KR102040499B1 - An animal model for real-time monitoring of cancer cells metastasized to bone marrow and a method of producing thereof - Google Patents
An animal model for real-time monitoring of cancer cells metastasized to bone marrow and a method of producing thereof Download PDFInfo
- Publication number
- KR102040499B1 KR102040499B1 KR1020170134988A KR20170134988A KR102040499B1 KR 102040499 B1 KR102040499 B1 KR 102040499B1 KR 1020170134988 A KR1020170134988 A KR 1020170134988A KR 20170134988 A KR20170134988 A KR 20170134988A KR 102040499 B1 KR102040499 B1 KR 102040499B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- bone marrow
- animal model
- bone
- cancer
- seeded
- Prior art date
Links
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 109
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 108
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 title claims abstract description 74
- 238000010171 animal model Methods 0.000 title claims abstract description 44
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 33
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 title description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 30
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 claims abstract description 26
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 claims abstract description 24
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 75
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 claims description 42
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 16
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 claims description 15
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 claims description 13
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims description 13
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 13
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 13
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 claims description 10
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 claims description 10
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 claims description 6
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 5
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims description 4
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 3
- 238000007789 sealing Methods 0.000 claims description 3
- 238000002513 implantation Methods 0.000 claims 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 abstract description 4
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 2
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 2
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 210000003195 fascia Anatomy 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- YLZOPXRUQYQQID-UHFFFAOYSA-N 3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)-1-[4-[2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]propan-1-one Chemical compound N1N=NC=2CN(CCC=21)CCC(=O)N1CCN(CC1)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F YLZOPXRUQYQQID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 208000002151 Pleural effusion Diseases 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000002380 cytological effect Effects 0.000 description 1
- 238000002716 delivery method Methods 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 210000003275 diaphysis Anatomy 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000005059 dormancy Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000002745 epiphysis Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 210000002436 femur neck Anatomy 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 1
- 238000000760 immunoelectrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0271—Chimeric vertebrates, e.g. comprising exogenous cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
- C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
- G01N33/5088—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms of vertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2207/00—Modified animals
- A01K2207/12—Animals modified by administration of exogenous cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/0331—Animal model for proliferative diseases
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 골수로 파종된 암세포의 실시간 관찰 동물모델 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 골수로 파종된 암세포는 고형 종양의 전신 전이를 발생시키는 원인으로 지목되고 있으나, 이를 연구할 마땅한 모델이 부재한 실정이다. 본 발명의 골수로 파종된 암세포의 실시간 관찰 동물모델은 골수 파종암세포의 특성을 실시간으로 관찰 가능하므로, 의학 분야에서 크게 활용될 것으로 기대된다.The present invention relates to a real-time observation animal model of cancer cells seeded with bone marrow and a method for producing the same. Cancer cells seeded with bone marrow have been identified as a cause of systemic metastasis of solid tumors, but there is no suitable model to study them. The real-time observation animal model of cancer cells seeded with bone marrow of the present invention can be observed in real time the characteristics of bone marrow sowing cancer cells, it is expected to be greatly utilized in the medical field.
Description
본 발명은 골수로 파종된 암세포의 실시간 관찰 동물모델 및 이의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a real-time observation animal model of cancer cells seeded with bone marrow and a method for producing the same.
암의 치료는 크게 암 조직의 성장 억제와 전이 억제로 구분할 수 있는데, 여기서의 전이란 악성 종양이 그 원발부위에서 신체의 다른 부위로 이동하여 그곳에 정착, 증식하는 것을 의미한다. 수술 등으로 국소 부위의 암을 완전히 제거할지라도 시간이 경과한 후 다른 부위에서 암 전이가 발생할 수 있으므로, 암의 전이 유무는 암 환자의 생존율을 향상시키는 데 중요한 요소라 할 것이다.Treatment of cancer can be divided into growth inhibition and metastasis suppression of cancer tissues. Here, metastasis means that a malignant tumor moves from its primary part to another part of the body to settle and proliferate there. Even if the cancer of the local area is completely removed by surgery or the like, cancer metastasis may occur in another part of the body after time, and thus metastasis of the cancer may be an important factor for improving the survival rate of cancer patients.
특히 암세포가 골수로 파종된 경우에, 이를 골수 파종암세포(DTCs: Disseminated tumor cells)라 하는데, 주요 고형 종양의 치료 후 전신 전이의 주된 원인으로 지목되고 있다. 이는 골수로부터 분화된 다양한 순환계 세포가 혈관을 따라 전신으로 이동하면서 암세포를 함께 이동시키기 때문인 것으로 파악된다. 따라서 암 치료 분야에서 골수 파종암세포에 대한 연구가 매우 중요하다고 할 것이나, 골수 파종암세포의 휴면 또는 재활성화를 연구하기 위한 실험 모델이 부재한 실정이다.In particular, when cancer cells are transplanted into the bone marrow, these are called disseminated tumor cells (DTCs), which are considered as the main cause of systemic metastasis after treatment of major solid tumors. It is believed that this is because various circulatory cells differentiated from the bone marrow move cancer cells together as they move systemically along the blood vessels. Therefore, in the field of cancer treatment, research on bone marrow seed cancer cells is very important, but there is no experimental model for studying the dormancy or reactivation of bone marrow seed cancer cells.
본 연구는 골수로 파종된 암세포의 실시간 관찰 동물모델 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명의 동물 모델은 골수 파종암세포의 특성을 실시간으로 관찰 가능하므로, 의학 분야에서 크게 활용될 것으로 기대된다.The present invention relates to a real-time observation animal model of cancer cells seeded with bone marrow and a method of manufacturing the same, the animal model of the present invention is expected to be widely used in the medical field because the characteristics of bone marrow somatic cancer cells can be observed in real time.
본 발명은 상기와 같은 종래의 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 골수로 파종된 암세포의 실시간 관찰 동물모델 및 이의 제조방법에 관한 것이다.The present invention has been made to solve the problems of the prior art, and relates to a real-time observation animal model of cancer cells seeded with bone marrow and a method of manufacturing the same.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the technical problem to be achieved by the present invention is not limited to the above-mentioned problem, another task that is not mentioned will be clearly understood by those skilled in the art from the following description.
