KR102040982B1 - Mass production technology of recombinant botulinum toxin protein - Google Patents

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Abstract

본 발명은 고용해성 녹색형광 단백질과 보툴리늄 독소 단백질의 융합단백질 구성을 통한 재조합 보툴리늄 독소 단백질의 대량생산 기술에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 보툴리늄 독소 단백질은 고용해성의 GFP-HS1 태그와 보툴리늄 독소 단백질을 융합한 것으로, 재조합 단백질의 발현 시 세포질 내 용해도가 향상되어 생산수율이 우수하며, 비-독성인 완전독소(holotoxin)로서 발현되고, 프로테아제 영역을 포함하여 단백질 발현 후 분리 정제뿐만 아니라 활성화 형태의 보툴리늄 독소를 수득하는 데에도 용이하다.The present invention relates to a mass production technology of recombinant botulinum toxin protein through the fusion protein composition of the high resolution green fluorescent protein and the botulinum toxin protein. Recombinant botulinum toxin protein of the present invention is a fusion of a high-soluble GFP-HS1 tag and botulinum toxin protein, and improves the solubility in the cytoplasm when the recombinant protein is expressed, resulting in excellent production yield and non-toxic holotoxin. It is expressed as and is easy to obtain the activated form of botulinum toxin as well as to separate and purify after protein expression, including the protease region.

Description

고용해성 녹색형광 단백질과 보툴리늄 독소 단백질의 융합단백질 구성을 통한 재조합 보툴리늄 독소 단백질의 대량생산 기술{Mass production technology of recombinant botulinum toxin protein}Mass production technology of recombinant botulinum toxin protein by fusion protein composition of high dissolved green fluorescent protein and botulinum toxin protein

본 발명은 고용해성 녹색형광 단백질과 보툴리늄 독소 단백질의 융합단백질 구성을 통한 재조합 보툴리늄 독소 단백질의 대량생산 기술에 관한 것이다.The present invention relates to a mass production technology of recombinant botulinum toxin protein through the fusion protein composition of the high resolution green fluorescent protein and the botulinum toxin protein.

보툴리늄 신경독소 타입 A(Botulinum neurotoxin type A, BoNT/A)는 Clostridium botulinum으로부터 생산되고, serotype A 독소는 현재까지 많은 신경학적 및 비-신경학적 장애의 치료용도로 임상적으로 가장 널리 사용되는 독소이다. 이 독소는 150 kDa의 단백질로, 경쇄(light chain, LC) 및 중쇄(heavy chain, HC)의 두개의 서브 유닛을 포함하며, 각각은 50 kDa, 및 100 kDa 이다. 상기 LC는 실제 독소이고, HC는 타겟에 결합하여 HC의 아미노 말단 영역에 의해 LC를 세포질 내로 변위시키는 역할을 한다.Botulinum neurotoxin type A (BoNT / A) is produced from Clostridium botulinum and serotype A toxin is by far the most widely used toxin for the treatment of many neurological and non-neuronal disorders. . This toxin is a 150 kDa protein that contains two subunits, light chain (LC) and heavy chain (HC), each 50 kDa and 100 kDa. The LC is the actual toxin and the HC binds to the target and serves to displace the LC into the cytoplasm by the amino terminal region of the HC.

상기 HC는 운동 신경의 외부수용체(ectoacceptor)에 결합하여 세포내 함입(endocytosis)에 의해 침입하고, LC는 HC의 아미노 말단 영역에 의해 세포질 내로 변위된다. 마지막으로, 아연-프로테아제 패밀리(zinc-protease family)에 속하는 효소적 도메인 LC는 특별히 SNARE25 단백질을 절단하고, SNARE25 단백질은 시냅스 접합부(junction)에서 아세틸콜린의 방출을 억제한다. 이 독소는 본질적으로 비-독성인 완전독소(holotoxin)로서 단일 사슬로서 생산되고, C. botulinum 프로테아제의 세포 내 프로테아제는 LC 및 HC 영역의 접합부를 절단하여 LC 및 HC 도메인 간의 이황화 결합에 의해 결합된 이중-사슬 분자(di-chain molecule)를 형성한다.The HC binds to the ectoacceptor of the motor nerve and invades by intracellular endocytosis, and the LC is displaced into the cytoplasm by the amino terminal region of the HC. Finally, the enzymatic domain LC belonging to the zinc-protease family specifically cleaves the SNARE25 protein, which inhibits the release of acetylcholine at synaptic junctions. This toxin is produced essentially as a non-toxic holotoxin as a single chain, and the intracellular protease of C. botulinum protease is cleaved at the junction of the LC and HC regions to be bound by disulfide bonds between the LC and HC domains. Form a di-chain molecule.

통상적으로, BoNT/A는 Clostridium 종으로부터 생산되며, 생물학적 안전 수준 (BL3) 설비를 필요로 하는 수 개의 정제 및 복잡한 결정화 단계를 필요로 한다. 따라서 위와 같은 생물학적 안전 수준 설비가 필요 없도록 안전하면서도, 수율이 높고, 복잡한 분리 정제 과정이 필요 없는 새로운 보툴리늄 독소 단백질의 생산기술 개발의 필요성이 높아지고 있다.Typically, BoNT / A is produced from Clostridium species and requires several purification and complex crystallization steps that require a biological safety level (BL3) facility. Therefore, there is a growing need to develop a new botulinum toxin protein production technology that is safe and does not require such a biological safety level, and does not require a complicated separation and purification process.

대한민국 공개특허 제10-2003-0060150호Republic of Korea Patent Publication No. 10-2003-0060150

본 발명자들은 생물학적 안전 수준 설비가 필요 없도록 안전하면서도, 수율이 높고, 복잡한 분리 정제 과정이 필요 없는 새로운 보툴리늄 독소 단백질의 생산기술을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 고용해성 녹색형광 단백질과 보툴리늄 독소 단백질의 융합단백질 구성을 통한 재조합 보툴리늄 독소 단백질의 컨스트럭트를 제조하고 이를 대장균에서 대량 발현시키고, 분리 정제하는데 성공함으로써 본 발명을 완성하였다.The present inventors earnestly researched to develop a new botulinum toxin protein production technology that is safe, does not require a biological safety level equipment, high yield, and does not require a complex separation and purification process. As a result, the present invention was completed by preparing a construct of recombinant botulinum toxin protein through the fusion protein construction of the high-solubility green fluorescence protein and the botulinum toxin protein, expressing it in E. coli, and successfully purifying and separating it.

따라서 본 발명은 보툴리늄 독소 단백질의 융합단백질 구성을 통한 재조합 보툴리늄 독소 단백질 및 이의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.Therefore, an object of the present invention is to provide a recombinant botulinum toxin protein and a method for producing the same by fusion protein construction of the botulinum toxin protein.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.Other objects and advantages of the present invention will become apparent from the following detailed description, claims and drawings.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 재조합 보툴리늄 독소 단백질의 제조를 위한 융합단백질로서, (a) 태깅 단백질; (b) 형광단백질; (c) 프로테아제 인식 아미노산 서열(protease recognition amino acid sequence); (d) 보툴리늄 A 타입 독소 경쇄(light chain of Botulinum neurotoxin type A); (e) 프로테아제 인식 아미노산 서열; 및 (f) 보툴리늄 A 타입 독소 중쇄(heavy chain of BoNT/A)가 순차적으로 융합된 융합 단백질을 제공한다. In order to achieve the above object, the present invention is a fusion protein for the production of recombinant botulinum toxin protein, (a) tagging protein; (b) fluorescent proteins; (c) protease recognition amino acid sequence; (d) light chain of Botulinum neurotoxin type A; (e) protease recognition amino acid sequences; And (f) a fusion protein in which the botulinum A type toxin heavy chain of BoNT / A is sequentially fused.

본 명세서에서 용어, "융합단백질(fusion protein)"은 단백질에 한 개 이상의 다른 단백질의 유전자를 연결시킨 후 발현시킨 인공 재조합 단백질을 의미한다. 융합단백질을 만들어서 얻을 수 있는 가장 큰 이점은 A 단백질에 B 단백질을 연결함으로써 그 기능에 시너지 효과를 기대할 수 있다는 점이다. 예를 들어, 1) A 단백질을 인식하는 항체가 존재하지 않지만 B 단백질을 인식하는 항체가 존재할 경우, B 단백질을 인식하는 항체를 사용한 western blot 등으로 A 단백질의 발현 정도를 확인할 수 있다. 또한 2) B 단백질의 성질을 이용하여 단백질 정제를 용이하게 할 수 있다. 또는 3) A 단백질이 세포에 결합하고 B 단백질이 형광을 띄는 경우, 융합단백질 AB를 이용한 flow cytometry 실험이 가능하다.As used herein, the term “fusion protein” refers to an artificial recombinant protein that is expressed after linking a gene of one or more other proteins to the protein. The biggest advantage of making a fusion protein is that it can be synergistic in its function by linking B protein to A protein. For example, 1) If there is no antibody that recognizes A protein, but there is an antibody that recognizes B protein, the expression level of A protein can be confirmed by western blot using an antibody that recognizes B protein. 2) protein purification can be facilitated using the properties of B protein. Or 3) When A protein binds to cells and B protein fluoresces, flow cytometry experiments using fusion protein AB are possible.

본 명세서에서 용어 "태깅 단백질(tagging protein, protein tag)"은 "표지단백질"이라고도 불리우며, 재조합 단백질에 유전적으로 이식된 펩타이드 서열이다. 종종 이 표지들은 화학작용제를 이용하거나 또는 단백질분해나 인테인 스플라이싱(intein splicing)과 같은 효소적 방법 등을 통해 제거할 수 있다. 단백질 태그는 친화성 태그, 가용화 태그, 크로마토그래피 태그, 항원결정기 태그, 형광 표지 등 다양한 목적으로 단백질에 부착된다. As used herein, the term "tagging protein (protein tag)" is also referred to as "labeled protein", and is a peptide sequence genetically transplanted into a recombinant protein. Often these labels can be removed using chemical agents or by enzymatic methods such as proteolysis or intein splicing. Protein tags are attached to proteins for various purposes, such as affinity tags, solubilization tags, chromatography tags, epitope tags, fluorescent labels, and the like.

본 발명에서 상기 태깅 단백질은 친화성 표지(Affinity tags)의 의미로 사용된다. 친화성 표지는 본래의 생물학적 재료로부터 친화도를 이용한 기술(Affinity technique)을 이용하여 정제할 수 있다. 이는 키틴결합단백질(CBP), 말토스결합단백질(MBP), 글루타치온-S-전이효소(GST) 등을 포함한다. 폴리(히스티딘) 표지(Polyhistidine-tag)가 단백질 표지 재료로 널리 이용되며 금속 기질에 결합한다.In the present invention, the tagging protein is used in the sense of Affinity tags. Affinity labels can be purified from the original biological material using the Affinity technique. This includes chitin binding protein (CBP), maltose binding protein (MBP), glutathione-S-transferase (GST) and the like. Polyhistidine-tags are widely used as protein labeling materials and bind to metal substrates.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 태깅 단백질은 4 내지 10개의 폴리(히스티딘), 키틴결합단백질(CBP), 말토스결합단백질(MBP), 또는 글루타치온 S-전이효소(GST)이다.In one embodiment of the invention, the tagging protein is 4 to 10 poly (histidine), chitin binding protein (CBP), maltose binding protein (MBP), or glutathione S-transferase (GST).

