KR102070269B1 - 지혈용 다공성 스펀지 및 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 지혈용 다공성 스펀지 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 오리 발로부터 유래한 콜라겐과 실크를 혼합하여 제조할 수 있고, 지혈 특성 및 응고 특성이 우수한 지혈용 다공성 스펀지 및 그 제조방법에 관한 것이다. 이를 위해, 지혈용 다공성 스펀지는 콜라겐-실크 하이브리드 구조체를 포함하는 것을 특징으로 한다.

Description

지혈용 다공성 스펀지 및 그 제조방법{POROUS SPONGE FOR HEMOSTASIS AND MANUFACTURING METHOD THEREOF}

본 발명은 지혈용 다공성 스펀지 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 오리 발로부터 유래한 콜라겐과 실크를 혼합하여 제조할 수 있고, 지혈 특성 및 응고 특성이 우수한 지혈용 다공성 스펀지 및 그 제조방법에 관한 것이다.

지혈은 모든 수술 과정에서 중요한 역할을 한다. 좋은 외과 기술의 기본은 출혈의 최소화이며, 현대 외과의사는 이러한 노력을 돕기 위해 다양한 약제와 도구를 가지고 있는데, 국소 지혈제는 출혈을 감소시키고 수술 사망률을 감소시키는 데 효과적이다. 따라서 이러한 지혈제의 발전은 병력(medical history)의 중요한 주제이다.

지난 수 십년 동안 다양한 지혈제의 수가 크게 증가했다. 출혈의 유형, 약제의 정확한 작용 기작, 비용 및 유용성은 가장 적합한 약제를 선택하는 고려사항이다. 이상적인 지혈제는 매우 효과적이고 사용하기 쉬우며 살균, 안정적, 비면역적, 생분해성 및 비용 효과가 있어야 한다. 콜라겐 및 콜라겐 섬유, 산화 셀룰로오스, 섬유 단백질 및 산화 재생 셀룰로오스, 알긴산 염, 의료용 지혈제 젤라틴 및 키토산(CS)이 일반적으로 흡수성 지혈제로 사용된다. 또한, QuikClot, QuikClot ACS⁺(Z-Medica), HemCon, 자체 확장 지혈 폴리머(self-expanding hemostatic polymer, SEHP), WoundStat(Marum Polymer Technologies Inc), CombatGauze(Z-Medica), FastAct/SeraSeal(Wortham Labs Inc.) 및 TraumaDex와 같은 여러 가지 지혈제가 미국 식품 의약품 안전청(FDA) 및 적합성 유로피안(CE) 승인을 받았다. 그러나 이러한 인공 지혈제는 발열 반응이나 생분해성이 좋지 않고, 전염 인자 전달의 위험, 말단 혈전증의 형성, 알레르기 반응의 염려 등의 문제가 있다.

콜라겐 기반 제품은 지혈제 시장에서 최근에 개발되고 승인된 제품이다. 활성 마이크로피브릴 콜라겐 지혈제로서, 소 콜라겐에서 유래된 아비텐(Avitene)은 1970년대 초 미국에서 처음 소개되었다. Avitene은 가루 형태로 처음 출시되었으며 지금도 가루 형태로 일반적으로 사용되나, 최근에는 부직포 소재 및 스폰지 형태로 확대되었다. 가장 최근에 추가된 Avitene Ultra foam Collagen은 스폰지 형태로 2000년 5월에 미국 FDA의 승인을 받았다. Avitene은 혈소판 응집 및 섬유소 형성 단백질의 방출을 통해 응고 형성을 촉진하는 것으로 입증되었다. 하지만, Avitene이 성공적인 지혈제로 사용 되더라도 농양 형성, 혈종, 창상 열개, 알레르기 반응 및 이물 반응을 포함한 감염을 강화시키는 것과 같은 몇 가지 제한사항이 존재한다.

한편, 시판되는 콜라겐 계열 재료는 일반적으로 소 및 돼지에서 유래한다. 소 기원의 콜라겐은 소 해면상 뇌증(BSE)과 전염성 해면상 뇌증(TSE)의 전염과 관련이 있다. 돼지 콜라겐은 일부 종교 공동체에서 윤리적인 우려를 불러 일으킬 수 있다.