이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.Hereinafter, various embodiments described herein are described with reference to the drawings. In the following description, for a thorough understanding of the present invention, various specific details are set forth, such as specific forms, compositions, processes and the like. However, certain embodiments may be practiced without one or more of these specific details, or in conjunction with other known methods and forms. In other instances, well known processes and manufacturing techniques have not been described in particular detail in order to not unnecessarily obscure the present invention. Reference throughout this specification to "one embodiment" or "embodiment" means that a particular feature, form, composition or characteristic described in connection with the embodiment is included in one or more embodiments of the invention. Thus, the context of “in one embodiment” or “embodiment” expressed at various places throughout this specification does not necessarily represent the same embodiment of the invention. In addition, particular features, forms, compositions, or properties may be combined in any suitable manner in one or more embodiments.
명세서에서 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.Unless otherwise defined, all scientific and technical terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs.
본 발명의 일 구체예에서 "전이(metastasis)"란, 악성 종양이 발병한 장기에서 떨어져 다른 조직으로 전파한 상태를 의미한다. 전이는 악성 종양의 진행에 수반되는 현상이다. 악성 종양 세포가 증식하고 암이 진행함에 따라 새로운 유전 형질을 획득하면서 전이가 일어나게 된다. 새로운 유전 형질을 획득한 종양 세포가 혈관과 임파선으로 침윤하고 혈액과 림프를 따라 순환하다가 다른 조직에 정착, 증식하게 되면 전이가 일어난다. In one embodiment of the present invention, "metastasis" refers to a state in which a malignant tumor has spread from other organs to other tissues. Metastasis is a phenomenon that accompanies the progression of malignant tumors. As malignant tumor cells proliferate and cancer progresses, metastasis occurs as new genetic traits are acquired. When tumor cells with new genetic traits invade blood vessels and lymph nodes, circulate along blood and lymph, and settle and proliferate in other tissues, metastasis occurs.
본 발명의 일 구체예에서 "파종암세포(DTCs: Disseminated tumor cells)"란, 암의 원발 부위를 떠나 다른 조직으로 파종된 암세포를 의미한다. 상기의 파종이란 침윤과 동일한 의미로 해석될 수 있다. 암세포가 골수로 파종된 경우에 이를 골수 파종암세포라 하고, 골수 파종암세포는 골수로부터 분화된 다양한 순환계 세포와 함께 혈관을 따라 이동하면서 전신에 암 전이를 유발하므로, 암 치료 분야에서 골수 파종암세포에 대한 연구가 매우 중요하다고 할 것이다.In one embodiment of the present invention, "disseminated tumor cells (DTCs)" refers to cancer cells that are seeded in other tissues after leaving the primary site of the cancer. The above seeding may be interpreted in the same sense as infiltration. When cancer cells are transplanted into the bone marrow, they are called bone marrow seed cancer cells, and bone marrow seed cancer cells move along blood vessels along with various circulatory cells differentiated from the bone marrow to cause cancer metastasis throughout the body. Research is very important.
본 발명의 일 구체예에서 "진단"이란, 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미하며, 본 발명의 목적상 진단은 골수 파종암세포의 의한 암 전이의 발생을 확인하고, 질환의 심도를 판단하는 것이다. 이를 위해 암 전이 의심 개체로부터의 조직의 육안적 또는 세포학적 확인으로 암 전이를 진단할 수 있으며, 암 전이 발병 의심 개체의 검체(임상적으로는 세포, 혈액, 수액, 흉수, 복수, 관절액, 농(膿), 분비액, 담,인두점액, 요(尿), 담즙, 대변등) 내에 포함되어 있는 암세포를 측정하는 방법, 암 전이 관련 단백질을 직접 검출하는 방법, 상기 단백질에 대한 항체의 농도를 측정하는 방법, 또는 상기 단백질 및/또는 상기 항체를 코딩하는 핵산을 직접 검출하는 방법으로 암 전이를 진단할 수 있다. 암세포를 측정하는 방법으로는 암세포에 특이적으로 반응하는 염색액을 이용한 염색이 있을 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 항원-항체 결합 또는 암 전이 관련 단백질을 직접 검출하는 방법을 이용한 진단적 수단으로는 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 암 전이 관련 단백질을 코딩하는 핵산을 직접 검출하는 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In one embodiment of the present invention, "diagnosis" refers to confirming the presence or characteristics of a pathological condition, and for purposes of the present invention, the diagnosis is to confirm the occurrence of cancer metastasis caused by bone marrow disseminated cancer cells and to determine the depth of the disease. It is. For this purpose, cancer metastasis can be diagnosed by gross or cytological confirmation of tissues from suspected cancer metastases, and samples of suspected cancer metastases (clinically cells, blood, sap fluid, pleural effusion, plural fluid, joint fluid, pus) (Iv), secretion, bile, pharyngeal mucus, urine, bile, feces, etc. to measure cancer cells, direct detection of cancer-related proteins, methods of measuring antibody concentrations to the proteins Cancer metastasis can be diagnosed by a method of detecting or directly detecting a nucleic acid encoding the protein and / or the antibody. The method for measuring cancer cells may be staining using a staining solution that specifically reacts with cancer cells, but is not limited thereto. The method may be used as a diagnostic means by directly detecting antigen-antibody binding or cancer metastasis-related proteins. Western blot, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, Ouchterlony immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, Immunoprecipitation Assay, Complement Fixation Assay, Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS), Protein Chip, etc., but are not limited thereto. Methods of directly detecting nucleic acid may include reverse transcriptase (RT-PCR), competitive reverse transcriptase (Competitive RT-PCR), Time RT-PCR (Real-time RT-PCR), RNase protection assay (RPA; RNase protection assay), Northern blotting, but the like (Northern blotting), or DNA chip, but it is not limited thereto.