본 명세서에서 용어 형광단백질은 형광을 발현하는 단백질로서 다양한 용도의 생물학적 마커로서 사용되는 단백질이다. As used herein, the term fluorescent protein is a protein used as a biological marker for various uses as a protein expressing fluorescence.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 형광단백질은 녹색 형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 적색 형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 노란색 형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 또는 청록색 형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP)이나, 이에 한정되는 것은 아니며 당업계에서 사용되는 다양한 형광단백질이 사용될 수 있다. In one embodiment of the invention, the fluorescent protein is a green fluorescent protein (green fluorescent protein (GFP), red fluorescent protein (RFP), yellow fluorescent protein (YFP), or cyan fluorescent protein (cyan fluorescent protein, CFP), but is not limited to a variety of fluorescent proteins used in the art can be used.

본 명세서에서 "프로테아제(protease)"는 단백질 또는 펩타이드(peptide)에서 펩타이드 결합의 가수분해를 촉매하는 효소를 의미하며 단백질 분해효소라고도 한다. 프로테아제의 종류에는 폴리펩티드 사슬의 말단에만 작용, 아미노산 혹은 디펩티드를 차례로 유리(遊離)시키는 엑소펩티다아제(예 : 류신아미노펩티다아제 · 카르복시펩티다아제 · 디펩티딜펩티다아제)와, 내부에 작용해 여러 가지 크기의 펩티드를 유리시키는 엔도펩티다아제(예 : 펩신이나 트립신)의 2가지로 나누어진다.As used herein, "protease" refers to an enzyme that catalyzes the hydrolysis of peptide bonds in a protein or peptide and is also referred to as protease. Types of proteases include exopeptidase (for example, leucine aminopeptidase, carboxypeptidase, dipeptidyl peptidase), which act only at the end of the polypeptide chain and in turn release amino acids or dipeptides, and peptides of various sizes that act inside. It is divided into two types of endopeptidase which releases (eg pepsin or trypsin).

상술한 바와 같이, 본 발명의 일 양태는 재조합 보툴리늄 독소 단백질의 제조를 위한 융합단백질로서, (a) 태깅 단백질; (b) 형광단백질; (c) 프로테아제 인식 아미노산 서열(protease recognition amino acid sequence); (d) 보툴리늄 A 타입 독소 경쇄(light chain of Botulinum neurotoxin type A); (e) 프로테아제 인식 아미노산 서열; 및 (f) 보툴리늄 A 타입 독소 중쇄(heavy chain of BoNT/A)가 순차적으로 융합된 융합 단백질을 제공하는 것이다.As described above, one aspect of the present invention is a fusion protein for the production of recombinant botulinum toxin protein, comprising: (a) a tagging protein; (b) fluorescent proteins; (c) protease recognition amino acid sequence; (d) light chain of Botulinum neurotoxin type A; (e) protease recognition amino acid sequences; And (f) a fusion protein in which a botulinum A type toxin heavy chain of BoNT / A is sequentially fused.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 (c) 또는 (e)의 프로테아제는 엔테로키나제(enterokinase), Xa 인자(Factor Xa), HRV3C 프로테아제, TEV 프로테아제(Tobacco Etch Virus protease), 또는 트롬빈(thrombin)이다. In one embodiment of the invention, the protease of (c) or (e) is enterokinase (enterokinase), Factor Xa (Factor Xa), HRV3C protease, TEV protease (Tobacco Etch Virus protease), or thrombin (thrombin) .

본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 프로테아제가 엔테로키나제인 경우 엔테로키나제가 인식하는 아미노산 서열은 '-DDDDK/비프롤린 아미노산-'이다.In a specific embodiment of the present invention, when the protease is enterokinase, the amino acid sequence recognized by enterokinase is '-DDDDK / biproline amino acid-'.

본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 프로테아제가 Xa 인자인 경우 Xa 인자가 인식하는 아미노산 서열은 '-IE(or D)GR/-'이다.In a specific embodiment of the present invention, when the protease is factor Xa, the amino acid sequence recognized by factor Xa is '-IE (or D) GR /-'.

본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 프로테아제가 HRV3C인 경우 HRV3C 프로테아제가 인식하는 아미노산 서열은 '-LEVLFQ/GP-'이다.In a specific embodiment of the present invention, when the protease is HRV3C, the amino acid sequence recognized by the HRV3C protease is '-LEVLFQ / GP-'.

본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 프로테아제가 TEV 프로테아제인 경우 TEV 프로테아제가 인식하는 아미노산 서열은 '-ENLYFQ/G-'In a specific embodiment of the present invention, when the protease is a TEV protease, the amino acid sequence recognized by the TEV protease is '-ENLYFQ / G-'

본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 프로테아제가 트롬빈인 경우 트롬빈이 인식하는 아미노산 서열은 -P4P3PR(or K)/P1'P2'- 또는 -P2"R(or K)/P1"- 이다. 여기에서 P4P3는 소수성 아미노산이고, P1'P2'은 비산성 아미노산이며, P2", P1"은 G이다.In a specific embodiment of the invention, if the protease is thrombin, the amino acid sequence of the thrombin recognition -P 4 P 3 PR (or K ) / P 1 'P 2' - or -P 2 "R (or K) / P 1 "-. P 4 P 3 is a hydrophobic amino acid, P 1 'P 2 ' is a non-acidic amino acid, P 2 ", P 1 " is G.

여기에서 상기 프로테아제 인식 아미노산 서열 중 "/"는 절단 사이트(cleavage site)를 의미한다. Herein, "/" in the protease recognition amino acid sequence means a cleavage site.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 재조합 보툴리늄 독소 단백질의 제조를 위한 융합단백질은 서열목록 제1서열의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 제1서열의 아미노산 서열로 이루어진 단백질의 생물학적 기능 균등물의 범위까지 포함된다.According to another embodiment of the present invention, the fusion protein for preparing the recombinant botulinum toxin protein may be composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto. It also covers the range of biological equivalents.

본 발명의 재조합 보툴리늄 독소 단백질 범위에 포함될 수 있는 생물학적 기능 균등 물은 본 발명의 재조합 단백질과 균등한 생물학적 활성을 발휘하는 아미노산 서열의 변이에 한정될 것이라는 것은 당업자에게 명확하다.It will be apparent to those skilled in the art that biological equivalents that may be included in the range of recombinant botulinum toxin proteins of the present invention will be limited to variations in amino acid sequences that exert biological activity equivalent to the recombinant proteins of the present invention.

이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.Such amino acid variations are made based on the relative similarity of amino acid side chain substituents such as hydrophobicity, hydrophilicity, charge, size, and the like. By analysis of the size, shape and type of amino acid side chain substituents, arginine, lysine and histidine are all positively charged residues; Alanine, glycine and serine have similar sizes; It can be seen that phenylalanine, tryptophan and tyrosine have a similar shape. Thus, based on these considerations, arginine, lysine and histidine; Alanine, glycine and serine; Phenylalanine, tryptophan and tyrosine are biologically equivalent functions.

상기 변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스 (hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신 (+4.5); 발린 (+4.2); 류신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글라이신 (-0.4); 쓰레오닌 (-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 타이로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르테이트 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 라이신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5).In introducing such mutations, the hydropathic index of amino acids can be considered. Each amino acid is assigned a hydrophobicity index depending on its hydrophobicity and charge: isoleucine (+4.5); Valine (+4.2); Leucine (+3.8); Phenylalanine (+2.8); Cysteine / cysteine (+2.5); Methionine (+1.9); Alanine (+1.8); Glycine (-0.4); Threonine (-0.7); Serine (-0.8); Tryptophan (-0.9); Tyrosine (-1.3); Proline (-1.6); Histidine (-3.2); Glutamate (-3.5); Glutamine (-3.5); Aspartate (-3.5); Asparagine (-3.5); Lysine (-3.9); And arginine (-4.5).

펩타이드의 상호적인 생물학적 기능 (interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 구체적으로는 ± 2 이내, 보다 구체적으로는 ± 1 이내, 보다 더 구체적으로는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.Hydrophobic amino acid indexes are very important in conferring the interactive biological function of peptides. It is known that substitution with amino acids having similar hydrophobicity indexes can retain similar biological activity. When introducing mutations with reference to the hydrophobicity index, substitutions are made between amino acids that exhibit hydrophobicity index differences within ± 2, more specifically within ± 1, and even more specifically within ± 0.5.

한편, 유사한 친수성 값 (hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 펩타이드를 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌 (+3.0); 라이신 (+3.0); 아스팔테이트(+3.0± 1); 글루타메이트 (+3.0± 1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글라이신 (0); 쓰레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5 ± 1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 루이신 (-1.8); 아이소루이신 (-1.8); 타이로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 트립토판 (-3.4).On the other hand, it is also well known that substitutions between amino acids with similar hydrophilicity values result in peptides with equivalent biological activity. As disclosed in US Pat. No. 4,554,101, the following hydrophilicity values are assigned to each amino acid residue: arginine (+3.0); Lysine (+3.0); Asphaltate (+ 3.0 ± 1); Glutamate (+ 3.0 ± 1); Serine (+0.3); Asparagine (+0.2); Glutamine (+0.2); Glycine (0); Threonine (-0.4); Proline (-0.5 ± 1); Alanine (-0.5); Histidine (-0.5); Cysteine (-1.0); Methionine (-1.3); Valine (-1.5); Leucine (-1.8); Isoleucine (-1.8); Tyrosine (-2.3); Phenylalanine (-2.5); Tryptophan (-3.4).

친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 구체적으로는 ± 2 이내, 보다 구체적으로는 ± 1 이내, 보다 더 구체적으로는 ± 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.When introducing mutations with reference to hydrophilicity values, substitutions are made between amino acids that exhibit hydrophilicity value differences within ± 2, more specifically within ± 1, and even more specifically within ± 0.5.

분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다 (H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.Amino acid exchange in peptides that do not alter the activity of the molecule as a whole is known in the art (H. Neurode, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). The most commonly occurring exchanges are amino acid residues Ala / Ser, Val / Ile, Asp / Glu, Thr / Ser, Ala / Gly, Ala / Thr, Ser / Asn, Ala / Val, Ser / Gly, Thy / Phe, Ala / Exchange between Pro, Lys / Arg, Asp / Asn, Leu / Ile, Leu / Val, Ala / Glu, Asp / Gly.

