KR102042609B1 - 측방유동 카트리지에서 형광측정법을 이용한 비타민 d의 신속 정량 검사법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 측방유동 카트리지에서 형광측정법을 이용한 비타민 D의 신속 정량 검사법에 관한 것으로, 본 발명의 방법은 종래의 시간 및 노동 집약적인 시료 전처리 단계가 불필요하여 신속하고 정확하게 비타민 D를 측정할 수 있다.

Description

측방유동 카트리지에서 형광측정법을 이용한 비타민 D의 신속 정량 검사법{Rapid quantitative fluorescent immunoassay method for vitamin D using lateral flow cartridge}
본 발명은 측방유동 카트리지에서 형광측정법을 이용한 비타민 D의 신속 정량 검사법에 관한 것이다.
비타민 D는 칼슘과 인의 수치를 조절하여 뼈를 건강하게 형성하고 유지하는데 도움을 주는 지용성 비타민으로, 면역체계와 혈당을 조절하고 각종 감염 발생을 억제하는 역할도 수행한다. 비타민 D가 부족하게 되면 골다공증, 낙상, 고관절 골절 발생률을 높일 뿐 아니라 여러 가지 암이나 자가 면역 질환의 발병도 높아진다.
비타민 D(칼시페롤, calciferol)는 D2(에르고칼시페롤, ergocalciferol)와 D3(콜레칼시페롤, cholecalciferol)로 분류된다. 비타민 D2는 효모와 식물 스테롤(sterol)인 에르고스테롤(ergosterol)로부터 만들어지며, 비타민 D3는 햇빛 자외선을 피부에 쪼이면 콜레스테롤의 전구체인 7-디히드로콜레스테롤(7-dehydrocholesterol)로부터 만들 수 있는데, 이들의 효율성은 거의 같은 것으로 알려져 있다.
비타민 D는 체내에서 합성된 것이나 식품으로 섭취된 것 모두 활성호르몬의 전구체인 프로호르몬(pro-hormone) 형태이며, 간과 신장에서 활성형으로 전환되어야 생물학적 기능을 발휘할 수 있다. 간에서 비타민 D3 및 비타민 D2는, 25번 탄소 위치가 수산화되어 각각 25-히드록시비타민 D3(25-OH-D3) 및 25-히드록시비타민 D2(25-OH-D2)로 대사되고, 상기 25-히드록시비타민 D3 및 25-히드록시비타민 D2는 신장으로 운반되어 다시 1번 탄소 위치가 수산화되어 25-히드록시비타민 D3는 활성 호르몬 1,25-디히드록시비타민 D3로 대사되고, 25-히드록시비타민 D2는 활성 호르몬 1,25-디히드록시비타민 D2로 대사된다.
비타민 D의 결핍이나 과잉을 파악하고 모니터링하는데 가장 적절한 검사는 25-히드록시비타민 D를 측정하는 것으로, 25-히드록시비타민 D의 정확한 양을 측정하기 위해서는 25-히드록시비타민 D3(25-OH-D3) 및 25-히드록시비타민 D2(25-OH-D2) 모두를 측정해야 한다.
일반적으로 사용되고 있는 비타민 D의 검사방법으로 크게 LC-MS/MS(Liquid Chromatography-Mass Spectrometry/Mass Spectrometry) 방법과 화학발광면역측정법(chemiluminescence immunoassay, CLIA)이 있다. LC-MS/MS 방법은 비타민 D의 표준검사 방법으로 정확성이 우수하며, 민감도와 정밀도가 우수한 장점이 있고, 비타민 D3와 D2를 구별하여 측정할 수 있는 장점이 있다. 그러나, LC-MS/MS 방법은 고가의 분석장비가 구비되어야만 하는 단점이 있다. 그리고 CLIA법은 자동화 장비를 사용하여 빠르게 측정이 가능하며, 높은 민감도와 정밀도, 전처리 과정이 필요없는 장점이 있다. 하지만, CLIA법은 시약 또는 방법에 따라 차이가 커 검사기관마다 결과가 다를 수 있는 단점이 있다.
