KR102047067B1 - 마이크로 구조물 및 마이크로 구조물의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 구조물 및 마이크로 구조물의 제조 방법은 베이스 플레이트를 패터닝하여 복수의 요입부를 구비하는 몰드를 형성하는 몰드 형성 단계, 몰드의 표면에 제1 액상 폴리머를 도포하여 복수의 요입부 내에 제1 액상 폴리머를 충진하는 제1 충진 단계, 제1 액상 폴리머를 경화시켜서 복수의 요입부에 대응하는 복수의 돌출부를 구비하는 베이스 프레임을 형성하는 베이스 프레임 형성 단계, 복수의 돌출부로 둘러싸인 공간에 제2 액상 폴리머를 충진하는 제2 충진 단계, 복수의 돌출부로 둘러싸인 공간에 충진된 제2 액상 폴리머의 일부를 제거하는 제거 단계 및 복수의 돌출부로 둘러싸인 공간에 잔존하는 제2 액상 폴리머를 경화시키는 경화 단계를 포함한다.

Description

마이크로 구조물 및 마이크로 구조물의 제조 방법{MICRO STRUCTURE AND METHOD FOR MANUFACTURING THE SAME}

본 발명은 마이크로 구조물 및 마이크로 구조물의 제조 방법에 관한 것이다.

인체 내의 세포들은 주변 세포 및 세포 외 기질(Extracellular Matrix, ECM)과의 상호작용을 통해 3차원 형상으로 기능적으로 특화된 집합체(aggregation)를 형성하고 이러한 집합체는 장기를 형성한다. 따라서, 세포의 3차원 형상은 생화학 및 기계적으로 세포 생리 및 구조체에 매우 중요한 역할을 담당하고 있다.

그러나, 일반적으로 세포를 3차원 형상으로 배양하는 것은 2차원 배양과 달리 특별한 방법이 요구되고, 2차원 배양에 비해서 많은 시간이 요구된다. 이러한 이유로 2차원적으로 배양한 세포는 대량신속한 약물 스크리닝 (high throughput drug screening)이나 각종 기초적인 약물평가 실험에 사용한다. 하지만, 2차원적으로 배양된 세포가 실제 생체와는 매우 다른 환경에 처해지기 때문에, 실험에 쓰일 세포가 가지고 있는 세포 자체의 특성이나 세포의 조직 특이성을 잃어버리고, 약물의 특성이 과 발현 되는 현상이 나타나기도 한다.

반면, 세포의 3차원 배양은 2차원 배양에 비하여 생체 내와 유사한 약물평가가 가능하지만, 형성에 필요한 시간 및 비용이 2차원 배양에 비해서 많이 들어가기 때문에 좀 더 심층적인 약물평가에 사용되고 있다.

세포를 3차원으로 배양하기 위해서 여러 가지 방법들이 사용되고 있지만, 마이크로 웰을 이용하면 비슷한 크기의 3차원 세포 스페로이드를 대량으로 획득할 수 있는 장점이 있다. 또한, 비슷한 크기의 3차원 세포 스페로이드는 비교적 정량적으로 균일한 약물반응을 나타낸다. 이러한 이유로 여러 가지 세포가 시딩(seeding)되어 3차원 형상으로 배양되는 웰을 구비하는 마이크로 구조물이 개발된 바 있다. 그러나, 종래의 마이크로 구조물의 웰은 멤스(MEMS) 및 반도체 공정에서 사용하는 소프트 리소그라피(soft lithography) 기술을 통해 형성되므로, 마이크로 구조물을 제작하는데 많은 시간이 소요되고, 마이크로 구조물을 제조하기 위한 제조 비용이 증가되는 문제가 있다.

또한, 종래의 마이크로 구조물의 웰에 세포를 시딩하는 경우, 예컨대, 웰에 들어가지 않은 세포를 제거하는 경우, 웰의 외부에 있는 세포는 제거해야 하는데 이 경우 세포가 손실되는 문제가 있다.

국내 공개특허공보 제10-2013-0013537호 (2013.02.06. 공개)

본 발명의 일 목적은 세포 손실 없이 시딩이 가능하여 다세포 종양 스페로이드(multi-cellular cancer spheroid), 장기세포 스페로이드(organ cell spheroid) 및 오가노이드(organoid)를 효율적으로 형성할 수 있는 마이크로 구조물을 제공하는 것이다.

