 확인한 결과는 도 7 내지 9에 나타내었다.The results of confirming the effect of the different wavelength LED irradiation on the artificial peeling treatment by the razor blade are shown in Figures 7 to 9.
도 7에 나타낸 바와 같이, 박리 상처 후 3일째와 7일째에 상처에서 일어나는 조직병리학적 변화와 재-상피화(Re-epithelization)가 일어난 표피 두께를 측정한 결과 3일 째에서 520nm 및 640nm LED 조사구가 대조구에 비해 유의적으로 빠른 상피증생을 나타냈다.As shown in FIG. 7, 520 nm and 640 nm LED irradiated spheres were measured on
또한, 도 8에 나타낸 바와 같이, 상처 후 3일 째에 520 nm 조사 구간의 상처부분에서 전-염증성 사이토카인(pro-inflammation cytokine)인 IL-1, IL-8이 유의적으로 증가하였으며 보체 관련 유전자인 PoDAK, 상처치료와 관련된 유전자인 MMP-13 등이 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다. 반면, 7일째에는 520nm 구간에서 전-염증성 사이토카인의 발현과 TNF-a, PoDAK의 발현이 감소하는 것을 확인하였다.In addition, as shown in FIG. 8, IL-1 and IL-8, which are pro-inflammation cytokines, were significantly increased in the wound area of the 520 nm irradiation section at 3 days after the wound, and complement-related. PoDAK gene and MMP-13 gene related to wound healing were significantly increased. On the other hand, on
또한, 샘플링 이후 남은 여분의 2마리는 계속 실험을 진행하면서 10, 20, 30일 해당파장의 빛이 조사되었을 때 임상적인 회복이 보이는지 확인하기 위해 관찰하며 사진을 찍었으며 도 9에 나타내었다. 그 결과, 대조구에서는 30일째까지 상처에서 출혈증상이 관찰되었으나 520nm와 640nm 조사구간에서는 이러한 증상이 관찰되지 않았으며, 많은 상처회복이 진행된 것을 확인할 수 있었다. In addition, the extra two remaining after sampling was observed and photographed to confirm the clinical recovery when the light of the corresponding wavelength is irradiated for 10, 20, 30 days while continuing the experiment was shown in FIG. As a result, in the control group, bleeding symptoms were observed in the wound until 30 days, but these symptoms were not observed in the 520 nm and 640 nm irradiation sections, and it was confirmed that a lot of wound recovery proceeded.
또한, 도 10에 나타낸 바와 같이, 박리 상처 후 3회 반복하여 폐사율을 관찰한 결과, 대조구에 비해 520, 640nm 조사구간이 유의적으로 낮은 폐사율을 나타냈다.As shown in FIG. 10, the mortality was observed three times after the peeling wound. As a result, the 520 and 640 nm irradiation sections showed significantly lower mortality than the control group.
2-3. 물리적 상처로서 인위적 표피 박리에 따른 LED 조사 효과2-3. Effect of LED Irradiation on Artificial Epidermal Peeling as a Physical Wound
2-3-1. 실험방법2-3-1. Experiment method
앞서 사용된 실시예 방법보다 상처의 깊이를 약하게 하여 2.5 x 1.2 x 0.1 mm3 정도의 박리 상처를 도 11에 나타내었다. 수온은 18-20℃ 였고 매일 80%의 물을 환수해주며 누적폐사율을 관찰하였다. 각 구간 당 36마리의 인위적 상처 개체를 12마리씩 3 탱크에 옮겨 닮은 뒤 Room light, 520nm-H, 640nm (평균 방출 광량 = 229 μ·mol·m-2·s-1/ 수면 위 도달광량 = 64 μ·mol·m-2·s-1) 으로 12L: 12D광주기로 빛을 28일간 조사해 주었다. 상처가 난 후 0, 1, 3, 7, 14 그리고 28일 뒤에 각 구간별 상처의 가로와 세로크기를 측정했고 0, 3, 7, 14 그리고 28일 뒤에 각 구간별 5마리씩 안락사 시킨 뒤 상처부위를 2등분하여 한 부분은 조직병리학적 분석을 위해 Bouin′s solution에 고정하였으며 나머지 한 부분은 RNA later에 넣어 -80℃에 보관하였다.A peel wound of about 2.5 × 1.2 × 0.1 mm 3 was shown in FIG. 11 by making the depth of the wound weaker than the example method used previously. The water temperature was 18-20 ℃ and 80% of the water was returned daily and the cumulative mortality was observed. After the artificial wound object for each 36 per segment-like grains transferred to a
2-3-2. 조직병리학적 분석2-3-2. Histopathological Analysis
최소 48시간 이상 고정하고 다시 24시간 동안 재고정을 시킨 후, tissues processing (Leica TP 1020, Germany)로 포매하여 5 μm의 두께가 되도록 수직으로 박절했다. 이후, harris hematoxylin - eosin 염색과 Masson trichrome stain (Sigma, Korea)을 제조사의 매뉴얼과 같이 실시하였다.After fixing for at least 48 hours and re-establishing for 24 hours, the cells were embedded in tissues processing (Leica TP 1020, Germany) and cut vertically to a thickness of 5 μm. After that, harris hematoxylin-eosin staining and Masson trichrome stain (Sigma, Korea) were performed with the manufacturer's manual.