상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 재조합 보툴리늄 독소 단백질은 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성 (substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 구체적으로는 90%의 상동성, 가장 구체적으로는 98%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10(1990))은 NBCI (National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn and tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLAST는 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.Considering the above-described variations with biologically equivalent activity, the recombinant botulinum toxin protein of the present invention is also interpreted to include sequences that exhibit substantial identity with the sequences listed in the Sequence Listing. This substantial identity is at least 80% when the sequences of the present invention are aligned with each other as closely as possible and the aligned sequences are analyzed using algorithms commonly used in the art. By homology, more specifically, 90% homology, most specifically 98% homology. Alignment methods for sequence comparison are known in the art. Various methods and algorithms for alignment are described in Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48: 443 (1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31 (1988); Higgins and Sharp, Gene 73: 237-44 (1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5: 151-3 (1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16: 10881-90 (1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8: 155-65 (1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24: 307-31 (1994). NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-10 (1990)) is accessible from the National Center for Biological Information (NBCI), etc. It can be used in conjunction with sequencing programs such as blastx, tblastn and tblastx. BLAST is accessible at www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/. Sequence homology comparisons using this program can be found at www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 재조합 보툴리늄 독소 단백질의 제조를 위한 융합단백질로서, (a) 태깅 단백질; (b) 형광단백질; (c) 프로테아제 인식 아미노산 서열(protease recognition amino acid sequence); (d) 보툴리늄 A 타입 독소 경쇄(light chain of Botulinum neurotoxin type A); (e) 프로테아제 인식 아미노산 서열; 및 (f) 보툴리늄 A 타입 독소 중쇄(heavy chain of BoNT/A)가 순차적으로 융합된 융합 단백질을 인코딩하는 염기서열을 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. According to another aspect of the invention, the invention is a fusion protein for the production of recombinant botulinum toxin protein, (a) a tagging protein; (b) fluorescent proteins; (c) protease recognition amino acid sequence; (d) light chain of Botulinum neurotoxin type A; (e) protease recognition amino acid sequences; And (f) a nucleotide sequence encoding a fusion protein in which a botulinum A type toxin heavy chain of BoNT / A is sequentially fused.

본 명세서에서 용어 "핵산분자"는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산분자에서 기본구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).As used herein, the term "nucleic acid molecule" has the meaning of comprehensively including DNA (gDNA and cDNA) and RNA molecules, and the nucleotides that are the basic structural units in nucleic acid molecules are natural nucleotides, as well as analogs in which sugar or base sites are modified. and also analogues (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York (1980); Uhlman and Peyman, Chemical Reviews, 90: 543-584 (1990)).

뉴클레오타이드에서의 변이는 단백질에서 변화를 가져오지 않는 것도 있다는 사실은 당업자에게 잘 알려져 있다. 따라서 상기 재조합 보툴리늄 독소 단백질을 인코딩하는 핵산 분자는 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈(예를 들어, 코돈의 축퇴성에 의해, 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 핵산분자를 포함한다.It is well known to those skilled in the art that variations in nucleotides do not result in changes in protein. Thus, the nucleic acid molecule encoding the recombinant botulinum toxin protein may be a functionally equivalent codon or a codon encoding the same amino acid (eg, due to the degeneracy of the codon, six codons for arginine or serine), or biologically Nucleic acid molecules comprising codons that encode equivalent amino acids.

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 융합단백질을 인코딩하는 핵산분자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다. According to another aspect of the present invention, the present invention provides a recombinant expression vector comprising a nucleic acid molecule encoding the fusion protein described above.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 재조합 발현벡터는 플라스미드, YAC (yeast artificial chromosome), YEp (yeast episomal plasmid), YIp (yeast integrative plasmid), 및 재조합바이러스 등으로부터 선택되나, 이에 한정되는 것은 아니다. In one embodiment of the present invention, the recombinant expression vector is selected from plasmid, YAC (yeast artificial chromosome), YEp (yeast episomal plasmid), YIp (yeast integrative plasmid), recombinant virus and the like, but is not limited thereto. .

본 발명의 상기 재조합 발현벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.The recombinant expression vector system of the present invention can be constructed through various methods known in the art, and specific methods thereof are disclosed in Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001). This document is incorporated herein by reference.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵세포 또는 진핵세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 본 발명의 핵산 분자가 원핵세포 유래이고, 배양의 편의성 등을 고려하여, 원핵세포를 숙주로 하는 것이 바람직하다.Vectors of the present invention can typically be constructed as vectors for cloning or vectors for expression. In addition, the vector of the present invention can be constructed using prokaryotic or eukaryotic cells as hosts. The nucleic acid molecule of the present invention is derived from prokaryotic cells, and it is preferable to use prokaryotic cells as a host in consideration of the convenience of culture.

예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ 프로모터, pRλ 프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 E. coli가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위 (Yanofsky, C., J.Bacteriol., 158:1018-1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (pLλ프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet., 14:399-445(1980))가 조절 부위로서 이용될 수 있다.For example, when the vector of the present invention is an expression vector and the prokaryotic cell is a host, powerful promoters capable of promoting transcription (e.g., tac promoter, lac promoter, lacUV5 promoter, lpp promoter, pLλ promoter, pRλ promoter) , rac5 promoter, amp promoter, recA promoter, SP6 promoter, trp promoter and T7 promoter, etc.), ribosome binding sites and transcription / detox termination sequences for initiation of translation. When E. coli is used as the host cell, the promoter and operator sites of the E. coli tryptophan biosynthetic pathway (Yanofsky, C., J. Bacteriol., 158: 1018-1024 (1984)) and the leftward promoter of phage λ (pLλ) Promoter, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet., 14: 399-445 (1980)) can be used as regulatory sites.

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pUC19 및 pET 등), 파지(예: λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.On the other hand, vectors that can be used in the present invention are plasmids (eg, pSC101, ColE1, pBR322, pUC8 / 9, pHC79, pUC19 and pET, etc.), phages (eg, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1, etc.) which are often used in the art And M13, etc.) or viruses (eg, SV40, etc.).

한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.On the other hand, when the vector of the present invention is an expression vector and the eukaryotic cell is a host, a promoter derived from the genome of the mammalian cell (for example, metallothionine promoter) or a promoter derived from a mammalian virus (for example, adeno) Late viral promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, cytomegalovirus promoter and tk promoter of HSV) can be used and generally have a polyadenylation sequence as a transcription termination sequence.

본 발명의 벡터는 그로부터 발현되는 단백질의 정제를 용이하게 하기 위하여, 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질 (NEB, USA), FLAG (IBI, USA) 및 6x His (hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있고, 가장 구체적으로는 6x His이다. 상기 정제를 위한 추가적인 서열 때문에, 숙주에서 발현된 단백질은 친화성 크로마토그래피를 통하여 신속하고, 용이하게 정제된다.Vectors of the invention may be fused with other sequences to facilitate purification of the protein expressed therefrom. Sequences to be fused include, for example, glutathione S-transferase (Pharmacia, USA), maltose binding protein (NEB, USA), FLAG (IBI, USA) and 6x His (hexahistidine; Quiagen, USA), and most particularly Is 6 × His. Because of the additional sequence for this purification, the protein expressed in the host is purified quickly and easily through affinity chromatography.

본 발명의 구체적인 구현 예에 따르면, 상기 융합 서열이 포함되어 있는 벡터에 의해 발현된 융합 단백질은 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된다. 예컨대, 글루타티온-S-트랜스퍼라제가 융합된 경우에는 이 효소의 기질인 글루타티온을 이용할 수 있고, 6x His이 이용된 경우에는 Ni-NTA His-결합 레진 컬럼 (Novagen, USA) 등을 이용하여 소망하는 단백질을 신속하고 용이하게 얻을 수 있다.According to a specific embodiment of the present invention, the fusion protein expressed by the vector containing the fusion sequence is purified by affinity chromatography. For example, when glutathione-S-transferase is fused, glutathione, which is a substrate of this enzyme, can be used, and when 6x His is used, a Ni-NTA His-binding resin column (Novagen, USA) or the like can be used. Proteins can be obtained quickly and easily.

한편, 본 발명의 발현 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.On the other hand, the expression vector of the present invention as an optional marker, and includes antibiotic resistance genes commonly used in the art, for example, ampicillin, gentamicin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin, kanamycin, geneticin, neo There are genes resistant to mycin and tetracycline.

또한, 본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 재조합 발현벡터를 포함하는 숙주세포를 제공한다.In addition, according to one aspect of the present invention, the present invention provides a host cell comprising the recombinant expression vector of the present invention described above.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 숙주세포는 세균, 효모, 곤충세포, 및 포유동물세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. In one embodiment of the invention, the host cell is selected from the group consisting of bacteria, yeast, insect cells, and mammalian cells.

본 발명의 벡터를 안정하게 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어있는 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli Origami2, E. coli JM109, E. coli BL21(DE3), E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110와 같은 E. coli 균주, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내 균과 균주 등이 있다.Host cells capable of stably and continuously cloning and expressing the vectors of the present invention can use any host cell known in the art, for example, E. coli Origami2, E. coli JM109, E. coli BL21 (DE3). ), E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli strains, Bacillus subtilis, Bacillus strains such as Bacillus Chuo ringen systems such as E. coli W3110, and Enteric bacteria and strains such as Salmonella typhimurium, Serratia marsonsons and various Pseudomonas species.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환 시키는 경우에는 숙주 세포로서, 이스트(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포 및 사람 세포(예컨대, CHO 세포주(Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 등이 이용될 수 있다.In addition, when transforming a vector of the present invention to eukaryotic cells, yeast ( Saccharomyce) as a host cell cerevisiae ), insect cells and human cells (eg, CHO cell lines (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN and MDCK cell lines) and the like.

본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵세포인 경우, CaCl2 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법(Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세 주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 숙주 세포 내로 주입할 수 있다.The method of carrying the vector of the present invention into a host cell is performed by the CaCl 2 method (Cohen, SN et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9: 2110-2114 (1973), when the host cell is a prokaryotic cell). ), One method (Cohen, SN et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9: 2110-2114 (1973); and Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166: 557-580 (1983)) and electroporation methods (Dower, WJ et al., Nucleic. Acids Res., 16: 6127-6145 (1988)) and the like. In addition, when the host cell is a eukaryotic cell, a micro-injection method (Capecchi, MR, Cell, 22: 479 (1980)), calcium phosphate precipitation method (Graham, FL et al., Virology, 52: 456 (1973)), Electroporation (Neumann, E. et al., EMBO J., 1: 841 (1982)), liposome-mediated transfection (Wong, TK et al., Gene, 10:87 (1980)), DEAE- Dextran treatment (Gopal, Mol. Cell Biol., 5: 1188-1190 (1985)), and gene balm (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87: 9568-9572 (1990)) Can be injected into the host cell.