한편, 한국공개특허 제2015-0100935호에는 스테로이드 골격을 갖는 계면 활성제로 샘플을 처리하는 것을 특징으로 하는 '비타민 D의 측정 방법 및 측정용 키트'가 개시되어 있고, 한국공개특허 제2015-0110680호에는 '1,25-디히드록시비타민 D 및 관련 항체를 탐지하는 방법 및 키트'가 개시되어 있으나, 본 발명의 측방유동 카트리지에서 형광측정법을 이용한 비타민 D의 신속 정량 검사법에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 항-25-히드록시비타민 D 항체를 이용한 면역분석법과 측방유동 및 형광측정법을 이용하여 혈액 내 존재하는 비타민 D의 농도를 신속하게 정량할 수 있는 방법을 개발하였으며, 시료의 비타민 D 양에 따른 형광값의 정확한 구분을 위한 온도 조건을 최적화 함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 (a) 생물학적 시료와 방출(releasing) 버퍼를 혼합하여 32~37℃에서 3~7분동안 반응시켜 제1 반응물을 제조하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 제1 반응물에 검출 버퍼를 첨가하여 32~37℃에서 13~17분동안 반응시켜 제2 반응물을 제조하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 제2 반응물을 측방유동 카트리지에 로딩하고 6~10분동안 반응시킨 후 형광측정기로 형광세기를 측정하는 단계;를 포함하는 측방유동 카트리지에서 형광측정법을 이용한 비타민 D의 신속 정량 방법을 제공한다.
본 발명은 측방유동 카트리지와 형광측정법을 이용하여 생물학적 시료에서 비타민 D를 정량하는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 방법은 종래의 시간 및 노동 집약적인 시료 전처리 단계가 불필요하므로, 신속하고 정확하게 비타민 D를 측정할 수 있다.
도 1은 본 발명의 비타민 D 정량 방법에 사용된, 측방유동 반응의 원리와 형광측정의 원리를 보여주는 모식도이다.
도 2는 다양한 온도 조건에서 비타민 D 농도에 따른 형광 측정 결과를 분석한 그래프이다. T area: 검사선(test line)의 형광값, C area: 대조선(control line)의 형광값.
도 3은 45개의 혈청 검체를 사용하여 본 발명의 방법 및 장비로 측정한 결과와 대조장비(Cobas E 411)로 정량분석한 결과를 보여주는 그래프이다. Y: 기준장비 Cobas의 측정값, X: 본 발명의 측정값.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 생물학적 시료에서 측방유동 카트리지를 이용한 형광측정법을 통해 비타민 D의 신속 정량 방법을 제공한다.
본 발명의 비타민 D의 신속 정량 방법은 경쟁반응을 이용한 면역분석법을 사용하는데, 검출 버퍼에 존재하는 형광표지된 탐지항체(항-25-히드록시비타민 D 항체)와 검체(생물학적 시료) 내 존재하는 비타민 D(25-히드록시비타민 D; 25(OH)D2 및 25(OH)D3)가 항원-항체 복합체를 형성하고, 복합체를 형성하지 못하고 남은 탐지항체가 측방유동 카트리지 스트립의 니트로셀룰로즈 매질을 통해 이동하면서 니트로셀룰로즈 전개막에 고정되어 있는 경쟁자(BSA-25(OH)D 복합체)와 결합하게 되고, 경쟁자와 결합된 탐지항체에서 나오는 형광을 형광측정기(ichromaTM Reader, 바디텍메드)로 측정하는 것이다.
용어 "면역분석법"이란, 항원과 항체간의 특이적인 결합능을 이용하여 불순물이 많은 시료로부터 목적하는 미량의 물질을 측정하는 방법을 의미한다. 면역정량법에 형광(또는 발광) 물질, 방사성화합물, 효소, 금속 등의 표지법을 조합하면 측정감도가 비약적으로 높아진다.
본 발명에 따른 비타민 D의 신속 정량 방법은 구체적으로는,
(a) 생물학적 시료와 방출(releasing) 버퍼를 혼합하여 32~37℃에서 3~7분동안 반응시켜 제1 반응물을 제조하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 제1 반응물에 검출 버퍼를 첨가하여 32~37℃에서 13~17분동안 반응시켜 제2 반응물을 제조하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계의 제2 반응물을 측방유동 카트리지에 로딩하고 6~10분동안 반응시킨 후 형광측정기로 형광세기를 측정하는 단계;를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 비타민 D의 신속 정량 방법에 있어서, 상기 비타민 D는 바람직하게는 25-히드록시비타민 D3(25-OH-D3) 및 25-히드록시비타민 D2(25-OH-D2)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
과거 수십 년 동안은 체내 비타민 D의 농도를 검사할 때, 비타민 D의 완전 활성 형태인 1,25(OH)D를 측정하였으나, 간이나 혈액 내의 25(OH)D가 신장에서 1,25(OH)D로 변하기 때문에, 1,25(OH)D를 측정하는 것은 현재 체내 비타민 저장량이 아니라 신장의 기능을 반영한다고 판단, 최근에는 체내 비타민 D의 농도를 검사할 때 혈중 25(OH)D의 농도를 측정한다.