따라서, 생리적 문제, 윤리적 문제 등을 극복하기 위하여 훨씬 더 안전한 콜라겐을 얻으면서도 기존의 콜라겐 지혈제와 동일 또는 보다 우수한 성능을 가지는 지혈제에 대한 개발이 요구되고 있다.

대한민국 공개특허공보 제10-2016-0087033호

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 본 발명의 목적은 오리 발로부터 유래한 콜라겐과 실크를 혼합하여 제조할 수 있고, 지혈 특성 및 응고 특성이 우수한 지혈용 다공성 스펀지 및 그 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 상기 및 다른 목적과 이점은 바람직한 실시예를 설명한 하기의 설명으로부터 분명해질 것이다.

상기 목적은, 콜라겐-실크 하이브리드 구조체를 포함하는 지혈용 다공성 스펀지에 의해 달성될 수 있다.

이때, 콜라겐은, 동물로부터 유래된 콜라겐일 수 있고, 오리 발로부터 유래된 콜라겐인 것이 바람직하다.

또한, 상기 목적은, 동물성 콜라겐을 산 용액에 용해하여 콜라겐 용액을 제조하는 제1단계; 실크 용액을 콜라겐 용액과 혼합하여 콜라겐-실크 혼합 용액을 제조하는 제2단계; 및 콜라겐-실크 혼합 용액을 동결 건조하여 콜라겐-실크 하이브리드 다공성 스펀지를 제조하는 제3단계;를 포함하는 지혈용 다공성 스펀지 제조방법에 의해 달성될 수 있다.

제1단계에서, 동물성 콜라겐은 오리 발로부터 유래한 콜라겐일 수 있고, 콜라겐 용액은 2~5% w/v(g/ml)인 것이 바람직하다.

제2단계에서, 실크 용액과 콜라겐 용액은 1:1의 부피비로 혼합할 수 있고, 제3단계에서, 콜라겐-실크 혼합 용액은 영하 70~90℃에서 12~48시간 동안 동결 건조할 수 있다.

본 발명에 따르면, 콜라겐과 실크를 혼합하여 사용함으로써 다공성이 크고, 지혈 특성 및 응고 특성이 우수하다는 효과를 가진다.

또한, 오리 발로부터 유래한 콜라겐을 사용함으로써 기존에 소 또는 돼지로부터 유래한 콜라겐을 사용함에 따라 발생하는 전염 또는 감염과 같은 생리적 문제 또는 윤리적 문제를 극복할 수 있는 효과를 가진다.

다만, 본 발명의 효과들은 이상에서 언급한 효과로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

도 1은 실시예 및 비교예의 광 디지털 사진과 SEM 이미지를 나타낸 도면이다. A, C, E, G는 각각 Avitene(비교예 1), DFC(비교예 2), Silk(비교예 3), DFC/Silk(실시예)의 외부 형태이고, B, D, F, H는 각각 Avitene(비교예 1), DFC(비교예 2), Silk(비교예 3), DFC/Silk(실시예)의 SEM 이미지이다(Scale Bar: 1 mm).
도 2는 실시예 및 비교예의 FTIR 스펙트럼을 나타낸 도면이다.
도 3은 실시예 및 비교예의 다공성(A)과 물 흡수도(B)을 나타낸 그래프이다.
도 4는 실시예 및 비교예의 1, 3, 5일 동안 세포 독성을 평가한 그래프이다.
도 5는 실시예 및 비교예의 전혈 응고 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 실시예 및 비교예의 대퇴 동맥 상처의 지혈 효과를 나타낸 사진이다. A, E는 Avitene(비교예 1)의 전과 후, B, F는 DFC(비교예 2)의 전과 후, C, G는 Silk(비교예 3)의 전과 후, D, H는 DFC/Silk(실시예)의 전과 후를 비교한 사진이다.

이하, 본 발명의 실시예와 도면을 참조하여 본 발명을 상세히 설명한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위해 예시적으로 제시한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가지는 자에 있어서 자명할 것이다.