숙주 세포 내로 주입된 벡터는 숙주 세포 내에서 발현될 수 있으며, 이러한 경우에는 다량의 재조합 보툴리늄 독소 단백질을 얻게 된다. 예를 들어, 상기 발현 벡터가 lac 프로모터를 포함하는 경우에는 숙주 세포에 IPTG를 처리하여 유전자 발현을 유도할 수 있다.Vectors injected into a host cell can be expressed in the host cell, in which case a large amount of recombinant botulinum toxin protein is obtained. For example, when the expression vector contains a lac promoter, the host cell may be treated with IPTG to induce gene expression.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 재조합 보툴리늄 독소 단백질의 제조방법을 제공한다:According to another aspect of the present invention, the present invention provides a method for producing a recombinant botulinum toxin protein, comprising the following steps:

(i) 제 9 항의 숙주세포를 융합단백질 발현이 가능한 조건 하에서 배양하는 단계; 및 (i) culturing the host cell of claim 9 under conditions capable of expressing a fusion protein; And

(ii) 생산된 융합단백질을 회수하는 단계. (ii) recovering the produced fusion protein.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 제조방법은 상술한 단계 이후에 (iii) 회수된 융합단백질에 프로테아제를 처리하여 융합단백질의 (c) 및 (e)의 프로테아제 인식 서열을 절단하는 단계를 추가적으로 포함하여 수행될 수 있다.In one embodiment of the present invention, the method further comprises the step of (iii) treating the recovered fusion protein after the above-mentioned step to cleave the protease recognition sequence of (c) and (e) of the fusion protein. It can be performed, including.

상기 제조방법은, 프로모터에 작동적으로 연결된 상기 재조합 보툴리늄 독소 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환 한 다음, 상기 형질 전환된 숙주세포를 배양한 후, 숙주세포의 배양액으로부터 재조합 보툴리늄 독소 단백질을 수득 하는 과정을 포함한다.The production method, after transforming the host cell with a recombinant vector comprising a nucleic acid molecule encoding the recombinant botulinum toxin protein operably linked to a promoter, and then culturing the transformed host cell, the culture medium of the host cell Obtaining a recombinant botulinum toxin protein from the protein.

본 명세서에서 용어 "작동적으로 연결된"은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사(transcription) 및/또는 번역(translation)을 조절하게 된다.As used herein, the term “operably linked” means a functional binding between a nucleic acid expression control sequence (eg, an array of promoters, signal sequences, or transcriptional regulator binding sites) and other nucleic acid sequences, whereby the regulatory sequence Will regulate the transcription and / or translation of said other nucleic acid sequences.

상기 형질 전환된 숙주세포가 배양되는 동안, 재조합 발현벡터 내의 재조합 보툴리늄 독소 단백질이 발현되어 본 발명의 재조합 보툴리늄 독소 단백질이 제조된다. 제조된 재조합 보툴리늄 독소 단백질은 배양액 내 또는 숙주세포 내에 존재하므로, 이를 분리, 정제함으로써 순수한 재조합 보툴리늄 독소 단백질을 수득할 수 있다.While the transformed host cell is cultured, the recombinant botulinum toxin protein in the recombinant expression vector is expressed to prepare the recombinant botulinum toxin protein of the present invention. Since the recombinant botulinum toxin protein prepared is present in culture or in host cells, pure recombinant botulinum toxin protein can be obtained by separating and purifying it.

형질 전환된 숙주세포의 배양은 공지된 숙주세포 배양 방법 또는 이를 변형한 방법으로 행할 수 있다. 예를 들어, 숙주세포가 대장균(E. coli)인 경우 형질전환 숙주세포의 배양을 위한 배지는 대장균이 효율적으로 이용할 수 있는 탄소원, 질소원, 무기염 등을 포함한다면 천연 배지 또는 합성 배지를 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 탄소원은 글루코오스, 프럭토오스, 수크로오스와 같은 탄수화물; 녹말, 녹말의 가수분해물; 아세트산 및 프로피온산과 같은 유기산; 에탄올, 프로판올, 글리세롤과 같은 알코올 등을 포함한다. 질소원은 암모니아; 염화암모늄, 암모늄설페이트, 암모늄아세테이트 및 암모늄포스페이트와 같은 무기산 또는 유기산의 암모늄염; 펩톤, 고기추출물(meat extract), 이스트추출물, 옥수수 침지액, 카제인 가수분해물, 대두추출물, 대두가수분해물; 다양한 발효된 세포 및 이들의 분해물 등을 포함한다. 무기염은 포타슘디하이드로젠 포스페이트, 다이포타슘하이드로젠 포스페이트, 마그네슘 포스페이트, 마그네슘 설페이트, 소디엄 클로라이드, 망간 설페이트, 구리 설페이트, 칼슘 카보네이트 등을 포함한다.Cultivation of the transformed host cell can be carried out by a known host cell culture method or a modified method thereof. For example, when the host cell is E. coli , the medium for culturing the transformed host cell may be a natural medium or a synthetic medium if the medium contains a carbon source, nitrogen source, or inorganic salt that E. coli can efficiently use. have. Carbon sources that can be used include carbohydrates such as glucose, fructose, sucrose; Starch, hydrolyzate of starch; Organic acids such as acetic acid and propionic acid; Alcohols such as ethanol, propanol, glycerol and the like. The nitrogen source is ammonia; Ammonium salts of inorganic or organic acids such as ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate and ammonium phosphate; Peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, casein hydrolyzate, soybean extract, soybean hydrolysate; Various fermented cells and their lysates and the like. Inorganic salts include potassium dihydrogen phosphate, dipotassiumhydrogen phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate and the like.

상기 배양은 통상적으로 진탕배양 또는 회전기에 의한 회전에 의한 것과 같은 호기성 조건하에서 행한다. 배양 온도는 바람직하게는 10 내지 40℃의 범위에서 행하고, 배양시간은 일반적으로 5 시간 내지 7 일간 행한다. 배지의 pH는 배양 중에서 바람직하게는 3.0 내지 9.0의 범위를 유지한다. 배지의 pH는 무기 또는 유기산, 알칼리 용액, 우레아, 칼슘 카보네이트, 암모니아 등으로 조절할 수 있다. 배양 중에는 필요한 경우 재조합 벡터의 유지 및 발현을 위해 암피실린, 스트렙토마이신, 클로람페니콜, 카나마이신 및 테트라사이클린과 같은 항생제를 첨가할 수 있다. 유도(induction) 가능한 프로모터를 갖는 재조합 발현 벡터로 형질 전환된 숙주세포를 배양하는 경우 필요하다면 배지에 적합한 유도제(inducer)를 첨가할 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터가 lac 프로모터를 함유하는 경우 IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)를 첨가하고, trp 프로모터를 포함하는 경우 인돌아크릴산(indoleacrylic acid)을 배지에 첨가할 수 있다.The culture is usually carried out under aerobic conditions, such as by shaking culture or rotation by a rotator. The culture temperature is preferably in the range of 10 to 40 ° C., and the culture time is generally 5 hours to 7 days. The pH of the medium is preferably maintained in the range of 3.0 to 9.0 during incubation. The pH of the medium can be adjusted with inorganic or organic acids, alkaline solutions, urea, calcium carbonate, ammonia, and the like. During the culturing, antibiotics such as ampicillin, streptomycin, chloramphenicol, kanamycin and tetracycline can be added for maintenance and expression of the recombinant vector, if necessary. When culturing host cells transformed with a recombinant expression vector having an inducible promoter, a suitable inducer may be added to the medium if necessary. For example, if the expression vector contains a lac promoter, IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) may be added, and if it contains a trp promoter, indoleacrylic acid may be added to the medium.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 융합단백질은 형광단백질로 GFP를 포함하고, N-말단에 Ni-NTA 정제에 도움을 주는 8x-His 서열을 포함한다. 본 발명에 따른 융합단백질은 대장균에서 발현되었으며, BoNT/A와 융합된 재조합 단일 사슬로서 용출되었다.According to an embodiment of the present invention, the fusion protein of the present invention comprises GFP as a fluorescent protein, and includes an 8x-His sequence at the N-terminus to help Ni-NTA purification. The fusion protein according to the present invention was expressed in E. coli and eluted as a recombinant single chain fused with BoNT / A.

본 발명의 경우 GFP의 녹색 형광을 사용하여 정제된 단백질의 존재 여부에 대해 쉽게 모니터링이 가능하므로, SDS-PAGE 또는 다른 검출 기술로 확인하지 않아도 되어 종래의 방법에 비하여 정제가 더욱 용이하다. 또한 정제된 단백질은 TEV 프로테아제를 사용한 효소적 절단에 적합한 완충액으로 투석된 후 TEV 프로테아제로 절단되었다. 상기 TEV 프로테아제는 타겟 서열을 매우 높은 특이성으로 인식하고, 인간뿐만 아니라 사용된 이종성 발현 숙주, 즉 대장균에도 전혀 없는 효소이므로 본 발명의 재조합 융합 단백질을 분리하기에 용이하다.In the case of the present invention, the green fluorescence of the GFP can be easily monitored for the presence of the purified protein. Therefore, it is not necessary to confirm by SDS-PAGE or other detection techniques, and thus the purification is easier than the conventional method. The purified protein was also cleaved with TEV protease after dialysis with a buffer suitable for enzymatic cleavage with TEV protease. The TEV protease recognizes the target sequence with very high specificity and is easy to isolate the recombinant fusion protein of the present invention because it is an enzyme that is not present in humans as well as in the heterologous expression host used, ie, Escherichia coli.

상기 정제된 단백질은 TEV 프로테아제를 이용하여 절단이 이루어진다. 본 발명의 재조합 단백질에는 GFP와 LC 사이, 및 LC와 HC 사이에 TEV 절단 부위가 두 위치에 존재하므로 TEV 프로테아제 처리 시 GFP가 분리되고, LC와 HC 사이에 이황화결합의 형성이 유도되어 활성화 이중-사슬 독소(active di-chain toxin)가 형성된다. 다시 말하면, 상기 대장균에서 발현된 재조합 단백질은 TEV 프로테아제로 절단(cleavage)되기 전에는 그 자체로서는 독성이 없는 완전독소(holotoxin)로서 매우 안전하다. 또한 TEV 프로테아제로 절단이 되어야만 GFP의 제거 및 독소의 활성화가 이루어진다. 따라서 본 발명의 재조합 보툴리늄 독소 단백질은 TEV 프로테아제로 절단하기 전까지의 발현과정에는 BL3 시설을 필요로 하지 않는다는 점에서 시설 비용을 크게 절감할 수 있는 장점이 있다. The purified protein is cleaved using TEV protease. In the recombinant protein of the present invention, since the TEV cleavage site is present at two positions between GFP and LC, and between LC and HC, GFP is separated upon TEV protease treatment, and the formation of disulfide bond between LC and HC is induced, thereby activating double- Active di-chain toxins are formed. In other words, the recombinant protein expressed in E. coli is very safe as a holotoxin which is not toxic in itself before cleavage with the TEV protease. In addition, the cleavage with TEV protease removes GFP and activates toxins. Therefore, the recombinant botulinum toxin protein of the present invention has an advantage of greatly reducing the facility cost in that the expression process until cleavage with the TEV protease does not require the BL3 facility.

이로 인해 생겨난 혼합물은 Ni-NTA 칼럼이나 겔 여과, 또는 막 차단 여과(membrane cut-off filtration)를 사용하여 간단히 정제될 수 있다.The resulting mixture can be simply purified using Ni-NTA columns, gel filtration, or membrane cut-off filtration.

