KR102072959B1

KR102072959B1 - pH 민감성 이중 블록 공중합체 및 이의 세포 배양 용도

Info

Publication number: KR102072959B1
Application number: KR1020180100457A
Authority: KR
Inventors: 이두성; 우터펑; 이 리; 김봉섭; 방석호; 이태진
Original assignee: 성균관대학교산학협력단
Priority date: 2018-08-27
Filing date: 2018-08-27
Publication date: 2020-02-04

Abstract

본 발명은 pH 민감성 합성 고분자의 제조방법과 pH 변화에 따른 세포 탈착 및 탈착된 세포의 조직공학적 이용에 관한 것으로, 본 발명의 블록 공중합체를 사용하여 만들어진 고분자는 pH 민감성을 나타내어 pH 조건을 변화시키는 방법으로 완전히 분해할 수 있으므로 세포 배양 시 적합한 고분자로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

pH 민감성 이중 블록 공중합체 및 이의 세포 배양 용도 {A pH-sensitive block copolymer and its use for cell culture}

본 발명은 pH 민감성인 이중 블록 공중합체 및 이를 이용한 세포의 배양 방법과, 상기 이중 블록 공중합체를 이용한 세포 배양용 조성물 및 이의 조직 공학적 응용에 관한 것이다.

세포 배양은 사고나 질병에 의해 결손된 우리 몸을 대체 또는 복원하는 조직공학분야에서 매우 광범위하게 이용되고 있다. 일반적인 진핵세포의 세포배양 방법이 개발된 지도 40여년이 경과되었지만, 부착성 세포의 성장을 지지해주기 위하여 현재까지 가장 흔히 사용되고 있는 방법은 폴리스티렌 혹은 유리로 된 기질로 이루어진 2차원 표면에서 세포를 배양하는 것이다. 또한 폴리스티렌 혹은 유리 기질로 이뤄진 2차원 표면에서 배양된 세포는 일반적으로 세포 탈착용 효소인 트립신을 사용하여 배양 표면에서 탈착한다. 트립신으로 탈착된 세포는 단일세포 용액(single cell solution)으로 구성되어 주사법 등을 이용해 생체 내 이식되거나 새로운 표면에 균주되어 재 배양된다. 그러나 이러한 트립신의 처리는 일정시간 이상 처리할 경우 세포 외 기질을 파괴하여 (T Shimizu, M Yamato, A Kikuchi, et al., Cell sheet engineering for myocardial tissue reconstruction. Biomaterials, 24, 2309(2003)) 세포의 손상 및 세포의 급격한 생존도 감소를 유발하며, 이를 방지하기 위해 고가의 혈청 (fetal bovine serum)을 매 탈착 과정에 추가 사용해야 하는 문제가 있다. 또한 세포의 탈착 과정에서 세포의 부착, 기능 유지, 치료 물질 분비 등에 필수인 세포외기질의 대량 손실이 수반된다.

위와 같은 기존의 세포 배양 과정의 문제점과 비효율성을 해결하기 위하여 본 발명자들은 pH 민감성 출발 물질을 이용하여 이의 반응 비를 달리하는 합성 방법에 대한 연구 끝에, pH의 변화에 의하여 세포 배양 후 배양된 세포의 손상을 최소화 하면서 순수 배양된 세포만 분리시킬 수 있는 세포 배양 구조체로써 활용 가능한 신규 합성 고분자와 그 제조방법 및 이의 용도에 관한 본 발명을 완성하였다.

특허출원 제 10-2017-0121590 호 일본 특허출원 제 2004-511596 호 미국 특허출원 제 2018-0112038 호

본 발명의 목적은 pH 민감성 고분자로서, 1블록의 폴리(β-아미노 에스터) 1올리고머와 제2블록의 폴리(β-아미노 에스터) 2올리고머를 공중합한 이중 블록 공중합체를 제공하는 것으로, 제1블록으로서, 비스아크릴레이트 계열 화합물과 아미노알킬알코올계화합물로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 폴리(β-아미노 에스테르)1 올리고머; 제2블록으로서, 비스아크릴레이트 계열 화합물과 2차 아민 함유 디아민 화합물으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 폴리(β-아미노 에스테르)2 올리고머를 포함하는 pH 민감성 이중 블록 공중합체 및 이를 포함하는 세포 배양용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명의 이중 블록 공중합체 고분자 용액을 준비하는 제1단계; 상기 고분자 용액을 세포 배양용 구조체에 코팅하는 제2단계; 제2단계의 세포 배양용 구조체를 이용하여 세포를 배양하는 제3단계; pH를 7.0 이하로 조정하여 배양 구조체로부터 세포를 수득하는 제4단계를 포함하는, 세포 배양 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 배양된 세포를 이용한 조직 공학적 치료용 조성물 및 치료제를 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 제1블록으로서, 비스아크릴레이트 계열 화합물과 아미노알킬알코올계 화합물으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 폴리(β-아미노 에스터) 1올리고머 및 제2블록으로서, 비스아크릴레이트 계열 화합물과 2차 아민 함유 디아민 화합물로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 폴리(β-아미노 에스터) 2올리고머를 공중합하여 형성된 이중 블록 공중합체를 제공하며, 상기 이중 블록 공중합체, 폴리(β-아미노 에스터)1-폴리(β-아미노 에스터)2 는 pH 7.0 이하에서 이온화되는 3차 아민기를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 이중 블록 공중합체는 하기 반응식으로 표기될 수 있다.

