KR102033894B1 - 삼일열말라리아 진단용 키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 삼일열원충의 글루탐산탈수소효소 재조합 단백질을 이용한 말라리아 진단용 키트 및 진단에 관한 정보 제공 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 삼일열원충의 글루탐산탈수소효소 재조합 단백질은 삼일열원충의 혈청 진단에 사용 가능할 뿐만 아니라, 정확성 및 민감도가 높기 때문에 본 발명에 따른 재조합 단백질을 이용하여 말라리아 진단에 효과적으로 사용될 수 있을 것으로 기대된다. 뿐만 아니라 상기 항원을 이용하여 말라리아의 발병을 억제할 수 있는 백신 조성물로도 사용가능할 것으로 기대된다.

Description

삼일열말라리아 진단용 키트{Diagnostic kit for Vivax Malaria}

본 발명은 말라리아 진단용 키트에 관한 것이다.

말라리아는 말라리아 매개모기(Anopheles mosquito)를 매개체로 하며, 말라리아 모기에 물리게 되면 원충(Plasmodium)에 의한 감염이 일어나 적혈구 파괴에 의한 여러 가지 병증이 나타나게 된다. WHO 통계에 따르면 말라리아는 세계적으로 매년 5억명 이상이 감염되고 이 중 2백만명 이상이 목숨을 잃고 있다(국내등록특허 10-1402271). 처음에 말라리아 모기에 물리면 포자낭충이 감염되어 혈액을 따라 이동하다 간으로 들어간 후 증식 또는 잠복을 하게 된다. 그러다가 혈중으로 나오게 되면 적혈구에 감염되고, 여기서 형성된 수십 개의 분열소체가 적혈구 파괴를 수반하여 방출되며, 다시 이 분열소체들이 적혈구에 들어가 증식을 하게 된다. 증상으로는 몇 일간 지속되는 고열과 두통, 오한, 전신 통증, 빈혈 등이 있다.

말라리아의 진단에는 일반적으로 현미경을 이용하여 원충을 검사하는 혈액 도말법, 말라리아 특이 항원이나 항체를 검사하는 효소면역학적 분석법, 유전자 증폭법 등이 이용되고 있다. 혈액 도말법은 현재까지 가장 많이 사용되는 검사 방법이지만, 원충을 육안으로 일일이 확인해야 하므로 번거롭고 시간이 오래 걸리며, 검사자 간의 편차가 큰 것이 문제점이다. LDH(Lactate dehydrogenase)나 HRP II(Histidine rich protein II)과 같은 말라리아 특이 항원을 이용한 검사 방법은 혈액도말법의 단점을 극복할 수 있으나, 전혈을 사용해야 하므로 과정이 번거롭고 자동화가 어려우며 민감도가 혈액도말법 보다 떨어진다는 것이 문제점이다.

한편, 국내에서는 1993년 말라리아가 재유행한 후, DMZ에 인접한 경기북부, 인천북부, 강원북부 등에서 말라리아가 토착화되어 현재까지 3만 여명의 환자가 발생하고 있어 한국에서 발생하는 6번째 중요한 감염성 질환으로 알려져있음에도 불구하고, 한국인 특이적 말라리아의 진단 및 치료와 관련된 연구는 미비한 실정이다.

따라서, 특이도 및 민감도가 증가되고, 평가 시간이 짧고 자동화가 가능할 뿐만 아니라 혈청을 이용한 말라리아 원충을 진단할 수 있는 항원성을 가지는 단백질의 개발이 요구되고 있는 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 말라리아 원충의 글루탐산탈수소효소 재조합 단백질을 포함하는 말라리아 진단용 항원 조성물 및 이를 포함하는 진단 키트를 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

또한, 말라리아 원충의 글루탐산탈수소효소 재조합 단백질을 포함하는 항원 조성물을 유효성분으로 포함하는, 말라리아용 백신 조성물을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물, 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.