본 발명의 일 구체예에서 "스크리닝"이란, 여러 물질로 이루어진 후보군으로부터 목적으로 하는 어떤 특정한 성질을 갖는 물질을 특정한 조작 또는 평가 방법으로 선별하는 것이다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 스크리닝은, 본 발명에 의한 골수로 파종된 암세포의 실시간 관찰 동물모델에 암 전이 예방용 또는 치료용 후보물질을 처리하고, 상기 후보물질에 의하여 암 전이가 예방되거나, 치료되거나, 대조군 물질에 비하여 예후가 증진된 경우에 후보물질을 암 전이 예방제 또는 치료제로 결정하는 것이다.In one embodiment of the present invention, "screening" refers to selecting a substance having a specific characteristic of interest from a candidate group consisting of various substances by a specific manipulation or evaluation method. For the purposes of the present invention, the screening of the present invention is to treat a cancer metastasis prevention or treatment candidate material in a real-time observation animal model of cancer cells seeded with bone marrow according to the present invention, cancer metastasis is prevented by the candidate material The candidate is determined to be a cancer metastasis preventive or therapeutic agent when the prognosis is improved or when compared to the control substance.
본 발명의 일 구체예에서 "투여"란, 어떠한 적절한 방법으로 개체에게 특정한 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 조성물의 투여경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 경구 투여, 복강 내 투여, 혈관 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여, 강내 투여, 복강 내 투여, 경막 내 투여가 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명에서 유효량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 개체의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 성인의 경우, 상기 조성물을 1회 50ml~500ml의 양으로 체내에 투여 가능하며, 화합물일 경우 0.1ng/kg-10㎎/kg, 단백질에 대한 모노클로날 항체일 경우 0.1ng/kg-10㎎/kg의 용량으로 투여될 수 있다. 투여간격은 1일 1회 내지 12회일 수 있으며, 1일 12회 투여할 경우에는 2시간마다 1회씩 투여할 수 있다. 또한 펩타이드들 및 핵산들은 면역 반응을 증진하기 위하여 고안된 다른 치료, 예를 들어 당업계에 주지된 것과 같은 어쥬번트 또는 사이토카인(또는 사이토카인을 코딩하는 핵산)과 혼합하여 투여될 수 있다. 바이오리스틱(biolistic) 전달 또는 생체 외(ex vivo) 처리와 같은 다른 표준 전달 방법들이 사용될 수도 있다. 생체 외 처리에서 예를 들어 항원제시 세포들(APCs), 수지상세포들, 말초혈액 단핵구 세포들, 또는 골수세포들을 환자 또는 적당한 공여자로부터 얻어서 면역 조성물로 생체 외에서 활성화된 후 그 환자에게 투여될 수 있다.In one embodiment of the present invention, "administration" means introducing a specific composition to an individual in any suitable way, the route of administration of the composition can be administered via any general route as long as it can reach the desired tissue. Oral administration, intraperitoneal administration, vascular administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, intranasal administration, pulmonary administration, rectal administration, intraluminal administration, intraperitoneal administration, intradural administration, but are not limited thereto. Do not. In the present invention, the effective amount is defined as the type of disease, the severity of the disease, the type and amount of the active and other ingredients contained in the composition, the type and formulation of the formulation and the age, body weight, general health condition, sex and diet, time of administration, route of administration. And various factors, including the rate of secretion of the composition, the duration of treatment, and the drugs used concurrently. For adults, the composition can be administered once in the body in an amount of 50ml ~ 500ml, 0.1ng / kg-10mg / kg for compound, 0.1ng / kg-10mg for monoclonal antibody to protein It may be administered at a dose of / kg. Dosing interval may be 1 to 12 times a day, if 12 times a day may be administered once every two hours. Peptides and nucleic acids can also be administered in admixture with other therapies designed to enhance an immune response, for example adjuvant or cytokines (or nucleic acids encoding cytokines), as is well known in the art. Other standard delivery methods may be used, such as biolistic delivery or ex vivo treatment. In ex vivo treatment, for example antigen presenting cells (APCs), dendritic cells, peripheral blood mononuclear cells, or bone marrow cells can be obtained from a patient or a suitable donor and activated in vitro with an immune composition and then administered to the patient. .
본 발명의 일 구체예에서, (a) 인간을 제외한 제 1 개체의 혈관으로 암세포를 주입하는 단계; (b) 상기 제 1 개체의 골 조직을 수득하고 절단하여 해면골을 노출시키는 단계; 및 (c) 상기 골 조직의 해면골이 인간을 제외한 제 2 개체의 피내에 접하도록 이식하는 단계를 포함하는 골수로 파종된 암세포 동물모델의 제조방법을 제공하고, 상기 (c) 단계에서의 이식은, (가) 제 2 개체의 피부를 인장하여 중첩시키고, 중첩된 한 면의 피부를 천공하는 단계; (나) 상기 (b) 단계의 골 조직의 해면골이 제 2 개체의 피내에 접하도록 위치시키는 단계; 및 (다) 제 2 개체의 천공 부위의 중첩 피부를 유리로 밀봉하는 단계를 포함하는 골수로 파종된 암세포 동물모델의 제조방법을 제공하며, 상기 (a) 단계에서의 혈관은 정맥인 것을 특징으로 하는 골수로 파종된 암세포 동물모델의 제조방법을 제공하며, 상기 (a) 단계는 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)를 추가로 첨가하는 것을 특징으로 하는 골수로 파종된 암세포 동물모델의 제조방법을 제공하며, 상기 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자는 1 ng/ml 내지 50 ng/ml의 농도로 첨가하는 것을 특징으로 하는 골수로 파종된 암세포 동물모델의 제조방법을 제공하며, 상기 (b) 단계에서의 골 조직은 적골수(red marrow)를 포함하는 골인 것을 특징으로 하는 골수로 파종된 암세포 동물모델의 제조방법을 제공하며, 상기 골 조직은 대퇴골인 것을 특징으로 하는 골수로 파종된 암세포 동물모델의 제조방법을 제공하며, 상기 (c) 단계 이후에, (d) 상기 제 2 개체의 피내 이식된 골 조직을 실시간 관찰하는 단계를 추가로 포함하는 골수로 파종된 암세포 동물모델의 제조방법을 제공하며, 상기 (d) 단계에서의 관찰은 이광자 현미경(two-photon microscopy)를 이용하는 것을 특징으로 하는 골수로 파종된 암세포 동물모델의 제조방법을 제공한다.In one embodiment of the invention, (a) injecting cancer cells into the blood vessels of the first individual, except human; (b) obtaining and cutting bone tissue of the first individual to expose spongy bone; And (c) implanting the spongy bone of the bone tissue so as to be in contact with the blood of a second individual except a human, and wherein the transplantation in the step (c) is performed. (A) stretching