KR102063456B1 - 유산균 생존율 및 저장안정성 향상을 위한 과냉각 저온 전처리 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 유산균 생존율 및 저장 안정성 향상을 위한 과냉각 저온 전처리 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 과냉각 저온 전처리 방법은 유산균의 냉동 또는 동결건조 후의 유산균 생존율 향상에 우수한 효과를 보이며, 저장기간에 따른 저장안정성 역시 우수한 효과를 나타낸다. 따라서, 본 발명에 따른 유산균의 생존율 및 저장안정성 향상 방법에 의해, 궁극적으로 유산균 함유 제품의 품질을 향상시키고 저장안정성의 증진과 함께 유산균 함유 제품의 유통비용을 현격히 절감시킬 수 있다.

Description

유산균 생존율 및 저장안정성 향상을 위한 과냉각 저온 전처리 방법{Method for improving viability and storage stability by supercooling cold adaptation of lactic acid bacteria}

본 발명은 유산균 생존율 및 저장 안정성 향상을 위한 과냉각 저온 전처리 방법에 관한 것이다.

유산균의 산업적 이용을 위해서는 유산균의 활성이 유지되는 상태로 보급 및 유통이 진행되어야 한다. 이를 위해서는 유산균의 제형화 기술이 중요하며, 이 과정에서 가장 널리 사용되는 기술이 냉동 또는 동결건조 기술이다.

유산균의 냉동 또는 동결건조 과정은 대부분의 유산균을 장기 보존하는데 효과적이며 저장 및 유통 과정 중에서도 보관이 편리하다. 하지만 냉동 또는 동결건조 과정은 세포의 얼음결정에 의한 손상, 탈수에 의한 세포막 구조의 붕괴 그리고 이에 따른 산화 데미지를 유발시키게 되고 이에 따라 제형화 및 저장과정 중 균체의 활성과 생존율이 급격하게 감소하게 되는 문제를 가지고 있다.

유산균의 냉동 또는 동결건조 과정에서의 유산균의 생존율을 개선하기 위해 유산균을 기능성 고분자 및 다당류로 캡슐화시키는 방법과 탈지유, 전분, 콩가루 등과 같은 고분자 물질, 글루코스, 락토오스 등과 같은 저분자 물질 등의 동결보호제를 첨가하여 온도와 수분의 손실을 최소화하여 유산균의 생존율을 높이는 방법이 이용되고 있지만, 이러한 제형화 기술 역시 유산균의 종류, 동결조건, 건조시간 등에 따라 유산균의 생존율 편차가 클 뿐만 아니라 유산균의 활성이 저장기간이 오래될수록 급격히 떨어지는 등 여전히 해결해야 할 문제들을 안고 있다.

따라서, 유산균의 냉동 또는 동결건조 과정에서 유산균의 생존율 개선과 저장 안정성 향상을 위한 또다른 기술의 개발이 시급한 실정이다.

본 발명자들은 많은 박테리아들이 낮은 온도 조건에 대한 반응으로 cold sh ock proteins(CSPs)을 생산하며, CSPs는 RNA 샤페론(RNA chaperon)과 같이 작용하여 번역(translation)을 촉진시킴으로써 저온조건에 대한 부작용을 최소화시킨다는 점에 착안하고, 냉동 또는 동결건조 과정의 전 단계로서 저온처리를 먼저 수행하여 CSPs의 발현을 유도하고자 하였다.

미생물은 저온 전처리하였을 경우 저온 쇼크(cold shock)에 의해 특정반응(방어기작)을 하게 되는데, 크게 나누어 생화학적 반응과 분자수준에서 방어기작을 하게 된다. 일반적인 생화학 반응으로는 세포막의 구조적인 변화가 있으며, 분자수준의 방어기작으로는 CSP(cold shock protein)(Fujii et al., FEMS Microbiol Lett . 1999, 178:123-128; Graumann et al., J. Bacteriol . 1996, 178:4611-4619; Horton et al., Antonie van Leeuwenhoek, 2000, 77:13-20)와 CAP(cold acclimation protein) 같은 특정 단백질을 생산하는 기작이 알려져 있으나(Drouin et al., FEMS Microbiol. Ecol. 2000, 32:111-120) 구체적인 작용 메카니즘은 아직 밝혀지지 않은 실정이다.