명세서에서 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.

본 명세서에 있어서, "키트"란 말라리아 원충에 대한 항원을 유효성분으로 포함하고 있어, 말라리아의 진단에 관한 정보를 제공하는 검진용 기기를 의미하며, 생물학적 시료로부터 항체 여부를 확인할 수 있는 형태라면 제한이 없다. 바람직하게는 말라리아 원충의 글루탐산탈수소효소 재조합 단백질을 포함할 수 있으며, 상기 재조합 단백질은 삼일열원충의 글루탐산탈수소효소의 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 펩타이드 서열을 의미하며, 말라리아 원충에 대한 항체를 확인할 수 있는 항원이라면 제한이 없다.

본 발명은 말라리아 원충의 글루탐산탈수소효소(glutamate dehydrogenase; GDH)를 유효성분으로 포함하는, 말라리아 진단용 항원 조성물 및 상기 항원 조성물을 포함하는 말라리아 진단용 키트를 제공하는 것을 그 목적으로 하고 있다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 글루탐산탈수소효소는 바람직하게는 서열번호 3의 펩타이드를 포함하는 재조합 단백질이나, 말라리아 원충에 대한 항원성을 나타내는 펩타이드 서열이라면 제한이 없다.

본 발명의 다른 구체예에 있어서, 상기 말라리아 원충은 바람직하게는 Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale 등 일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 삼일열원충(Plasmodium vivax)이나, 상기 글루탐산탈수소효소에 대한 항원성을 나타내는 말라리아 원충이라면 제한이 없다.

본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 말라리아 원충 진단용 항원 조성물은 한국인 특이적인 진단용 조성물이나, 삼일열원충에 감염되는 민족이라면 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 진단은 바람직하게는 혈청, 혈액, 혈장, 또는 타액을 이용하는 것이나, 항체를 확인할 수 있는 종류라면 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 항원 조성물을 유효성분으로 포함하는, 말라리아용 백신 조성물을 제공하는 것을 그 목적으로 하고 있다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 백신 조성물은 면역항원보강제(adjuvant)를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 면역항원보강제는 바람직하게는 monophosphoryl lipid A(MPL), STING agonist 등이 있으나, 기존에 사용되고 있는 면역항원보강제라면 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 다른 구체예에 있어서, 상기 백신 조성물은 바람직하게는 리포좀(liposome)에 봉입되어 있을 수 있으나, 체내에 주입되는데 용이한 형태라면 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 백신 조성물은 바람직하게는 삼일열원충의 감염을 예방하는 것이나, 글루탐산탈수소효소를 가지고 있는 말라리아 원충이라면 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 조성물은 병원균 예방용 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로오스 용액, 수크로오스 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 게시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내, 근육 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 투여 대상의 무게, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.

본 발명에 따른 삼일열원충의 글루탐산탈수소효소 재조합 단백질은 삼일열원충의 혈청 진단에 사용 가능할 뿐만 아니라, 정확성 및 민감도가 높기 때문에 본 발명에 따른 재조합 단백질을 이용하여 말라리아 진단에 효과적으로 사용될 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 상기 글루탐산탈수소효소 재조합 단백질의 항원성을 이용하여 말라리아의 발병을 억제하는데 효과적으로 사용될 수 있는 백신 조성물로도 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 삼일열원충의 글루탐산탈수소효소의 유전자 정보를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 BLAST program를 이용한 분석 결과를 나타낸 도면이다. 도면에서 Py는 P. yoelii yoelii strain 17XNL(XM_719434.1), Pk는 P. knowlesi strain H(XM_002260680.1), Pf는 P. falciparum strain FCC1/HN(AY040586.1), Pch는 P. chabaudi chabaudi(XM_738585.1), Pc는 P. cynomolgi strain B(XM_004224427.1), Pb는 P. berghei strain ANKA(XM_673901.1), Pv Sal-1은 P. vivax strain Sal-1(XP_001616667)을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 BLAST program를 이용하여 상동성을 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 삼일열원충의 글루탐산탈수소효소의 재조합 단백질을 분리한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 웨스턴 블롯팅 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 ELISA 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 기생충혈증(Parasitemia) 정도와 ELISA와의 연관관계를 나타낸 도면이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로써, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 말라리아 진단용 유전자의 확인