또한, 달리 정의하지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 가지며, 상충되는 경우에는, 정의를 포함하는 본 명세서의 기재가 우선할 것이다.

도면에서 제안된 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다. 그리고, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 또한, 명세서에서 기술한 "부"란, 특정 기능을 수행하는 하나의 단위 또는 블록을 의미한다.

각 단계들에 있어 식별부호(제1, 제2, 등)는 설명의 편의를 위하여 사용되는 것으로 식별부호는 각 단계들의 순서를 설명하는 것이 아니며, 각 단계들은 문맥상 명백하게 특정 순서를 기재하지 않는 이상 명기된 순서와 다르게 실시될 수 있다. 즉, 각 단계들은 명기된 순서와 동일하게 실시될 수도 있고 실질적으로 동시에 실시될 수도 있으며 반대의 순서대로 실시될 수도 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 지혈용 다공성 스펀지는 콜라겐-실크 하이브리드 구조체를 포함한다. 콜라겐-실크 하이브리드 구조체는 콜라겐 용액과 실크 용액을 혼합한 후, 이를 동결 건조함으로써 형성되는 복합 구조체로, 본 발명은 다공성이 큰 콜라겐-실크 하이브리드 구조체를 포함함으로써 지혈 특성 및 응고 특성이 우수한 효과를 가진다.

일 실시예에 있어서, 콜라겐은 동물로부터 유래된 동물성 콜라겐을 사용할 수 있으나, 감염 또는 전염과 같은 생리적 문제나 윤리적 문제를 극복하기 위하여 오리 발로부터 유래된 콜라겐을 사용하는 것이 바람직하다. 오리 발로부터 유래된 콜라겐은 오리 발의 뼈를 제거한 후, 껍질과 함께 작은 크기로 세절한 후 영하 20℃ 이하에서 급냉시키는 원료 전처리 단계; 수산화나트륨을 이용하여 표백 및 과도한 지방을 제거하는 단계; 산 및 염화나트륨을 이용하여 가용성 콜라겐 추출물을 제조하는 단계; 추출에 사용한 염을 제거하는 탈염단계; 및 이를 농축 건조하여 콜라겐 함유 건조물을 얻는 건조단계;를 통해 수득할 수 있다.

일 실시예에 있어서, 실크(silk)는 누에나방 벌레(Bombyx mori silk-worm)에서 추출한 천연 섬유상 중합체로, 피브로인(fibroin)과 세리신(sericin)의 두 가지 단백질로 이루어져 있다. 실크는 콜라겐과 혼합되어 다공성을 증가시키고, 지혈 특성 및 응고 특성을 향상시킬 뿐만 아니라 기계적 특성을 향상시킬 수 있다. 특히, 실크 단백질의 주성분인 피브로인은 뛰어난 인장 강도, 적은 항원성, 비 염증성 특성 및 조절 가능한 생물 분해성 등으로 인해 생의학 분야에서 다양하게 활용되고 있고, 따라서 실크는 주성분인 피브로인(실크 피브로인이라 한다)만을 사용하는 것이 더욱 바람직하다.

다음으로, 지혈용 다공성 스펀지 제조방법에 대해 설명한다. 이를 설명하는데 있어 상술하여 중복된 부분에 있어서는 그 설명을 생략하도록 한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 지혈용 다공성 스펀지 제조방법은 동물성 콜라겐을 산 용액에 용해하여 콜라겐 용액을 제조하는 제1단계; 실크 용액을 콜라겐 용액과 혼합하여 콜라겐-실크 혼합 용액을 제조하는 제2단계; 및 콜라겐-실크 혼합 용액을 동결 건조하여 콜라겐-실크 하이브리드 다공성 스펀지를 제조하는 제3단계;를 포함한다. 본 발명은 동물성 콜라겐과 실크를 혼합한 후 동결건조하여 다공성이 큰 콜라겐-실크 하이브리드 구조체를 형성함으로써 지혈 특성 및 응고 특성이 우수한 지혈용 다공성 스펀지를 제조할 수 있다.