and overlapping the skin of the second individual, and perforating the skin of the overlapping side; (B) positioning the spongy bone of the bone tissue of step (b) to contact the blood of the second individual; And (C) provides a method for producing a bone marrow seeded cancer cell animal model comprising the step of glass sealing the overlapping skin of the perforated part of the second individual, characterized in that the blood vessel in step (a) is a vein To provide a method for producing a cancer cell animal model seeded with bone marrow, the step (a) is the production of bone marrow seeded cancer cell animal model characterized in that the addition of granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) It provides a method, the granulocyte macrophage colony stimulating factor provides a method for producing a bone marrow seeded cancer cell animal model, characterized in that the addition of 1 ng / ml to 50 ng / ml, the step (b) Bone tissue in the present invention provides a method for producing a cancer cell animal model seeded with bone marrow characterized in that the bone containing the red bone marrow (red marrow), the bone tissue characterized in that the femur bone A method for producing an animal model of cancer cell seeded with water, wherein after the step (c), (d) real-time observation of the intradermal transplanted bone tissue of the second individual, the cancer cell seeded with bone marrow It provides a method for producing a model, the observation in the step (d) provides a method for producing a cancer cell animal model seeded with bone marrow characterized in that using two-photon microscopy.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 중 어느 하나 이상의 방법으로 제조되는 것을 특징으로 하는 골수로 파종된 암세포 동물모델을 제공한다.In another embodiment of the present invention, there is provided an animal model of cancer cells seeded with bone marrow, characterized in that produced by any one or more of the above methods.
본 발명의 또 다른 구체예에서, (a) 인간을 제외한 제 1 개체의 골 조직을 수득하고 절단하여 해면골을 노출시키는 단계; 및 (b) 상기 골 조직의 해면골이 인간을 제외한 제 2 개체의 피내에 접하도록 이식하는 단계를 포함하는 골수 내 세포 모니터링용 동물모델의 제조방법을 제공하고, 상기 (b) 단계에서의 이식은, (가) 제 2 개체의 피부를 인장하여 중첩시키고, 중첩된 한 면의 피부를 천공하는 단계; (나) 상기 (b) 단계의 골 조직의 해면골이 제 2 개체의 피내에 접하도록 위치시키는 단계; 및 (다) 제 2 개체의 천공 부위의 중첩 피부를 유리로 밀봉하는 단계를 포함하는 골수 내 세포 모니터링용 동물모델의 제조방법을 제공하며, 상기 (a) 단계에서의 골 조직은 적골수(red marrow)를 포함하는 골인 것을 특징으로 하는 골수 내 세포 모니터링용 동물모델의 제조방법을 제공하며, 상기 골 조직은 대퇴골인 것을 특징으로 하는 골수 내 세포 모니터링용 동물모델의 제조방법을 제공하며, 상기 (b) 단계 이후에, (c) 제 2 개체의 피내 이식된 골 조직을 실시간 관찰하는 단계를 추가로 포함하는 골수 내 세포 모니터링용 동물모델의 제조방법을 제공하며, 상기 (c) 단계에서의 관찰은 이광자 현미경(two-photon microscopy)를 이용하는 것을 특징으로 하는 골수 내 세포 모니터링용 동물모델의 제조방법을 제공한다.In another embodiment of the present invention, the method comprises the steps of: (a) obtaining and cutting bone tissue of a first individual except a human to expose the cavernous bone; And (b) implanting the spongy bone of the bone tissue so as to be in contact with the blood of a second individual, except for humans. (A) stretching and overlapping the skin of the second individual, and perforating the skin of the overlapping side; (B) positioning the spongy bone of the bone tissue of step (b) to contact the blood of the second individual; And (C) provides a method for producing an animal model for monitoring intracellular bone marrow cell comprising the step of glass sealing the overlapping skin of the perforated portion of the second individual, wherein the bone tissue in step (a) is red bone marrow (red) It provides a method for producing an animal model for monitoring intracellular bone marrow characterized in that the bone containing marrow), the bone tissue provides a method for producing an animal model for monitoring the intracellular bone marrow characterized in that the femur bone, After step b), (c) provides a method for producing an animal model for monitoring intracellular bone marrow further comprising the step of observing the intradermal transplanted bone tissue in real time, the observation in step (c) Provides a method for producing an animal model for monitoring intracellular bone marrow using two-photon microscopy.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 중 어느 하나 이상의 방법으로 제조되는 것을 특징으로 하는 골수 내 세포 모니터링용 동물모델을 제공한다.In another embodiment of the present invention, there is provided an animal model for monitoring intracellular bone marrow, characterized in that produced by any one or more of the above methods.
본 발명의 또 다른 구체예에서, (a) 상기의 골수로 파종된 암세포 동물모델 A 개체와 B 개체의 해면골이 피내에 이식된 접합무에서 혈관 신생을 측정하는 단계; (b) 상기 A 개체에 혈관 신생 억제용 후보물질을 투여하는 단계; (c) 상기 A 개체와 B 개체의 해면골이 피내에 이식된 접합무에서 혈관 신생을 재측정하는 단계; 및 (d) 상기 A 개체에서의 혈관 신생이 B 개체에서의 혈관 신생보다 억제된 경우에 상기 후보 물질을 혈관 신생 억제용 물질로 판단하는 단계를 포함하는 혈관 신생 억제용 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.In another embodiment of the present invention, the method comprises the steps of: (a) measuring the angiogenesis in the junctional bone in which the spongy bone of the cancer cell animal model A and B individuals sown with bone marrow is implanted into the blood; (b) administering a candidate substance for inhibiting angiogenesis to the subject A; (c) re-measuring angiogenesis in the junctional joint in which spongy bones of subject A and B are implanted into the blood; And (d) judging the candidate substance as an angiogenesis-inhibiting substance when the angiogenesis in the A subject is more inhibited than the angiogenesis in the B subject. do.