2010년에서 2011년 사이에 인천광역시의 강화군(37.31N, 125.33E), 경기도의 김포시(37.33N, 126.48E), 부천시(37.29N, 126.46E) 및 파주시(37.88N, 126.76E), 그리고 강원도의 철원군(38.10N, 127.30E)에서 보건소에 방문한 환자들 중 말라리아가 의심이 되는 환자들의 혈액 시료에서 말라리아 원충의 감염 여부를 김자염색(giemsa stain) 후에 현미경으로 확인하고, 각각의 혈액 시료는 -80℃에서 보관하였다. 그리고 삼일열원충(Plasmodium vivax)에 감염되었다고 확인된 말라리아 환자의 혈액으로부터 QIAamp DNA Blood Mini Kit(Qiagen)를 이용하여 전체 지노믹 DNA를 추출하고, 추출된 DNA를 이용하여 삼일열원충의 글루탐산탈수소효소(glutamate dehydrogenase; GDH) 유전자를 증폭시켰다. 증폭된 유전자에 대한 정보는 도 1에 나타내었다. GDH 유전자 증폭을 위해서는 TaKaRa Ex Taq DNA polymerase kit에 50ng의 지노믹 DNA와 40pmol의 프라이머 조성물(forward primer: 5′-ATT TTA CCC CTC TCG GCC GTG GCC CTT TTC-3′ 및 reverse primer: 5′-GGC GCC GTC GCA CTG CTC GTA GAT GCT CCT-3′)을 혼합하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)을 실시하였다. 중합효소연쇄반응용 조성물은 증류수(distilled water)를 이용하여 최종 50uL로 맞춰주었고, 중합효소연쇄반응은 94℃에서 5분 동안 변성(denaturation) 단계를 거친 후에 94℃ 30초, 55℃ 60초, 및 72℃ 90초를 35회 반복하였다. 그리고 최종적으로 72℃에서 5분간 연장(extension) 단계를 실시하였다. 그리고 증폭된 유전자는 1% 아가로즈 겔을 이용하여 확인한 후에 QIAquick Gel Extraction Kit를 이용하여 추출하였고, 추출된 유전자는 pCR2.1 cloning vector(Invitrogen)에 삽입하여 pVpGDH 벡터를 제작한 후 매뉴얼에 따라 ABI PRISM Big-Dye Terminator Ready Reaction Cycle Sequencing Kit FS(Perkin Elmer)를 이용하여 염기서열분석(DNA sequencing)을 실시하였다. 이후 분석된 염기서열 정보는 MegAlign program(DNASTAR package)을 이용하여 아미노산 정보를 획득하였고, NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 BLAST program을 이용하여 아미노산 서열을 분석하였다. 본 발명의 글루탐산탈수소효소의 아미노산 서열은 서열번호 1로 확인되었다. 그 결과는 도 2 및 도 3에 나타내었다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 글루탐산탈수소효소의 아미노산 서열은 서열번호 3이다.