일 실시예에 있어서, 제1단계는 동물성 콜라겐을 산 용액에 용해하여 콜라겐 용액을 제조하는 단계로, 산 용액은 염산과 같은 다양한 산 용액을 사용할 수 있다. 동물성 콜라겐은 감염 또는 전염과 같은 생리적 문제나 윤리적 문제를 극복하기 위하여 오리 발로부터 유래된 콜라겐을 사용하는 것이 바람직하고, 콜라겐 용액은 콜라겐을 산 용액에 용해하여 2~5% w/v(g/ml)의 농도로 형성하는 것이 바람직하다.

일 실시예에 있어서, 제2단계는 실크 용액을 제1단계에서 제조한 콜라겐 용액과 혼합하여 콜라겐-실크 혼합 용액을 제조하는 단계로, 실크 용액과 콜라겐 용액은 1:1의 부피비로 혼합하는 것이 바람직하다. 실크 용액은 실크 단백질을 염화칼슘, 물, 에탄올이 혼합된 혼합용매에 용해시킨 것을 의미한다. 실크 단백질의 주성분인 피브로인은 뛰어난 인장 강도, 적은 항원성, 비 염증성 특성 및 조절 가능한 생물 분해성 등으로 인해 생의학 분야에서 다양하게 활용되고 있고, 피브로인의 이러한 장점으로 인해 실크 용액은 실크 단백질에서 세리신 단백질과 불순물을 제거한 실크 피브로인 단백질을 상기 혼합용매에 용해한 실크 피브로인 용액을 사용하는 것이 바람직하다.

일 실시예에 있어서, 제3단계는 제2단계에서 제조한 콜라겐-실크 혼합 용액을 동결 건조하여 콜라겐-실크 하이브리드 다공성 스펀지를 제조하는 단계로, 콜라겐-실크 혼합 용액을 영하 70~90℃에서 12~48시간 동안 동결 건조하여 수분을 제거하는 것이 바람직하다.

또한, 제3단계 이후에, 콜라겐-실크 하이브리드 다공성 스펀지를 글루타르알데하이드 수용액(glutaraldehyde solution)에 12~36시간 동안 침지하는 단계; 콜라겐-실크 하이브리드 다공성 스펀지를 꺼내어 탈염수 또는 증류수로 세척하는 단계; 세척된 콜라겐-실크 하이브리드 다공성 스펀지를 글리신(glycine) 수용액에 침지하는 단계; 및 콜라겐-실크 하이브리드 다공성 스펀지를 꺼내어 탈염수 또는 증류수로 세척한 후, 영하 80~100℃에서 12~24시간 동안 동결 건조하는 단계;를 더 포함할 수 있고, 이를 통해 제조된 지혈용 다공서 스펀지의 기계적 특성 등을 향상시킬 수 있다.

이하, 구체적인 실시예와 비교예를 통하여 본 발명의 구성 및 그에 따른 효과를 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나, 본 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[제조예]

재료준비

오리 발로부터 유래된 콜라겐(Duck 's feet derived collagen, DFC)은 세원 셀론텍(Sewon Cellontech, 서울)에서 구입하였고, NIH3T3 섬유 아세포는 ATCC(Manassas, VA, USA)로부터 구입하였다. Welgene, Fresh MediaTM(Dalseogu, Daegu, Korea)에서 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM), FBS(fetal bovine serum), 항생제/항균제(A/A) 및 트립신을 구입하였다. 세포 계수 키트-8(CCK-8)은 EnzoLifeSciences(Switzerland)에서 구입하였다.

실크 피브로인 용액 준비

Bombyx mori의 누에고치를 0.02M Na₂CO₃ 수용액에서 30분 동안 100℃로 가열하고, 증류수로 3회 반복 세척하여 세리신 단백질과 불순물 등을 제거하여 순수한 실크 피브로인을 얻었다. 정련된 실크 피브로인은 CaCl₂:H₂0:EtOH = 1:8:2 mol 비의 혼합 용매에 98℃에서 1시간 동안 용해시킨 다음 증류수에서 72시간 동안 투석하여 순수한 실크 피브로인 용액(SF)을 제조하였다. 제조된 실크 피브로인의 최종 농도는 6 wt%였다.