또한, 웰부에 세포를 시딩하는 과정에서 대부분의 세포가 웰부에 자연스럽게 갇히기 때문에 불필요한 세포 제거 공정이 필요치 않아 세포 손실이 거의 없는 마이크로 구조물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 제조 시간을 단축시키고, 제조 비용을 절감할 수 있는 마이크로 구조물의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 베이스 플레이트를 패터닝하여 복수의 요입부를 구비하는 몰드를 형성하는 몰드 형성 단계; 상기 몰드의 표면에 제1 액상 폴리머를 도포하여 상기 복수의 요입부 내에 상기 제1 액상 폴리머를 충진하는 제1 충진 단계; 상기 제1 액상 폴리머를 경화시켜서 상기 복수의 요입부에 대응하는 복수의 돌출부를 구비하는 베이스 프레임을 형성하는 베이스 프레임 형성 단계; 상기 베이스 프레임의 표면에 제2 액상 폴리머를 도포하여 상기 복수의 돌출부로 둘러싸인 공간에 상기 제2 액상 폴리머를 충진하는 제2 충진 단계; 상기 복수의 돌출부로 둘러싸인 공간에 충진된 상기 제2 액상 폴리머의 일부를 제거하는 제거 단계; 및 상기 복수의 돌출부로 둘러싸인 공간에 잔존하는 상기 제2 액상 폴리머를 경화시키는 경화 단계를 포함하는, 마이크로 구조물의 제조 방법이 제공될 수 있다.

또한, 상기 경화 단계는, 상기 복수의 돌출부로 둘러싸인 공간에서 상기 제2 액상 폴리머가 메니스커스(meniscus)를 형성하는 단계; 및 상기 메니스커스를 형성하고 있는 상기 제2 액상 폴리머를 경화시키는 단계를 포함할 수 있다.

또한, 상기 몰드 형성 단계는, 레이저 패터닝 공정을 통해 수행될 수 있다.

또한, 상기 제거 단계는, 상기 복수의 돌출부로 둘러싸인 공간에 충진된 상기 제2 액상 폴리머의 10% 초과 90% 미만의 양으로 제거할 수 있다.

본 발명의 일 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 다른 실시예에 따르면, 베이스 플레이트를 패터닝하여 복수의 요입부를 구비하는 몰드를 형성하는 몰드 형성 단계; 상기 몰드의 상기 복수의 요입부의 일측 단부를 모따기 가공하는 가공 단계; 상기 몰드의 표면에 액상 폴리머를 도포하여 상기 몰드의 상기 복수의 요입부 내에 상기 액상 폴리머를 충진하는 충진 단계; 및 상기 액상 폴리머를 경화시켜서 상기 복수의 요입부에 대응하는 복수의 돌출부를 구비하는 베이스 프레임을 형성하는 베이스 프레임 형성 단계를 포함하는, 마이크로 구조물의 제조 방법이 제공될 수 있다.

또한, 상기 가공 단계는, 레이저 패터닝 공정을 통해 수행될 수 있다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 복수의 웰부 및 상기 웰부를 둘러싸는 격벽부를 구비하는 플레이트를 포함하는 마이크로 구조물에 있어서, 상기 웰부는 상기 플레이트의 길이 방향 및 폭 방향을 따라 등 간격으로 배치되고, 상기 웰부의 내측면은 곡면으로 이루어지는, 마이크로 구조물이 제공될 수 있다.

또한, 상기 격벽부는 상기 플레이트의 타측에서 상기 플레이트의 일측으로 향할수록 폭이 좁아지는 형상으로 이루어질 수 있다.

또한, 상기 웰부는 상기 플레이트의 타측에서 상기 플레이트의 일측으로 갈수록 직경이 커지는 형상으로 형성될 수 있다.

또한, 상기 격벽부의 높이는 100μm 내지 3.0mm일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 구조물 및 마이크로 구조물의 제조 방법은 제조 시간이 단축되고, 제조 비용이 절감되며, 세포 손실 없이 시딩이 가능하여 다세포 종양 스페로이드, 장기세포 스페로이드 및 오가노이드를 효율적으로 형성할 수 있다는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 구조물을 나타내는 사진이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 구조물을 광학 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 구조물의 제조 방법을 나타내는 순서도이다.
도 4 내지 도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 구조물의 제조 방법을 나타내는 도면들이다.
도 12는 본 발명의 다른 실시예에 따른 마이크로 구조물의 제조 방법을 나타내는 순서도이다.
도 13 내지 도 17은 본 발명의 다른 실시예에 따른 마이크로 구조물의 제조 방법을 나타내는 도면들이다.
도 18은 폐암세포주(A549) 및 쥐의 섬유아세포(NIH3T3)를 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 구조물에 시딩한 후에 다세포 종양 스페로이드로 배양된 것을 광학 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸다.
도 19는 도 18의 다세포 종양 스페로이드에 약물처리를 한 후에 다세포 종양 스페로이드의 사멸을 관찰한 결과를 나타낸다.