도 2 및 도 3에 나타난 바와 같이, 분석된 아미노산 서열은 P. vivax strain Sal-I(GenBank accession No. XM_001616617.1)과 100% 상동성(homology)을 나타내는 것을 확인하였으며, P. cynomolgi strain B(PCYB_132800, XM_004224305.1)와는 83.0%의 상동성을 나타내며, P. knowlesi strain H(PKH_131950, XM_002260679.1)와는 78.6%의 상동성을 나타내며, P. chabaudi chabaudi(XM_738585.1)와는 66.6%의 상동성을 나타내며, P. berghei strain ANKA(XM_673901.1)와는 64.5%의 상동성을 나타내며, P. falciparum(AF269241.1)과는 58.5%의 상동성을 나타내며, P. yoelii yoelii strain 17XNL(XM_719434.1)과는 56.2%의 상동성을 나타내는 것을 확인하였다. 상기 결과를 통하여 삼일열원충의 글루탐산탈수소효소(pGDH) 유전자는 유전자 서열의 변화가 크지 않은 것을 확인할 수 있었으며, 이를 통하여 상기 글루탐산탈수소효소 유전자를 말라리아의 진단에 사용가능하다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 2: 삼일열원충 글루탐산탈수소효소 재조합 단백질 분리

삼일열원충의 글루탐산탈수소효소 단백질을 분리하기 위하여, 실시예 1과 동일한 방법으로 글루탐산탈수소효소 유전자를 증폭하였다. TaKaRa Ex Taq DNA polymerase kit에 50ng의 지노믹 DNA와 40pmol의 프라이머 조성물(forward primer: 5′-AGC CAT ATG CGC GCC AAG GTG CGC GGC GC-3′ 및 reverse primer: 5′-GTG CTC GAG CAG GCC GCC CTG CTC CAG GA-3')을 혼합하여 중합효중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)을 실시하였다. 상기 forward primer에는 NdeI 제한효소 사이트(CATATG)가, 그리고 reverser primer에는 XhoI 제한효소 사이트(CTCGAG)가 포함되도록 프라이머를 제작하였다. 중합효소연쇄반응에 의하여 증폭된 유전자는 제한효소인 NdeI과 XhoI을 이용하여 자른 후 1% 아가로즈 겔을 이용하여 확인하였고, QIAquick Gel Extraction Kit를 이용하여 추출하였다. 그 결과는 도 4a에 나타내었다. 그리고 추출된 유전자는 pET28b expression vector(Novagen)에 삽입하여 pVKtype3 벡터를 제작하였고, 제작된 벡터는 Escherichia coli BL21(DE3)pLysS 균주에 형질전환(transformation)시켰다. 제작된 벡터는 실시예 1과 동일한 방법으로 염기서열 분석을 통하여 정확한 유전자가 삽입된 것을 확인하였다. 글루탐산탈수소효소 재조합단백질 생성을 위하여 형질전환된 E. coli를 LB 배지를 이용하여 배양한 후에 1mM의 IPTG(isopropyl-1-thio-β-d-galactopyranoside)와 함께 배양하였고, 재조합 단백질의 발현 촉진된 것을 SDS-page와 Coomassie brilliant blue 염색법을 통하여 확인하였다. 그 결과는 도 4b에 나타내었다. 그리고 배양된 배양액으로부터 매뉴얼에 따라 affinity chromatography(Novagen)를 이용하여 pGDH-(His)₆ 재조합 단백질을 분리하였다. 분리된 단백질은 SDS-page와 Coomassie brilliant blue 염색법을 통하여 확인하였다. 그 결과는 도 4c에 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이, 55kDa의 pGDH 재조합 단백질이 제대로 분리된 것을 확인하였다.