[실시예]

DFC를 0.1M 염산(HCl)에 녹인 후 1M 수산화나트륨(NaOH)으로 중화시켜 3%(w/v)의 콜라겐 용액을 제조하였다. 실크 피브로인 용액(SF) 20ml와 콜라겐 용액 20ml를 혼합하고, 페트리 접시에 40ml를 부었다. 영하 80℃에서 12시간 동안 동결한 후, 24시간 동안 동결건조하여 지혈용 다공성 스펀지를 제조하였다. 다공성 스펀지를 95% 에탄올(EtOH)에 희석시킨 0.25% v/v 글루타르알데하이드(glutaraldehyde) 수용액에 24시간 동안 침지한 후, 꺼내어 증류수로 2, 3번 세척하고, 이어서 0.1M 글리신(glycine) 수용액에 24시간 동안 침지한다. 이 후, 다공성 스펀지를 꺼내어 증류수로 충분히 세척한 후, 영하 80℃에서 12시간 동안 동결한 뒤, 동결 건조하여 콜라겐-실크 하이브리드 구조체를 포함하는 지혈용 다공성 스펀지(실시예, DFC/Silk)를 제조하였다.

[비교예 1]

시중에 판매되는 Avetene을 구입하였고, 이를 비교예 1(Avetene)로 하였다.

[비교예 2]

DFC를 0.1M 염산(HCl)에 녹인 후 1M 수산화나트륨(NaOH)으로 중화시켜 3%(w/v)의 콜라겐 용액을 제조하고, 페트리 접시에 40ml를 부었다. 영하 80℃에서 12시간 동안 동결한 후, 24시간 동안 동결건조하여 지혈용 다공성 스펀지를 제조하였다. 다공성 스펀지를 95% 에탄올(EtOH)에 희석시킨 0.25% v/v 글루타르알데하이드(glutaraldehyde) 수용액에 24시간 동안 침지한 후, 꺼내어 증류수로 2, 3번 세척하고, 이어서 0.1M 글리신(glycine) 수용액에 24시간 동안 침지한다. 이 후, 다공성 스펀지를 꺼내어 증류수로 충분히 세척한 후, 영하 80℃에서 12시간 동안 동결한 뒤, 동결 건조하여 콜라겐 구조체를 포함하는 지혈용 다공성 스펀지(비교예 2, DFC)를 제조하였다.

[비교예 3]

상기 제조예의 실크 피브로인 용액을 페트리 접시에 40ml 부은 후, 영하 80℃에서 12시간 동안 동결 건조하였다. 이어서, 실크 지지체 가교를 위해 100%부터 50%(100, 90, 80, 70, 50%)의 에탄올 용액(에탄올과 물의 혼합 부피비로서, 80%의 경우, 에탄올:물을 80:20의 부피비로 혼합한 것을 의미함)에 각각 한 시간씩 침지시킨 후, 탈염수로 세척하고, 동결 건조하여 다공성 스펀지(비교예 3, Silk)를 제조하였다.

[실험예]

외관 관찰

실시예 및 비교예의 구조를 관찰하기 위해 각 스펀지를 1cm x 1cm의 정사각형 크기로 만들고, Au-Pd로 코팅 후, 주사전자현미경(VP-FESEM)으로 관찰하였으며, 이를 도 1(스케일 바(scale bar)는 1mm)에 나타내었다. 주사전자현미경 관찰은 기초과학연구원(춘천)에서 이루어졌다.

총체적인 이미지로부터 모든 스펀지에서 다공 구조를 형성하는 것을 확인하였다. Avitene과 DFC 스펀지 모두 비결정 상호 연결 기공 모양을 나타내 었으며, 실크 스펀지는 스트립형 구조를 나타내었다. DFC/Silk 스펀지는 다른 스펀지보다 큰 기공 크기를 나타내어 DFC에 실크를 첨가하면 보다 큰 다공성 구조의 하이브리드 스펀지가 형성됨을 알 수 있었다. 그러나 DFC 기반 스펀지는 다른 스펀지보다 균일하게 상호 연결된 세공 분포를 보였다.