본 발명의 또 다른 구체예에서, (a) 상기의 골수로 파종된 암세포 동물모델 A 개체와 B 개체를 준비하는 단계; (b) 상기 A 개체에 암 전이 억제용 후보물질을 투여하는 단계; (c) 상기 A 개체와 B 개체의 장기에서 암 발생을 측정하는 단계; 및 (d) 상기 A 개체에서의 암 발생이 B 개체에서의 암 발생보다 억제된 경우에 상기 후보 물질을 암 전이 억제용 물질로 판단하는 단계를 포함하는 암 전이 억제용 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.In another embodiment of the present invention, (a) preparing a cancer cell animal model A and B individuals seeded with the bone marrow; (b) administering a candidate substance for inhibiting cancer metastasis to the subject A; (c) measuring the incidence of cancer in the organs of Subject A and Subject B; And (d) judging the candidate substance as a cancer metastasis suppressing substance when the occurrence of cancer in the subject A is more inhibited than the occurrence of cancer in the subject B. do.
이하 상기 본 발명을 단계별로 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail step by step.
골수로 파종된 암세포는 고형 종양의 전신 전이를 발생시키는 원인으로 지목되고 있으나, 이를 연구할 마땅한 모델이 부재한 실정이다. 본 발명의 골수로 파종된 암세포의 실시간 관찰 동물모델은 골수 파종암세포의 특성을 실시간으로 관찰 가능하므로, 의학 분야에서 크게 활용될 것으로 기대된다.Cancer cells seeded with bone marrow have been identified as a cause of systemic metastasis of solid tumors, but there is no suitable model to study them. The real-time observation animal model of cancer cells seeded with bone marrow of the present invention can be observed in real time the characteristics of bone marrow sowing cancer cells, it is expected to be greatly utilized in the medical field.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, 암세포를 단독배양하거나, 섬유모세포와 공동 배양하거나, 또는 골수(bone marrow)와 36시간 동안 공동배양한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른, 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)가 있거나 또는 없는 환경에서 암세포를 48시간 배양한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른, 골수 파종암세포 공여 마우스로부터 수득한 대퇴골의 삭정 방법을 나타낸 모식도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른, 골수 파종암세포 실시간 관찰 동물모델 제조의 전체적인 모식도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른, 골수 파종암세포 공여 마우스로부터 수득한 대퇴골을 수여 마우스의 피내에 이식하는 방법을 나타낸 모식도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른, 골수 파종암세포 실시간 관찰 동물모델 제조의 실사를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른, 골수 파종암세포의 혈관 신생 과정을 이광자 현미경으로 관찰하는 방법을 나타낸 모식도이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른, 골수 파종암세포 실시간 관찰 동물모델을 스테이징 시스템에 거치한 실사를 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른, 이식된 골수(공여 마우스의 해면뼈 노출 대퇴골)와 공여 마우스의 피내 근막사이에 혈관이 신생된 결과를 나타낸 도이다.1 is a diagram showing the results of cultured cancer cells alone, co-culture with fibroblasts, or co-culture with bone marrow (bone marrow) for 36 hours according to an embodiment of the present invention.
Figure 2 is a diagram showing the results of 48 hours of cancer cell culture in an environment with or without granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) according to an embodiment of the present invention.
Figure 3 is a schematic diagram showing a method for cutting the femur obtained from bone marrow disseminated cancer cell donor mice, according to an embodiment of the present invention.
Figure 4 is a schematic diagram of the production of bone marrow seed carcinoma cells real-time observation animal model according to an embodiment of the present invention.
Figure 5 is a schematic diagram showing a method of transplanting the femur obtained from bone marrow disseminated cancer cell donor mice into the blood of the recipient mouse, according to an embodiment of the present invention.
Figure 6 is a diagram showing the actual inspection of the bone marrow seeding cancer cells real-time observation animal model according to an embodiment of the present invention.
Figure 7 is a schematic diagram showing a method of observing the neovascularization process of bone marrow disseminated cancer cells in a two-photon microscope according to an embodiment of the present invention.
8 is a diagram showing the live-action of a bone marrow disseminated cancer cell real-time observation animal model according to an embodiment of the present invention to a staging system.
9 is a view showing the result of the formation of blood vessels between the implanted bone marrow (sponge exposed femur of donor mouse) and the intradermal fascia of the donor mouse according to an embodiment of the present invention.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are only for illustrating the present invention in more detail, and it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples according to the gist of the present invention. .
실시예Example 1. 골수 환경에서 안정적인 암세포의 제조 1. Production of stable cancer cells in bone marrow environment
사람 유래 유방암 세포주 MCF7 과 췌장암 세포주인 AsPC-1을 미국 세포주은행(ATCC: American Tissue Culture Collection)으로부터 수득하였고, 10 % 소 태아 혈청과 100 unit/mL 페니실린, 및 100 μg/mL 스트렙토마이신을 첨가한 RPMI-1640 배지로 37 및 5 % CO2가 유지되는 조건에서 배양하였다. 상기의 암세포를 렌티 바이러스성 형질전환 시스템(lenti-viral transduction system)을 이용하여 녹색 또는 적색 형광 단백질(GFP 또는 RFP)로 표지하고, 상기 세포를 단독배양하거나, 섬유모세포와 공동 배양하거나, 또는 골수(bone marrow)와 36시간 동안 공동배양하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.Human-derived breast cancer cell line MCF7 and pancreatic cancer cell line AsPC-1 were obtained from the American Tissue Culture Collection (ATCC) and added 10% fetal bovine serum, 100 unit / mL penicillin, and 100 μg / mL streptomycin. Cultured in RPMI-1640 medium at 37 and 5% CO 2 . The cancer cells are labeled with green or red fluorescent protein (GFP or RFP) using a lenti-viral transduction system, cultured alone, co-cultured with fibroblasts, or bone marrow (bone marrow) and co-culture for 36 hours. The results are shown in FIG.