실시예 3: 삼일열원충 글루탐산탈수소효소 재조합 단백질의 항원성 확인

실시예 2의 방법으로 제조된 삼일열원충 글루탐산탈수소효소(pGDH) 재조합 단백질의 항원성(antigenicity)을 확인하기 위하여, 웨스턴 블롯팅(western blotting) 및 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)를 실시하였다. 웨스턴 블롯팅을 실시하기 위하여 12% SDS-page 겔을 이용하여 재조합 단백질을 분리하고, 분리된 재조합 단백질은 니트로섬유소막(nitrocellulose membrane)으로 전기영동을 통하여 이동시켰다. 그리고 55 kDa에 해당하는 위치의 니트로섬유소막을 자른 후 인산완충용액(phosphate buffered saline; PBS)에 용해되어 있는 5% skim milk를 이용하여 4℃에서 12시간 동안 블록킹(blocking)하였고, 0.15% Tween 20-PBS 용액을 이용하여 3회 세척하였다. 그리고 세척된 니트로섬유소막은 1:100(v/v)으로 희석된 삼일열원충에 감염된 환자의 혈청(serum), 열대열말라리아원충(Plasmodium falciparum; Pf)에 감염된 환자의 혈청, 또는 말라리아가 아닌 환자의 혈청(대조군)과 4시간 동안 반응시킨 후에 0.15% Tween 20-PBS 용액을 이용하여 3회 세척하였다. 그리고 1:1,000(v/v)으로 희석된 horseradish peroxidase-conjugated goat anti-human IgG secondary antibody(Sigma)를 처리하고 실온에서 3시간 동안 반응시킨 후에 0.2% diaminobenzidine과 0.02% H₂O₂-PBS를 이용하여 발색시킨 후에 확인하였다. 그 결과는 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타난 바와 같이, 열대열말라리아원충에 감염된 환자 또는 대조군에서는 55 kDa에 해당하는 위치의 밴드가 없는 반면에, 삼일열원충에 감염된 환자에서는 55 kDa에 해당하는 위치에서 모두 밴드가 나타나는 것을 확인하였다. 상기 결과를 통하여, 본 발명의 pGDH 재조합 단백질을 이용하여 삼일열원충에 감염된 환자를 특이적으로 진단할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

또한, ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assays)를 실시하여 혈액 시료에 pGDH 항원에 대한 항체를 가지고 있는지 확인하였다. ELISA를 실시하기 위하여, 0.5 ug/mL의 pGDH 재조합 단백질을 포함하는 capture antigen solution 50uL를 96 well plate에 첨가한 후 실온에서 12시간 동안 반응시켰다. 그리고 용액을 모두 제거하고 1% BSA(bovine serum albumin)과 0.05% Tween 20-PBS가 첨가된 blocking solution을 웰(well)에 첨가한 후에 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후에 0.05% Tween 20-PBS 용액을 이용하여 3회 세척하였다. 그리고 blocking buffer를 이용하여 1:100(v/v)으로 희석된 삼일열원충에 감염된 환자의 혈청(serum), 삼일열원충에 감염되지 않은 환자의 혈청(대조군)을 각 웰에 첨가한 후에 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후에 0.05% Tween 20-PBS 용액을 이용하여 3회 세척하고 1:2,000(v/v)으로 희석된 horseradish peroxidase-conjugated anti-human IgG(Sigma)를 처리하고 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후에 0.05% Tween 20-PBS 용액을 이용하여 3회 세척하여 반응을 종결시켰다. 그리고 100 uL의 peroxidase substrate 2,2′-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (Kirkegaard & Perry Laboratories)을 첨가하고 30분 동안 반응시킨 후에 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과는 도 6에 나타내었다. 그리고 각각의 혈청을 희석배수를 늘려 ELISA를 이용하여 확인하였다. 실시예의 모든 통계분석은 GraphPad software(GraphPad Software Inc.)를 이용하여 실시하였으며, "p<0.05"이면 유의성이 있는 것으로 분석하였다. 말라리아 환자군과 정상 대조군의 비교 정확성을 확인하는데 two-tailed t test를 사용하였다.

