KR102040638B1

KR102040638B1 - Live cells의 기전자극 및 분석을 위한 기능성 well plate 시스템

Info

Publication number: KR102040638B1
Application number: KR1020170170596A
Authority: KR
Inventors: 이동원; 정윤진; 김철
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2017-12-12
Filing date: 2017-12-12
Publication date: 2019-11-27
Also published as: KR20190070096A

Abstract

본 발명은 기전자극이 가능한 기능성 well plate와 배양기를 통해 실시간으로 세포를 배양하면서 자극에 따른 세포의 변형 및 수축력, 박동 수의 변화를 현미경과 레이저 변위계를 통해 분석할 수 있는 시스템에 관한 것으로서, 더욱 자세하게는 폴리다이메틸실록세인(Polydimethylsiloxane, PDMS)으로 설계한 다이어프램 위에 배양된 심장근육 세포에 기전 자극을 통해 세포를 성숙시키고 staining을 통해 세포 내에 있는 특정한 단백질을 염색하여 분포와 위치를 확인함으로써 세포의 성숙 분석이 가능하고, 현미경 상부에 집적화된 레이저 변위계를 통해 실시간으로 심장근육 세포의 수축력 및 박동 수의 변화를 측정할 수 있는 세포 분석 시스템에 관한 것이다.
본 발명에 따른 기전자극 및 분석 시스템은 심장근육 세포의 기전자극에 따른 세포의 형상 및 수축력, 박동수를 현미경과 레이저 변위계를 이용하여 실시간 측정이 가능하고 자극의 최적화를 도출하는데 효과적이다. 또한 본 발명에 따른 기전자극 및 분석 시스템은 총3개의 well 로 구성할 수 있으며, 기전자극을 통해 성숙화된 세포를 통해 약물에 따른 반응을 현미경과 레이저 변위계를 통해 분석이 가능하다. 추가적인 well의 확정은 구조의 변경을 통해 가능하다.

Description

Live cells의 기전자극 및 분석을 위한 기능성 well plate 시스템{Functional well plate system for electro-mechanical stimulation and analysis of live cells}

본 발명은 기능성 well plate를 사용함에 따라 기계적 자극 및 전기적 자극 (이하, '기전자극'이라고 함)이 가능하고 현미경과 배양기를 이용하여 세포를 관찰하는 동안 온도, 습도, CO₂ 농도를 일정하게 유지할 수 있으며, motorized stage를 이용함으로써 정확하고 빠른 multi position의 이동 및 현미경을 통한 세포 형상 분석 및 레이저 변위계를 통하여 세포의 수축력 및 박동 수를 분석할 수 있을뿐더러, 기계적 자극과 전기적 자극을 통해 세포의 성숙을 향상시키는 것이 가능한, live cells의 기전자극 및 분석을 위한 기능성 well plate 시스템에 관한 것이다.

심장질환은 현재 세계에서 가장 중요한 건강문제의 하나이며, 심장이 특히 문제가 되는 것은 자체적으로 손상 회복이 거의 되지 않기 않으며 심장근육세포가 질병 등으로 손상을 받았을 때 재생 능력이 매우 미미한 편이다.

심장 재생이 성공하기 위해서는 이 심근세포들이 신호에 반응하고 주위의 심장근육과 융합되어야한다. 그러나 줄기세포에서 만들어낸 심근세포들은 미성숙하고 그에 따라 박동이 불규칙해 재생의학이나 생물학 연구를 위한 활용성에 제한이 많았다. 하지만 최근 인간 줄기세포로 만든 심장근육세포에 기전자극을 가해 발달과 기능을 향상시킬 수 있다는 연구 결과들이 발표되고 있다.

하지만 기계적 자극과 전기적 자극을 동시에 진행할 경우 이에 따른 자극의 최적화 및 심근세포의 morphology 및 수축력을 분석할 수 있는 시스템이 필요하다.