이하에서는 본 발명의 사상을 구현하기 위한 구체적인 실시예에 대하여 도면을 참조하여 상세히 설명하도록 한다. 여기서, 도면은 설명의 편의를 위해 일정한 비율로 그려지지 않았음을 밝혀둔다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 구성 또는 기능에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략한다.

또한, 본 명세서에서 일측, 타측, 상측, 하측 등의 표현은 도면에 도시를 기준으로 설명한 것이며, 해당 대상의 방향이 변경되면 다르게 표현될 수 있음을 미리 밝혀둔다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 구조물을 나타내는 사진이고, 도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 구조물을 광학 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸다.

도 1 및 도 2를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 구조물(1)은 적어도 하나의 세포가 시딩(seeding)되어 다세포 종양 스페로이드(multi-cellular cancer spheroid), 장기세포 스페로이드(organ cell spheroid) 및 오가노이드(organoid) 중 어느 하나로 배양되는 구조물로서, 기판(2)에 결합될 수 있다.

여기서, '다세포 종양 스페로이드'는 암세포, 혈관세포, 섬유아세포, 면역세포, 세포 외 기질 등이 복합적으로 구성된 응집체를 의미한다.

'세포 외 기질'은 세포에 의해 합성되고 세포 외에 분비, 축적된 분자로 구성되며, 조직 내 또는 세포 외의 공간을 채우고 있는 생체고분자의 복잡한 집합체를 의미한다. 여기서, '세포 외 기질'은 콜라겐, 매트리젤(matrigel), 피브린, 젤라틴, 히알루론산 하이드로젤로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다.

'장기세포 스페로이드'는 장기세포를 이용하여 체외에서 배양기술을 통해 형성되며, 인체 장기의 기능과 구조가 유사한 작은 인공장기 또는 유닛 장기를 의미한다.

'오가노이드'는 줄기세포를 이용하여 체외에서 배양기술을 통해 형성되며, 인체 장기의 기능과 구조가 유사한 작은 인공장기 또는 유닛 장기를 의미한다.

마이크로 구조물(1)에 시딩된 적어도 하나의 세포는 일 예로 슬라이드 글래스, 커버 글래스 등과 같은 기판(2)으로 공급되는 유체를 통해 다세포 종양 스페로이드, 장기세포 스페로이드 및 오가노이드 중 어느 하나로 배양될 수 있다.

여기서, '유체'는 세포 배양 배지, 생리식염수로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 또한, '유체'는 혈관세포, 섬유아세포, 면역세포, 암 줄기세포, 암세포, 장기세포, 장기줄기세포(위장, 소장, 대장, 심장, 간장, 신장, 폐장, 비장 등의 줄기세포), 성체줄기세포 및 일반 조직세포(예컨대, 혈관을 제외한 조직의 비줄기세포(non-stem cell) 또는 줄기세포)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 세포를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

마이크로 구조물(1)은 복수의 웰부(11) 및 웰부(11)를 둘러싸는 복수의 격벽부(12)를 구비하는 플레이트(10)를 포함할 수 있다.

웰부(11)는 적어도 하나의 세포가 시딩되어 다세포 종양 스페로이드, 장기세포 스페로이드 및 오가노이드 중 어느 하나로 배양되는 부분으로, 복수 개로 구비될 수 있다. 복수의 웰부(11)는 플레이트(10)의 길이 방향(도 2의 (b)의 x축 방향) 및 플레이트(10)의 폭 방향(도 2의 (b)의 y축 방향)을 따라 등 간격으로 배치될 수 있다.

웰부(11)는 플레이트(10)의 일측에서 소정 깊이로 요입되어 형성될 수 있다. 웰부(11)의 내측면은 곡면으로 이루어질 수 있다. 웰부(11)는 플레이트(10)의 타측(도 1의 하측)에서 플레이트(10)의 일측(도 1의 상측)으로 갈수록 직경(d)이 커지는 형상으로 형성될 수 있다. 여기서, 웰부(11)의 직경(d)은 인접하게 배치되는 격벽부(12)의 정점을 연결하는 직선 거리를 의미한다. 이와 같이, 플레이트(10)의 일측에 위치하는 웰부(11)의 직경(d)이 플레이트(10)의 타측에 위치하는 웰부(11)의 직경(d)에 비해 크므로, 세포가 웰부(11)에 용이하게 초기 진입될 수 있다.