도 6에 나타난 바와 같이, 삼일열원충의 글루탐산탈수소효소(GDH)를 서열을 3가지로 나누어 효과를 확인하였다. 서열번호 1에서 1 내지 161번째 아미노산까지를 N말단 영역으로 하고(도 6의 A 그래프), 서열번호 1에서 162 내지 321번째 아미노산까지를 중앙(Central) 영역으로 하며(도 6의 B 그래프 및 DNA 서열은 서열번호 2 참조, 아미노산 서열은 서열번호 3 참조), 서열번호 1에서 322 내지 502번째 아미노산까지를 C말단 영역으로 하였다(도 6의 C 그래프). 삼일열원충에 감염된 환자에게서는 대조군과 비교하여 흡광도가 유의성있게 증가된 것을 확인하였다. 한편, 특이성(specificity) 및 민감도(sensitivity)를 각각 확인해 본 결과, 본 발명의 pGDH 재조합 단백질을 이용한 진단의 특이성은 중앙(Central) 영역에서 96.9%, 민감도는 92.0%로 가장 높은 진단 정확성을 나타내는 것을 확인하였다.

또한, 기생충혈증 정도에 따라 ELISA를 실시하고 흡광도를 측정한 결과를 도 7에 나타내었다. Kruskal-Wallis test 및 One-way ANOVA는 기생충혈증 정도와 흡광도의 비교에 대한 정확성을 확인하는데 사용하였다.

도 7에 나타난 바와 같이, 기생충혈증의 정도에 따라서는 정확성이 큰 차이를 나타내지 않는 것을 확인하였으며(p=0.6309), 이를 통하여 삼일열원충의 감염 정도와 관계없이 높은 정확도를 가지고 감염 여부를 진단할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과들을 통하여, 본 발명의 삼일열원충 pGDH 재조합 단백질은 항원성을 나타내며, 이를 이용하여 진단 및 치료에 사용가능하다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4: 삼일열원충 글루탐산탈수소효소 재조합 단백질의 이용 가능성 확인

실시예 2의 방법으로 제조된 삼일열원충 글루탐산탈수소효소(pGDH) 재조합 단백질이 진단에 사용가능한지 확인하기 위하여, 2012년도에 인천광역시의 강화군의 교동면의 3074명의 주민들을 대상으로 하여 총 876개의 혈청 시료를 획득하여, pGDH 재조합 단백질을 이용하여 ELISA를 실시하였다. 연간 말라리아 발생률(annual parasite incidence, API)은 각각의 연구 지역에서 개별적으로 1,000명의 주민당 말라리아 양성 환자의 수를 계산하였다. 그리고 2012년도 및 2013년도에서 API의 양성률의 관계를 분석하는데는 Pearson's correlation analysis를 사용하였다.

API = (현미경을 통해 말라리아 진단된 환자의 수(number of microscopically proven malaria cases)/연구 지역의 인구수(population of administrative area)) * 1,000

그 결과는 표 1에 나타내었다.

표 1에 나타난 바와 같이, 총 876개의 혈청 시료 중 91개(10.39%)에서 양성 반응을 나타내었으며, 난정리에서 가장 높은 양성률(16.81%, 19/113)을 나타내었으며, 그 이후로는 지석리(16.39%, 10/61)가 뒤를 잇는 것을 확인하였다. 양성 반응을 나타낸 주민 중 13명(14.29%)은 지난 10년 사이에 말라리아 감염증을 경험했었던 사람들이고, 나머지 78명(85.71%)는 pGDH에 대하여 새롭게 항체를 획득한 사람들이었다. 2012년도에는 9명의 말라리아 환자가 발생하였으며, 2013년도에는 4명의 말라리아 환자가 발생하였다. 따라서, 교동면 전체에 대해서는 API는 2012년도에는 2.93, 2013년도에는 1.30으로 감소되었으나, 봉소리 및 대령리에서는 API가 증가되는 것을 확인하였다.