이에 따라 본 발명자들은, 폴리다이메틸실록세인(Polydimethylsiloxane, PDMS)으로 설계한 다이어프램 위에, 세포를 배양하는 동안 기전자극이 가능한 기능성 well plate를 제작하고 세포의 형상 측정 및 모니터링을 하는 동안 온도, 습도, CO2농도를 유지 할 수 있는 소형 배양기와 multi well plate 및 분석 시 정확하고 빠른 position 이동을 위해 motroized stage 그리고 세포 분석을 위한 현미경 및 레이저 변위계를 이용하여 live cell의 기전자극 및 분석이 가능한 검사 장치의 발명을 완성하였다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 상술한 바와 같은 종래의 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 기전자극이 가능한 기능성 multi well plate 및 배양기, motorized stage, 현미경, 레이저 변위계로 구성된 시스템을 통해 배양되는 세포의 기전자극에 다른 세포의 형상 분석 및 수축력, 심박동 수를 분석할 수 있는 검사 장치를 제공함으로써 기존 검사방법의 문제점을 해결하고자 하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세포가 수용되고, 미세 그루브 패턴을 가지는 영역이 하나 또는 그 이상인 다이어프램 판; 상기 다이어프램 판 외부의 양 측면에 위치하는, 전기자극을 부여하는 전극; 및 상기 세포가 수용되는 영역 중심부의 레이저 변위계 반사판을 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포에 대한 기전자극 분석용 다이어프램을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 다이어프램 판 위 세포가 수용되는 공간에 위치하는 마이크로전극의 어레이(Microelectode array, MEA);를 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상부 웰 플레이트; 하부 웰 플레이트; 상기 상부 웰 플레이트와 하부 웰 플레이트 사이에 위치하며 유연성을 갖는, 상기 다이어프램의 어레이; 및 압력인가 조절기를 포함하여, 압력이 인가되면 다이어프램이 부풀어 세포에 기계적 자극을 부여하는, 세포에 대한 기전자극 분석용 웰 플레이트를 제공한다. 세포가 배양되는 구역에 전기장을 형성하여 전기적 자극을 부여하는 것도 가능하다.

또한, 본 발명은 상기 웰 플레이트; 및 세포를 배양하는 배양기(incubator);를 포함하고, X축과 Y축의 2차원 방향으로 움직일 수 있는 전동 스테이지(motorized stage), 레이저 변위계(laser vibrometer), 전기적 자극 생성기 및 기계적 자극 생성기로 이루어진 군에서 하나 이상의 장비를 더 포함하는, 세포에 대한 기전자극 분석용 웰 플레이트 시스템을 제공한다.

상기 배양기(incubator)는, 세포에 대한 자극을 위한 연결 핀이 있는 상부 배양기(Top incubator)와 온도 유지를 위한 히팅선(heating line)이 있는 하부 배양기(Bottom incubator)를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명은, 약물의 세포에 대한 독성을 기전자극 분석용 웰 플레이트 시스템을 이용하여 측정하는 방법에 있어서, (1) 피진단 약물을 기전자극 분석용 웰 플레이트 시스템 상의 세포에 투여하는 단계; (2) 기전자극 분석용 웰 플레이트 시스템으로부터 레이저 변위계를 이용하여 수축값을 획득하는 단계; (3) 상기 획득한 수축값을 기준표와 비교하여, 피진단 약물의 독성을 판단하는 단계;를 포함하는, 약물의 세포에 대한 독성을 측정하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 기전자극 및 분석 시스템은 심장근육 세포의 기전자극에 따른 세포의 형상 및 수축력, 박동수를 현미경과 레이저 변위계를 이용하여 실시간 측정이 가능하고 자극의 최적화를 도출하는데 효과적이다.

또한 본 발명에 따른 기전자극 및 분석 시스템은 single 또는 multi well 로 구성되며, 기전자극을 통해 성숙화된 세포를 통해 약물에 따른 반응을 현미경과 레이저 변위계를 통해 분석이 가능하다.

도 1은 본 발명의 기전자극(Electromechanical stimulation) 분석용 웰 플레이트 시스템의 구성도.
도 2는 기전자극(Electromechanical stimulation) 분석용 웰 플레이트 시스템의, 실제 기기 모습으로 이루어진, 핵심 부분에 대한 구성도 (기전자극 컨트롤러, stage top incubator, 배양기 컨트롤러, 기능성 well plate, 모터화 스테이지를 갖춤)
도 3은 (도 2)의 모터화 스테이지를 더욱 확대한 모습이며, 정확하고 빠르게 다수의 위치(multi position)를 이동하며 측정하기 위한, XY방향 모터화 스테이지(motorized stage)의 모습
도 4는 well adapter가 장착되지 않은 상태에서 incubator cover 및 body 모습
도 5는 (도 4)의 스테이지 상 배양기(stage top incubator)가 구성품으로부터 체결되는 모습
도 6은 전기적 자극을 생성하는 기능 생성기(Function generator)와 기계적 자극을 생성하는 압력펌프(Pressure pump)를 포함하고, 그 외에 압력센서(Pressure sensor) 및 SMPS가 구비된 기전자극 컨트롤러(Electromechanical stimulation controller)의 구성도.
도 7은 기전자극 분석용 well plate를 구성하는 각 부분에 대한 구체적인 이미지.
도 8은 (도 7)의 기전자극 분석용 well plate의 최종 조립된 이미지를 나타내며, 상부 사진은 전기적 자극을 생성하는 Pogo Pin, 하부 사진은 기계적 자극을 생성하는 가압된 팽창 다이어프램의 모습의 사진을 보임.
도 9는 기전자극 분석용 well plate를 구성하는 하나의 well에서, PDMS 다이어프램 구조체를 제작하는 공정도.
도 10은 PDMS 다이어프램 구조체 상에, 미세 그루브 패턴이 있는 다이어프램 구조를 나타낸 것으로, 레이저 변위계 반사판과 전기적 자극을 생성하는 전극의 상대적 위치가 표시된 모습.
도 11은 PDMS 다이어프램 위에 형성된 방사형 micro groove 유/무에 따른 심장세포 정렬 및 이에 따른 수축력의 차이를 나타내는 사진과 그래프.
도 12는 실린지 펌프를 이용하여 주기적은 압력 증가/감소시키고, 이에 따른 PDMS 다이어프램의 변형 이미지 및 실시간 변위 그래프.
도 13은 전기자극의 주파수 변화에 따른, 세포의 수축력 및 박동 수의 변화를 레이저 변위계을 통해 측정한 결과 그래프.
도 14는 세포 배양 이후 3일 시점부터 시작하여 5일간 전기 자극을 통해 세포를 성숙화한 후, 형광 염색을 통해 DAPI 핵단백질(파란색), Cx-43 단백질(초록색) 및 F-actin(빨간색)을 염색하여 촬영한 결과 사진.
도 15는 약물(Verapamil)을 처리하여 이에 따른 심장세포 수축력의 변화를 측정한 그래프.
도 16은 배양된 세포의 전기적 활동을 분석하기 위해 다이어프램 위에 집적화된 Microelectrode array의 개념도 및 분석 데이터.

본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세포가 수용되고, 미세 그루브 패턴을 가지는 영역이 하나 또는 그 이상인 다이어프램 판; 상기 다이어프램 판 외부의 양 측면에 위치하는, 전기자극을 부여하는 전극; 및 상기 세포가 수용되는 영역 중심부의 레이저 변위계 반사판을 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포에 대한 기전자극 분석용 다이어프램을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 다이어프램 판 위 세포가 수용되는 공간에 위치하는 마이크로전극의 어레이(Microelectode array, MEA);를 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상부 웰 플레이트; 하부 웰 플레이트; 상기 상부 웰 플레이트와 하부 웰 플레이트 사이에 위치하며 유연성을 갖는, 상기 다이어프램의 어레이; 및 압력인가 조절기를 포함하여, 압력이 인가되면 다이어프램이 부풀어 세포에 기계적 자극을 부여하는, 세포에 대한 기전자극 분석용 웰 플레이트를 제공한다. 상부 웰 플레이트와 하부 웰 플레이트 사이에 가스킷(gasket)을 적용하여 압력 인가될 때의 leak를 방지하고 다이어프램의 변형을 유도할 수 있다. 한편 세포가 배양되는 구역에 전기장을 형성하여 전기적 자극을 부여하는 것도 가능하다. 플레이트에 있는 well의 숫자는 확정된 것이 아니며 well을 추가하는 것은, 구조의 변경을 통해 가능하다.