또한, 본 발명의 일 구현 예에 따른 비타민 D의 신속 정량 방법에 있어서, 상기 (a) 단계의 방출 버퍼는 0.4~0.6N 수산화나트륨 및 35~45%(v/v) DMSO(dimethyl sulfoxide)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 상기 방출 버퍼는 생물학적 시료 내의 25-히드록시비타민 D를 비타민 D 결합 단백질(vitamin D binding protein)로부터 방출시키기 위해 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어 "생물학적 시료"란, 액체상 또는 액체와 유사한 유동성 물질, 예를 들면 혈액, 타액, 소변, 땀, 간질 또는 세포내 체액, 또는 이로부터 추출된 물질 등을 들 수 있고, 혈액은 전혈, 혈장, 혈청이나 소정의 처리(예를 들면 응고 방지)가 이루어진 혈액, 혈장, 혈청 등이 이에 해당될 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 상기 생물학적 시료는 조작하거나 조작하지 않은 상태로 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 일 구현 예에 따른 비타민 D의 신속 정량 방법에 있어서, 상기 (b) 단계의 검출 버퍼는 형광표지된 항-25-히드록시비타민 D 항체를 포함하는 것일 수 있고, 구체적으로는, 형광표지된 항-25-히드록시비타민 D 항체, 형광표지된 항-토끼 IgG, 0.3~0.7%(w/v) 젤라틴, 100~200mM 염화나트륨, 0.05~0.15%(w/v) 아지드화나트륨, 0.3~0.55%(w/v) CHAPS(3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate hydrate) 및 400~600mM Tris-HCl로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 검출 버퍼 내의 항-25-히드록시비타민 D 항체는 25-히드록시비타민 D2 및 25-히드록시비타민 D3 모두에 결합될 수 있으며, 상업적으로 판매되는 항체를 구매하여 이용할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 구현 예에 따른 비타민 D의 신속 정량 방법에 있어서, 상기 측방유동 카트리지는, 테스트 스트립의 형태로, 시료를 주입하는 시료 주입부; 상기 시료 주입부로부터 일정간격이 이격된 위치에 소혈청알부민(bovine serum albumin, BSA)과 25-히드록시비타민 D의 복합체가 고정된 검사선(test line); 및 토끼 IgG가 고정된 대조선(control line)이 순차적으로 구비된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명에 따른 비타민 D의 신속 정량 방법에서 형광세기는 생물학적 시료 내 비타민 D의 농도에 반비례하는 것을 특징으로 하는데, 이는 검출 버퍼 내에 존재하는 형광표지된 항-25-히드록시비타민 D 항체 중 항원-항체 복합체를 형성하지 않은 유리(free) 형태의 항-25-히드록시비타민 D 항체가 검사선에 고정되어 있는 BSA-25-히드록시비타민 D 복합체에 포획되고, 여기서 나오는 형광량을 측정하기 때문이다. 즉, 혈액 내 25-히드록시비타민 D가 다량 존재하면 항-25-히드록시비타민 D 항체가 대부분 항원-항체 복합체를 만들고, 유리(free) 형태의 항-25-히드록시비타민 D 항체의 양이 적어지므로, 측방유동 카트리지의 검사선에 고정된 BSA-25-히드록시비타민 D 복합체에 결합하는 항-25-히드록시비타민 D 항체의 수가 많지 않아 최종 형광 신호 세기가 약하게 확인되고, 반대로 혈액 내 25-히드록시비타민 D가 소량 존재하면 최종 형광 신호 세기는 강하게 나오게 되는 것이다.
상기 검출 버퍼 내의 또다른 형광표지된 항-토끼 IgG는 내부 대조구(internal control)로 사용되며, 측방유동 카트리지에서 대조선에 고정되어 있는 토끼 IgG에 결합하고, 형광을 나타내게 된다. 따라서 정상적인 반응이라면 모든 반응에서 일정한 형광량을 보이게 된다.