2-3-3. 총 RNA 추출, cDNA 합성 및 qPCR 분석2-3-3. Total RNA Extraction, cDNA Synthesis, and qPCR Analysis
총 RNA 추출 및 cDNA합성은 상기 실시예 2-1-2에 개시된 방법으로 실시하였으며, 상기 실시예 2-1-3에 개시된 방법과 동량의 SYBR green, cDNA 및 프라이머를 첨가하여 qPCR을 실시하였다. Total RNA extraction and cDNA synthesis were performed by the method described in Example 2-1-2, and qPCR was performed by adding the same amount of SYBR green, cDNA, and primers as the method described in Example 2-1-3.
2-3-4. 결과2-3-4. result
상기 다른 파장의 LED 조사가 면도날에 의한 인위적 박리 치료에 미치는 효과를 확인한 결과는 도 12 내지 19에 나타내었다.The results of confirming the effect of the LED irradiation of the different wavelength on the artificial peeling treatment by the razor blade are shown in Figures 12 to 19.
도 12에 나타낸 바와 같이, 28일간 발생한 각 대조구, 520nm, 640nm의 폐사율은 29%, 4%, 17%로 520nm 조사구간에서 상대적으로 낮은 폐사율을 확인하였다.As shown in FIG. 12, the mortality rates of the control, 520 nm, and 640 nm, which occurred for 28 days, were 29%, 4%, and 17%, respectively.
또한, 표피 박리 후 1, 3, 7, 14 및 28일째에 상처에서 일어나는 조직병리학적 변화를 확인하기 위해 재-상피화가 일어난 표피 두께를 측정하였고, 결합조직(connective tissue)인 콜라겐 층(collagen layer)의 발현을 확인하기 위해 masson trichrome 염색하여 청색으로 염색된 정도를 image J 프로그램을 이용하여 측정하였다. 상기 1, 3, 7, 14 및 28일 뒤 변화 결과들은 각각 도 13, 14, 15, 16 및 17에 나타내었다. 각 도면은 각 날짜 조건하에서의 (a) 표피 박리 대조구, (b) 표피 박리 520nm 조사구 및 (c) 표피 박리 640nm 조사구에서의 H&E (왼쪽 패널) 및 Masson-trichrome (오른쪽 패널) 염색 이미지를 보여준다. 또한, 각 도면은 각 날짜 조건하에서의 (d) 표피 두께 및 (e) 콜라겐 층의 밀도를 측정한 결과를 보여준다. 그 결과, 520nm 조사 구간에서 1일째부터 유의적으로 빠른 상피의 재생을 보였으며 7일째에는 유의적으로 많은 결합조직의 발현을 확인할 수 있었다. 2주째 까지는 넙치의 상처에서 출혈이 보였으나 3주째부터는 실제적으로 상처가 회복되어 상처가 점점 아무는 현상을 모든 구간에서 확인할 수 있었다. 3주와 4주째 모든 구간의 넙치 상처의 사진을 찍어 상처가 회복된 정도를 Image J program을 이용하여 도 18에 나타내었으며, 그 결과. 상처가 회복되는 비율도 520nm 조사가 640nm와 대조구 조사에 대비하여 유의적으로 높은 회복을 보여주었다.In addition, the epidermal thickness of the re-epithelialization was measured to identify histopathological changes in the wounds on
또한, 도 19에 나타낸 바와 같이, 1, 3, 7, 14 및 28일에 상처시 상처회복을 돕는 MMP-13 유전자 발현의 경우에도 520nm 조사 구간의 경우 7일째까지 대조구에 대비하여 높은 발현을 확인했으며, 항염증 관련 사이토카인의 경우에는 초기에 520nm 구간에서 높은 발현을 보였으나 이후 그 발현이 낮아지는 경향을 확인하였다.In addition, as shown in Figure 19, 1, 3, 7, 14 and 28, even in the case of MMP-13 gene expression to help the wound recovery on the day of the 520nm irradiation section confirmed the high expression compared to the control until the 7th day In the case of anti-inflammatory cytokines, high expression was initially observed in the 520 nm region, but the expression was then decreased.