기전자극이 가능한 PDMS 다이어프램 기반의 기능성 multi well plate는 실린지 펌프등과 같은 기계식 펌프를 이용하여, 어레이를 이루는 각 다이어프램에 압력을 균일하게 인가할 수 있는 하부 웰 플레이트(bottom well plate), 전기자극을 위해 전극이 형성되는 유리 기판, 배양액 및 세포를 가둘수 있는 상부 웰 플레이트(top well plate), 세포가 배양되는 PDMS 다이어프램으로 구성된다. PCB 및 PDMS 구조체를 제외한 하부 웰 플레이트와 상부 웰 플레이트는 Polystyrene (PS)를 이용하여 제작될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 웰 플레이트; 및 세포를 배양하는 배양기(incubator);를 포함하고, X축과 Y축의 2차원 방향으로 움직일 수 있는 모터화 스테이지(motorized stage), 레이저 변위계(laser vibrometer), 전기적 자극 생성기 및 기계적 자극 생성기로 이루어진 군에서 하나 이상의 장비를 더 포함하는, 세포에 대한 기전자극 분석용 웰 플레이트 시스템을 제공한다. 기전자극이 가능한 PDMS 다이어프램 기반의 기능성 multi well plate, 그리고 온도, 습도 CO2 농도를 유지하기 위한 배양기, multi position의 정확한 위치 제어를 위한 motorized stage, 세포의 형상 확인을 위한 현미경, 심장세포의 수축력 및 박동 수를 측정하기 위한 레이저 변위계를 추가하여 해당 기능을 이용할 수 있다.

세포의 수축력 및 박동수 측정을 위한 레이저 변위계의 경우, 측정범위(measuring range)는 50±5mm, resolution은 0.01um, repeatability는 ±0.1um일 수 있다. motorized stage는 X축과 Y으로 구동되며, 동작거리는 150x100mm 이상으로 well plate 내의 모든 위치에서 세포의 관찰이 용이하도록 구성되며, maximum speed는 20mm/sec , repeatability는 ±3μm이다. 세포를 지속적으로 배양할 수 있는 배양기(incubator)는, 세포 배양시 온도, 습도, CO2 농도 등 각 기능 요소를 제어하기 위한 controller가 추가되어 구성의 일부가 될 수 있다.

상기 세포는 심장세포일 수 있다. 이외에도 본 시스템은 기전자극에 따른 세포의 변화를 측정할 수 있기 때문에 심장세포 이외에 근육 세포, 연골 세포 및 신경세포등 다양한 세포에서도 활용이 가능하다.

상기 배양기(incubator)는, 세포에 대한 자극을 위한 연결 핀이 있는 상부 배양기(Top incubator)와 온도 유지를 위한 히팅선(heating line)이 있는 하부 배양기(Bottom incubator)를 포함할 수 있다.

배양기(incubator)는 상부 배양기(top incubator)와 하부(bottom incubator)로 이루어져 있으며, 상부 배양기는 FTO glass를 히팅함으로써 결로를 예방하고 하부는 온수를 순환함으로써 배양기 내부의 온도를 유지시킨다.

또한 배양기 내부에 장착된 well plate에 기전가극을 가하는 것이 가능하도록 하기 위해 배양기 내부에 어댑터(adapter)를 장착하였다. 내부 adapter는 single well plate용과 multi well plate용으로 구분된다. 상부 adapter에는 전기적 연결을 위해 pogo pin이 제공되며, 하부 adapter는 well plate의 위치 고정 및 압력을 이용하여 기계적 자극이 가능하도록 설계되었다.

본 발명은, 약물의 세포에 대한 독성을 기전자극 분석용 웰 플레이트 시스템을 이용하여 측정하는 방법에 있어서, (1) 피진단 약물을 기전자극 분석용 웰 플레이트 시스템 상의 세포에 투여하는 단계; (2) 기전자극 분석용 웰 플레이트 시스템으로부터 레이저 변위계를 이용하여 수축값을 획득하는 단계; (3) 상기 획득한 레이저 변위계 수축값을 기준표와 비교하여, 피진단 약물의 독성을 판단하는 단계;를 포함하는, 약물의 세포에 대한 독성을 측정하는 방법을 제공한다.

아래에서는 첨부한 도면을 참고로 하여 본 발명의 실시예에 대하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였다.

명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 또한, 명세서에 기재된 "…부", "…기", "…모듈" 등의 용어는 적어도 하나의 기능이나 동작을 처리하는 단위를 의미하며, 이는 하드웨어나 또는 소프트웨어 또는 하드웨어 및 소프트웨어의 결합으로 구현될 수 있다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시 예를 설명함으로써, 본 발명을 상세히 설명한다.