본 발명에서는 항원-항체 복합체를 검출하기 위해 형광물을 표지체로 사용하였으나, 이에 제한되지 않으며, 효소, 리간드, 발광물, 미소입자 또는 방사성 동위원소 등을 이용할 수 있다.
검출 표지체로서 사용되는 형광물로는 플루오레세인, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민, Eu3+, Eu3+ 킬레이트 또는 크립테이트 등을 포함하며, 효소로는 아세틸콜린에스테라제, 알칼라인 포스파타제, β-D-갈락토시다제, 호스래디쉬 퍼옥시다제, β-락타마제 등을 포함하며, 리간드로는 바이오틴 유도체 등을 포함하며, 발광물로는 아크리디늄 에스테르, 이소루미놀 유도체 등을 포함하며, 미소입자로는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등을 포함하며, 방사성 동위원소로는 57Co, 3H, 125I, 125I-볼톤(Bonton) 헌터(Hunter) 시약 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 방법을 통해 생물학적 시료 내 존재하는 비타민 D의 정량이 가능한 범위는 8.0 ~ 70 ng/mL이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 시약 및 장비
형광표지된 항-25(OH)D 항체 및 항-토끼 IgG 항체는, 각각의 항-25(OH)D 항체와 항-토끼 IgG 항체 및 FPR-648을 따로따로 구입하여 컨쥬게이션시켜 준비하였다. 검사선에 고정할 소혈청알부민(bovine serum albumin)과 25-히드록시비타민 D3(25(OH)D3) 또한 각각 구입하여 컨쥬게이션시켜 준비하였다.
방출 버퍼(releasing buffer)는 0.5N 수산화나트륨 및 40% DMSO의 조성으로 제조하였으며, 검출 버퍼(detection buffer)는 0.5% 젤라틴, 150mM 염화나트륨, 0.1% 아지드화나트륨(NaN3), 0.4% CHAPS, 500mM Tris-HCl(pH 6.8), 형광표지된 항-25(OH)D 항체 및 형광표지된 항-토끼 IgG의 조성으로 제조하였다.
2. 형광값을 통한 비타민 D의 농도 산출
검사선에서 측정된 형광량(T-area)을 대조선에서 측정된 형광량(C-area)으로 나눈 값을 ratio로 명하였다.
표준장비를 사용하여 기측정된 8 구간의 농도 조건(0, 5, 10, 20, 30, 50, 70, 100ng/ml)의 칼리브레이터(calibrator)를 준비하고 각각의 농도 조건에서의 ratio 값을 형광측정기(ichromaTM Reader, 바디텍메드)로 측정하여 결정하였다. 이를 기준으로 검량선(calibration curve)를 작성하고, 상기 검량선에 미지의 시료 측정시 나오는 ratio를 대입하면, 시료 내 비타민 D의 농도가 산출된다.
실시예 1. 온도 조건에 따른 결과값의 변화 분석
시료 내의 비타민 D의 농도를 측정함에 있어서, 반응 조건 시의 온도가 미치는 영향을 평가하였다. 방출 버퍼 50㎕와 0, 10, 30 및 70ng/ml 농도의 비타민 D 시료 50㎕를 각각 혼합한 후 20, 22, 25, 30, 32, 35, 37 또는 39℃의 온도 조건에서 5분간 반응시켰다. 그 후, 100㎕의 검출 버퍼를 상기 반응물에 첨가하고 상기 8개의 온도 조건에서 15분간 반응시켰다. 형광측정기의 슬롯 위에 올려진 테스트 카트리지의 시료 주입부에 상기 반응물의 75㎕를 로딩하고, 형광측정기의 슬롯을 닫은 후 8분 후 대조선 및 검사선의 형광세기를 측정하였다.
그 결과, 도 2에서 확인되는 것과 같이 시료 농도 및 온도 조건에 상관없이 모든 경우에서 대조선의 형광량(C area)이 일정한 값을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 그러나, 20, 22, 25 및 30℃의 온도 조건에서는 0과 10ng/ml 농도의 비타민 D에 대한 검사선의 형광량(T area)이 구분되지 않는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 39℃에서는 32, 35 및 37℃ 조건에 비해 형광 측정값의 농도별 차이가 다시 감소되는 경향을 보였다. 검사선에서 측정된 형광량(T-area)을 대조선에서 측정된 형광량(C-area)으로 나눈 값인 ratio와 이의 백분율 환산값을 살펴보면 비타민 D 시료 농도에 따른 형광 측정값이 뚜렸하게 차이나서, 시료 농도의 구분에 보다 유리한 온도 조건은 32~37℃의 범위인 것으로 확인되었다.