상기 식에서, m과 n은 2 내지 50 범위의 자연수이다.

또한, 본 발명의 일 양태로서, 본 발명의 블록 공중합체의 수평균 분자량은, 300 내지 15,000 g/mol 인 것을 특징으로 하며, 보다 바람직하게는 500 내지 5,000 g/mol인 것을 특징으로 한다. 분자량이 300 g/mol 미만인 경우 다공성 지지체의 기계적 물성이 떨어져 세포 배양에 적합하지 않으며, 분자량이 15,000 g/mol 보다 큰 경우 다공성 지지체의 기계적 물성이 과도하여 세포배양 후 다공성 지지체의 생분해에 시간이 걸려 부적합하다

또한, 본 발명의 또 다른 양태로서, 상기 이중 블록 공중합체의 총 분자량에 있어서 제1블록과 제2블록의 비율은 1:1 내지 1:4 범위인 블록 공중합체인 것을 특징으로 한다. 제1블록과 제2블록의 비율이 1:1 미만의 경우 합성된 공중합체가 점성이 너무 강하여 지지체로서 사용하기가 어렵고, 제1블록과 제2블록의 비율이 1:4 이상인 경우 합성된 공중합체가 탄성이 너무 강하여 지지체로서 사용하기가 어렵다.

본 발명의 이중 블록 공중합체의 제1블록 또는 제2블록에 포함되는 상기 비스아크릴레이트 화합물은, 이에 제한되는 것은 아니나 에틸렌글리콜다이아크릴레이트, 1,4-부탄다이올다이아크릴레이트, 1,3-부탄다이올다이아크릴레이트, 1,6-헥산다이올다이아크릴레이트, 1,6-헥산다이올에톡실레이트다이아크릴레이트, 1,6-헥산다이올프로폭실레이트다이아크릴레이트, 3-하이드록시-2,2-다이메틸프로필3-하이드록시-2,2-다이메틸프로피오네이트다이아크릴레이트, 1,7-헵탄다이올다이아크릴레이트, 1,8-옥탄다이올다이아크릴레이트, 1,9-노나다이올아크릴레이트및 1,10-테칸다이올다이아크릴레이트로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 이중 블록 공중합체의 제1블록에 포함되는 상기 아미노알킬알코올계 화합물은, 3-amino-1-propanol(프로판올아민), 1-amino-2-propanol(이소프로판올아민), 2-아미노-2-메틸-1-프로판올, tert-부틸아미노, 2-(2-메톡시페닐)에틸-1-아미노, 4-(2-메톡시 페닐)-1-피페라지닐 또는 4-피레로닐-1-피페라지닐 디아제판으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 이중 블록 공중합체의 제2블록에 포함되는 2차 아민 함유 디아민 화합물은, 이에 제한되는 것은 아니나, 4,4‘-트리메틸렌 다이피퍼리딘, 피퍼라진, N,N'-다이메틸 에틸렌 다이아민, N,N'-다이에틸에틸렌다이아민, 이미다졸리딘, 피퍼리딘(piperidine), 피롤리딘(pirrolidine), 3,3-다이메틸피퍼리딘(3,3-dimethylpiperidine) 및 디아제판으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 상기 블록 공중합체를 이용하여 세포 배양 및 pH 변화를 통한 세포를 수득하는 방법으로서, 블록 공중합체를 유기용매에 용해시킨 고분자 용액을 준비하는 제1단계; 상기 고분자 용액을 세포 배양 구조체의 표면에 처리하는 제2단계; 제2단계로부터 수득한 세포 배양 구조체에 세포를 배양하는 제3단계; pH 를 7 이하로 조정하여 배양 구조체로부터 세포를 수득하는 제4단계를 포함하는 세포 배양 방법을 제공한다.

본 발명의 상기 세포 배양 방법에 따라 배양될 수 있는 세포는 “부착성 세포”로서, 본 발명에서 부착성 세포는, 세포로부터 세포외 기질 단백질과 프로테오글리칸 등을 분비하여 기질(matrix)를 형성할 수 있는 세포를 의미한다. 이러한 세포는 표면의 수용체를 이용하여 세포 배양용 구조체에 부착하여 증식한다. 본발명에서는, 블록 공중합체 또는 블록 공중합체가 표면에 처리된 세포 배양용 구조체에 부착하여 증식될 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 부착성 세포는, 뼈(bone), 연골(cartilage), 지방(fat), 힘줄, 치수, 신경 조직(nerve tissue), 섬유아세포(fibroblast) 및 근육 세포(muscle cell) 등 조직 세포로부터 유래한 초대 세포, 세포주, 또는 이들의 줄기세포를 포함할 수 있으며, 보다 구체적으로는, 섬유아세포(fibroblast), 연골세포(chondrocyte), 조골세포(osteoblast), 혈관내피세포(endothelial cell), 혈관내피 전구세포(endothelial precursor cell), 근세포(myoblast), 평활근세포(smoothmuscle cell), 간세포(hepatocyte), 신경세포(neural cell), 심근세포(cardiomyocyte)및 척추 추간판 세포(interverteveral disc cell)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로부터 유래된 중간엽 줄기세포, 또는 상기 조직 세포 군에서 선택되는 어느 하나로부터 유래한 세포주 또는 초대 세포일 수 있다. 특히, 중간엽 줄기세포를 사용하는 경우, 본 발명에서 사용될 수 있는 중간엽 줄기세포는 골수(bone marrow), 말초신경 혈액, 제대혈, 골막(periosteum), 진피(dermis) 및 중배엽 기원의 조직 등으로부터 분리되고 정제될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 인간 지방으로부터 유래된 줄기세포를 사용하여 세포 배양을 수행하였다.

본 발명에서 세포 배양 구조체는, 세포 배양이 가능한 모든 지지체 및 구조물을 의미하는 것으로서, 그 형태 및 소재에 제한되지 않으며, 플레이트(배양 접시), 용기, 막(membrane), 미세담체(microcarrier), 실관(hollow fiber), 세라믹 매트릭스(ceramic matrix), 비드(bead), 미세캡슐(microencapsule), 스캐폴드(scaffold) 중 선택될 수 있다. 상기 세포 배양 구조체는 열거된 형태가 아닌 다른 형태의 구조체를 사용할 수 있으며, 배양하는 세포의 종류 및 이를 활용하는 형태에 따라 적절하게 선택하여 사용할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 세포 배양 구조체는 세포 배양 접시이며, 배양 접시 표면에 처리된(코팅된) 고분자는 pH 6 내지 6.5의 환경에서 분해되는 것일 수 있다. 따라서, 상기 세포배양 접시에 코팅된 고분자 배양된 세포에 영향을 주지 않는 범위에서 pH를 변화시켜 세포배양 접시에 코팅된 고분자 완전히 분해시켜 제거하고 배양된 세포를 손상 없이 회수할 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 상기 배양된 세포 및 이를 이용한 조직 공학적 치료 방법 및 조성물을 제공한다. 조직 공학적 치료 방법이란, 손상된 생체 조직을 복원하거나, 기능을 재생시키기 위한 방법을 포함하며, 보다 상세하게는 뼈, 인대, 근육, 피부, 혈관과 같은 생체 조직 손상 시, 이를 재생하여 치료하는 방법을 의미한다. 본 발명에서는 상기와 같은 치료 방법을 제공할 수 있는 조성물로서, 본 발명의 블록 공중합체 및 이를 이용하여 배양된 세포를 포함하는 조직 재생용 또는 상처 치료용 조성물을 제공한다.

상기 용도와 관련하여, 본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 블록 공중합체를 이용하여 배양한 줄기세포의 세포 부착능, 세포 독성 및 치료 물질 분비능이 기존의 세포 배양 및 트립신을 이용하여 분리한 줄기세포의 능력과 동등한 수준으로 유지될 수 있음을 확인하였으며, 이를 마우스의 피부 상처에 처리하여 피부 창상치료에 대한 효능이 있음을 확인하였다.

본 발명의 일 양태로서, 상기 본 발명의 조성물은 치료제로 사용될 수 있다. 상기 치료제는 조성물에 제한되는 것은 아니며, 상기 본 발명의 블록 공중합체 및 이를 이용하여 배양된 세포를 포함하는 조성물이 적용된 모든 치료용 물질을 포함한다. 이에 제한되는 것은 아니나, 붕대, 스테리-스트립(steri-strip), 봉합사(sature), 스테이플(staple), 또는 이식 조직(graft), 의료용 이식 조직편(medical implant), 생체-공학적 물질, 조직-공학 처리된 스캐폴드를 모두 포함할 수 있다.

본 발명의 방법으로 pH 감응성 이중 블록 공중합체를 사용하여 만들어진 고분자는 pH 민감성을 나타내어 pH 조건을 변화시키는 방법으로 완전히 분해할 수 있으므로 고분자가 코팅된 세포배양 접시에서 배양된 세포는 손상시키지 않으면서 세포배양 구조체에 코팅된 고분자를 완전히 제거하고 배양된 세포를 회수할 수 있는 세포 예컨대, 줄기세포의 배양에 적합한 고분자로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 이중 블록 공중합체를 이용한 세포 배양 및 조직 공학적 치료 방법에 대한 전체적인 실험을 모식화한 것이다.
도 2는 본 발명의 제조 예에 따른 블록 공중합체의 H-NMR에 의한 공중합반응여부를 판단할 수 있는 도이다.
도 3은 본 발명의 제조예에 따른 블록 공중합체의 NaOH 수용액을 이용한 적정법에 의거하여 구한 pK_b값을 보여주는 pH 민감도 그래프이다.
도 4는 pH 민감성 고분자가 코팅된 세포 배양 접시를 이용한 세포 배양과 세포 독성도 및 부착평가결과를 나타낸 도이다.
도 5는 pH 민감성 고분자가 코팅된 세포 배양 접시에서 배양된 세포의 분리 및 독성도, 치료인자 분비 확인 및 세포 재 부착 능력 확인 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 분리된 줄기세포의 창상치료 효능 평가에서 창상면적이 감소를 나타낸 도이다.
도 7은 분리된 줄기세포의 창상치료 효능 평가에서 조직학, 면역염색 및 RT-PCR을 이용한 피부 조직 재생을 나타낸 도이다.

이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따라 pH 민감성 블록 공중합체의 구성 성분 중 pH 민감성을 발현하기 위하여 공중합체내에 3차 아민기를 형성할 수 있도록 2차 다이아민 화합물, 예컨대 4,4’-트리메틸렌피페라진 계열 화합물을 사용하는 것이 바람직하며, 일례를 들면 하기 [화학식 1]의 화합물이 있다.

상기 식에서, z는 1 내지 10 범위의 자연수이다.

특히, 세포 부착을 위해 측쇄로 하이드록시기(-OH)를 갖도록아미노알킬알코올계 화합물, 예컨대 3-아미노-1 프로판올 계열 화합물을 사용하는 것이 바람직하며, 일례를 들면 하기 [화학식 2]의 화합물이 있다.

상기 식에서, y는 1 내지 10 범위의 자연수이다.

또한 이들 아민계 화합물에 반응할 수 있도록 비스아크릴레이트 계열 화합물, 예컨대 1,4-부탄다이올아크릴레이트 계열 화합물을 사용하는 것이 바람직하며, 일례를 들면 하기 [화학식 3]의 화합물이 있다.

상기 식에서, x는 1 내지 10 범위의 자연수이다.

본 발명에 따른 pH 민감성 블록 공중합체는 당업계에 알려진 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있으며, 이의 일 실시예를 들면 하기 [반응식 1]의 경로에 의해 합성될 수 있다.

[반응식 1]

상기 [반응식 1]로 도식되는 제조 방법의 일 실시예를 들면, 아크릴레이트 말단기를 갖는 비스아크릴레이트에 pH 민감성기를 갖는 4,4’-트리메틸렌피페라진과 3-아미노 1-프로판올을 이용하여 당업계에 통상적으로 알려진 미첼반응(Michael reaction)이라는 부가반응에 의해 폴리(β-아미노 에스터)를 형성하게 되며, 형성된 폴리(β-아미노 에스터)는 pH 민감성기인 3차 아민과 측쇄로 하이드록실기를 갖게 된다. 측쇄에 형성된 하이드록시(-OH)기는 세포와의 부착성을 향상시켜 주는 역할을 한다.

본 발명에서는 상기와 같이 합성된 블록 공중합체의 pH 변화에 따른 pH민감도를 나타내는 pK_b는 형광 분광기(Fluorescence spectrometer, FL)를 이용하여 확인할 수 있었다.

제조예 1 내지 6: 폴리(β-아미노 에스테르)1-(β-아미노 에스테르)2 블록 공중합체의 제조

제조예 1.

부탄다이올 다이아크릴레이트(1,4-butanediol diacrylate; 1,4-BD) 1몰과 3-아미노-1-프로판올 0.5몰 그리고 4,4’-트리메틸렌디피페리딘 0.5 몰을 반응기에 넣고 질소 환경 조건으로 100℃에서 5시간 동안 수행하였다. 반응 종료 후, 반응하지 않은 잔류물질을 제거하기 위하여 과량의 에틸에테르에 침전시켜 여과한 후 상온에서 진공건조하여 pH 민감성기를 갖는 제1블록과 제2블록의 분자량 비율이 1:1인 수평균분자량이 1,000 g/mol인 폴리(β-아미노 에스테르)1-(β-아미노 에스테르)2(PAE 1-PAE 2,mPAE) 이중 공중합체를 90% 이상의 수율로 수득하였다.

제조예 2.

3-아미노-1-프로판올 0.4몰 그리고 4,4’-트리메틸렌디피페리딘 0.6몰을 사용하는 것을 제외하고는 상기 제조예 1과 동일한 방법으로 제1블록과 제2블록의 분자량 비율이 1:1.5인 제1블록과 제2블록의 분자량 비율이 1:1.5인 수평균 분자량이 2000 g/mol 인 폴리(β-아미노 에스테르) 1-(β-아미노 에스테르)2 (mPAE) 이중 공중합체를 90% 이상의 수율로 수득하였다.

제조예 3.

3-아미노-1-프로판올 0.3몰 그리고 4,4‘-트리메틸렌디피페리딘 0.7몰을 사용하는 것을 제외하고는 상기 제조예 1과 동일한 방법으로 제1블록과 제2블록의 분자량 비율이 1:25인 수평균 분자량 2000 g/mol인 폴리(β-아미노 에스테르) 1-(β-아미노 에스테르)2 (mPAE) 이중 공중합체를 90% 이상의 수율로 수득하였다.

제조예 4.

3-아미노-1-프로판올 0.2몰 그리고 4,4’-트리메틸렌디피페리딘 0.8몰을 사용하는 것을 제외하고는 상기 제조예 1과 동일한 방법으로 제1블록과 제2블록의 분자량 비율이 1:4인 수평균 분자량 2000 g/mol인 폴리(β-아미노 에스테르) 1-(β-아미노 에스테르)2 (mPAE) 이중 공중합체를 90% 이상의 수율로 수득하였다.

제조예 5.

헥산다이올 다이아크릴레이트(1,6-hexanediol diacrylate; 1,6-BD) 1몰인 것을 제외하고는 상기 제조예 4와 동일한 방법으로 제1블록과 제2블록의 분자량 비율이 1:4인 수평균분자량이 2600 g/mol 인 폴리(β-아미노 에스테르) 1-(β-아미노 에스테르)2 (mPAE) 이중 공중합체를 90% 이상의 수율로 수득하였다.

제조예 6.

1,10-테칸 다이올 다이아크릴레이트(1,10-decanediol diacrylate; 1,10-BD) 1몰인 것을 제외하고는 상기 제조예 4와 동일한 방법으로 제1블록과 제2블록의 분자량 비율이 1:4인 수평균 분자량 4,500 g/mol인 폴리(β-아미노 에스테르) 1-(β-아미노 에스테르)2 (mPAE) 이중 공중합체를90% 이상의 수율로 수득하였다.