(도 1)은, 본 발명의 기전자극(Electromechanical stimulation) 분석용 웰 플레이트 시스템의 구성도이며, 구체적으로는 전기적 자극을 만드는 기능 생성기(Function generator)와 기계적 자극을 만드는 실린지 펌프(Syring pump)를 이용하여 세포에 자극을 부여하고, 이에 따른 변화를 laser vibrometer를 이용해 세포(심장세포, 근육세포, 연골세포, 신경세포)의 수축력을 측정하며, CCD monitor를 이용하여 세포 형상을 분석하는 구성의 시스템이다.

(도 2)는, 기전자극(Electromechanical stimulation) 분석용 웰 플레이트 시스템의, 실제 기기 모습으로 이루어진, 핵심 부분에 대한 구성도 (기전자극 컨트롤러, stage top incubator, 배양기 컨트롤러, 기능성 well plate, 모터화 스테이지를 갖춤)이며, 기전자극 컨트롤러(Electromechanical stimulation controller), stage top incubator, 배양기 컨트롤러(Incubator Controller)가, 단일(Single) well plate 주변에 도시되어 있다. 구체적으로는 Incubator, Motorized Stage, Controller 및 촬영을 할 수 있는 CCD camera가 장착된 현미경 등 구성요소들의 상호 관계를 확인할 수 있다.

(도 3)은, (도 2)의 모터화 스테이지를 더욱 확대한 모습이며, 정확하고 빠르게 다수의 위치(multi position)를 이동하며 측정하기 위한, XY방향 모터화 스테이지(motorized stage)의 모습이다. 구성은 XY축(axis) 부품 및 incubator jig로 이루어져 있으며, 동작 가능한 거리는 150x100 mm 이상으로, well plate 내의 모든 위치에서 세포의 관찰이 용이하도록 구성되고, maximum speed는 20mm/sec이며 , 반복이동오차(repeatability)는 ±3μm로 제작할 수 있다.

(도 4)는, well adapter가 장착되지 않은 상태에서 배양기(incubator) cover 및 body 모습이다. 이는 incubator jig 안쪽의 배양기(incubator)를 구성하는 top incubator 및 bottom incubator의 모습이다. 세포가 배양되는 기능성 well plate의 온도, 습도 및 CO2 농도를 일정하게 유기시키기 위한 기구가 배양기이며, 상부 배양기(Top Incubator)는, Leaser vibrometer를 이용하여 심장세포의 수축력을 측정이 가능하고, 배양기 내부와 외부의 온도 차이에 의한 결로현상을 방지하기 위해 FTO glass를 히팅함으로써 결로를 예방하고 하부 배양기(Bottom Incubator)는 온수를 순환함으로써 배양기 내부의 온도를 유지시키고 CO2 가스가 주입될 수 있도록 설계되었다.

(도 5)는 , (도 4)의 스테이지 상 배양기(stage top incubator)가 구성품으로부터 체결되는 모습으로서, 여러개의 well을 포함하는 어댑터(Adapter) 커버(Cover)와 어댑터(Adapter) 보디(Body) 두 개의 부품으로 이루어져 하나로 체결된다. 기전자극 분석용 well plate의 위치고정, 전기적 자극 그리고 공기 공급을 위해 Pogo pin과 공기 주입 튜브를 구비한다. 이를 통해 외부의 기전자극 컨트롤러를 이용하여 배양기 내부에 있는 well plate에 전기적 자극 및 공기 공급이 가능하다. well plate의 위치 고정 및 압력을 이용하여 기계적 자극이 또한 가능하다.

(도 6)은, 전기적 자극을 생성하는 기능 생성기(Function generator)와 기계적 자극을 생성하는 압력펌프(Pressure pump)를 포함하고, 그 외에 압력센서(Pressure sensor) 및 SMPS가 구비된 기전자극 컨트롤러(Electromechanical stimulation controller)의 구성도이다. 이를 통해 기전자극 분석용 well plate 내부에 세포가 배양되는 동안 전기적 자극, 기계적 자극 또는 기전자극이 가능함.

(도 7)은 기전자극 분석용 well plate를 구성하는 각 부분에 대한 구체적인 이미지를 나타낸다. 또한 구성 부품의 상대적 위치 순서대로 표시하였기 때문에, 조립 구성이기도 하다. 전체 구성은 위에서부터 cover, top well plate, gasket 2, PDMS 재질 diaphragm, gasket 1, bottom well plate이며, 조립을 통해 제작이 완료된다.