요약하면, 본 실시예에서는 어류상피 유래의 세포주에서 520nm와 640nm가 유의적으로 상피를 증생시킬 수 있는 파장대라는 것을 확인하였고, 해당 파장으로 넙치에 in vivo로 적용하였다. 그 결과, 520nm와 640nm 둘 다 넙치의 물리적 상처를 회복하는데 도움을 주는 것으로 확인되었으며, 520nm 조사에서 그러한 경향이 보다 탁월하였다. 유효파장의 LED를 상처가 난 어류에 조사 시 초기에는 붕괴된 상피의 재생을 촉진시켜 외부의 병원균과 삼투압 붕괴를 막았으며 이후에 탈락된 부분에 콜라겐 층을 포함한 결합 조직의 발현이 증가하였다. 조금 더 시간이 지나게 되면 결합 조직으로 덮여있던 부분이 근육층으로 변화하면서 상처가 치료되는 것을 확인했으며, 상처 회복에 관련된 MMP-13의 발현 또한 520nm 조사구간에서 높게 나타나는 것을 확인하였다. In summary, in the present embodiment, it was confirmed that 520 nm and 640 nm in the epithelial cell line derived from fish epithelium were significantly increased in the epithelium, and applied to the flounder in vivo at the corresponding wavelength. As a result, both 520nm and 640nm were found to help repair the physical injury of the flounder, and the trend was superior in the 520nm irradiation. When irradiated LEDs with effective wavelengths were applied to wounded fish, they initially promoted the regeneration of disintegrated epithelium, preventing external pathogens and osmotic collapse, and thereafter, the expression of connective tissue including collagen layer in the dropped part was increased. After a little more time, the wound covered with connective tissue changed to the muscle layer, and the wound was healed, and the expression of MMP-13 related to wound recovery was also found to be high in the 520 nm irradiation section.
결론적으로 520nm의 조사가 어류의 물리적 상처치료를 도와주는 파장이라는 것을 제시한다. 따라서, 본 발명의 방법을 이용하는 경우, 양식장에서 밀집되어 양식되는 수산해양생물 또는 관상용으로 이용되고 있는 관상생물에 대한 특정파장대의 LED광인 520nm을 조사함으로써 수산해양생물의 상처 발생시 수산해양생물에 대한 치료수조에 활용할 수 있다. In conclusion, it is suggested that 520nm irradiation is the wavelength that helps physical wound healing of fish. Therefore, in the case of using the method of the present invention, the treatment of aquatic marine organisms in the event of a wound of aquatic marine organisms by irradiating 520 nm, which is LED light of a specific wavelength band, for aquatic marine organisms that are densely farmed in aquaculture or coronary organisms that are used for ornamental Can be used in tanks.
Claims (8)
상기 LED 광원은 수면 위 도달 광량이 18 내지 64 μㆍmolㆍm-2ㆍs-1 범위의 광량으로 유지되고;
상기 방법은 TGF-βR2(TGF-β receptor 2) 및 MMP-13 유전자의 발현 수준을 증가시켜서 피부 상피세포의 증식을 유도하는 것을 특징으로 하는, 방법.
A method of treating skin wounds on the flounder, comprising: irradiating a light source having a wavelength of 520 nm with a photoperiod of 12:12 (L: D) conditions in an aquatic environment including the flounder without treating photosensitizers. As
The LED light source is maintained at an amount of light reaching the water level in the range of 18 to 64 占 mol 占 m -2 s -1 ;
The method is characterized by inducing proliferation of dermal epithelial cells by increasing the expression levels of TGF-βR2 (TGF-β receptor 2) and MMP-13 genes.
상기 수중 환경은 어항, 수족관, 양식장, 연못, 사육장 또는 해양인 것을 특징으로 하는, 방법.
The method of claim 1,
Wherein said aquatic environment is a fishbowl, an aquarium, a farm, a pond, a kennel or an ocean.
상기 상처는 절상, 박리, 찰과상, 열상(박리), 자상, 결출상 및 관통상으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 방법.
The method of claim 1,
Wherein the wound is selected from the group consisting of cuts, peels, abrasions, tears, peelings, cutouts and penetrating wounds.
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| KR1020180028593A KR102073353B1 (en) | 2018-03-12 | 2018-03-12 | Method for accelerating fish skin wound healing using light emitting diode(LED) |
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