실시예 1: mPAE 이중 블록 공중합체를 이용한 pH 민감성 고분자의 세포 배양 접시 코팅

상기 제조예 1에 따라 제조한 mPAE 블록 공중합체를 이용하여 pH 민감성 고분자를 세포배양 접시에 코팅하였다. 준비된 블록 공중합체 100mg을 500 ml 비이커에 넣는다. 3차 증류수를 pH 3.0으로 조절 한 후 이를 공중합체가 들어있는 비커에 200ml 넣고 교반한다. 공중합체가 완전히 용해 된 후,용액의 pH를 6.0으로 조정한다. 0.22um 크기의 구멍을 가진 필터를 이용하여 클린 벤치 내에서 필터 하여 멸균한다.6well 배양 접시에 멸균된 용액 1ml, 10cm 배양 접시에 멸균된 용액 5ml, 15cm 세포 배양 접시에 멸균된 용액 8ml를 넣고 클린벤치 내에서 12내지 24시간 방치하여 완전히 건조 시킨다.

실시예 2. mPAE 이중 블록 공중합체를 이용한 pH 민감성 고분자가 코팅된 세포 배양 접시를 이용한 세포 배양과 세포 독성도 및 부착평가

상기 실시예 1에 따라 준비된 세포 배양 접시를 이용하여 인간 지방유래 줄기세포를 10% FBS, 2 mM 글루타민 및 100 U/ml 페니실린-스트렙토마이신을 포함하는 DMEM 배지에서 37℃ 및 5% CO₂ 습식 공기 조건 하에서 배양하였다. 세포 배양 접시에서의 시험관 내(in vitro) 세포 독성을 LIVE and DEAD, RT-PCR을 이용하여 연구하였다. 또한 세포 부착정도를 팔로이딘(phalloidin) 염색 후 형광 현미경으로 확인하였다.

구체적으로, 세포를 분주하기 전 준비된 세포 배양 접시를 PBS로 3회 세척 후, Live and Dead 분석을 위해 24 well에 1.5 x 10³세포를, RT-PCR분석을 위해 10cm 배양 접시에 1.0 x 10⁵세포를, 세포 부착 평가를 위해 24 well에 1.0 x 10³세포를 각각 균주한 후, 24well에는 500ul, 10cm 세포 배양접시에는 10ml 세포 배양액을 첨가하고 5% CO₂ 및 95% 공기 분위기의 습식 배양기에서 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 이후 Live and Dead 분석을 위해 세포를 PBS로 3회 세척한 다음, 혈청이 들어있는 배양액을 넣어 주었다. 살아 있거나 혹은 죽은 세포는 플루오레세인 디아세테이트(fluorescein diacetate(FDA), Sigma사 제조) 와 에티디움 브로마이드(ethidium bromide(EB), Sigma사 제조)로 각각 확인하였다. 세포를 FDA/EB (5 μg/ml or 10 μg/ml) 용액으로 5분간 처리하여 37 ℃에서 배양한 후, PBS로 두 번 세척해 주었다. 죽은 세포는 EB의 핵 투과성에 의해 오렌지색으로 염색되었다. 살아있는 세포는 비형광의 FDA가 플루오레세인으로 변화하는 성질에 의하여 녹색으로 염색되었다. 염색이 끝난 후, 세포들을 형광 현미경을 이용하여 관찰하였다. RT-PCR 분석을 위해 배양된 세포를 PBS로 1회 세척 후에 트리졸 시약 (Trizol reagent, Sigma사 제조) 1 ㎖을 넣고 상온에서 10분간 반응 후, 세포를 파괴하여 세포의 내용물을 용출시켰다. 200 ㎕의 클로로포름(chloroform)을 넣고 15초 동안 인버트 (invert) 상태로 섞어준 다음 상온에서 15분간 반응하여 13,000 rpm, 15분, 4℃의 조건으로 원심 분리하여 DNA와 단백질부분을 제외한 상층액만을 회수하였다. 그 후 500 ㎕의 이소프로판올 (isopropanol)을 넣고 상온에서 10분간 반응시킨 후 13,000 rpm, 10 min, 4℃의 조건 하에서 원심 분리하여 펠렛 (pellet)을 세척 (washing)하였다. 그리고 75% EtOH 1 ㎖로 세척 (washing)하고 8,000 rpm, 5 min, 4℃의 조건 하에서 원심 분리한 다음 상층액을 제거하고 펠렛 (pellet)을 건조 시켰다. 그 후 RNA 저해용액 (DEPC water) 10 ul에 펠렛 (pellet)을 녹여 total RNA를 준비하였다. Total RNA로부터 cDNA를 합성하기 위하여 total RNA 1 ㎕(0.5~1 ㎍/㎕)와 5x PrimeScript Rt Master MiX(TAKARA, Japan)를 혼합하여 37℃에서 15분간, 85℃에서 5초 반응시켜 역전사효소(reverse transcriptase)를 불활성화 (inactivation) 한 후 4℃에서 방치 하였다. Quantitative PCR 분석을 통한 유전자 발현 분석을 위하여 합성된 cDNA를 SsoAdvanced Universal SYBR® Green supermix (Bio-Rad)를 이용하여 95℃ 30초, 95℃ 5초, 60℃ 10초, 72℃ 10초간 40 사이클을 증폭시킨 후, 65℃부터 95℃까지 30초에 0.5℃씩 증가시키면서 melt curve값을 얻고 gene expression analysis for chromo4 real-time PCR detection system(Bio-Rad)을 사용하여 분석하였다. 사용된 프라이머는 표 1에 표시하였다.

정량적, 반 정량적 PCR 프라이머

유전자	Forward primer	Reverse primer
GAPDH	GTC GGA GTC AAC GGA TTT GG	GGG TGG AAT CAA TTG GAA CAT
BAX	CAT GTT TTC TGA CGG CAA CTT C	AGG GCC TTG AGC ACC AGT TT
BCL2	CTT GAC AGA GGA TCA TGC TGT AC	GGA TGC TTT ATT TCA TGA GGC

세포 부착평가를 위해 24 well에 배양된 세포를 PBS로 1회 세척 후 4% 파라포름알데히드로 고정한 후 광학 현미경으로 분석을 실시 한 다음 팔로이딘 시약 (vector, USA)으로 염색한 후 형광 현미경으로 관찰하였다.

실시예 3. mPAE 이중 블록 공중합체를 이용한 pH 민감성 고분자가 코팅된 세포 배양 접시에서 배양된 세포의 분리 및 독성도, 치료인자 분비 확인 및 세포 재 부착 능력 확인

15cm 배양 접시에 1.0 x 10⁶세포를 균주 한 후, 20ml 세포 배양액을 첨가하고 5% CO₂ 및 95% 공기 분위기의 습식 배양기에서 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후 세포가 부착 배양된 배양 접시에 세포에 영향을 주지 않는 조건인 pH 6.0의 환경을 제공하여 pH 민감성 고분자를 선택적으로 이온화시켜 완전히 용해시킴으로써 배양된 세포를 배양접시로부터 온전하게 분리하였다. 분리된 세포를 실시예 2에서 사용한 RT-PCR을 기법을 이용하여 독성도 및 치료인자 분비 변화를 확인하였다. 사용된 프라이머는 표 2에 표시하였다. 분리된 세포를 일반 세포 24well에 배양 접시에 다시 균주하여 2시간 배양 후 배양된 세포를 PBS로 1회 세척 후 4% 파라포름알데히드로 고정하여 광학현미경으로 분석을 실시 한 후, 팔로이딘 시약 (vector, USA)으로 염색한 후 형광 현미경으로 관찰하였다. 대조군으로 기존 세포 분리 방법인 트립신을 사용하여 분리된 세포를 사용하였다.

정량적, 반 정량적 PCR 프라이머

유전자	Forward primer	Reverse primer
GAPDH	GTC GGA GTC AAC GGA TTT GG	GGG TGG AAT CAA TTG GAA CAT
BAX	CAT GTT TTC TGA CGG CAA CTT C	AGG GCC TTG AGC ACC AGT TT
BCL2	CTT GAC AGA GGA TCA TGC TGT AC	GGA TGC TTT ATT TCA TGA GGC
VEGF	GAG GGC AGA ATC ATC ACG AAG T	CAC CAG GGT CTC GAT TGG AT
FGF2	AGC GGC TGT ACT GCA AAA AC	GTA GCT TGA TGT GAG GGT CG

실시예 4.분리된 줄기세포의 창상치료 효능 평가

실시예 3에 따라 배양된 줄기세포를 15cm 배양 접시에 1.0 x 10⁶세포를 균주 한 후, 20ml 세포 배양액을 첨가하고 5% CO₂ 및 95% 공기 분위기의 습식 배양기에서 37℃에서 3일간 배양하였다. 3일 후 세포가 부착 배양된 배양 접시에 세포에 영향을 주지 않는 조건인 pH 6.5 PBS 10ml를 10분간 처리하여 pH 민감성 고분자를 선택적으로 이온화시켜 완전히 용해시킴으로써 배양된 세포를 배양접시로부터 온전하게 분리하였다. 분리된 세포에 세포 배양액 10ml 첨가 후 원심 분리를 통해 상등액을 제거하고,PBS로 1회 세척한 후,1.0 x 10⁶세포를 100ul 부피의 PBS에 분산하였다. 분리된 세포의 창상 치유 능력 확인을 위해 6주령 누드마우스를 자일라진(10mg/kg)과 케타민(100mg/kg)을 이용하여 마취 한 후, 등 피부를 2cm x 2cm로 제거하였다. 100ul 세포를 환부의 모서리에 각각 25ul씩 균주 하였다. 그 후 tegarderm (3M Health Care, St. Paul, MN, USA)을 환부에 부착 한 후, coban(3M)을 감아 환부를 보호하였다. 5일, 10일, 14일째 환부를 사진을 찍어 상처 재생면적을 확인하고 정량 하였다. 14일째에 쥐를 안락사 한 후 조직을 회수하였다. 회수한 조직의 절반을메스를 이용하여 잘게 다진 후 트리졸 용액을 처리하여 실시예2 에서 사용한 방법으로 cDNA를 얻었다. 그 후 실시예 2에서 사용한 RT-PCR을 기법을 이용하여 혈관 생성을 확인하였다. 사용된 프라이머는 표 3에 표시하였다. 나머지 절반의 조직은 4% 파라포름알데히드로 고정한 후, Optimal Cutting Temperature compound (Tissue-Tek, Sakura Finetk, Torrance, CA, USA)를 사용하여 포매(embedding)한 다음 10um의 두께로 박편하였다. 박편된 조직을 H&E염색을 실시하여 현미경으로 관찰하였다. 다음으로 박편된 조직을 Involucrin 항체(BioLegend, San Diego, CA)를 사용하여 염색한 후 형광 현미경을 통해 관찰하였다.

정량적, 반 정량적 PCR 프라이머

유전자	Forward primer	Reverse primer
Beta-actin	GGC TGT ATT CCC CTC CAT CG	CCA GTT GGT AAC AAT GCC ATG T
CD31	CAA ACA GAA ACC CGT GGA GAT G	ACC GTA ATG GCT GTT GGC TTC

모든 정량 데이터는 평균 ±표준편차로 나타내었으며, 통계적 분석은 Bonferroni test를 이용하여 analysis of variance (ANOVA)로 실시하였다. P < 0.05 인 값을 통계적으로 유의하다고 판단하였다.

실험예 1: mPAE 이중 공중합체의 pH 민감도 측정

본 발명에 따라 제조된 mPAE 이중 공중합체의 NaOH 수용액을 이용한 적정법에 의거하여 구한 pK_b 값을 형광 분광기(FL)에 의하여 측정하였다. 도 3에서 보는 바와 같이 pH 변화에 의한 마이셀-디마이셀 전이의 pK값을 확인할 수 있었다.

실험예 2: pH 민감성 고분자가 코팅된 세포 배양 접시에서 배양된 세포의 세포 부착능력 및 독성평가

pH 민감성 고분자가 코팅된 세포 배양 접시에 인간지방유래 줄기세포를 균주하여 24시간 배양한 후 세포 부착과 독성평가를 실시하였다(도 4). 먼저 광학 현미경을 이용하여 세포 부착모습을 관찰하였다. 고분자가 코팅되지 않은 세포 배양 접시와 비교하여 큰 차이를 보이지 않았다(도 4a). 다음으로 팔로이딘 염색을 통해 고분자에 대한 세포 부착 정도를 확인해 보았다. pH 민감성 고분자가 코팅된 접시위에 부착된 세포와 일반 세포 배양 접시 위에 부착된 세포에서 팔로이딘의 발현이 유사하게 나타나는 것을 확인하였다 (도 4b). 다음으로 세포 독성도를 live and dead 염색을 통해 확인해 보았다. 세포 배양 접시 및 pH 민감성 고분자가 코팅된 세포 배양 접시 위에서 배양된 세포 모두 죽은 세포에서 나오는 붉은색이 발현 되지 않고 살아있는 세포에서 나오는 녹색형광이 발현됨을 확인하였다(도 4c). 다음으로 세포 사멸 및 항 사멸인자의 유전자 발현을 RT-PCR로 확인하였다. 세포배양 접시 및 pH 민감성 고분자가 코팅된 세포에서 배양된 세포에서 항 세포사멸인자인 bcl2 및 사멸인자인 bax 유전자 발현에서 통계학적 차이가 나타나지 않았다(도 4d).

실험예 3: pH 민감성 고분자가 코팅된 세포 배양 접시에서 분리된 세포의 독성도, 세포 재 부착 및 치료인자 분비능력 평가

pH 민감성 고분자가 코팅된 세포배양 접시에서 24시간 동안 배양된 세포를 pH 6내지 6.5 PBS로 10분간 처리하여 세포를 세포 배양 접시로부터 분리하였다. 분리 된 세포를 광학사진으로 관찰하였다. 대표적으로 세포를 세포 배양접시로부터 분리하는데 사용되는 트립신을 이용한 세포를 대조군으로 사용하였다. 트립신을 사용하여 분리한 세포와 pH 6 내지 6.5 PBS를 사용하여 분리한 세포 사이에 외관상 차이는 나타나지 않았다(도 5a). 다음으로 세포 사멸 및 항 사멸인자, 그리고 혈관생성인자 의 유전자 발현을 RT-PCR로 확인하였다. pH 6 내지 6.5 PBS를 사용하여 분리한 세포에서 항 세포사멸인자인 bcl2 및 사멸인자인 bax 유전자발현이 감소하였다(도 5b). 반면에 혈관생성인자 유전자 발현은 두 군간에 차이가 나타나지 않았다(도 5c). 트립신 및 pH 변화로 분리된 세포를 일반 세포배양 접시에 균주 하여 2시간 배양 후 세포 부착을 관찰하였다. 트립신 및 pH 변화로 분리된 세포는 일반 세포 배양 접시에 잘 부착 되었으며(도 5d), 각각 부착된 세포에서 팔로이딘 발현이 유사하게 나타나는 것을 확인하였다(도 5e).