실험결과, 암세포를 단독배양하거나 섬유모세포와 공동배양하는 경우에 비해서, 골수와 공동배양 하는 경우에 암세포의 활성에 매우 낮아지는 것을 알 수 있었다. 이는 골수 내 다양한 면역세포에 의해 암세포가 활성이 저해되는 것으로 이해된다.As a result, it was found that the activity of cancer cells was very low when cocultured with bone marrow, compared with the case where cancer cells were cultured alone or co-cultured with fibroblasts. It is understood that cancer cell activity is inhibited by various immune cells in the bone marrow.
골수 환경에서도 암세포의 활성이 안정적으로 유지되도록 하기 위해서, 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF, 20ng/ml)가 있거나 또는 없는 환경에서 암세포를 48시간 배양하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.In order to maintain the activity of cancer cells in a bone marrow environment, cancer cells were cultured for 48 hours in an environment with or without granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF, 20ng / ml). The results are shown in FIG.
실험 결과, 암세포 배양 환경에 GM-CSF가 첨가된 경우에, 암세포의 증식이 대조군에 비해 크게 증가되는 것을 알 수 있었다.As a result, it was found that when GM-CSF was added to the cancer cell culture environment, the proliferation of cancer cells was significantly increased compared to the control group.
실시예Example 2. 골수로 2. into the bone marrow 파종된Sown 암세포의 실시간 관찰 동물모델 제조 Production of real time observation animal model of cancer cells
실시예Example 2-1. 골수 2-1. marrow 파종암세포Sowing cancer cells 공여 마우스의 제조 Preparation of Donor Mouse
실시예 1의 형광 단백질 표지된 암세포(세포수 1 X 106/C㎕)를 공여 마우스(C57BL/6)의 꼬리 정맥으로 주사하고, 추가로 GM-CSF(20ng/ml)을 마우스의 꼬리 정맥으로 주사하였다. 마우스를 24시간 사육 후, 마우스의 대퇴골을 수득하였다. 상기 대퇴골의 양측 뼈끝(epiphyses)을 제거하고, 뼈몸통(diaphysis)의 바깥 치밀골(compact bone)을 종축으로 절단하여 해면골(spongy bone)이 노출되도록 준비하였다. 상기 대퇴골 삭정의 모식도를 도 3에 나타내었다.The fluorescent protein labeled cancer cells (cell count 1 × 10 6 / Cμl) of Example 1 were injected into the tail vein of the donor mouse (C57BL / 6), and further GM-CSF (20 ng / ml) was injected into the tail vein of the mouse. Injection. After breeding mice for 24 hours, the femurs of the mice were obtained. The epiphyses on both sides of the femur were removed, and the outer compact bone of the diaphysis was cut in the longitudinal axis to prepare the sponge bone to be exposed. A schematic diagram of the femoral neck was shown in FIG. 3.
실시예Example 2-2. 골수 2-2. marrow 파종암세포Sowing cancer cells 실시간 관찰 동물모델 제조 Real time observation animal model manufacturing
공여 마우스(C57BL/6)의 등쪽 피부를 인장하여 중첩시키고, 중첩된 두 면 중 한 면의 피부를 천공하였다. 천공된 피부면 측에 실시예 2-1에서 수득된 대퇴골을 해면골이 천공되지 않은 피부 면의 내측에 닿도록 위치시키고, 천공 부위를 포함한 중첩 피부를 유리로 밀봉하였다. 상기 유리 밀봉(유리창 모델)은 공지된 문헌(Nature protocols 6, 1355-1366)과 동일하게 수행하였다. 상기 골수 파종암세포 실시간 관찰 동물모델 제조의 전체적인 모식도 및 대퇴골 피내 이식의 모식도를 도 4와 도 5에 각각 나타내고, 동물모델 제조의 실사를 도 6에 나타내었다.The dorsal skin of the donor mouse (C57BL / 6) was tensioned and superimposed, and the skin of one of the two overlapping faces was punctured. On the perforated skin side, the femur obtained in Example 2-1 was placed so that the spongy bone touched the inside of the unperforated skin side, and the overlapping skin including the perforated area was sealed with glass. The glass seal (window model) was performed in the same manner as known literature (Nature protocols 6, 1355-1366). 4 and 5 show the schematic diagram of the bone marrow disseminated cancer cell real-time observation animal model production and the femoral intradermal graft, respectively.
실시예Example 3. 골수 3. Bone marrow 파종암세포의Somatic cancer cells 혈관 신생 과정 확인 Identify Angiogenesis
실시예 2의 골수 파종암세포 실시간 관찰 동물모델을 이용하여, 피내로 이식된 해면골 내의 골수로부터 혈관이 신행되는 과정 및 상기 혈관으로 골수 파종암세포가 이동하는 과정을 확인하였다.Using the bone marrow disseminated cancer cells real-time observation animal model of Example 2, the process of blood vessels from the bone marrow in the cavernous bone implanted into the blood and the process of moving the bone marrow disseminated cancer cells to the blood vessels was confirmed.
이를 위해, 마우스를 졸레틸(zoletil, Virbac Colombia)로 마취하였다. 장기간 마취일 경우에는 이소플로란(isoflurane) 흡입 마취제를 사용하였다. 이후, 마우스를 스테이징 시스템에 거치하고, 이광자 현미경(two-photon microscopy, LSM7MP, Carl-Zeiss, Germany)으로 실시간 관찰하고, 이광자 현미경 제조사에서 권장하는 이미지 분석 프로그램(Zen 소프트웨어)로 분석하였다. 상기 이광자 현미경 관찰 모식도를 도 7에 나타내고, 마우스를 스테이징 시스템에 거치한 실사를 도 8에 나타내었다.To this end, mice were anesthetized with zoletil (virlet Colombia). For prolonged anesthesia, isoflurane inhalation anesthesia was used. The mice were then mounted on a staging system, observed in real time with two-photon microscopy (LSM7MP, Carl-Zeiss, Germany) and analyzed with an image analysis program (Zen software) recommended by the two-photon microscopy manufacturer. The schematic diagram of the two-photon microscope observation is shown in FIG. 7, and the photorealism in which the mouse is mounted on the staging system is shown in FIG. 8.