복수의 격벽부(12)는 웰부(11)를 둘러싸면서 웰부(11)를 정의하는 부분으로, 웰부(11)에 시딩된 세포가 웰부(11)로부터 이탈되는 것을 방지할 수 있다.

격벽부(12)는 플레이트(10)의 타측으로부터 플레이트(10)의 일측을 향할수록 폭이 좁아지는 형상으로 형성되어 격벽부(12)의 일측 단부는 뾰족한 형상을 가질 수 있다. 다만, 이는 일 예에 불과하고, 격벽부(12)의 일측 단부는 라운드진 형상, 적어도 이회 절곡된 형상 등 다양한 형상으로 구비될 수 있다.

격벽부(12)의 둘레면은 웰부(11)의 내측면과 실질적으로 동일하고, 웰부(11)의 내측면은 곡면으로 이루어지므로, 세포를 웰부(11)에 시딩하는 과정에서 세포가 중력에 의해 격벽부(12)의 둘레면, 즉, 웰부(11)의 곡면을 따라 미끄러져 내리면서 웰부(11) 내로 용이하게 투입될 수 있다.

웰부(11)에 시딩된 세포 및 웰부(11)에서 배양된 다세포 종양 스페로이드, 장기세포 스페로이드 및 오가노이드 중 어느 하나는 격벽부(12)에 의해 가로 막혀서 마이크로 구조물(1)이 의도치 않게 움직임이더라도 웰부(11)로부터 이탈되지 않을 수 있다. 예를 들어, 격벽부(12)의 높이(h)는 100μm 내지 3.0mm일 수 있다. 여기서, 격벽부(12)의 높이(h)는 웰부(11)의 저면으로부터 격벽부(12)의 일측 단부 사이의 직선 거리를 의미한다.

상술한 바와 같은 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 구조물(1)은 웰부(11) 내에서 다세포 종양 스페로이드, 장기세포 스페로이드 및 오가노이드 중 어느 하나로 배양됨에 따라, 다세포 종양 스페로이드, 장기세포 스페로이드 및 오가노이드 중 어느 하나를 배양하는데 필요한 시간을 단축시킬 수 있고, 제조 비용 또한 절감할 수 있다.

또한, 상술한 바와 같은 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 구조물(1)은 웰부(11) 내에 시딩된 적어도 하나의 세포가 다세포 종양 스페로이드, 장기세포 스페로이드 및 오가노이드 중 어느 하나로 배양되는 과정에서 불필요한 세포 또는 다세포 종양 스페로이드, 장기세포 스페로이드 및 오가노이드 중 어느 하나가 동일한 크기로 형성되는데 방해가 되는 세포를 제거하는 추가적인 작업이 불필요하므로, 다세포 종양 스페로이드, 장기세포 스페로이드 및 오가노이드 중 어느 하나를 효율적으로 형성할 수 있다.

이하에서는, 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 구조물(1)의 제조 방법에 대하여 설명하겠다. 도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 구조물의 제조 방법을 나타내는 순서도이고, 도 4 내지 도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 구조물의 제조 방법을 나타내는 도면들이다.

도 3을 참조하면, 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 구조물(1)의 제조 방법은, 베이스 플레이트(100)를 패터닝하여 복수의 요입부(210)를 구비하는 몰드(200)를 형성하는 몰드 형성 단계(S100), 몰드(200)의 표면에 제1 액상 폴리머(P)를 도포하여 복수의 요입부(210) 내에 제1 액상 폴리머(P)를 충진하는 제1 충진 단계(S200), 제1 액상 폴리머(P)를 경화시켜서 복수의 요입부(210)에 대응하는 복수의 돌출부(310)를 구비하는 베이스 프레임(300)을 형성하는 베이스 프레임 형성 단계(S300), 베이스 프레임(300)의 표면에 제2 액상 폴리머(P')를 도포하여 복수의 돌출부(310)로 둘러싸인 공간(S)에 제2 액상 폴리머(P')를 충진하는 제2 충진 단계(S400), 복수의 돌출부(310)로 둘러싸인 공간(S)에 충진된 제2 액상 폴리머(P')의 일부를 제거하는 제거 단계(S500) 및 복수의 돌출부(310)로 둘러싸인 공간(S)에 잔존하는 상기 제2 액상 폴리머(P')를 경화시키는 경화 단계(S600)를 포함할 수 있다.