FTIR 스펙트럼 관찰

실시예 및 비교예의 구조 분석을 위해 ATR-FTIR 측정장치(GX PerkinElmer Inc., USA)를 이용하여 정석분석하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 스펙트럼 범위는 2000~1000 cm^-1 였다.

Avitene의 FTIR 스펙트럼은 아미드 Ⅰ 및 Ⅱ 밴드(1653 및 1547 cm^{- 1})에서 강한 피크를 보였다. DFC는 훨씬 넓은 아미드 Ⅰ 및 Ⅱ 밴드(1650 및 1553 cm^{- 1})를 나타내었다. Avitene과 DFC의 차이는 소 콜라겐과 오리 발 콜라겐의 구조적 차이 때문인 것으로 보인다. 또는 콜라겐의 추출 방법에 따라 달라질 수도 있다고 예상된다. Silk는 1628과 1520 cm^-1에서 강한 흡수 피크를 나타내었다. DFC/Silk는 1629 cm^-1(아미드 Ⅰ) 및 1523 cm^-1(아미드 Ⅱ)에서 흡수 밴드를 보였다.

다공성(공극률) 및 물 흡수도 확인

실시예 및 비교예의 물 흡수도를 확인하기 위하여 건조상태의 스펀지의 무게를 측정하였다(W_d). 그 다음 스펀지를 증류수에 3시간 동안 침지시킨 후, 충분히 침지된 스펀지 표면의 증류수를 제거하고 무게를 측정하였다(W_s). 물 흡수도는 하기 수학식 1을 통해 계산하였고, 그 결과는 도 3(A)에 나타내었다.

[수학식 1]

또한, 실시예 및 비교예의 공극률을 측정하기 위하여 액체 치환법(liquid displacement process)을 사용하였다. 일정 부피의 증류수(V₁)에 스펀지를 10분 동안 침지하였다. 그 다음 스펀지가 침지된 증류수의 부피를 확인하였다(V₂). 침지되어있던 스펀지를 제거한 후, 남은 증류수의 부피를 측정하였다(V₃). 공극률(P)은 하기 수학식 2를 통해 계산하였고, 그 결과는 도 3(B)에 나타내었다.

[수학식 2]

도 3의 값은 평균±표준편차(n=3)으로 표현되었고, Avitene 및 DFC와 비교하여 *p< 0.05이고, **p< 0.01이다.

다공성은 생물학적 스펀지에서 중요한 역할을 하는데, DFC/Silk 스펀지는 다른 스펀지보다 높은 다공성(73.79±5.380)을 보여 주었으며, 이를 통해 실크의 첨가가 DFC 스펀지의 다공성에 중요한 영향을 미친다는 것을 알 수 있었고, 이러한 결과는 스펀지의 단면 SEM 이미지와 일치하였다.

물 흡수도 역시 지혈 및 상처 드레싱 재료 평가에서 중요한 요소로서, 조사한 모든 스펀지의 수분 섭취량은 약 90%였으며, 이를 통해 실크가 DFC 스펀지의 물 흡수도에 특별한 영향을 미치지 않았다는 것을 알 수 있었다.

CCK-8 분석법에 의한 세포 생존력 평가

실시예 및 비교예의 멸균된 스펀지를 직경 8mm의 원형으로 규격화 한 다음 NIH 3T3 섬유아세포를 1개의 well에 2 x 10⁴개의 밀도로 파종하였다. 각 스펀지를 Transwell culture system의 바닥부분에 위치시킨 후, transwell culture system을 세포 배양 배지에 옮겨 1, 3, 5일간 배양하였다. 각 기간별로 배양액 : CCK-8 용액을 9 : 1 부피비로 혼합하여 넣고, 2시간 동안 배양(incubation)하였다. ELISA microplate reader(Molecular Devices, SpectraMax^® Plus 384, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였고, 이를 도 4에 나타내었다. 도 4의 값은 평균±표준편차(n=3)으로 표현되었다.