미생물의 환경 스트레스와 관련하여 저온 전처리 효과에 대한 종래 연구 결과를 살펴보면, 37℃에서 배양한 대장균(E. Coli)을 6시간 동안 10℃에서 저온 전처리한 후 냉동시켰을 때, 저온 전처리를 하지 않은 것에 비해 미생물의 활성이 높아진다고 보고된 바 있다(Goldstein et al., Proc. Natl. Acad. USA .1990, 87:283-287). 또한 저온 전처리한 바실러스 섭틸러스(Bacillus subtilis)와 락토코커스 락티스 아종 락티스(Lactoccus lactis subsp. lactis )에서도 저온 전처리하지 않은 경우보다 저온 전처리한 경우에 냉동 조건에서 훨씬 큰 생균력을 갖는다(Panoff et al., Cryobiol, 1995,32:516-520, Willimsky et al., J. Bacteriol. 1990, 87:5589-5593)고 보고된 바 있다.

대한민국 등록특허 제10-0465853호에서는 브래디리조비움 자포니쿰(Bradyrhizobium japonicum)을 저온 전처리하여 고온, 건조, 알코올 및 산화적 스트레스와 같은 여러 환경 스트레스에 대한 내성을 증진시켜 생균력을 증진시키는 방법에 대해 개시하고 있다.

그러나, 유산균의 냉동 또는 동결건조의 전 단계에서 10℃의 조건에서 저온 전처리를 하는 것은 보고된 바 있으나, 본 발명자들은 극한 환경의 동결건조 과정에서 적응할 수 있도록 0 ℃ 이하의 온도에서 얼지 않고 액체상태로 존재하는 과냉각(supercooling) 조건을 저온 전처리 과정에서 구현함으로써, 유산균에서의 생물학적 냉온저항 특성을 발현을 극대화하고자 시도하였고, 이것이 매우 효과적인 유산균 생존율 및 저장안정성을 개선할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

대한민국 등록특허 제10-0465853호

본 발명의 목적은 냉동 또는 동결건조 과정 후에도 유산균의 생존율과 저장 안정성을 향상시킬 수 있는 전처리 기술을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 유산균의 냉동 또는 동결건조 과정 전에 유산균을 과냉각 조건에서 저온 전처리를 하고, 유산균을 냉동 또는 동결건조하는 것을 포함하는 유산균의 생존율 및 저장안정성 향상 방법을 제공하고자 한다.

본 발명에 있어서, 과냉각(supercooling)은 고체화(solidification)가 일어나는 상 변화(얼음 결정 형성)없이 빙점(freezing point) 이하로 제품의 저장 온도를 낮추는 과정을 말한다. 제품의 저장 온도가 빙점 이하로 내려가면 물이 얼음이 되는 상 변화가 생기게 되는데, 이러한 상 변화가 일어나기 위해서는 핵화(nucleation)와 결정화(crystallization)가 일어나야 한다. 과냉각은 이러한 상변화가 일어나기 위한 상전이 시간 (phase transition time)동안, 상전이 온도 밑으로 온도가 내려가도 원래 상을 유지하고 있는 상태(비동결 상태)를 의미한다.

하기 실시예에서는 상업적으로 사용되는 유산균의 대표적인 예로써, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria), 류코노스톡 메센테로이드 (Leuconostoc mesenteroides) 및 락토바실러스 쿠르바투스(Lactobacillus curvatus)에 대해 냉동 또는 동결 건조를 수행하기 전 단계에서 과냉각 저온 전처리를 수행하여 동결 직후 및 4주 내지 8주간의 저장 기간 동안 유산균의 생존율을 조사하였다. 그 결과 무처리군 또는 10 ℃ 저온 전처리군에 비해 과냉각 전처리 후 냉동 또는 동결 건조를 수행한 군의 유산균 생존율과 저장안정성이 현저히 증진되는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 유산균을 과냉각 조건에서 저온 전처리하는 단계; 및 유산균을 냉동 또는 동결건조하는 단계를 포함하는 유산균의 생존율 및 저장안정성 향상 방법을 제공한다.

과냉각 조건에서 저온 전처리하는 단계는 유산균을 과냉각 조건의 온도에서 일정기간 동안 놔두는 것을 의미한다.

이에 제한되는 것은 아니나, 통상 과냉각 조건은 빙점과 빙점으로부터 5 ℃낮은 온도의 구간으로 정의할 수 있다. 예를 들어, 순수한 물의 빙점은 0 ℃이며, 이 때 과냉각 조건은 0 ℃ 내지 -5 ℃일 수 있다. 본 발명에서 유산균은 배지를 포함하고 있는 상태로 과냉각이 진행될 수 있으므로, 빙점이 물보다 낮은 온도일 수 있음을 감안하여 과냉각 조건을 설정할 수 있을 것이다.