도 4 및 도 5를 참조하면, 베이스 플레이트(100)를 패터닝하여 복수의 요입부(210)를 구비하는 몰드(200)를 형성한다(S100). 먼저, 베이스 플레이트(100)를 준비한다. 예를 들어, 베이스 플레이트(100)는 5.0mm의 두께(a)를 가질 수 있고, 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA) 재질로 형성될 수 있으나, 이는 일 예에 불과하고, 이로 인해, 본 발명의 사상이 제한되는 것은 아니다.

다음으로, 레이저 패터닝 장치(3)를 이용하여 베이스 플레이트(100)의 일측(도 4의 상측)에 레이저를 조사한다. 레이저 패터닝 장치(3)의 레이저에 의해 베이스 플레이트(100)의 일측이 1.5mm의 깊이(b)로 패터닝됨으로써, 복수의 요입부(210)가 형성될 수 있다. 복수의 요입부(210)는 베이스 플레이트(100)의 길이 방향 및 베이스 플레이트(100)의 폭 방향을 따라 등 간격으로 배치될 수 있다.

복수의 요입부(210)는 몰드(200)의 일측(도 5의 상측)으로부터 몰드(200)의 타측(도 5의 하측)을 향하는 방향으로 폭이 점차적으로 좁아져 베이스 플레이트(100)의 타측과 인접하는 요입부(210의 단부는 뾰족한 형상을 가질 수 있다.

도 6을 참조하면, 몰드(200)의 표면, 즉, 몰드(200)의 일측에 제1 액상 폴리머(P)를 도포하여 복수의 요입부(210) 내에 제1 액상 폴리머(P)를 충진한다(S200). 예를 들어, 제1 액상 폴리머(P)는 폴리디메틸실록산(PDMS) 전구체 및 경화제가 10:1의 비율로 포함된 폴리디메틸실록산(PDMS)일 수 있다. 다만, 이는 일 예에 불과하고, 제1 액상 폴리머(P)의 종류에 의해 본 발명의 사상이 제한되는 것은 아니다.

도 7을 참조하면, 복수의 요입부(210) 내에 제1 액상 폴리머(P)의 충진이 완료되면, 제1 액상 폴리머(P)를 경화시켜서 복수의 요입부(210)에 대응하는 복수의 돌출부(310)를 구비하는 베이스 프레임(300)을 형성한다(S300). 복수의 돌출부(310)는 베이스 프레임(300)의 길이 방향 및 베이스 프레임(300)의 폭 방향을 따라 등 간격으로 배치될 수 있다.

도 8을 참조하면, 몰드(200)로부터 베이스 프레임(300)을 분리한 후, 베이스 프레임(300)의 배치 방향을 역전시킨 다음, 베이스 프레임(300)의 표면에 제2 액상 폴리머(P')를 도포하여 복수의 돌출부(310)로 둘러싸인 공간(S)에 제2 액상 폴리머(P')를 충진한다(S400). 예를 들어, 제2 액상 폴리머(P')는 제1 액상 폴리머(P)와 실질적으로 동일한 재료로 이루어질 수 있다.

도 9를 참조하면, 복수의 돌출부(310)로 둘러싸인 공간(S)에 충진된 제2 액상 폴리머(P')의 일부를 제거한다(S500).

석션 장치(4)를 이용하여 복수의 돌출부(310)로 둘러싸인 공간(S)에 충진된 제2 액상 폴리머(P')의 10% 초과 90% 미만의 양을 석션함으로써, 복수의 돌출부(310)로 둘러싸인 공간(S)에 충진된 제2 액상 폴리머(P')를 제거한다.

도 10 및 도 11을 참조하면, 복수의 돌출부(310)로 둘러싸인 공간(S)에 잔존하는 제2 액상 폴리머(P')를 경화시킨다(S600). 이때, 제2 액상 폴리머(P')의 표면장력에 의해 복수의 돌출부(310)로 둘러싸인 공간(S)에서 제2 액상 폴리머(P')가 메니스커스(meniscus)를 형성한다. 여기서, '메니스커스'는 액상의 물질(즉, 제2 액상 폴리머(P'))과 개체(즉, 복수의 돌출부(310)의 내측면)가 만나는 지점에서 액상의 물질의 표면장력에 의하여 액상의 물질이 곡면을 이루는 것을 의미한다. 메니스커스의 형성이 완료되면 메니스커스를 형성하고 있는 제2 액상 폴리머(P')를 80℃에서 2시간동안 경화시켜서 마이크로 구조물(1)을 형성한다. 여기서, 베이스 프레임(300)은 마이크로 구조물(1)의 플레이트(10)와 실질적으로 동일하고, 복수의 돌출부(310)는 마이크로 구조물(1)의 격벽부(12)와 실질적으로 동일하다.