(도 8)은, (도 7)의 기전자극 분석용 well plate의 최종 조립된 이미지를 나타내며, 오른쪽 상부 사진은 전기적 자극을 생성하는 Pogo Pin, 오른쪽 하부 사진은 기계적 자극을 생성하는 가압된 팽창 다이어프램의 모습의 사진을 보인다. 전기적 자극은 기능 생성기(Function generator)를 이용하여 전기장을 형성하게 되고 기계적 자극은 압력펌프(Pressure pump)를 이용하여 PDMS 다이어프램의 변형을 통해 세포가 스트레칭(stretching) 된다.

(도 9)는, 기전자극 분석용 well plate를 구성하는 하나의 well에서, PDMS 다이어프램 구조체를 제작하는 공정도이며, 상세한 제작 공정은 PET 필름 부분과 투명한 기판 부분으로 나누어진다. PET필름 부분은 PET 필름 위에 micro/nano groove pattern이 있는 PUA 몰드를 형성하고 그 위에 PDMS를 코팅 및 shadow mask를 이용하여 metal patterning 한다. 다음으로 pinnacle die를 이용하여 PDMS 다이어프램의 형상을 define한다. 투명한 기판 부분은 투명한 기판위에 shadow mask를 이용하여 metal patterning하고 sandblasting process를 통해 홀을 형성하다. 제작된 PET 필름 부분과 투명한 기판 부분은 산소 플라즈마 공정을 통해 bonding하고 PET필름 및 PUA 몰드를 제거함으로써 제작이 완료된다.

(도 10)는, PDMS 다이어프램 구조체 상에, 미세 그루브 패턴(Micro groove 패턴와 Nano groove 패턴)이 있는 다이어프램 구조를 나타낸 것으로, 레이저 변위계 반사판과 전기적 자극을 생성하는 전극의 상대적 위치가 같이 표시된 모습이다. 왼쪽의 미세 그루브 패턴은 오른쪽 사진의 다이어프램 부분을 확대한 것이다. 홀(Hole)이 형성된 glass 위에 마이크로 그루브(micro groove) 또는 나노 그루브(nano groove)가 있고, 또한 레이저 변위계 반사판(Reflector for Laser vibrometer)과 전기자극 전극(Electrical stimulation electrode)이 배치된다. 이렇게 형성되는 과정은, 레이저 변위계 반사판 및 마이크로 그루브가 형성된 PDMS 멤브레인 과 전기자극 전극 및 홀이 형성된 glass를 plasma bonding 과정을 통해 PDMS 다이어프램 제작이 이루어진다. 오른쪽 사진은 실제 제작된 시제품의 모습이다.

실시예 1. 마이크로 그루브의 존재 여부에 따른 레이저 변위의 변화 확인 결과

(도 11)은, PDMS 다이어프램 위에 형성된 방사형 micro groove 유/무에 따른 심장세포 정렬 및 이에 따른 수축력의 차이를 나타내는 사진과 그래프이다. 왼쪽 사진과 그래프는 micro groove가 없는 상태의 PDMS 다이어프램에서 심장세포를 키운 것이며, 오른쪽 사진과 그래프는 micro groove가 있는 상태의 PDMS 다이어프램에서 심장세포를 키운 것이다. micro groove가 있는 상태(with groove라고 표시함)일 때, 심장세포들이 그루브(groove) 방향으로 정렬되는 것을 현미경 사진으로 확인 할 수 있었고, 다이어프램의 변위(displacement)도 4~4.5 ㎛(without groove)에서 17~18 ㎛(with groove)의 값으로 증가하였다. 이러한 변위의 증가를 이용하여, 동일한 농도의 물질을 처리하더라도, 해당 농도의 물질이 심장세포 수축력에 어떠한 영향을 미치는지에 대해, 더 용이하게 심장세포의 수축력 변화를 확인할 수 있다.

실시예 2. 세포의 수축력 및 박동 수의 변화를 레이저 변위계를 통해 측정하고 사진으로 확인한 결과

(도 12)는 실린지 펌프를 이용하여 주기적인 압력 증가/감소시키고, 이에 따른 기체의 주입 및 배출에 따라 PDMS 다이어프램의 변형을 통해 2축 방향의 Strain을 형성하는 이미지 및 실시간 변위 그래프이다. 주기적인 압력 변화에 따른 PDMS 다이어프램의 변위를 레이저 변위 센서를 이용하여 측정한 결과, 주기적 압력(cyclic stretching)에 의해 다이어프램이 변형되며 다이어프램 상에 배양된 세포는 스트레칭된다.