NIH3T3 섬유아세포는 세포 성장을 점차적으로 증가하였고, 이는 각 스펀지가 세포 정장에 적절한 환경을 제공하였다는 것을 의미한다. 모든 스펀지는 배양기간(incubation time) 동안 유사한 성장 패턴을 보였다. 이 결과로부터, 각 스펀지는 모두 유독한 효과가 없다는 것을 알 수 있었다.

전혈 응고 실험(The whole blood clotting experiment)

실시예 및 비교예를 0.5cm x 0.5cm의 크기로 준비하여 0.2ml의 쥐 혈액을 떨어뜨리고 튜브에 위치시킨 후, 20㎕의 CaCl₂ 용액(0.2M)을 떨어뜨려 응고시켰다. 37℃에서 30rpm 속도로 10분간 반응시킨 후, 25ml의 증류수를 튜브에 넣어 혈전이 생성되지 않은 적혈구를 용해시켰다. 음성 대조군(Negative control)은 0.2ml 혈액에 25ml을 증류수를 넣은 것을 준비하였다. 540nm에서 헤모글로빈 용액의 흡광도(D_s)를 측정하였고, 540nm에서 0.2ml의 용혈된 전혈의 흡광도(D_o)를 측정하였다. 혈액 응고 지수(blood clotting index(BCI))는 하기 수학식 3을 통해 계산하였고, 그 결과는 도 5에 나타내었다. 도 5의 결과는 평균±표준편차(n=3)으로 표현되었고, Avitene 및 DFC와 비교하여 *p< 0.05이고, **p< 0.01이다.

[수학식 3]

BCI = D_s/D_o

여기에서, D_s는 헤모글로빈 용액 흡광도를 의미하고, D_o는 용혈된 전혈의 흡광도를 의미한다. BCI 값은 응고 인자에 갇혀 있지 않은 자유로운 적혈구를 반영하고, 낮은 BCI 값은 더 좋은 응고 형성 용량을 의미한다.

Avitene, DFC 및 Silk의 BCI 값은 각각 0.045±0.0024, 0.0519±0.0069 및 0.051±0.0024로 측정되었다. 반면, DFC/Silk 스펀지는 0.0329±0.0034의 가장 낮은 BCI 값으로 측정되었다. 이는 DFC/Silk 스펀지가 다른 모든 스펀지보다 혈액 응고 능력이 가장 우수함을 의미한다. 또한, 이 결과로부터, 실크 섬유를 DFC에 첨가하면 DFC 스펀지의 혈액 응고 능력이 증가된다는 것을 알 수 있다. 콜라겐 섬유는 혈소판의 부착, 응고 인자 결합을 촉진하고 빠른 응고 형성을 유도하는 물리적 성능을 제공하는 것으로 알려져 있는데, 여기에 실크 섬유를 혼합함으로써 체외에서 혈액 응고 능력을 증가시킬 수 있다는 것을 알 수 있었다.

대퇴 동맥 지혈 실험(The femoral artery hemorrhage rat model)

실시예 및 비교예의 지혈 실험은 체중 250~300g의 수컷 Sprague-Dawley 종 백서를 실험동물로 사용하였다. 동물실은 25±1℃의 온도로 조절하고, 명암은 주야 12시간 자동 조절하였다. 또한 사료와 물은 자유롭게 섭취하도록 하고 모든 실험동물은 1 주 동안 동물실 환경에 적응 시킨 후 실험에 사용하였다. 3% 이소프루란(isoflurane)을 이용하여 백서의 호흡마취를 유도하였다. 각각의 백서의 편측 서혜부를 절개하여 대퇴 동맥과 대퇴 정맥을 노출시킨 후 수술용 매스를 이용해 혈관을 절단하여 출혈을 유발하였다. 1cm x 1cm 크기의 스펀지를 출혈 부위에 덮고 5N의 일정한 압력을 가하기 위해 인장 압축 시험기(Digital Push Pull Gauge^®, SUNDOO, China)를 이용하여 30 초간 눌러 지혈 효과를 관찰하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