이하에서는, 본 발명의 다른 실시예에 따른 마이크로 구조물(1)의 제조 방법에 대하여 설명하겠다. 도 12는 본 발명의 다른 실시예에 따른 마이크로 구조물의 제조 방법을 나타내는 순서도이고, 도 13 내지 도 17은 본 발명의 다른 실시예에 따른 마이크로 구조물의 제조 방법을 나타내는 도면들이다.

도 12를 참조하면, 본 발명의 다른 실시예에 따른 마이크로 구조물(1)의 제조 방법은 베이스 플레이트(100)를 패터닝하여 복수의 요입부(210)를 구비하는 몰드(200)를 형성하는 몰드 형성 단계(S101), 몰드(200)의 복수의 요입부(210)의 일측 단부를 모따기 가공하는 가공 단계(S201), 몰드(200)의 표면에 액상 폴리머(P)를 도포하여 몰드(200)의 복수의 요입부(210) 내에 액상 폴리머(P)를 충진하는 충진 단계(S301) 및 액상 폴리머(P)를 경화시켜서 복수의 요입부(210)에 대응하는 복수의 돌출부(310)를 구비하는 베이스 프레임(300)을 형성하는 베이스 프레임 형성 단계(S401)를 포함할 수 있다.

도 13 및 도 14를 참조하면, 베이스 플레이트(100)를 패터닝하여 복수의 요입부(210)를 구비하는 몰드(200)를 형성한다(S101). 다만, 몰드 형성 단계(S101)는 도 3 내지 도 5를 참조하여 설명한 몰드 형성 단계(S100)와 실질적으로 동일하므로, 상세한 설명은 생략하고, 상기한 설명에 갈음한다.

도 15를 참조하면, 몰드(200)의 복수의 요입부(210)의 일측 단부를 모따기 가공한다(S201). 레이저 패터닝 장치(3)를 이용하여 복수의 요입부(210)의 일측 단부에 레이저를 조사한다. 이에, 복수의 요입부(210)의 일측 단부에는 비스듬하게 곡면을 이루면서 경사지게 형성된 가공면(220)이 형성될 수 있다.

도 16을 참조하면, 몰드(200)의 표면에 액상 폴리머(P)를 도포하여 몰드(200)의 복수의 요입부(210) 내에 액상 폴리머(P)를 충진한다(S301). 여기서, 액상 폴리머(P)는 복수의 요입부(210) 및 가공면(220)에 충진될 수 있으며, 일 예로, 폴리디메틸실록산(PDMS) 전구체 및 경화제가 10:1의 비율로 포함된 폴리디메틸실록산(PDMS)일 수 있다.

도 17을 참조하면, 액상 폴리머(P)를 경화시켜서 복수의 요입부(210)에 대응하는 복수의 돌출부(310)를 구비하는 베이스 프레임(300)을 형성한다(S401). 여기서, 복수의 돌출부(310)는 복수의 요입부(210) 형상에 대응하는 형상을 가질 수 있으며, 복수의 요입부(210)의 일측 단부가 모따기 가공되어 있으므로, 복수의 돌출부(310)의 외측면은 비스듬하게 곡면을 이루면서 경사진 경사면으로 이루어질 수 있다.

마지막으로, 베이스 프레임(300)의 배치 방향을 역전시킴으로써, 마이크로 구조물(1)의 제작이 완료된다. 여기서, 베이스 프레임(300)은 마이크로 구조물(1)의 플레이트(10)와 실질적으로 동일하고, 복수의 돌출부(310)는 마이크로 구조물(1)의 격벽부(12)와 실질적으로 동일하다.

<실시예> 마이크로 구조물의 제작

격벽부(12)에 의해 둘러싸인 웰부(11)가 플레이트(10)의 길이 방향 및 플레이트(10)의 폭 방향을 따라 반복적으로 배치된 구조를 갖는 마이크로 구조물(1)을 제작하였다.

<실험예 1> 다세포 종양 스페로이드(multi-cellular cancer spheroid)의 형성

일반적으로, 폐암은 다세포 종양 스페로이드와 같은 큰 조직 형태로 관찰되므로, 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 구조물(1)의 웰부(11)에 시딩된 세포가 다세포 종양 스페로이드를 형성하는지 확인하는 실험을 수행하였다.

먼저, 마이크로 구조물(1)의 웰부(11)의 내측면을 4% 소 혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA) 용액으로 24시간 동안 코팅하였다.