본 발명의 삼일열원충 글루탐산탈수소효소(pGDH) 재조합 단백질은 항원성을 가지고 있으며, 삼일열원충에서 거의 유전자 변이 없이 아미노산 서열이 유지되며, 삼일열원충의 감염이 적은 혈청 시료에서도 정확히 감염 정도를 진단할 수 있으므로, 삼일열원충의 감염을 조기에 정확히 진단하는데 사용가능할 것으로 기대된다. 또한, 상기 항원성을 이용하여 삼일열원충의 감염을 억제하는 백신 조성물로도 사용가능할 것으로 기대된다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> LTS Co., Ltd <120> Diagnostic kit for Vivax Malaria <130> DPB172846.k01 <150> KR 10-2017-0079840 <151> 2017-06-23 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 502 <212> PRT <213> Plasmodium vivax <400> 1 Met Ile Leu Pro Leu Ser Ala Val Ala Leu Phe Ala Ile Phe Ser Gly 1 5 10 15 Ala Arg Gly Leu Ser Thr Thr Ser His Leu Lys His Val Ala Pro Gly 20 25 30 Ser Asn Ile Arg Thr Ile Arg Arg Ala Lys Val Arg Gly Ala Ala Gln 35 40 45 Ser Tyr Gly Tyr Asn Ala Ser Gly Ser Leu Asp Asp Lys Met Asp Leu 50 55 60 Leu Arg Glu Arg Val Lys Ala Arg Asn Arg Gly Glu Pro Glu Phe Leu 65 70 75 80 Gln Ala Phe Glu Glu Val Leu Ser Ser Leu Lys Pro Leu Phe Gln Arg 85 90 95 Asp Ser Val Tyr Leu Gly Val Leu Glu Asn Leu Ala Glu Pro Glu Arg 100 105 110 Val Ile Gln Phe Arg Val Pro Trp Val Asp Asp Arg Gly Glu His Arg 115 120 125 Met Asn Arg Gly Phe Arg Ile Gln Tyr Ser Ser Val Leu Gly Pro Tyr 130 135 140 Lys Gly Gly Leu Arg Phe His Pro Thr Val Asn Leu Ser Ile Met Lys 145 150 155 160 Phe Leu Gly Phe Glu Gln Met Phe Lys Asn Ser Leu Thr Thr Leu Pro 165 170 175 Met Gly Gly Gly Lys Gly Gly Ser Asp Phe Asp Pro Lys Gly Lys Ser 180 185 190 Pro Asn Glu Ile Leu Ser Phe Cys Gln Ser Phe Met Thr Asn Leu Phe 195 200 205 Arg His Ile Gly Pro Asn Thr Asp Val Pro Ala Gly Asp Ile Gly Val 210 215 220 Gly Gly Arg Glu Ile Gly Tyr Leu Phe Gly Gln Tyr Lys Arg Leu Ser 225 230 235 240 Asn Ala Phe Glu Gly Val Leu Thr Gly Lys Asn Val Lys Trp Gly Gly 245 250 255 Ser Asn Ile Arg Ser Glu Ala Thr Gly Tyr Gly Ala Val Tyr Phe Ala 260 265 270 Glu Asn Ala Leu Ala Lys Val Asn Glu Gln Leu Lys Asp Lys Arg Cys 275 280 285 Val Val Ser Gly Ser Gly Asn Val Ala Gln Tyr Leu Val Glu Met Leu 290 295 300 Leu Arg Lys Gly Ala Ile Val Leu Thr Met Ser Asp Ser Asp Gly Tyr 305 310 315 320 Ile Ile Glu Pro Ser Gly Phe Thr Lys Glu Gln Leu Ala His Val Met 325 330 335 Glu Leu Lys Asn Val Lys Arg Gly Arg Leu Arg Glu Tyr Val Lys Trp 340 345 350 Ser Ser Thr Ala Lys Tyr Val Glu Lys Gly Lys Pro Trp Glu Val Pro 355 360 365 Cys Asp Leu Ala Phe Pro Cys Ala Thr Gln Asn Glu Ile Asn Gln Asp 370 375 380 Asp Ala Asp Leu Leu Ile Lys Asn Gln Cys Lys Met Val Val Glu Gly 385 390 395 