이에 제한되는 것은 아니나, 본 발명에서 과냉각은 0 ℃ 내지 -6 ℃, 예컨대, 0 ℃ 내지 -5 ℃, 0 ℃ 내지 -4 ℃, 0 ℃ 내지 -3 ℃, 0 ℃ 내지 -2 ℃, -1 ℃ 내지 -5 ℃, -1 ℃ 내지 -4 ℃, -1 ℃ 내지 -3 ℃, -2 ℃ 내지 -5 ℃, -3 ℃ 내지 -5 ℃ 등과 같은 상기 범위 내의 임의의 구간, 또는 0 ℃, -1 ℃, -2℃, -3℃, -4℃, -5℃일 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서, 과냉각 조건에서의 저온 전처리는 이에 제한되는 것은 아니나, 1시간 내지 6시간 동안 수행될 수 있다. 예를 들어, 과냉각 조건에서의 저온 전처리는 1시간 내지 3시간 동안 수행될 수 있다.

과냉각 조건에서의 저온 전처리 후, 유산균을 냉동 또는 동결건조시키기 전에 동결보호제를 처리하는 것이 바람직하다.

따라서, 본 발명에 따른 유산균의 생존율 및 저장안정성 향상 방법은 유산균의 냉동 또는 동결건조 전 동결보호제를 처리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 동결보호제는 콩가루, 당류, 아미노산, 펩타이드, 젤라틴, 글리세롤, 당알콜, 유청, 알긴산, 아스코르빈산, 효모 추출물, 탈지유, 트레할로스 및 마늘 추출물로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 동결 보호제는 유산균이 최종 첨가되는 식품의 맛, 향, 식감 등의 변화나 제품 생산 비용 등을 고려하여 적절히 조합하여 사용하는 것이 가능하다.

한편, 본 발명의 유산균의 생존율 및 저장안정성 향상 방법이 적용될 수 있는 유산균의 종류는 특별히 제한되지 않는다.

예를 들어, Lactococcus속, Lactobacillus 속, Weissella 속, Leuconostoc 속, Bifidobacterium 속, Pediococcus 속, Enterococcus속, Streptococcus 속 등의 유산균에 본 발명에 따른 과냉각 저온 전처리 방법을 적용함으로써 유산균의 생존율 및 저장안정성을 향상시킬 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria), 류코노스톡 메센테로이드 (Leuconostoc mesenteroides) 및 락토바실러스 쿠르바투스(Lactobacillus curvatus)에 대해 과냉각 저온 전처리를 수행함으로써 유산균의 생존율 및 저장안정성을 향상시킬 수 있음에 대해 보여주고 있다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 유산균의 생존율 및 저장안정성 향상 방법을 구현할 수 있는 유산균 제형화 시스템을 제공한다.

본 발명은 한 구체예에서,

유산균을 배양할 수 있는 바이오리액터,

상기 바이오리액터와 연결된 유산균 저장 장치로서, 유산균을 과냉각 조건에서 저온 전처리하는 장치; 및

유산균 저장 장치로부터 유산균을 회수하여 농축하는 장치;

유산균을 냉동 또는 동결건조하는 장치를 포함하는

유산균 제형화 시스템을 제공한다.

유산균을 배양할 수 있는 바이오리액터는 통상의 것을 사용할 수 있으며, 상기 바이오리액터는 유산균 저장 장치와 연결되어 있다. 유산균의 배양이 끝나면 바이오리액터는 연결부를 통해 유산균 저장 장치로 유산균을 이동시킬 수 있다.

유산균 저장 장치는 기본적인 유산균 저장을 기능을 수행하며 앞서 설명한 과냉각 조건에서 저온 전처리하는 과정을 수행하는 기능을 갖는다. 따라서 유산균 저장 장치에는 저장 및 저온 전처리를 위한 온도 조절 장치가 구비되어 있다.

유산균의 과냉각 저온 전처리가 완료되면 유산균은 유산균 저장 장치로부터 회수하여 제형화를 위해 농축하게 된다. 유산균의 회수, 농축은 이에 제한되는 것은 아니나 통상 원심분리기를 이용하여 수행할 수 있으며, 이 과정에서 배지의 세척 등을 위한 장치들이 추가될 수 있다.

회수, 농축된 유산균은 냉동 또는 동결건조하는 장치로 이동되어 최종적인 제형화 단계를 거치게 된다.