(도 13)은, 전기자극의 주파수 변화에 따른, 세포의 수축력 및 박동 수의 변화를 레이저 변위계을 통해 측정한 결과 그래프이다. 심근세포의 박동 수는 전기자극에 동기화 되며, 자극의 주파수가 0.5Hz에서 3Hz로 증가시킴에 따라 박동 수도 증가한다는 것을 확인할 수 있다.

(도 14)는, 세포 배양 이후 3일 시점부터 시작하여 5일간 전기 자극을 통해 세포를 성숙화한 후, 형광 염색을 통해 DAPI 핵단백질(파란색), Cx-43 단백질(초록색) 및 F-actin(빨간색)을 염색하여 촬영한 결과 사진이다. (a) 전기자극(Electric Stimulation, ES)이 없던 경우와, (b) 전기자극(ES)이 있는 경우의 사진을 비교하면, 전기자극이 있는 경우에 세포와 세포 간 연결(cell-cell communication)이 강해진 것을 사진에서 확인할 수 있다.

실시예 3. 약물 처리 농도에 따른 심장세포 수축력의 변화 효과

(도 15)는, 약물(Verapamil)을 처리하여 이에 따른 심장세포 수축력의 변화를 측정한 그래프이다. 본 발명의 기전자극 분석용 웰 플레이트 시스템을 사용하여, Ca²⁺ 채널 억제제인 Verapamil의 농도를 다르게 하여 심장세포에 처리한 결과, 농도 증가에 따라 수축력은 감소한다는 것을 확인하였다. 단, 0.5 sec 와 2.5 sec 위치에서 심근세포의 수축이 항상 일정하게 발생하는 것으로 확인되었으므로, 전기자극을 통해 일정한 심장세포의 박동은 동기화 된다는 것을 확인하였다.

실시예 4. 전기생리학 분석을 위한 Microelectrode array(MEA) 집적화

(도 16)은, 배양된 세포의 전기적 활동을 분석하기 위해 다이어프램 위에 집적화된 Microelectrode array(MEA)를 추가하였으며, 이 다이어프램 구조체의 개념도와 결과 데이터이다. (B)는 Microelectrode array(MEA)가 집적화된 다이어프램 구조체의 모습이고, (A)는 다이어프램 상의 MEA를 확대한 이미지이다. (C)는 집적된 MEA를 이용하여 Field potential을 측정한 데이터의 사례이며, (D)는 세포에 투여된 약물의 농도 변화에 따라, Conduction velocity 측정값 데이터의 변화양상을 보인 사례이다. 집적화된 MEA는 field potential 측정을 통해 심근세포의 박동수, 탈분극 진폭, field potential duration 및 conduction velocity 등을 측정할 수 있다.

이상으로 본 발명에 관한 바람직한 실시예를 설명하였으나, 본 발명은 상기 실시예에 한정되지 아니하며, 본 발명의 실시예로부터 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의한 용이하게 변경되어 균등하다고 인정되는 범위의 모든 변경을 포함한다.