다음으로, 웰부(11)로부터 4% 소 혈청 알부민 용액을 제거한 후, 웰부(11)를 인산완충생리식염수(PBS)로 수세하였다. 수세 후, 폐암세포(A549) 및 섬유아세포(Fibroblast, NIH3T3)를 2:1의 비율로 혼합하여 폐암세포(A549) 및 섬유아세포(NIH3T3)의 혼합물을 웰부(11)에 시딩하였다.

폐암세포(A549) 및 섬유아세포(NIH3T3)의 혼합물이 시딩된 마이크로 구조물(1)을 회전 장치, 예컨대, 원심 분리기에 장착하여 회전시킴에 따라, 폐암세포(A549) 및 섬유아세포(NIH3T3)가 웰부(11)의 하단부로 이동되었다. 원심분리는 1000 rpm의 속도로 2분간 수행되었다.

그 후, 폐암세포(A549) 및 섬유아세포(NIH3T3)의 혼합물의 발달 과정을 광학 현미경을 이용하여 확인하였다.

그 결과, 도 18의 (a)에 도시된 바와 같이, 폐암세포(A549) 및 섬유아세포(NIH3T3)의 혼합물을 웰부(11)에 시딩하고 1일 후에는 폐암세포(A549) 및 섬유아세포(NIH3T3)의 혼합물이 400μm 내지 450μm의 직경을 갖는 다세포 종양 스페로이드를 형성함을 확인할 수 있었다.

또한, 도 18의 (b)에 도시된 바와 같이, 다세포 종양 스페로이드가 각각의 웰부(11)에 안정적으로 형성되었음을 확인할 수 있었다.

<실험예 2> 다세포 종양 스페로이드의 항암제에 대한 약물 반응

마이크로 구조물(1)에서 배양된 다세포 종양 스페로이드를 이용하여 항암제 효능을 평가하기 위하여, 실시예에서와 같은 방법을 사용하여 마이크로 구조물(1)에 폐암세포(A549) 및 섬유아세포(NIH3T3)를 혼합하여 시딩한 후 배양하여 다세포 종양 스페로이드를 형성하였다. 그리고, 다세포 종양 스페로이드가 형성된 시점(day 0)에서부터 다세포 종양 스페로이드에 탁솔(Taxol) 및 젬시타빈(Gemcitabine) 약물을 처리한 시점(day 2)을 지난 4일째까지 세포의 성장과 발달을 관찰하였다.

도 19의 (a)는 칼케인 calcein AM 및 ethidium bromide과 같은 형광 물질을 사용하여 활성 세포(live cell)와 비활성 세포(dead cell)에 대해 부착한 후 획득된 이미지이다.

도 19의 (b)를 참조하면, 다세포 종양 스페로이드가 형성된 시점으로부터 2일 후부터 젬시타빈(Gemcitabine) 및 탁솔(Taxol) 약물을 투여하여 세포의 사멸을 유도하였다.

그 결과, 젬시타빈(Gemcitabine)과 탁솔(Taxol)을 조합하여 투여한 경우, 탁솔(Taxol) 및 젬시타빈(Gemcitabine)을 단독으로 투여하였을 때에 비해 높은 세포 사멸률(dead cells(%))을 유도하였다.

도 19의 (b)에 나타낸 바와 같이, 다세포 종양 스페로이드가 형성된 시점으로부터 4일 후, 젬시타빈(Gemcitabine)과 탁솔(Taxol)을 조합하여 투여한 경우, 탁솔(Taxol) 및 젬시타빈(Gemcitabine) 약물에 의한 세포 사멸률이 약 60%에 도달하였다. 항암제가 투여되지 않은 모의 집단(Mock)에서 세포 사멸률 또한 시간 의존적으로 증가하였다.

도 19의 (c)를 참조하면, 형광 강도(fluorescence intensity)에 의한 비활성 셀의 패턴을 확인하기 위해 세포 생존 능력 분석이 수행되었다. 그 결과, 형광 강도 내의 비활성 셀의 증가와 유사하게 항암제 투여로 세포 생존력이 감소됨을 알 수 있었다. 또한, 항암제가 투여되지 않은 모의 집단에서의 세포 생존 능력 또한 시간 의존적으로 감소됨을 알 수 있었다.

이상 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들에 대하여 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 예를 들어 당업자는 각 구성요소의 재질, 크기 등을 적용 분야에 따라 변경하거나, 실시형태들을 조합 또는 치환하여 본 발명의 실시예에 명확하게 개시되지 않은 형태로 실시할 수 있으나, 이 역시 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시 적인 것으로 한정적인 것으로 이해해서는 안 되며, 이러한 변형된 실시예들은 본 발명의 특허청구범위에 기재된 기술사상에 포함된다고 하여야 할 것이다.