혈액 흡수율은 각각 Silk, Avitene, DFC/Silk 및 DFC 순이었다. 도 6의 E에서, 출혈은 Avitene으로 치료한 후 완전히 중단되었고, 출혈 부위가 깨끗한 것으로 관찰되었다. 상처가 DFC 스펀지로 덮였을 때는, 실험 시간 동안 지혈 완료가 이루어지지 않았다(B, F). 유사하게, 상처가 실크 스펀지로 처리되었을 때에도 출혈은 완전히 멈추지 않았다(C, G). 반면, DFC/Silk 스펀지의 경우, 투명한 부상 부위로 출혈이 완전히 중단됨을 관찰할 수 있었다(D, H). 이로부터, DFC에 실크를 혼입하면 DFC 스펀지의 생체 내 지혈 특성이 증가한다는 것을 알 수 있었다.

Graphpad Prism 7.0을 사용하여 상기 실험예의 모든 통계 데이터를 분석하였고, 모든 통계는 ANOVA 및 post hoc Bonferroni 테스트를 사용하여 평가되었다. 모든 데이터는 평균±표준 편차로 나타내었고, p<0.05는 통계적 유의성을 나타내는 것으로 간주되었다.

상기 실험예를 통해, DFC/Silk 스펀지(실시예)는 다른 모든 스펀지보다 더 큰 상호 연결된 기공의 구조적 특성을 가지고 있다는 것을 알 수 있었고, SF의 혼입은 DFC 스펀지의 다공성을 현저히 증가시켰지만 물 흡수도를 변화시키지 않았다는 것을 알 수 있었다. 또한, 전혈 응고 실험의 결과로부터 DFC/Silk 스펀지가 시험 관내에서 Avitene보다 우수한 응고 능력을 나타낸다는 것을 알 수 있었고, 쥐의 대퇴 동맥 출혈 실험으로부터, DFC 기반 스펀지는 Avetene과 지혈 능력이 유사함을 알 수 있었다.

본 명세서에서는 본 발명자들이 수행한 다양한 실시예 가운데 몇 개의 예만을 들어 설명하는 것이나 본 발명의 기술적 사상은 이에 한정하거나 제한되지 않고, 당업자에 의해 변형되어 다양하게 실시될 수 있음은 물론이다.

Claims (9)

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4. 오리 발로부터 유래된 콜라겐을 산 용액에 용해하여 2~5% w/v(g/ml)의 콜라겐 용액을 제조하는 제1단계;
   실크 단백질에서 세리신 단백질과 불순물이 제거된 실크 피브로인 단백질이 염화칼슘, 물 및 에탄올이 혼합된 혼합용매에 용해된 실크 용액을 콜라겐 용액과 1:1의 부피비로 혼합하여 콜라겐-실크 혼합 용액을 제조하는 제2단계;
   콜라겐-실크 혼합 용액을 영하 70~90℃에서 12~48시간 동안 동결 건조하여 콜라겐-실크 하이브리드 다공성 스펀지를 제조하는 제3단계;
   콜라겐-실크 하이브리드 다공성 스펀지를 글루타르알데하이드 수용액(glutaraldehtde solution)에 12~36시간 동안 침지하는 제4단계;
   침지된 콜라겐-실크 하이브리드 다공성 스펀지를 꺼내어 탈염수 또는 증류수로 세척하는 제5단계;
   세척된 콜라겐-실크 하이브리드 다공성 스펀지를 글리신(glycine) 수용액에 침지하는 제6단계; 및
   콜라겐-실크 하이브리드 다공성 스펀지를 꺼내어 탈염수 또는 증류수로 세척한 후, 영하 80~100℃에서 12~24시간 동안 동결건조하는 제7단계;를 포함하고,
   하기 수학식 3으로 측정되는 혈액 응고 지수(BCI)가 0.0295~0.0363인, 지혈용 다공성 스펀지의 제조방법.
   BCI = Ds/Do　　 (수학식 3)
   (Ds는 헤모글로빈 용액 흡광도이고, Do는 용혈된 전혈의 흡광도임)
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9. 제4항에 기재된 지혈용 다공성 스펀지의 제조방법으로 제조된 지혈용 다공성 스펀지.
   

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