Claims

세포가 수용되고, 미세 그루브 패턴을 가지는 영역이 하나 또는 그 이상인 다이어프램 판;
상기 다이어프램 판 외부의 양 측면에 위치하는, 전기자극을 부여하는 전극; 및
상기 세포가 수용되는 영역 중심부의 레이저 변위계 반사판을 포함하고,
상기 다이어프램은 기체 주입 및 배출에 따라 2축 방향으로 신장(strain)되는 것을 특징으로 하며,
상기 다이어프램 판 위 세포가 수용되는 공간에 위치하는 마이크로전극의 어레이(Microelectode array);를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 세포에 대한 기전자극 분석용 다이어프램.
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하부 웰 플레이트;
상기 하부 웰 플레이트 상부 일측을 밀폐하는 가스켓1;
상기 가스켓1 상부에 위치하는 제1항의 기전자극 분석용 다이어프램;
상기 기전자극 분석용 다이어프램의 상부 일측을 밀폐하는 가스켓2;
상기 가스켓2 상부에 세포 수용 공간 및 상기 기전자극 분석용 다이어프램에 압력을 인가할 수 있는 압력 조절 홀을 포함하는 상부 웰 플레이트;
상기 웰 플레이트의 세포 수용 공간을 덮는 덮개를 포함하고,
상기 압력 조절 홀을 통해 압력이 인가되면 상기 기전자극 분석용 다이어프램이 2축신장하여 세포에 기계적 자극을 부여하는 것을 특징으로 하는 세포에 대한 기전자극 분석용 웰 플레이트.
제 3항의 웰 플레이트;
상기 웰 플레이트를 수용하여 세포를 배양하는 배양기(incubator);를 포함하고,
상기 배양기 하측면에 상기 웰 플레이트에 수용된 세포를 X축과 Y축의 2차원 방향으로 움직이며 측정할 수 있는 모터화 스테이지(motorized stage) 또는 상기 배양기 하측면에 상기 웰 플레이트에 수용된 세포의 변위를 측정하는 레이저 변위계(laser vibrometer) 또는 상기 웰 플레이트에 수용된 세포에 자극을 형성하는 전기적 자극 생성기 및 기계적 자극 생성기로 이루어진 군에서 하나 이상의 장비를 더 포함하고,
상기 모터화 스테이지(motorized stage) 또는 레이저 변위계(laser vibrometer)는 세포의 수축력 변화를 확인 하는 것을 특징으로 하는 세포에 대한 기전자극 분석용 웰 플레이트 시스템.
제 4항에 있어서,
상기 배양기(incubator)는,
세포에 대한 자극을 위한 연결 핀이 있는 상부 배양기(Top incubator)와 온도 유지를 위한 히팅선(heating line)이 있는 하부 배양기(Bottom incubator)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포에 대한 기전자극 분석용 웰 플레이트 시스템.
약물의 세포에 대한 독성을 측정하는 방법에 있어서,
(1) 피진단 약물을 제4항의 기전자극 분석용 웰 플레이트 시스템 상의 세포에 투여하는 단계;
(2) 기전자극 분석용 웰 플레이트 시스템으로부터 레이저 변위계를 이용하여 수축값을 획득하는 단계; 및
(3) 상기 획득한 레이저 변위계 수축값을 기준표와 비교하여, 피진단 약물의 독성을 판단하는 단계를 포함하고,
상기 기전자극 분석용 웰 플레이트 시스템은,
웰 플레이트; 및
상기 웰 플레이트를 수용하여 세포를 배양하는 배양기(incubator)를 포함하며,
상기 배양기 하측면에 상기 웰 플레이트에 수용된 세포를 X축과 Y축의 2차원 방향으로 움직이며 측정할 수 있는 모터화 스테이지(motorized stage) 또는 상기 배양기 하측면에 상기 웰 플레이트에 수용된 세포의 변위를 측정하는 레이저 변위계(laser vibrometer) 또는 상기 웰 플레이트에 수용된 세포에 자극을 형성하는 전기적 자극 생성기 및 기계적 자극 생성기로 이루어진 군에서 하나 이상의 장비를 더 포함하고,
상기 기전자극 분석용 웰 플레이트는,
하부 웰 플레이트;
상기 하부 웰 플레이트 상부 일측을 밀폐하는 가스켓1;
상기 가스켓1 상부에 위치하는 기전자극 분석용 다이어프램;
상기 다이어프램 어레이 상부 일측을 밀폐하는 가스켓2;
상기 가스켓2 상부에 세포 수용 공간 및 상기 기전자극 분석용 다이어프램에 압력을 인가할 수 있는 압력 조절 홀을 포함하는 상부 웰 플레이트; 및
상기 웰 플레이트의 세포 수용 공간을 덮는 덮개를 포함하며,
상기 기전자극 분석용 다이어프램은,
세포가 수용되고, 미세 그루브 패턴을 가지는 영역이 하나 또는 그 이상인 다이어프램 판;
상기 다이어프램 판 외부의 양 측면에 위치하는, 전기자극을 부여하는 전극; 및
상기 세포가 수용되는 영역 중심부의 레이저 변위계 반사판; 및
상기 다이어프램 판 위 세포가 수용되는 공간에 위치하는 마이크로전극의 어레이(Microelectode array)를 포함하는 것을 특징으로 하는 약물의 세포에 대한 독성을 측정하는 방법.