1: 마이크로 구조물 2: 세포 배양 기판
3: 레이저 패터닝 장치 4: 석션 장치
10: 플레이트 11: 웰부
12: 격벽부 100: 베이스 플레이트
200: 몰드 210: 요입부
220: 가공면 300: 베이스 프레임
310: 돌출부

Claims (10)

1. 베이스 플레이트를 패터닝하여 복수의 요입부를 구비하는 몰드를 형성하는 몰드 형성 단계;
   상기 몰드의 표면에 제1 액상 폴리머를 도포하여 상기 복수의 요입부 내에 상기 제1 액상 폴리머를 충진하는 제1 충진 단계;
   상기 제1 액상 폴리머를 경화시켜서 상기 복수의 요입부에 대응하는 복수의 돌출부를 구비하는 베이스 프레임을 형성하는 베이스 프레임 형성 단계;
   상기 베이스 프레임의 표면에 제2 액상 폴리머를 도포하여 상기 복수의 돌출부로 둘러싸인 공간에 상기 제2 액상 폴리머를 충진하는 제2 충진 단계;
   상기 복수의 돌출부로 둘러싸인 공간에 충진된 상기 제2 액상 폴리머의 일부를 제거하는 제거 단계; 및
   상기 복수의 돌출부로 둘러싸인 공간에 잔존하는 상기 제2 액상 폴리머를 경화시키는 경화 단계를 포함하고,
   상기 제거 단계는
   상기 복수의 돌출부의 단부가 뾰족하고 양 측면이 비스듬하게 곡면을 이루면서 경사진 경사면을 갖도록 상기 제2 액상 폴리머의 일부를 제거하는,
   마이크로 구조물의 제조 방법.
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 경화 단계는,
   상기 복수의 돌출부로 둘러싸인 공간에서 상기 제2 액상 폴리머가 메니스커스(meniscus)를 형성하는 단계; 및
   상기 메니스커스를 형성하고 있는 상기 제2 액상 폴리머를 경화시키는 단계를 포함하는,
   마이크로 구조물의 제조 방법.
3. 제 1 항에 있어서,
   상기 몰드 형성 단계는,
   레이저 패터닝 공정을 통해 수행되는,
   마이크로 구조물의 제조 방법.
4. 제 1 항에 있어서,
   상기 제거 단계는,
   상기 복수의 돌출부로 둘러싸인 공간에 충진된 상기 제2 액상 폴리머의 10% 초과 90% 미만의 양으로 제거하는,
   마이크로 구조물의 제조 방법.
5. 베이스 플레이트를 패터닝하여 복수의 요입부를 구비하는 몰드를 형성하는 몰드 형성 단계;
   상기 몰드의 상기 복수의 요입부의 일측 단부를 모따기 가공하는 가공 단계;
   상기 몰드의 표면에 액상 폴리머를 도포하여 상기 몰드의 상기 복수의 요입부 내에 상기 액상 폴리머를 충진하는 충진 단계; 및
   상기 액상 폴리머를 경화시켜서 상기 복수의 요입부에 대응하는 복수의 돌출부를 구비하는 베이스 프레임을 형성하는 베이스 프레임 형성 단계를 포함하고,
   상기 가공 단계는
   상기 복수의 돌출부의 단부가 뾰족하고 양 측면이 비스듬하게 곡면을 이루면서 경사진 경사면을 갖도록 상기 복수의 요입부의 일측 단부를 모따기 가공하는,
   마이크로 구조물의 제조 방법.
6. 제 5 항에 있어서,
   상기 가공 단계는,
   레이저 패터닝 공정을 통해 수행되는,
   마이크로 구조물의 제조 방법.
7. 복수의 웰부 및 상기 웰부를 둘러싸는 격벽부를 구비하는 플레이트를 포함하는 마이크로 구조물에 있어서,
   상기 웰부는 상기 플레이트의 길이 방향 및 폭 방향을 따라 등 간격으로 배치되고,
   상기 웰부의 내측면은 곡면으로 이루어지고,
   상기 웰부는 바닥면에서 개방측으로 갈수록 직경이 커지는 형상으로 형성되고,
   상기 격벽부는 상기 웰부에서 단부를 향할수록 폭이 좁아지고 양 측면이 비스듬하게 곡면을 이루면서 경사진 경사면을 가지고, 상기 격벽부의 단부는 뾰족한 형상을 갖는,
   마이크로 구조물.
8. 삭제
9. 삭제
10. 제 7 항에 있어서,
    상기 격벽부의 높이는 100μm 내지 3.0mm인,
    마이크로 구조물.

Images