본 발명에 따른 과냉각 저온 전처리 방법은 유산균의 냉동 또는 동결건조 후의 유산균 생존율 향상에 우수한 효과를 보이며, 저장기간에 따른 저장안정성 역시 우수한 효과를 나타낸다. 따라서, 본 발명에 따른 유산균의 생존율 및 저장안정성 향상 방법에 의해, 궁극적으로 유산균 함유 제품의 품질을 향상시키고 저장안정성의 증진과 함께 유산균 함유 제품의 유통비용을 현격히 절감시킬 수 있다.

도 1 내지 4는 각각 각각, 락토바실러스 브레비스 WiKim0069, 와이셀라 시바리아 WiKim28, 류코노스톡 메센테로이드 WiKim32, 및 락토바실러스 쿠르바투스 WiKim38의 과냉각 저온 전처리 전, 후의 세포외다당류(EPS)의 미시적 변화를 보여주는 TEM 사진이다(과냉각 저온 전처리 전 (30℃) (A)과 과냉각 저온 전처리 후 (-5℃) (B)).
도 5는 과냉각 저온 전처리 전, 후의 세포외층단백질(SLP) 발현량을 보여주는 SDS-Page 결과이다.
도 6은 과냉각 저온 전처리에 따른 동결건조 후의 락토바실러스 브레비스 WiKim0069의 생존율 변화를 보여준다.
도 7은 과냉각 저온 전처리에 따른 동결건조 후의 류코노스톡 메센테로이드 WiKim32의 생존율 변화를 보여준다.
도 8은 과냉각 저온 전처리 후 냉동 직후 및 수 주간의 락토바실러스 브레비스 Wikim0069의 생존율 변화를 보여준다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

[ 실시예 ]

실시예 1. 과냉각 저온 전처리를 통한 유산균 생존율 증진

김치로부터 추출된 락토바실러스 브레비스 WiKim0069(Lactobacillus brevis WiKim0069, KCCM12134P), 와이셀라 시바리아 WiKim28(Weissella cibaria WiKim28, KFCC11526P), 류코노스톡 메센테로이드 WiKim32(Leuconostoc mesenteroides WiKim32, KFCC11639P), 및 락토바실러스 쿠르바투스WiKim38(Lactobacillus curvatus WiKim38, KFCC11667P)를 사용하여 하기 실험을 진행하였다.

- 70℃에서 장기 보관된 실험균주를 10 mL MRS broth에 1 % (v/v)접종하여 30℃에서 24시간 배양한 후, 다시 MRS broth에 2차 접종하여 미생물의 활성을 증대시킨 후 사용하였다.

김치로부터 분리된 유산균을 각 조건별로 MRS broth 5L에 1% 접종하여 30℃에서 24시간 배양하였다. 배양 후 인큐베이터 및 과냉각장치를 이용하여 시험군별로 30℃(대조구(일반배양온도)), 10℃저온 전처리 조건)와 -5℃과냉각 저온 전처리 조건)에서 1시간 내지 3시간 동안 전처리한 후 원심분리(8,000rpm, 10min)하여 균체를 회수 및 농축하였다.

투과전자현미경(Transmission electron microscope; TEM)을 이용하여 실험균주의 세포표면의 변화를 관찰하였다. 그 결과, 도 1 내지 4(각각, 락토바실러스 브레비스 WiKim0069, 와이셀라 시바리아 WiKim28, 류코노스톡 메센테로이드 WiKim32, 및 락토바실러스 쿠르바투스 WiKim38)에서 볼 수 있는 바와 같이, 과냉각 저온처리에 따라 세포외층단백질(SLP) 또는 세포외다당류(Exopolysaccharide; EPS)의 비후를 확인하였다(도 1B, 2B, 3B, 4B). 세포외층단백질(SLP)과 세포외다당류(EPS)은 유산균 세포를 기계적, 삼투압 스트레스, 급격한 pH와 온도 변화 등의 외부 환경 자극으로부터 보호하는 역할을 하는 것으로 보고되어 있다.

락토바실러스 브레비스 WiKim0069에 대하여, 과냉각 저온 전처리에 따른 세포외층단백질(SLP)의 비후에 영향을 미치는 단백질의 발현량을 SDS-page를 이용하여 확인하였다. 도 5는 과냉각 저온 전처리 전, 후의 세포외층단백질(SLP) 발현량을 보여주는 SDS-Page 결과이다. 도 5에서 볼 수 있는 바와 같이, 저온 전처리 수행 시 처리 온도가 낮아 질수록 세포외층단백질(SLP)의 발현량이 증가함을 확인하였다. 이는 온도변화에 따른 외부환경의 자극으로부터 유산균 세포를 보호하기 위한 반응기작에 의한 것으로 사료된다.