400 Ala Asn Met Pro Thr His Ile Asn Ala Leu Arg Leu Phe Lys Gln Lys 405 410 415 Gly Val Leu Val Cys Pro Ser Lys Ala Ala Asn Ala Gly Gly Val Ala 420 425 430 Val Ser Gly Leu Glu Met Ser Gln Asn Ser Met Arg Met Gln Trp Thr 435 440 445 Ala Glu Glu Thr Asp Arg Lys Leu Gln Ala Ile Met Arg Ser Ile Tyr 450 455 460 Glu Gln Cys Asp Gly Ala Ser Arg Arg Tyr Leu Gly Glu Ser Asp Leu 465 470 475 480 Val Ala Gly Ala Asn Ile Ala Gly Phe Leu Lys Val Ala Asp Ser Phe 485 490 495 Leu Glu Gln Gly Gly Leu 500 <210> 2 <211> 480 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The specific sequence of Plasmodium vivax <400> 2 ctagggtttg agcaaatgtt taagaacagc ttgacgacgc tacctatggg tggagggaaa 60 ggtggttctg attttgatcc caaagggaag tccccaaatg agatcctttc attttgccag 120 tccttcatga ccaatctgtt taggcacatt gggcccaaca cagatgtgcc tgcaggagat 180 atcggagtgg ggggaagaga gattggctac ctcttcgggc aatacaaaag gttaagcaac 240 gctttcgaag gagtgttaac tggcaagaat gtcaagtggg gtggaagcaa tatcaggtcg 300 gaagcaacag ggtatggggc agtctacttt gcagagaatg ccctagccaa agtgaatgag 360 cagttgaaag acaaacggtg tgtcgtcagt ggaagtggga acgtcgcgca gtacctggtg 420 gagatgctcc tacgaaaagg agccatcgtc ttaaccatga gtgacagcga tgggtacatc 480 480 <210> 3 <211> 160 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> The specific sequence of Plasmodium vivax <400> 3 Leu Gly Phe Glu Gln Met Phe Lys Asn Ser Leu Thr Thr Leu Pro Met 1 5 10 15 Gly Gly Gly Lys Gly Gly Ser Asp Phe Asp Pro Lys Gly Lys Ser Pro 20 25 30 Asn Glu Ile Leu Ser Phe Cys Gln Ser Phe Met Thr Asn Leu Phe Arg 35 40 45 His Ile Gly Pro Asn Thr Asp Val Pro Ala Gly Asp Ile Gly Val Gly 50 55 60 Gly Arg Glu Ile Gly Tyr Leu Phe Gly Gln Tyr Lys Arg Leu Ser Asn 65 70 75 80 Ala Phe Glu Gly Val Leu Thr Gly Lys Asn Val Lys Trp Gly Gly Ser 85 90 95 Asn Ile Arg Ser Glu Ala Thr Gly Tyr Gly Ala Val Tyr Phe Ala Glu 100 105 110 Asn Ala Leu Ala Lys Val Asn Glu Gln Leu Lys Asp Lys Arg Cys Val 115 120 125 Val Ser Gly Ser Gly Asn Val Ala Gln Tyr Leu Val Glu Met Leu Leu 130 135 140 Arg Lys Gly Ala Ile Val Leu Thr Met Ser Asp Ser Asp Gly Tyr Ile 145 150 155 160

Claims (10)

1. 삼일열원충(Plasmodium vivax)의 서열번호 3의 펩타이드로 이루어진 재조합 단백질을 포함하는, 말라리아 진단용 항원 조성물.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삼일열원충(Plasmodium vivax)의 서열번호 2에 대응하는 프라이머 염기쌍 또는 프로브를 포함하는, 말라리아 진단용 키트.
6. 제 5 항에 있어서,
   상기 키트는 혈청, 혈액, 혈장, 또는 타액을 이용하는 것인, 말라리아 진단용 키트.
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제

Images