마지막으로는 상기 혼합물에는 분리된 GFP와 이중-사슬 활성화 BoNT/A(LC-HC 단백질)가 혼재되어 있으므로, 이로부터 순수한 이중-사슬 활성화 BoNT/A(LC-HC 단백질)를 분리하여야 한다. 상술한 바와 같이 본 발명의 GFP(GFP-HS1)에는 His 택이 존재하므로 Ni-NTA 칼럼에 쉽게 결합된다. 따라서 상기 혼합물 용액을 Ni-NTA 칼럼에 통과시켜 GFP를 칼럼에 결합시킴으로써 최종적인 이중-사슬 활성화 BoNT/A(LC-HC 단백질)를 용출 액으로부터 수집할 수 있다. 겔 여과의 경우, TEV 프로테아제와 GFP는 각각 25 및 27 kDa의 서로 다른 분자량을 가지므로 쉽게 분리될 수 있다. 또한 분자량이 27 kDa 언저리인 GFP 또는 TEV와 비교하여 본 발명의 이중-사슬 활성화 BoNT/A는 분자량이 150 kDa이기 때문에 막 차단 여과에 의해 쉽게 정제될 수 있다. 비용을 더 절감하기 위하여, TEV 프로테아제는 E. coli에서 발현될 수 있고, TEV 발현 컨스트럭트를 사용하여 충분한 양이 제조될 수 있다. 고정된 TEV 칼럼은 최종 절단 과정에 사용될 수 있다.Finally, the mixture contains the separated GFP and double-chain activated BoNT / A (LC-HC protein), so pure double-chain activated BoNT / A (LC-HC protein) must be separated therefrom. As described above, GFP (GFP-HS1) of the present invention has a His tag, and thus is easily bound to a Ni-NTA column. Thus, the mixture solution can be passed through a Ni-NTA column to bind GFP to the column, thereby collecting the final double-chain activated BoNT / A (LC-HC protein) from the eluate. For gel filtration, TEV proteases and GFP have different molecular weights of 25 and 27 kDa, respectively, so they can be easily separated. In addition, compared to GFP or TEV having a molecular weight of 27 kDa, the double-chain activated BoNT / A of the present invention can be easily purified by membrane blocking filtration since the molecular weight is 150 kDa. To further reduce cost, TEV proteases can be expressed in E. coli and sufficient amounts can be made using TEV expression constructs. Fixed TEV columns can be used for the final cutting process.

본 발명의 재조합 보툴리늄 독소 단백질은 고용해성의 GFP-HS1 태그와 보툴리늄 독소 단백질을 융합한 것으로, 재조합 단백질의 발현 시 세포질 내 용해도가 향상되어 생산수율이 우수하며, 비-독성인 완전독소(holotoxin)로서 발현되고, 프로테아제 영역을 포함하여 단백질 발현 후 분리 정제뿐만 아니라 활성화 형태의 보툴리늄 독소를 수득하는 데에도 용이하다.Recombinant botulinum toxin protein of the present invention is a fusion of a high-soluble GFP-HS1 tag and botulinum toxin protein, and improves the solubility in the cytoplasm when the recombinant protein is expressed, resulting in excellent production yield and non-toxic holotoxin. It is expressed as and is easy to obtain the activated form of botulinum toxin as well as to separate and purify after protein expression, including the protease region.

도 1은 본 발명의 재조합 보툴리늄 독소 단백질의 클로닝 전략을 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명의 재조합 보툴리늄 독소 단백질의 아미노산 서열 및 구조를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 재조합 보툴리늄 독소 단백질의 발현 및 정제과정을 나타낸 모식도이다.
도 4는 본 발명의 발현 및 정제된 분획을 SDS-PAGE한 결과를 나타낸 도이다. SDS-PAGE에서는 정제 후 179 kDa의 표적 단백질(빨간색 화살표로 표시), 부분적으로 생성된 표적 단백질(파란색 화살표로 표시)을 나타내었다 [S; 용해성 단백질 추출물(soluble protein extract), I; 불용성 단백질 추출물(insoluble protein extract), TCP; 전체 세포 단백질(total cell protein), F1; Ni-NTA로부터 정제 된 분획, 및 M; 분자량 마커(molecular weight marker)].
도 5는 SDS-PAGE겔의 웨스턴 블롯 결과를 나타낸 도이다. A는 웨스턴블롯 결과 이미지를 나타낸다(M; 마커, I; 불용성 단백질 분획, 및 S; 가용성 단백질 분획) B는 정제된 분획은 GFP로 인하여 녹색을 나타내며, 이는 육안 검사를 통한 정제에 도움이 된다. 1 is a schematic diagram showing a cloning strategy of the recombinant botulinum toxin protein of the present invention.
2 is a diagram showing the amino acid sequence and structure of the recombinant botulinum toxin protein of the present invention.
Figure 3 is a schematic diagram showing the expression and purification of the recombinant botulinum toxin protein of the present invention.
4 is a diagram showing the results of SDS-PAGE of the expressed and purified fractions of the present invention. SDS-PAGE showed 179 kDa of target protein (indicated by red arrow) and partially generated target protein (indicated by blue arrow) after purification [S; Soluble protein extract, I; Insoluble protein extract, TCP; Total cell protein, F1; Fraction purified from Ni-NTA, and M; Molecular weight marker].
Figure 5 shows the Western blot results of the SDS-PAGE gel. A shows the western blot result image (M; marker, I; insoluble protein fraction, and S; soluble protein fraction) B shows that the purified fraction is green due to GFP, which is helpful for purification through visual inspection.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are only for illustrating the present invention in more detail, it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples in accordance with the gist of the present invention. .

실시예Example

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.Throughout this specification, "%" used to indicate the concentration of a particular substance, unless otherwise stated, solids / solids is (weight / weight)%, solids / liquids is (weight / volume)%, and Liquid / liquid is (volume / volume)%.

실시예Example 1: 재조합  1: recombination 보툴리늄Botulinum 독소 단백질  Toxin protein 컨스트럭트의Constructed 제작 making

본 발명의 재조합 보툴리늄 독소 단백질 컨스트럭트는 도 1 및 2에 나타낸 것과 같다.The recombinant botulinum toxin protein construct of the present invention is as shown in FIGS. 1 and 2.

도 1에 따르면, 본 발명의 재조합 보툴리늄 독소 단백질 컨스트럭트는 GFP-HS1, LC(light chain), 및 HC(heavy chain)를 포함한다. According to FIG. 1, the recombinant botulinum toxin protein construct of the invention comprises GFP-HS1, light chain (LC), and heavy chain (HC).

상기 GFP-HS1은 8x His 태깅된 녹색 형광단백질로, 이 GFP는 폴딩 및 안정성을 향상시킴으로써 높은 용해도를 증가시키기 위해 개발되었다. 상기 GFP-HS1은 고농도의 8 M 우레아에도 견딜 만큼 충분히 안정적이며 이의 폴딩 속도(folding rate)는 야생형의 것보다 2.3 배 빠르다. 따라서 이 GFP-HS1은 E. coli의 세포질에서 BoNT/A 발현의 용해도를 증가시키는 데 적합한 태그가 될 수 있다.The GFP-HS1 is an 8x His tagged green fluorescent protein, which was developed to increase high solubility by improving folding and stability. The GFP-HS1 is stable enough to withstand high concentrations of 8 M urea and its folding rate is 2.3 times faster than that of the wild type. Thus, this GFP-HS1 could be a suitable tag for increasing the solubility of BoNT / A expression in the cytoplasm of E. coli .

보툴리늄 신경독소 타입 A(Botulinum neurotoxin type A, BoNT/A)는 Clostridium botulinum으로부터 생산되는 독소로 총 150 kDa의 단백질이며, 약 50 kDa의 경쇄(light chain, LC) 및 약 100 kDa의 중쇄(heavy chain, HC)로 두개의 서브 유닛을 포함한다. 상기 LC는 실제 독소이고, 상기 HC는 타겟에 결합하여 HC의 아미노 말단 영역에 의해 LC를 세포질 내로 변위시키는 역할을 한다.Botulinum neurotoxin type A (BoNT / A) is a toxin produced from Clostridium botulinum , a total of 150 kDa protein, about 50 kDa light chain (LC) and about 100 kDa heavy chain. , HC) and two subunits. The LC is the actual toxin, and the HC binds to the target and serves to displace the LC into the cytoplasm by the amino terminal region of the HC.

도 1에 나타낸 표적 유전자 카세트는 pQE80-L 벡터에 클로닝 되었다. 상기 pQE80-L 벡터는 낮은 복사수를 가지고 적절한 폴딩을 돕는다. 표적 유전자 카세트는 EcoRI 및 SalI 사이트로 클로닝 되었다.The target gene cassette shown in FIG. 1 was cloned into the pQE80-L vector. The pQE80-L vector has a low copy number to aid proper folding. Target gene cassettes were cloned into EcoRI and SalI sites.

도 1의 다이어그램에 표시된 유전자 카세트는 N-말단부터 GFP-HS1, 링커 서열(GGSGGT), TEV (Tabacco Etch Virus) 프로테아제 부위(ENLYFQG)가 융합되어 있으며, LC 및 링커 서열(GSGG)이 뒤에 온다. 여기에 다시 TEV 프로테아제 부위 및 HC가 뒤따른다. 상기 표적 유전자 카세트는 완전독소(holotoxin)로서 단백질을 발현하는데 사용되며 이는 매우 안전하고 BL3 시설을 필요로 하지 않는다.The gene cassette shown in the diagram of FIG. 1 is fused with the GFP-HS1, linker sequence (GGSGGT), Tabacco Etch Virus (TEV) protease site (ENLYFQG) from the N-terminus, followed by the LC and linker sequence (GSGG). This is followed again by the TEV protease site and HC. The target gene cassette is used to express the protein as a holotoxin, which is very safe and does not require a BL3 facility.

상기 본 발명의 표적 유전자 카세트의 서열은 도 2에 나타내었다.The sequence of the target gene cassette of the present invention is shown in FIG. 2.