한편, 전처리를 거친 실험균주를 2.0x10¹¹ cfu/ml의 농도로 농축하여 보호제로 콩가루 20%와 농축된 균액을 1:1로 혼합하여 보호제 및 실험균주의 최종농도를 각각 10%와 1.0x10¹¹ cfu/ml로 조정한 후 -80℃에서 냉동 및 24시간 동결 후 동결건조를 진행하였다.

시험균주의 생존율 조사를 위해 MRS broth에 0.2% Bromophenol blue(BPB) 지시약 1%를 첨가하여 MRS-BPB 배지를 제조하였다. 미생물 현탁액 100 ㎕ 도말하여 30℃에서 48시간 동안 배양한 다음 미생물 군집의 숫자를 계수하여 생존율을 계산하였다.

표 1은 저온 전처리에 의한 동결건조 직후 생존율 변화를 보여준다.

저온 전처리에 의한 동결건조 직후 생존율 변화

	생존율(%)
유산균	대조구	10℃	-5℃
락토바실러스 브레비스 WiKim0069	92.8	94.2	96.7
와이셀라 시바리아 WiKim28	66.7	73.3	90.3
류코노스톡 메센테로이드 WiKim32	80.0	87.0	93.8
락토바실러스 쿠르바투스 WiKim38	64.6	71.4	88.7

표 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 실험 균주 모두에서 저온 전처리를 하지 않은 무처리군에 비해 10℃ 저온 전처리 또는 -5℃ 과냉각 저온 전처리시 동결건조 직후의 생존율이 증진됨을 확인할 수 있었다. 또한, 10℃ 저온 전처리에 비해서도 -5℃ 과냉각 저온 전처리시 동결건조 직후 생존율 증진 효과가 극대화됨을 확인할 수 있었다.

락토바실러스 브레비스 WiKim0069와 류코노스톡 메센테로이드 WiKim32의 경우, 와이셀라 시바리아 WiKim28나 락토바실러스 쿠르바투스 WiKim38에 비해, 동결보호제 추가 후 동결 건조 직후의 생존율은 전처리 온도에 따라 큰 변화를 나타내지는 않았으나, 도 5(락토바실러스 브레비스 WiKim0069) 및 도 6(류코노스톡 메센테로이드 WiKim32)에서 볼 수 있는 바와 같이, 동결 건조 28일 후, 56일 후의 유산균 생존율을 관찰하였을 때 과냉각 저온 전처리(-5℃) 조건에서 가장 높은 생존율을 나타내었다.

한편, 과냉각 저온 전처리 후 동결보호제를 추가하여 냉동 제형 직후 및 수 주간 락토바실러스 브레비스 Wikim0069의 생존율을 조사하였다(도 8). 동결보호제 추가 후 냉동 제형 직후의 생존율은 전처리 온도에 따라 큰 변화를 나타내지는 않았다. 반면, 냉동 제형 28일 후 30℃, 10℃과 -5℃를 처리한 유산균의 생존율은 각각 62.0%, 68.6%과 73.3% 임을 확인하였다. 냉동 제형 56일 후 30℃, 10℃과 -5℃를 처리한 유산균의 생존율은 각각 47.7%, 54.9%와 65.8%로, 과냉각 저온 전처리(-5℃) 조건에서 가장 높은 생존율을 나타내었다.

Claims (8)

1. 유산균을 -3 ℃내지 -6 ℃의 과냉각 조건에서 1시간 내지 6시간 저온 전처리하는 단계; 및
   유산균을 냉동 또는 동결건조하는 단계를 포함하는
   유산균의 생존율 및 저장안정성 향상 방법.
2. 제1항에 있어서,
   과냉각 조건에서의 저온 전처리는 1시간 내지 3시간 동안 수행되는 것인
   유산균의 생존율 및 저장안정성 향상 방법.
3. 제1항에 있어서,
   유산균의 냉동 또는 동결건조 전 동결보호제를 처리하는 단계를 추가로 포함하는
   유산균의 생존율 및 저장안정성 향상 방법.
4. 제3항에 있어서,
   동결보호제는 콩가루, 당류, 아미노산, 펩타이드, 젤라틴, 글리세롤, 당알콜, 유청, 알긴산, 아스코르빈산, 효모 추출물, 탈지유, 트레할로스 및 마늘 추출물로부터 선택되는 하나 이상인
   유산균의 생존율 및 저장안정성 향상 방법.
   
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