실시예 2. 표준조건을 이용한 성능 분석
상기 실시예 1을 통해 본 발명의 방법은 35℃의 조건에서 수행하는 것으로 결정하고, 본 발명의 방법을 이용한 시료 분석의 정밀도와 정확도를 분석하였다.
정밀도는 제조 로트(Between-lot), 시험자(Between-person), 동일 로트의 반복회차/일자(Between-day) 및 동일 로트의 수행장소(Between-site) 별로 표준 물질에 대한 측정 결과를 분석하였다.
정밀도 분석
표준물질
농도(ng/ml)		 Between-lot Between-person Between-day Between-site
평균 변동계수* 평균 변동계수 평균 변동계수 평균 변동계수
9.59 9.63 9.12 9.37 8.80 9.40 11.26 9.53 10.03
23.76 23.08 5.87 23.03 5.87 24.26 6.11 23.02 6.68
64.78 64.29 5.30 64.21 4.65 64.58 4.25 64.64 3.56
*변동계수: 평균에 대한 표준편차의 백분율(%)
그 결과, 상기 표 1과 같이 다양한 조건에서 로트별, 수행자별, 반복일자별 및 장소별로 측정결과에 큰 차이가 없음을 확인할 수 있었다. 또한, 3개 로트의 제품으로 3가지 농도의 표준물질에 대해 10회 반복 측정한 결과, 하기 표 2와 같이 회수율이 97~100% 수준으로 확인되어, 표준물질 농도와 동일한 수치로 측정된 것을 알 수 있었다. 이를 통해 본 발명의 비타민 D 측정방법의 정확도가 우수함을 알 수 있었다.
정확도 분석
표준물질 농도(ng/ml) Lot1 Lot2 Lot3 평균 표준편차 변동계수
(%)		 회수율*
(%)
9.59 9.56 9.74 9.61 9.63 0.88 9.12 100.46
23.76 22.71 22.84 23.68 23.08 1.35 5.87 97.13
64.78 63.21 65.05 64.62 64.29 3.41 5.30 99.25
*회수율: 측정치의 평균/표준물질 농도 x 100
실시예 3. 비교상관성
45개의 혈청 검체에 대해 본 발명의 형광측정 장비와 면역화학 분석장비인 Cobas e 411(로슈, 스위스)를 이용하여 비타민 D의 농도를 측정하고 비교분석하였다. 그 결과, 도 3과 같이 양 장비의 정량 분석 결과값은 Y = 1.1629X - 0.2829의 선형회귀식을 보였으며, 상관계수(R)는 0.9551을 나타냈다. 이를 통해, 본 발명의 측정값이 기준장비의 측정값과 비교하여 큰 차이가 없음을 알 수 있었다.

Claims (5)

  1. (a) 생물학적 시료와 0.4~0.6N 수산화나트륨 및 35~45%(v/v) DMSO(dimethyl sulfoxide)로 이루어진 방출(releasing) 버퍼를 혼합하여 32~37℃에서 3~7분동안 반응시켜 제1 반응물을 제조하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계의 제1 반응물에 형광표지된 항-25-히드록시비타민 D 항체를 포함하는 검출 버퍼를 첨가하여 32~37℃에서 13~17분동안 반응시켜 제2 반응물을 제조하는 단계; 및
    (c) 상기 (b) 단계의 제2 반응물을 측방유동 카트리지에 로딩하고 6~10분동안 반응시킨 후 형광측정기로 형광세기를 측정하는 단계;를 포함하는 측방유동 카트리지에서 형광측정법을 이용한 25-히드록시비타민 D(25-OH-D)의 신속 정량 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 측방유동 카트리지는, 시료를 주입하는 시료 주입부; 상기 시료 주입부로부터 일정간격이 이격된 위치에 소혈청알부민과 25-히드록시비타민 D의 복합체가 고정된 검사선(test line); 및 토끼 IgG가 고정된 대조선(control line)이 순차적으로 구비된 테스트 스트립 형태인 것을 특징으로 하는 측방유동 카트리지에서 형광측정법을 이용한 25-히드록시비타민 D(25-OH-D)의 신속 정량 방법.
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