도 2의 서열은 본 발명의 재조합 보툴리늄 독소(BoNT/A)의 융합 단백질 서열을 나타낸다. 녹색 바탕은 8X his로 태깅된 N-말단의 GFP-HS1 서열을 나타내고, EcoRI 절단 부위가 pQE80-L 벡터로 클로닝 되는데 사용되었다. GFP에 이어, 링커 서열(GGSGGT)이 볼드체로 강조되었으며, KpnI 절단 부위와 뒤따르는 TEV 프로테아제 절단 부위(ENLYFQG)는 빨간 바탕으로 표시되었다. BoNT/A의 LC는 노란색 바탕으로 표시되었으며, 링커(GSGG)와 TEV 프로테아제 절단 부위(ENLYFQG)가 뒤따른다. 마지막으로 BoNT/A의 HC는 청록색(cobalt cyan) 바탕으로 표시되었고, 그에 앞서는 링커(GGSGGS)는 볼드체로 표시되었으며, 이황화 결합 형성을 위한 시스테인들은 빨간색 볼드체로 표시되었다. SalI 절단 부위는 마지막에 위치한다. 단백질 서열 내에 표시된 모든 제한 효소 부위는 도 1에 표시되었다.2 shows the fusion protein sequence of the recombinant botulinum toxin (BoNT / A) of the present invention. The green background shows the N-terminal GFP-HS1 sequence tagged with 8X his and the EcoRI cleavage site was used to clone into the pQE80-L vector. Following GFP, the linker sequence (GGSGGT) is highlighted in bold, and the KpnI cleavage site followed by the TEV protease cleavage site (ENLYFQG) is indicated by a red background. The LC of BoNT / A is shown with a yellow background followed by a linker (GSGG) and a TEV protease cleavage site (ENLYFQG). Finally, HC of BoNT / A was indicated on a cobalt cyan background, followed by linker (GGSGGS) in bold, and cysteines for disulfide bond formation in red bold. The SalI cleavage site is located last. All restriction enzyme sites indicated within the protein sequence are shown in FIG. 1.

실시예Example 2: 재조합  2: recombination 보툴리늄Botulinum 독소 단백질의 발현 및 정제 Expression and Purification of Toxin Proteins

GFPhs-Link-TEV-BoNT/A/pQE80L 콘스트럭트를 BL21로 형질 전환시키고 Luria Britani (LB) 배지에서 발현시켰다. 간단히 설명하면, 오버 나이트로 배양시킨 형질전환된 BL21 배양액의 1 %를 LB에 접종하고 0.1 mM IPTG에 의해 단백질 생산을 스위치 온하고 25 ℃에서 5 시간 동안 발현하였다. 세포를 수확하고 단백질을 추출하였다. 생산된 단백질을 Ni-NTA 크로마토그래피로 정제하였다. 정제 된 분획은 녹색을 명확하게 나타내었고 식별하기 쉬웠으며, 순도를 확인하기 위해 SDS-PAGE가 수행되었다. 쿠마시 염색 젤은 표적 단백질의 95 % 순도를 보였다. 단백질을 추출 및 정제하고 SDS-PAGE로 분석하였다. GFPhs-Link-TEV-BoNT / A / pQE80L constructs were transformed with BL21 and expressed in Luria Britani (LB) medium. Briefly, 1% of the transformed BL21 cultures cultured with overnight were inoculated into LB and protein production was switched on by 0.1 mM IPTG and expressed at 25 ° C. for 5 hours. Cells were harvested and protein extracted. The protein produced was purified by Ni-NTA chromatography. Purified fractions were clearly green and easy to identify, and SDS-PAGE was performed to confirm purity. Coomassie stained gel showed 95% purity of the target protein. Protein was extracted and purified and analyzed by SDS-PAGE.

50 ㎖의 배양 펠렛을 5 ㎖의 용해 완충액(lysis buffer) (8 M 우레아, 50 mM 이미다졸, 500 mM NaCl pH 7.4를 함유하는 20 mM 인산 나트륨)에 현탁시키고 세포를 용해시켰다. 용해성 단백질(soluble protein)을 추출하여 FPLC를 사용하여 Ni-NTA 칼럼에 로딩하였다. Ni-NTA 칼럼에 결합된 표적 단백질은 이미다졸을 사용하여 용출되었고, 용출된 분획은 녹색으로 나타났다.50 ml of culture pellet was suspended in 5 ml of lysis buffer (20 mM sodium phosphate containing 8 M urea, 50 mM imidazole, 500 mM NaCl pH 7.4) and the cells were lysed. Soluble protein was extracted and loaded onto a Ni-NTA column using FPLC. The target protein bound to the Ni-NTA column was eluted using imidazole, and the eluted fractions appeared green.

도 4에서, SDS-PAGE 는 정제 후 179 kDa의 표적 단백질(빨간색 화살표로 표시), 부분적으로 생성된 표적 단백질(파란색 화살표로 표시) [S; 용해성 단백질 추출물(soluble protein extract), I; 불용성 단백질 추출물(insoluble protein extract), TCP; 전체 세포 단백질(total cell protein), F1; Ni-NTA로부터 정제 된 분획, 및 M; 분자량 마커(molecular weight marker)]. 표적 mRNA와 단백질의 크기가 매우 크기 때문에 부분 생성물 (파란색 화살표)이 세포에서 생성되었다. 이것은 본 발명의 표적 유전자의 크기가 매우 커서 불완전하게 전사가 되었기 때문에 발생된 것이다.In FIG. 4, SDS-PAGE shows 179 kDa of target protein (indicated by red arrow) after purification, partially generated target protein (indicated by blue arrow) [S; Soluble protein extract, I; Insoluble protein extract, TCP; Total cell protein, F1; Fraction purified from Ni-NTA, and M; Molecular weight marker]. Because of the large size of the target mRNA and protein, partial products (blue arrows) were produced in the cells. This occurred because the target gene of the present invention was so large that it was incompletely transcribed.

상기 부분적으로 생성된 재조합 단백질은 GFP에 대한 항체를 사용하는 웨스턴 블롯에 의해 추가로 확인되었다. 블롯은 도 5의 A에서 화살표로 표시된 179 kDa 및 기타 부분적으로 생성 된 단백질에서 표적 단백질을 명확하게 나타내었다. (블롯에서, M; 마커, I; 불용성 단백질 분획, 및 S; 가용성 단백질 분획) The partially produced recombinant protein was further confirmed by Western blot using an antibody against GFP. The blot clearly shows the target protein at 179 kDa and other partially produced proteins, indicated by arrows in FIG. 5A. (In b; M; marker, I; insoluble protein fraction, and S; soluble protein fraction)

도 5의 B에서, 정제된 분획물은 GFP로 인해 녹색을 나타내었고, 이는 육안 검사에 의한 정제를 돕는다. 정제된 분획을 모아 물에 투석 하였다. 동결 건조를 수행하여 단백질을 농축시켰다. 이 단계까지는 BL3 시설에 대한 요구 사항이 없으며 독소가 활성을 갖지 않기 때문에. 생산 설비에서 상당한 비용을 절감할 수 있다.In FIG. 5B, the purified fractions appeared green due to GFP, which aids in purification by visual inspection. The purified fractions were combined and dialyzed in water. Lyophilization was performed to concentrate the protein. Until this stage there are no requirements for the BL3 facility and because the toxins do not have activity. Significant cost savings can be achieved in production facilities.

실시예Example 3: 재조합  3: recombination 보툴리늄Botulinum 독소 단백질의 절단 및 활성화 Cleavage and Activation of Toxin Proteins

농축된 재조합 BoNT/A 단백질을 20 mM Tris pH 7.5로 현탁시키고 제조 프로토콜에 따라 20 ℃에서 밤새 TEV 프로테아제 (Thermo Scientific, USA)로 절단(digest)시켰다. 절단은 BL3 시설에서 수행되었으며 이후 모든 실험은 BL3 시설에서 수행되었다. 절단 여부는 SDS-PAGE로 확인 하였다. SDS-PAGE 분석 결과, TEV 프로테아제에 의해 전장 BoNT/A가 분해되어 재조합 BoNT/A의 LC 및 HC 단편으로부터 GFP를 제거함을 명백히 보여 주었다. LC 및 HC 단편은 다이설파이드 결합에 의해 결합 되었기 때문에, 전체 길이의 활성 BoNT/A가 생성된다. TEV 프로테아제 및 GFPhs1은 100 kDa 컷오프 막에 의해 제거되었다. TEV와 GFPhs1은 둘 다 27 kDa 였으므로 차단막에서 여과된다. GFP가 제거된 150 kDa의 표적 재조합 BoNT/A를 정제하고 Bradford 분석법을 사용하여 정량 하였다.The concentrated recombinant BoNT / A protein was suspended in 20 mM Tris pH 7.5 and digested with TEV protease (Thermo Scientific, USA) overnight at 20 ° C. according to the preparation protocol. Cleavage was performed at the BL3 facility and all subsequent experiments were performed at the BL3 facility. The cleavage was confirmed by SDS-PAGE. SDS-PAGE analysis clearly showed that full-length BoNT / A was degraded by TEV protease to remove GFP from LC and HC fragments of recombinant BoNT / A. Because the LC and HC fragments are bound by disulfide bonds, full length active BoNT / A is produced. TEV protease and GFPhs1 were removed by a 100 kDa cutoff membrane. TEV and GFPhs1 were both 27 kDa and thus filtered in the barrier membrane. The 150 kDa target recombinant BoNT / A from which GFP was removed was purified and quantified using the Bradford assay.

실시예Example 4: 재조합  4: recombination 보툴리늄Botulinum 독소 단백질의 활성 확인 Confirmation of Toxin Protein Activity

정제된 재조합 BoNT/A를 PBS에 현탁시키고 순도를 SDS-PAGE 및 쿠마시 염색에 의해 약 95 %로 확인 하였다. 정제 된 단백질을 추후 사용시까지 -70 ℃에서 동결시켰다. 재조합 BoNT/A의 LD50은 마우스를 통한 바이오어세이(bioassay)에 의해 결정되었다. 간단히 설명하면, 1XPBS에 현탁 된 재조합 BoNT/A의 단계 희석물을 약 14 내지 16 g의 CS57BL/6 마우스에 주사 하였다(표 1). 재조합 BoNT/A를 희석시키고 희석 배수당 3 마리의 마우스에 복강 내 주사 하였다 (1 회 주입 당 0.5 ml). 1 마리의 마우스는 음성 대조군으로서 작용하였고, 1X PBS 단독으로 주사 하였다. 모든 생쥐를 4 일간 관찰하고 보툴리누스 중독 또는 사망률을 기록했다. 결과는 표 1에 나타내었다. Purified recombinant BoNT / A was suspended in PBS and purity was confirmed at about 95% by SDS-PAGE and Coomassie staining. The purified protein was frozen at -70 ° C until further use. LD 50 of recombinant BoNT / A was determined by bioassay through mice. Briefly, step dilutions of recombinant BoNT / A suspended in 1XPBS were injected into about 14-16 g of CS57BL / 6 mice (Table 1). Recombinant BoNT / A was diluted and injected intraperitoneally into 3 mice per dilution fold (0.5 ml per injection). One mouse served as a negative control and injected with 1X PBS alone. All mice were observed for 4 days and botulinum poisoning or mortality was recorded. The results are shown in Table 1.

Figure 112018051191718-pat00001
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표 1에 나타낸 바와 같이, 20 pg를 투여한 그룹에서는 독소 투여 후 24 또는 48 시간 후에 마우스가 폐사하였다. 그러나 15 pg 를 투여한 그룹에서는 투여 24 시간 후에 임상증상을 나타내었으나, 투여 48 시간 후에는 회복되었다. 본 실시예에서는 정확한 LD50 를 계산하지 않았으나, 재조합 BoNT/A의 LD50은 약 20 pg/마우스가 될 것이다. 또한 20 pg보다 높은 용량으로 투여시 더 높은 폐사율을 나타낼 것임은 자명하다. 이 결과는 재조합 BoNT/A의 활성이 완전하게 기능한다는 것을 나타낸다. 1L LB 배양물에서 생산된 재조합 활성 BoNT/A의 총 수율은 부분적으로 번역 된 단백질을 고려하지 않으면 약 43±2 mg 이다. 그러나 BoNT/A의 완전 번역 빈도를 늘림으로써 위에서 기술한 방법을 더욱 최적화하면 더 높은 수율을 얻을 수 있을 것으로 기대된다. As shown in Table 1, in the group administered 20 pg, mice died 24 or 48 hours after toxin administration. However, the group treated with 15 pg showed clinical symptoms 24 hours after administration, but recovered 48 hours after administration. The exact LD 50 was not calculated in this example, but the LD 50 of the recombinant BoNT / A would be about 20 pg / mouse. It is also apparent that higher doses of mortality will be seen when administered at doses higher than 20 pg. This result indicates that the activity of recombinant BoNT / A is fully functional. The total yield of recombinant active BoNT / A produced in 1 L LB culture is about 43 ± 2 mg without considering partially translated protein. However, by increasing the frequency of full translation of BoNT / A, further optimization of the method described above is expected to yield higher yields.

따라서, 본 발명자들은 상기 실시예 및 결과로부터 본 발명의 재조합 보툴리늄 독소 단백질 제조 기술이 상술한 고순도 활성 BoNT 분자를 상업적 수준으로 생산할 수 있을 정도로 간단하면서도 강력하다는 것을 분명히 입증하였다. Accordingly, the inventors have clearly demonstrated from the above examples and results that the recombinant botulinum toxin protein preparation technology of the present invention is simple and powerful enough to produce the above-mentioned high purity active BoNT molecules on a commercial level.

즉, 본 발명자들은 공학적으로 조작된 고도로 폴딩가능한 GFP-hs1(highly foldable GFP-hs1)의 도움으로 BoNT/A를 용해성 폴딩 단백질(soluble folded protein)로 성공적으로 발현하였다. 또한 TEV 프로테아제를 GFPhs1을 제거하기 위해 정제된 표적 분자를 절단(digest)시키고, 다이설파이드 결합에 의해 보전된 BoNT/A의 LC와 HC 도메인 사이의 닉을 만들었다. 마지막으로, 본 발명자들은 또한 마우스 바이오어세이를 통하여 본 발명의 재조합 BoNT/A가 활성화되었음을 확인하였다.That is, the inventors have successfully expressed BoNT / A as soluble folded protein with the aid of an engineered, highly foldable GFP-hs1. The TEV protease also digested the purified target molecule to remove GFPhs1 and made a nick between the LC and HC domains of BoNT / A conserved by disulfide bonds. Finally, we also confirmed that the recombinant BoNT / A of the present invention was activated through mouse bioassays.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. Having described the specific part of the present invention in detail, it is apparent to those skilled in the art that the specific technology is merely a preferred embodiment, and the scope of the present invention is not limited thereto.

<110> BIOWITHUS, Inc. <120> Mass production technology of recombinant botulinum toxin protein <130> PN170103P <150> KR 10-2017-0066324 <151> 2017-05-29 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1563 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> His-GFPhs1-Link-TEV-BoNT/A <400> 1 Met His His His His His His His His Gln Ser Lys Gly Glu Glu Leu 1 5 10 15 Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn 20 25 30 Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Asn 35 40 45 Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val 50 55 60 Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Gly Tyr Gly Val Gln Cys Phe 65 70 75 80 Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Arg His Asp Phe Phe Lys Ser Ala 85 90 95 Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Ser Phe Lys Asp Asp 100 105 110 Gly Thr Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu 115 120 125 Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn 130 135 140 Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Phe Asn Ser 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125 Lys Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser     130 135 140 Tyr Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp 145 150 155 160 Ile Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu                 165 170 175 Thr Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp             180 185 190 Phe Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu         195 200 205 Leu Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His     210 215 220 Glu Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro 225 230 235 240 Asn Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly                 245 250 255 Leu Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala             260 265 270 Lys Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr         275 280 285 Asn Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile     290 295 300 Val Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu 305 310 315 320 Lys Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys                 325 330 335 Leu Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu             340 345 350 Asp Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu         355 360 365 Asn Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn     370 375 380 Tyr Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala 385 390 395 400 Asn Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys                 405 410 415 Leu Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val             420 425 430 Arg Gly Ile Ile Thr Ser Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln         435 440 445 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys Ala Leu Asn Asp Leu Cys Ile Lys     450 455 460 Val Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr 465 470 475 480 Asn Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu Ile Thr Ser Asp Thr Asn Ile Glu                 485 490 495 Ala Ala Glu Glu Asn Ile Ser Leu Asp Leu Ile Gln Gln Tyr Tyr Leu             500 505 510 Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro Glu Asn Ile Ser Ile Glu Asn Leu         515 520 525 Ser Ser Asp Ile Ile Gly Gln Leu Glu Leu Met Pro Asn Ile Glu Arg     530 535 540 Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu Leu Asp Lys Tyr Thr Met Phe His 545 550 555 560 Tyr Leu Arg Ala Gln Glu Phe Glu His Gly Lys Ser Arg Ile Ala Leu                 565 570 575 Thr Asn Ser Val Asn Glu Ala Leu Leu Asn Pro Ser Arg Val Tyr Thr             580 585 590 Phe Phe Ser Ser Asp Tyr Val Lys Lys Val Asn Lys Ala Thr Glu Ala         595 600 605 Ala Met Phe Leu Gly Trp Val Glu Gln Leu Val Tyr Asp Phe Thr Asp     610 615 620 Glu Thr Ser Glu Val Ser Thr Thr Asp Lys Ile Ala Asp Ile Thr Ile 625 630 635 640 Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu Asn Ile Gly Asn Met Leu Tyr                 645 650 655 Lys Asp Asp Phe Val Gly Ala Leu Ile Phe Ser Gly Ala Val Ile Leu             660 665 670 Leu Glu Phe Ile Pro Glu Ile Ala Ile Pro Val Leu Gly Thr Phe Ala         675 680 685 Leu Val Ser Tyr Ile Ala Asn Lys Val Leu Thr Val Gln Thr Ile Asp     690 695 700 Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu Lys Trp Asp Glu Val Tyr Lys Tyr 705 710 715 720 Ile Val Thr Asn Trp Leu Ala Lys Val Asn Thr Gln Ile Asp Leu Ile                 725 730 735 Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu Glu Asn Gln Ala Glu Ala Thr Lys             740 745 750 Ala Ile Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn Gln Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn         755 760 765 Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser     770 775 780 Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile Asn Lys Phe Leu Asn Gln Cys Ser 785 790 795 800 Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met Ile Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu                 805 810 815 Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys Asp Ala Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr             820 825 830 Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly Gln Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys         835 840 845 Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp Ile Pro Phe Gln Leu Ser Lys Tyr     850 855 860 Val Asp Asn Gln Arg Leu Leu Ser Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Lys Asn 865 870 875 880 Ile Ile Asn Thr Ser Ile Leu Asn Leu Arg Tyr Glu Ser Asn His Leu                 885 890 895 Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala Ser Lys Ile Asn Ile Gly Ser Lys Val             900 905 910 Asn Phe Asp Pro Ile Asp Lys Asn Gln Ile Gln Leu Phe Asn Leu Glu         915 920 925 Ser Ser Lys Ile Glu Val Ile Leu Lys Asn Ala Ile Val Tyr Asn Ser     930 935 940 Met Tyr Glu Asn Phe Ser Thr Ser Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr 945 950 955 960 Phe Asn Ser Ile Ser Leu Asn Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met                 965 970 975 Glu Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val Ser Leu Asn Tyr Gly Glu Ile Ile             980 985 990 Trp Thr Leu Gln Asp Thr Gln Glu Ile Lys Gln Arg Val Val Phe Lys         995 1000 1005 Tyr Ser Gln Met Ile Asn Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Arg Trp Ile Phe    1010 1015 1020 Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg Leu Asn Asn Ser Lys Ile Tyr Ile Asn 1025 1030 1035 1040 Gly Arg Leu Ile Asp Gln Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly Asn Ile His                1045 1050 1055 Ala Ser Asn Asn Ile Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg Asp Thr His            1060 1065 1070 Arg Tyr Ile Trp Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys Glu Leu Asn        1075 1080 1085 Glu Lys Glu Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser Asn Ser Gly Ile    1090 1095 1100 Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr Asp Lys Pro Tyr Tyr 1105 1110 1115 1120 Met Leu Asn Leu Tyr Asp Pro Asn Lys Tyr Val Asp Val Asn Asn Val                1125 1130 1135 Gly Ile Arg Gly Tyr Met Tyr Leu Lys Gly Pro Arg Gly Ser Val Met            1140 1145 1150 Thr Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu Tyr Arg Gly Thr Lys Phe        1155 1160 1165 Ile Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Gly Asn Lys Asp Asn Ile Val Arg Asn    1170 1175 1180 Asn Asp Arg Val Tyr Ile Asn Val Val Val Lys Asn Lys Glu Tyr Arg 1185 1190 1195 1200 Leu Ala Thr Asn Ala Ser Gln Ala Gly Val Glu Lys Ile Leu Ser Ala                1205 1210 1215 Leu Glu Ile Pro Asp Val Gly Asn Leu Ser Gln Val Val Val Met Lys            1220 1225 1230 Ser Lys Asn Asp Gln Gly Ile Thr Asn Lys Cys Lys Met Asn Leu Gln        1235 1240 1245 Asp Asn Asn Gly Asn Asp Ile Gly Phe Ile Gly Phe His Gln Phe Asn    1250 1255 1260 Asn Ile Ala Lys Leu Val Ala Ser Asn Trp Tyr Asn Arg Gln Ile Glu 1265 1270 1275 1280 Arg Ser Ser Arg Thr Leu Gly Cys Ser Trp Glu Phe Ile Pro Val Asp                1285 1290 1295 Asp Gly Trp Gly Glu Arg Pro Leu            1300 <210> 4 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BoNT / A-LC <400> 4 Gly Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn   1 5 10 15 Gly Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln              20 25 30 Pro Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu          35 40 45 Arg Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro      50 55 60 Glu Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser  65 70 75 80 Thr Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe                  85 90 95 Glu Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile             100 105 110 Val Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu         115 120 125 Lys Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser     130 135 140 Tyr Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp 145 150 155 160 Ile Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu                 165 170 175 Thr Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp             180 185 190 Phe Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu         195 200 205 Leu Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His     210 215 220 Glu Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro 225 230 235 240 Asn Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly                 245 250 255 Leu Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala             260 265 270 Lys Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr         275 280 285 Asn Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile     290 295 300 Val Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu 305 310 315 320 Lys Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys                 325 330 335 Leu Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu             340 345 350 Asp Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu         355 360 365 Asn Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn     370 375 380 Tyr Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala 385 390 395 400 Asn Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys                 405 410 415 Leu Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val             420 425 430 Arg Gly Ile Ile Thr Ser Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln         435 440 445 <210> 5 <211> 856 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BoNT / A-HC <400> 5 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys Ala Leu Asn Asp Leu Cys Ile Lys   1 5 10 15 Val Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr              20 25 30 Asn Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu Ile Thr Ser Asp Thr Asn Ile Glu          35 40 45 Ala Ala Glu Glu Asn Ile Ser Leu Asp Leu Ile Gln Gln Tyr Tyr Leu      50 55 60 Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro Glu Asn Ile Ser Ile Glu Asn Leu  65 70 75 80 Ser Ser Asp Ile Ile Gly Gln Leu Glu Leu Met Pro Asn Ile Glu Arg                  85 90 95 Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu Leu Asp Lys Tyr Thr Met Phe His             100 105 110 Tyr Leu Arg Ala Gln Glu Phe Glu His Gly Lys Ser Arg Ile Ala Leu         115 120 125 Thr Asn Ser Val Asn Glu Ala Leu Leu Asn Pro Ser Arg Val Tyr Thr     130 135 140 Phe Phe Ser Ser Asp Tyr Val Lys Lys Val Asn Lys Ala Thr Glu Ala 145 150 155 160 Ala Met Phe Leu Gly Trp Val Glu Gln Leu Val Tyr Asp Phe Thr Asp                 165 170 175 Glu Thr Ser Glu Val Ser Thr Thr Asp Lys Ile Ala Asp Ile Thr Ile             180 185 190 Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu Asn Ile Gly Asn Met Leu Tyr         195 200 205 Lys Asp Asp Phe Val Gly Ala Leu Ile Phe Ser Gly Ala Val Ile Leu     210 215 220 Leu Glu Phe Ile Pro Glu Ile Ala Ile Pro Val Leu Gly Thr Phe Ala 225 230 235 240 Leu Val Ser Tyr Ile Ala Asn Lys Val Leu Thr Val Gln Thr Ile Asp                 245 250 255 Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu Lys Trp Asp Glu Val Tyr Lys Tyr             260 265 270 Ile Val Thr Asn Trp Leu Ala Lys Val Asn Thr Gln Ile Asp Leu Ile         275 280 285 Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu Glu Asn Gln Ala Glu Ala Thr Lys     290 295 300 Ala Ile Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn Gln Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn 305 310 315 320 Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser                 325 330 335 Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile Asn Lys Phe Leu Asn Gln Cys Ser             340 345 350 Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met Ile Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu         355 360 365 Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys Asp Ala Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr     370 375 380 Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly Gln Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys 385 390 395 400 Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp Ile Pro Phe Gln Leu Ser Lys Tyr                 405 410 415 Val Asp Asn Gln Arg Leu Leu Ser Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Lys Asn             420 425 430 Ile Ile Asn Thr Ser Ile Leu Asn Leu Arg Tyr Glu Ser Asn His Leu         435 440 445 Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala Ser Lys Ile Asn Ile Gly Ser Lys Val     450 455 460 Asn Phe Asp Pro Ile Asp Lys Asn Gln Ile Gln Leu Phe Asn Leu Glu 465 470 475 480 Ser Ser Lys Ile Glu Val Ile Leu Lys Asn Ala Ile Val Tyr Asn Ser                 485 490 495 Met Tyr Glu Asn Phe Ser Thr Ser Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr             500 505 510 Phe Asn Ser Ile Ser Leu Asn Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met         515 520 525 Glu Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val Ser Leu Asn Tyr Gly Glu Ile Ile     530 535 540 Trp Thr Leu Gln Asp Thr Gln Glu Ile Lys Gln Arg Val Val Phe Lys 545 550 555 560 Tyr Ser Gln Met Ile Asn Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Arg Trp Ile Phe                 565 570 575 Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg Leu Asn Asn Ser Lys Ile Tyr Ile Asn             580 585 590 Gly Arg Leu Ile Asp Gln Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly Asn Ile His         595 600 605 Ala Ser Asn Asn Ile Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg Asp Thr His     610 615 620 Arg Tyr Ile Trp Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys Glu Leu Asn 625 630 635 640 Glu Lys Glu Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser Asn Ser Gly Ile                 645 650 655 Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr Asp Lys Pro Tyr Tyr             660 665 670 Met Leu Asn Leu Tyr Asp Pro Asn Lys Tyr Val Asp Val Asn Asn Val         675 680 685 Gly Ile Arg Gly Tyr Met Tyr Leu Lys Gly Pro Arg Gly Ser Val Met     690 695 700 Thr Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu Tyr Arg Gly Thr Lys Phe 705 710 715 720 Ile Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Gly Asn Lys Asp Asn Ile Val Arg Asn                 725 730 735 Asn Asp Arg Val Tyr Ile Asn Val Val Val Lys Asn Lys Glu Tyr Arg             740 745 750 Leu Ala Thr Asn Ala Ser Gln Ala Gly Val Glu Lys Ile Leu Ser Ala         755 760 765 Leu Glu Ile Pro Asp Val Gly Asn Leu Ser Gln Val Val Val Met Lys     770 775 780 Ser Lys Asn Asp Gln Gly Ile Thr Asn Lys Cys Lys Met Asn Leu Gln 785 790 795 800 Asp Asn Asn Gly Asn Asp Ile Gly Phe Ile Gly Phe His Gln Phe Asn                 805 810 815 Asn Ile Ala Lys Leu Val Ala Ser Asn Trp Tyr Asn Arg Gln Ile Glu             820 825 830 Arg Ser Ser Arg Thr Leu Gly Cys Ser Trp Glu Phe Ile Pro Val Asp         835 840 845 Asp Gly Trp Gly Glu Arg Pro Leu     850 855 <210> 6 <211> 238 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GFP-hs1 <400> 6 Gln Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val   1 5 10 15 Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly Glu              20 25 30 Gly Glu Gly Asp Ala Thr Asn Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys          35 40 45 Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu      50 55 60 Gly Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Arg  65 70 75 80 His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg                  85 90 95 Thr Ile Ser Phe Lys Asp Asp Gly Thr Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val             100 105 110 Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile         115 120 125 Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn     130 135 140 Phe Asn Ser His Lys Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly 145 150 155 160 Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Val Glu Asp Gly Ser Val                 165 170 175 Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro             180 185 190 Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Val Leu Leu         195 200 205 Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val     210 215 220 Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235

Claims (11)

재조합 보툴리늄 독소 단백질의 제조를 위한 융합단백질로서,
(a) 태깅 단백질; (b) 서열목록 제6서열의 아미노산 서열로 이루어진 형광단백질; (c) 프로테아제 인식 아미노산 서열(protease recognition amino acid sequence); (d) 보툴리늄 A 타입 독소 경쇄(light chain of Botulinum neurotoxin type A); (e) 프로테아제 인식 아미노산 서열; 및 (f) 보툴리늄 A 타입 독소 중쇄(heavy chain of BoNT/A)가 순차적으로 융합된 융합 단백질. As a fusion protein for the production of recombinant botulinum toxin protein,
(a) tagging proteins; (b) a fluorescent protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6; (c) protease recognition amino acid sequence; (d) light chain of Botulinum neurotoxin type A; (e) protease recognition amino acid sequences; And (f) a fusion protein in which the botulinum A type toxin heavy chain of BoNT / A is sequentially fused. 제 1 항에 있어서, 상기 태깅 단백질은 4 내지 10개의 폴리(히스티딘), 키틴결합단백질(CBP), 말토스결합단백질(MBP), 또는 글루타치온 S-전이효소(GST)인, 융합단백질.The fusion protein of claim 1, wherein the tagging protein is 4 to 10 poly (histidine), chitin binding protein (CBP), maltose binding protein (MBP), or glutathione S-transferase (GST). 삭제delete 제 1 항에 있어서, 상기 (c) 또는 (e)의 프로테아제는 엔테로키나제(enterokinase), Xa 인자(Factor Xa), HRV3C 프로테아제, TEV 프로테아제(Tobacco Etch Virus protease), 또는 트롬빈(thrombin)인, 융합단백질.The method according to claim 1, wherein the protease of (c) or (e) is enterokinase, Factor Xa, HRV3C protease, TEV protease (T obacco Etch Virus protease ), or thrombin, Fusion proteins. 재조합 보툴리늄 독소 단백질의 제조를 위한 융합단백질로서,
(a) 태깅 단백질; (b) 서열목록 제6서열의 아미노산 서열로 이루어진 형광단백질; (c) 프로테아제 인식 아미노산 서열(protease recognition amino acid sequence); (d) 보툴리늄 A 타입 독소 경쇄(light chain of Botulinum neurotoxin type A); (e) 프로테아제 인식 아미노산 서열; 및 (f) 보툴리늄 A 타입 독소 중쇄(heavy chain of BoNT/A)가 순차적으로 융합된 융합 단백질을 인코딩하는 염기서열을 포함하는 분리된 핵산 분자.As a fusion protein for the production of recombinant botulinum toxin protein,
(a) tagging proteins; (b) a fluorescent protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6; (c) protease recognition amino acid sequence; (d) light chain of Botulinum neurotoxin type A; (e) protease recognition amino acid sequences; And (f) a nucleotide sequence encoding a fusion protein in which a botulinum A type toxin heavy chain of BoNT / A is sequentially fused. 제 5 항의 핵산분자를 포함하는 재조합 발현벡터.A recombinant expression vector comprising the nucleic acid molecule of claim 5. 제 6 항에 있어서, 상기 재조합 발현벡터는 플라스미드, YAC (yeast artificial chromosome), YEp (yeast episomal plasmid), YIp (yeast integrative plasmid), 및 재조합바이러스로 구성된 군에서 선택된 것인, 재조합 발현벡터.The recombinant expression vector of claim 6, wherein the recombinant expression vector is selected from the group consisting of a plasmid, a yeast artificial chromosome (YAC), a yeast episomal plasmid (YEp), a yeast integrative plasmid (YIp), and a recombinant virus. 제 6 항 또는 제 7 항의 재조합 발현벡터를 포함하는, 숙주세포.A host cell comprising the recombinant expression vector of claim 6. 제 8 항에 있어서, 상기 숙주세포는 세균, 효모, 곤충세포, 및 포유동물세포로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 숙주세포.The host cell of claim 8, wherein the host cell is selected from the group consisting of bacteria, yeast, insect cells, and mammalian cells. (i) 제 9 항의 숙주세포를 융합단백질 발현이 가능한 조건 하에서 배양하는 단계; 및
(ii) 생산된 융합단백질을 회수하는 단계를 포함하는 재조합 보툴리늄 독소 단백질의 제조방법. (i) culturing the host cell of claim 9 under conditions capable of expressing a fusion protein; And
(ii) a method for producing a recombinant botulinum toxin protein comprising recovering the produced fusion protein. 제 10 항에 있어서,
(iii) 회수된 융합단백질에 프로테아제를 처리하여 융합단백질의 (c) 및 (e)의 프로테아제 인식 서열을 절단하는 단계를 추가적으로 포함하는, 제조방법.
The method of claim 10,
(iii) subjecting the recovered fusion protein to a protease to cleave the protease recognition sequences of (c) and (e) of the fusion protein.
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