실험예 4: 분리된 세포를 이용한 상처치유 효과 평가

6주령 누드마우스를 자일라진(10mg/kg)과 케타민(100mg/kg)을 이용하여 마취 한 후, 등 피부를 2cm x 2cm로 제거하였다. 트립신 혹은 pH 6 내지 6.5의 PBS로 분리된 세포 1.0 x 10⁶을 100ul 부피의 PBS에 분산한 후, 피부 창상 환부의 모서리에 각각 25ul씩 균주 하였다. 이후 14일간 피부 환부 상처치유를 관찰하여 재생 면적을 측정하여 정량 하였다. 10일 동안의 관찰에서 처치를 하지 않은 군 (무처리군), 트립신을 이용해 분리된 세포를 넣은 군 (TCP), 그리고 pH 6 내지 6.5 PBS를 이용해 분리된 세포를 넣은 군(mPAE)간의 피부 재생면적은 통계학적으로 유의한 차이를 보여 주지 못했다(도 6a,b). 그러나 14일째 TCP 및 mPAE군에서 무처리군보다 피부 재생면적이 증가하였다(도 6a,b). 다음으로 H&E와 involucrin 면역 염색을 통해 피부 조직의 재생 정도를 평가하였다. 도 6에서 보였던 것처럼 14일째에 TCP와 mPAE군에서 무처리군 보다 피부재생이 잘 일어 난 것을 확인할 수 있었으며(도 7a),특히 무처리군에서는 involucrin 발현이 나타나지 않은 반면 TCP와 mPAE군 에서는 involucrin이 발현됨을 확인할 수 있었다(도 7a). 다음으로 혈관생성 유전자 발현을 RT-PCR을 통해 확인하였다. TCP와 mPAE군에서 혈관생성이 무처리군보다 많이 일어난 것을 확인 할 수 있었다 (도 7b).

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY FOUNDATION FOR CORPORATE COLLABORATION <120> A pH-sensitive block copolymer and its use for cell culture <130> PN1808-283 <160> 14 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> GAPDH forward primer <400> 1 gtcggagtca acggatttgg 20 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> GAPDH reverse primer <400> 2 gggtggaatc aattggaaca t 21 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> BAX forward primer <400> 3 catgttttct gacggcaact tc 22 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> BAX reverse primer <400> 4 agggccttga gcaccagttt 20 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> BCL2 forward primer <400> 5 cttgacagag gatcatgctg tac 23 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> BCL2 reverse primer <400> 6 ggatgcttta tttcatgagg c 21 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> VEGF forward primer <400> 7 gagggcagaa tcatcacgaa gt 22 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> VEGF reverse primer <400> 8 caccagggtc tcgattggat 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> FGF2 forward primer <400> 9 agcggctgta ctgcaaaaac 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> FGF2 reverse primer <400> 10 gtagcttgat gtgagggtcg 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Beta-actin forward primer <400> 11 ggctgtattc ccctccatcg 20 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Beta-actin reverse primer <400> 12 ccagttggta acaatgccat gt 22 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> CD31 forward primer <400> 13 caaacagaaa cccgtggaga tg 22 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> CD31 reverse primer <400> 14 accgtaatgg ctgttggctt c 21

Claims

제1블록의 폴리(β-아미노 에스터) 1올리고머 및 제2블록의 pH 민감성 고분자로서, 폴리(β-아미노 에스터) 2올리고머를 공중합한 이중 블록 공중합체로서 상기 제1블록의 폴리(β-아미노 에스터) 1올리고머는 비스아크릴레이트 계열 화합물과 아미노알킬알코올계 화합물로 구성된 것이며, 상기 제2블록의 폴리(β-아미노 에스터) 2올리고머는 비스아크릴레이트 계열 화합물과 2차 아민을 함유한 디아민 화합물로 구성된 것인, 이중 블록 공중합체.
삭제
삭제
제1항에 있어서,
상기 이중 블록 공중합체는 pH 7.0 이하에서 이온화되는 3차 아민기를 포함하는 것을 특징으로 하는, 이중 블록 공중합체.
제1항에 있어서,
상기 이중 블록 공중합체의 수 평균 분자량은 300 내지 15,000 g/mol인 것을 특징으로 하는, 이중 블록 공중합체.
제1항에 있어서,
상기 이중 블록 공중합체의 제1블록 및 제2블록의 분자량의 비율은 1:1 내지 1:4인 것을 특징으로 하는, 이중 블록 공중합체.
제1항의 이중 블록 공중합체를 포함하는 세포 배양용 조성물.
제1항의 이중 블록 공중합체를 유기용매에 용해시킨 고분자 용액을 준비하는 제 1단계;
상기 고분자 용액을 세포 배양용 구조체의 표면에 처리하는 제 2단계;
상기 제 2단계로부터 수득한 세포 배양용 구조체에 세포를 배양하는 제 3단계; 및
상기 세포 배양용 구조체를 pH 를 7 이하로 조정된 용액에 침지하여 배양용 구조체로부터 고분자 용액을 제거하여 세포를 수득하는 제 4단계를 포함하는 세포의 배양 방법.
제8항에 있어서,
상기 세포는 부착성 세포인 것을 특징으로 하는, 세포의 배양 방법.
제8항에 있어서,
상기 세포 배양용 구조체는 플레이트, 용기, 막(membrane), 미세담체(microcarrier), 실관(hollow fiber), 세라믹 매트릭스(ceramic matrix), 비드(bead), 미세캡슐(microencapsule), 스캐폴드(scaffold)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 세포의 배양 방법.
제1항의 이중 블록 공중합체 및 제8항의 배양 방법에 의해 배양된 세포를 포함하는, 조직 재생용 조성물.
제1항의 이중 블록 공중합체 및 제8항의 배양 방법에 의해 배양된 세포를 포함하는, 상처 치료용 조성물.
제11항 또는 제12항의 조성물을 포함하는 치료제.
제13항에 있어서, 상기 치료제는, 붕대, 스테리-스트립(steri-strip), 봉합사(sature), 스테이플(staple), 또는 이식 조직(graft), 의료용 이식 조직편(medical implant), 생체-공학적 물질, 조직-공학처리된 스캐폴드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 치료제.