실험 결과, 이식된 골수(공여 마우스의 해면뼈 노출 대퇴골)와 공여 마우스의 피내 근막사이에 혈관이 신생되어 연결된 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과를 도 9에 나타내었다.As a result, it was confirmed that angiogenesis was connected between the transplanted bone marrow (the spongy bone exposed femur of the donor mouse) and the intradermal fascia of the donor mouse. The results are shown in FIG. 9.
상기 실시예 1 내지 3의 결과로부터, GM-CSF를 첨가하는 방법으로 암세포를 골수 내 환경에서 안정적으로 배양할 수 있다는 것과, 본 발명의 골수 파종암세포 실시간 관찰 동물모델이 파종암세포의 전이 기전을 연구하는데 효과적임을 확인하였다.From the results of Examples 1 to 3, the method of adding GM-CSF can cultivate cancer cells stably in the bone marrow environment, and the bone marrow disseminated cancer cell real-time observation animal model of the present invention to study the metastasis mechanism of the disseminated cancer cells It was confirmed that it is effective to.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.Having described the specific part of the present invention in detail, it is apparent to those skilled in the art that the specific technology is merely a preferred embodiment, and the scope of the present invention is not limited thereto. Therefore, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and equivalents thereof.
Claims (19)
(b) 상기 제 1 개체의 골 조직을 수득하고 절단하여 해면골을 노출시키는 단계; 및
(c) 상기 골 조직의 해면골이 인간을 제외한 제 2 개체의 피내에 접하도록 이식하는 단계를 포함하는, 골수로 파종된 암세포 동물모델의 제조방법.
(a) injecting cancer cells into blood vessels of a first individual except a human;
(b) obtaining and cutting bone tissue of the first individual to expose spongy bone; And
(c) implanting the spongy bone of the bone tissue so as to be in contact with the blood of a second individual except a human.
상기 (c) 단계에서의 이식은,
(가) 제 2 개체의 피부를 인장하여 중첩시키고, 중첩된 한 면의 피부를 천공하는 단계;
(나) 상기 (b) 단계의 골 조직의 해면골이 제 2 개체의 피내에 접하도록 위치시키는 단계; 및
(다) 제 2 개체의 천공 부위의 중첩 피부를 유리로 밀봉하는 단계를 포함하는, 골수로 파종된 암세포 동물모델의 제조방법.
The method of claim 1,
The implantation in step (c) is
(A) tensioning and overlapping the skin of the second individual, and puncturing the skin of the overlapping side;
(B) positioning the spongy bone of the bone tissue of step (b) to contact the blood of the second individual; And
(C) A method for producing an animal model of cancer cell seeded with bone marrow, the method comprising sealing the overlapped skin of the perforated portion of the second individual with glass.
상기 (a) 단계에서의 혈관은 정맥인 것을 특징으로 하는, 골수로 파종된 암세포 동물모델의 제조방법.
The method of claim 1,
The blood vessel in step (a) is characterized in that the vein, bone marrow seeded cancer cell animal model manufacturing method.
상기 (a) 단계는 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)를 추가로 첨가하는 것을 특징으로 하는, 골수로 파종된 암세포 동물모델의 제조방법.
The method of claim 1,
The step (a) is characterized in that additionally adding granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), bone marrow seeded cancer cell animal model manufacturing method.
상기 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자는 1 ng/ml 내지 50 ng/ml의 농도로 첨가하는 것을 특징으로 하는, 골수로 파종된 암세포 동물모델의 제조방법.
The method of claim 4, wherein
The granulocyte macrophage colony stimulating factor is added to a concentration of 1 ng / ml to 50 ng / ml, characterized in that the bone marrow seeded cancer cell animal model production method.
상기 (b) 단계에서의 골 조직은 적골수(red marrow)를 포함하는 골인 것을 특징으로 하는, 골수로 파종된 암세포 동물모델의 제조방법.
The method of claim 1,
The bone tissue in step (b) is characterized in that the bone containing the bone marrow (red marrow), bone marrow seeded cancer cell animal model manufacturing method.
상기 골 조직은 대퇴골인 것을 특징으로 하는, 골수로 파종된 암세포 동물모델의 제조방법.
The method of claim 6,
The bone tissue is characterized in that the femur, bone marrow seeded cancer cell animal model manufacturing method.
상기 (c) 단계 이후에,
(d) 상기 제 2 개체의 피내 이식된 골 조직을 실시간 관찰하는 단계를 추가로 포함하는, 골수로 파종된 암세포 동물모델의 제조방법.
The method of claim 1,
After step (c),
(d) real-time observation of the intradermal transplanted bone tissue of the second individual, a method of producing an animal model of cancer cell seeded cancer cells.
상기 (d) 단계에서의 관찰은 이광자 현미경(two-photon microscopy)를 이용하는 것을 특징으로 하는, 골수로 파종된 암세포 동물모델의 제조방법.
The method of claim 8,
Observation in the step (d) is characterized in that using a two-photon microscopy (two-photon microscopy), bone marrow seeded cancer cell animal model manufacturing method.
10. A cancer cell animal model seeded with bone marrow, characterized in that it is produced by any one or more of the methods.
(b) 상기 A 개체에 혈관 신생 억제용 후보물질을 투여하는 단계;
(c) 상기 A 개체와 B 개체의 해면골이 피내에 이식된 접합무에서 혈관 신생을 재측정하는 단계; 및
(d) 상기 A 개체에서의 혈관 신생이 B 개체에서의 혈관 신생보다 억제된 경우에 상기 후보 물질을 혈관 신생 억제용 물질로 판단하는 단계를 포함하는, 혈관 신생 억제용 후보물질의 스크리닝 방법.
(A) measuring the angiogenesis in the junction of the spongy bone of the animal model A and B individuals of claim 10 implanted into the blood;
(b) administering a candidate substance for inhibiting angiogenesis to the subject A;
(c) re-measuring angiogenesis in the junctional joint in which spongy bones of subject A and B are implanted into the blood; And
(d) screening the candidate substance for inhibiting angiogenesis, comprising determining the candidate substance as an angiogenesis-inhibiting substance when angiogenesis in the subject A is more inhibited than angiogenesis in the subject B.
(b) 상기 A 개체에 암 전이 억제용 후보물질을 투여하는 단계;
(c) 상기 A 개체와 B 개체의 장기에서 암 발생을 측정하는 단계; 및
(d) 상기 A 개체에서의 암 발생이 B 개체에서의 암 발생보다 억제된 경우에 상기 후보 물질을 암 전이 억제용 물질로 판단하는 단계를 포함하는, 암 전이 억제용 후보물질의 스크리닝 방법.
(a) preparing the animal model A and B individuals of claim 10;
(b) administering a candidate substance for inhibiting cancer metastasis to the subject A;
(c) measuring the incidence of cancer in the organs of Subject A and Subject B; And
(d) judging the candidate substance as a cancer metastasis suppressing substance when the occurrence of cancer in the subject A is more suppressed than the occurrence of cancer in the subject B.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020170134988A KR102040499B1 (en) | 2017-10-18 | 2017-10-18 | An animal model for real-time monitoring of cancer cells metastasized to bone marrow and a method of producing thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020170134988A KR102040499B1 (en) | 2017-10-18 | 2017-10-18 | An animal model for real-time monitoring of cancer cells metastasized to bone marrow and a method of producing thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20190043219A KR20190043219A (en) | 2019-04-26 |
| KR102040499B1 true KR102040499B1 (en) | 2019-11-05 |
Family
ID=66281189
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020170134988A KR102040499B1 (en) | 2017-10-18 | 2017-10-18 | An animal model for real-time monitoring of cancer cells metastasized to bone marrow and a method of producing thereof |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102040499B1 (en) |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100666607B1 (en) * | 2004-11-03 | 2007-01-09 | 재단법인서울대학교산학협력재단 | METHOD OF PRODUCING Xenogenic CD4 T-CELL AND ANIMAL MODEL PRODUCING Xenogenic CD4 T-CELL |
| KR102364713B1 (en) * | 2015-03-27 | 2022-02-22 | 가톨릭대학교 산학협력단 | Producing method of rheumatoid arthritis animal model, AbartaRA, via transplanting rheumatoid arthritis synovium |
| KR20170056272A (en) * | 2015-11-13 | 2017-05-23 | 메타바이오주식회사 | Animal models for efficacy evaluation of drug candidates for treating cervical cancer, process of manufacturing the animal models and application thereof |
| KR20170108822A (en) * | 2016-03-18 | 2017-09-27 | 니혼 메디피직스 가부시키가이샤 | Method for producing animal model of osteoblastic bone metastasis |
-
2017
- 2017-10-18 KR KR1020170134988A patent/KR102040499B1/en active IP Right Grant
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Clin Exp Metastasis., vol.23 no.7-8 pp.345-356(2006) |
| Nat Protoc. vol.6 no.9 pp.1355-1366 (2012.11.18. PMC공개)* |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20190043219A (en) | 2019-04-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ngo et al. | Antibody therapy targeting CD47 and CD271 effectively suppresses melanoma metastasis in patient-derived xenografts | |
| Lefley et al. | Development of clinically relevant in vivo metastasis models using human bone discs and breast cancer patient-derived xenografts | |
| Wagner et al. | Humanization of bone and bone marrow in an orthotopic site reveals new potential therapeutic targets in osteosarcoma | |
| EP3155010B1 (en) | Inhibition of chemokine ccl7 or receptor ccr3 of same for the treatment and diagnosis of prostate cancer | |
| CN110575540B (en) | Use of PDGF inhibitors for the production of a medicament for the treatment of inflammatory intestinal diseases | |
| CN111040032A (en) | Application of bidirectional regulator in preparation of preparation for diagnosing or regulating cell senescence and tumors | |
| CN108926713A (en) | The application of calcineurin regulatory protein 1.4 or its analog in the drug that preparation inhibits liver cancer | |
| KR102040499B1 (en) | An animal model for real-time monitoring of cancer cells metastasized to bone marrow and a method of producing thereof | |
| CN107217060A (en) | KDM1A purposes | |
| CN103966334A (en) | Application of CSF2RB (Colony Stimulating Factor2Receptor, Beta) gene in prostatic cancer bone metastasis | |
| Lin et al. | Activated vascular endothelia regulate invasion of glioma cells through expression of fibronectin | |
| CN102692500A (en) | ANGPTL4 as a marker of liver cancer metastasis by serological detection and application thereof | |
| KR101743340B1 (en) | Patient-derived xenograft model in gastric cancer and a use thereof | |
| CN103800919A (en) | Application of TUFT1 (tuftelin 1) in preparation of formulation for liver cancer diagnosis and treatment | |
| CN111110849B (en) | Application of serine protease inhibitor Kazal 1 in preparation of cell aging and tumor diagnosis or regulation preparation | |
| US9759725B2 (en) | Treatment-induced damage to the tumor micro-environment promotes cancer therapy resistance through extracellular proteins | |
| KR102226485B1 (en) | Method for producing xenograft model derived from a patient of breast cancer | |
| CN115381949A (en) | Application of targeted inhibition of pigment epithelium derived factor in promotion of liver regeneration and improvement of liver injury | |
| KR102557289B1 (en) | A patient-derived xenograft model of diffuse type of cancer and a method of producing thereof | |
| CN101998992A (en) | Methods involving MS4A12 and agents targeting MS4A12 for therapy, diagnosis and testing | |
| CN106701904B (en) | Application of ACSL4 gene and expression product in diagnosis and treatment of gastric cancer | |
| KR101423651B1 (en) | Process for enhancing stem cell bioactivity using genistein and the cellular therapeutic supplementary agent comprising the same | |
| CN105944082A (en) | Application of osteoprotegerin only or combination of osteoprotegerin with other cytokines in treatment of hepatic fibrosis | |
| Ireland | Understanding the role of the tumour microenvironment in chemoresistance and tumour progression | |
| Francis | The Tumour Immune Microenvironment in Early Breast Cancer Progression |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant |