KR102026521B1 - Kit and Method for Detecting Target Materials using Asymmetric Beads - Google Patents

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Abstract

본 발명은 크기가 상이한 입자의 비대칭 응집을 이용한 표적 물질 검출 키트 및 표적 물질의 검출 방법에 관한 것으로, 표적 물질에 대하여 서로 다른 결합 분자를 사용하면 입자 간의 비대칭 복합체를 얻을 수 있으며, 이를 분석하여 불특정 응집 효과를 배제하고, 높은 특이적 신호를 확보할 수 있어 각종 표적 물질을 효율적으로 검출할 수 있다.The present invention relates to a target material detection kit and a method for detecting a target material by using asymmetric aggregation of particles of different sizes, and by using different binding molecules for the target material, asymmetric complexes between the particles can be obtained, and the analysis is performed. It is possible to eliminate the aggregation effect and to secure a high specific signal so that various target substances can be detected efficiently.

Description

비대칭 입자를 이용한 표적 물질 검출 키트 및 방법{Kit and Method for Detecting Target Materials using Asymmetric Beads}Kit and Method for Detecting Target Materials using Asymmetric Beads}

본 발명은 크기가 상이한 입자의 비대칭 응집을 이용한 표적 물질 검출 키트 및 표적 물질의 검출 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a target material detection kit and a method for detecting target material using asymmetric aggregation of particles of different sizes.

시료 내 표적 물질을 검출하거나 분리하는 기술은 질병 진단, 식품 검사, 환경 모니터링 등 다양한 분야에서 활용되고 있다. 전통적인 검출 방법에는 면역분석법이 있으며, 그 검출 원리 및 방법에 따라 방사면역분석법, 효소면역측정법, 형광항체법, 화학발광면역측정법 등이 있다. 최근에는 금과 실리카 등 다양한 종류의 나노입자들을 항체나 효소 표면에 결합시켜 검출 감도를 높이려는 시도가 있었다.Techniques for detecting or isolating target substances in samples are used in a variety of fields, including disease diagnosis, food testing, and environmental monitoring. Conventional detection methods include immunoassays, and radioimmunoassays, enzyme immunoassays, fluorescent antibodies, chemiluminescent immunoassays according to the detection principle and method. Recently, there have been attempts to increase detection sensitivity by binding various types of nanoparticles such as gold and silica to the surface of antibodies or enzymes.

앱타머는 단일 사슬 DNA 또는 RNA 분자로서, 특정 화학 분자나 생물학적 분자에 높은 친화력과 선별력으로 결합하는 올리고머를 분리하여 수득한 것으로서 생체 분자 검출을 위하여 사용되어 왔다. 앱타머는 올리고뉴클레오타이드 기반이므로, 단백질 기반의 항체에 비하여 여러 장점이 있다. 즉, 생체 외에서 수득할 수 있고, 독소를 비롯한 다양한 유기물과 무기물을 표적 물질로 이용할 수 있으며, 특정 표적 물질에 특이적으로 결합하는 특정 앱타머가 확인되면 자동화된 올리고머 합성 방법을 이용하여 낮은 비용과 높은 일관성(batchconsistency)으로 재생산이 가능하다는 장점이 있다. 또한, 앱타머의 구조는 열에 의한 변성-회복(denaturation-renaturation) 과정이 가역적이므로 항체와 비교하여 긴 시간 동안 활성을 유지할 수 있다.Aptamers are single-stranded DNA or RNA molecules, which have been obtained by separating oligomers that bind to specific chemical or biological molecules with high affinity and selectivity, and have been used for biomolecule detection. Since aptamers are oligonucleotide based, they have several advantages over protein based antibodies. That is, it can be obtained in vitro, and various organic and inorganic materials including toxins can be used as target materials, and when specific aptamers that specifically bind to specific target materials are identified, low cost and high value can be obtained by using an automated oligomer synthesis method. The advantage is that reproduction is possible with batchconsistency. In addition, the structure of the aptamer can maintain activity for a long time compared to the antibody because the process of denaturation-renaturation by heat is reversible.

생체 시료로부터 특정의 표적 물질을 검출 또는 분리하는 방법으로서, 실리카, 유리섬유, 음이온교환수지 또는 자성 입자(beads)를 이용하는 방법이 알려져 있다. 이들 중에서 자성 입자를 이용하는 방법에 따르면, 표면에 표적 물질과 결합할 수 있는 프로브를 갖는 자성 입자를 시료 용액에 투입하여 표적 물질을 포획하고, 다시 자성 입자와 표적 물질을 분리함으로써 표적 물질을 분리 추출한다. 이렇게 자성 입자를 이용하여 표적 물질을 검출 또는 분리하는 방법(bead based separation)은 세포, 단백질, 핵산 등의 생체물질을 검출 또는 분리하는데 널리 이용되고 있다.As a method of detecting or separating a specific target substance from a biological sample, a method using silica, glass fiber, anion exchange resin or magnetic particles is known. According to the method of using magnetic particles among them, magnetic particles having a probe capable of binding to the target material on the surface thereof are introduced into the sample solution to capture the target material, and the magnetic material is separated from the target material to separate and extract the target material. do. The method of detecting or separating a target substance using magnetic particles is widely used for detecting or separating biological substances such as cells, proteins, nucleic acids, and the like.

1. BioChip J., Vol.8, 1 (2014), 1~7 BioChip J., Vol. 8, 1 (2014), 1 ~ 7

본 발명의 일 양상은 2 이상의 서로 다른 크기의 입자를 포함하며, 상기 입자는 각각 표적 물질의 서로 다른 인식 부위에 특이적으로 결합하는 결합 분자가 연결된 것인 표적 물질 검출 키트를 제공하는 것이다.One aspect of the invention is to provide a target material detection kit comprising two or more different sized particles, each of which is linked to a binding molecule that specifically binds to different recognition sites of the target material.

본 발명의 다른 양상은 상기 키트를 이용한 표적 물질 검출 방법을 제공하는 것이다.Another aspect of the present invention is to provide a method for detecting a target substance using the kit.

본 발명의 일 양상은 2 이상의 서로 다른 크기의 입자를 포함하며, 상기 입자는 각각 표적 물질의 서로 다른 인식 부위에 특이적으로 결합하는 결합 분자가 연결된 것인 표적 물질 검출 키트를 제공한다.One aspect of the present invention provides a target material detection kit comprising two or more different sized particles, each of which is linked to a binding molecule that specifically binds to different recognition sites of the target material.

본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 키트는 표적 물질의 제1 인식 부위에 특이적으로 결합하는 결합 분자가 연결된 제1 입자; 및 상기 표적 물질의 제2 인식 부위에 특이적으로 결합하는 결합 분자가 연결된 제2 입자를 포함하며, 상기 제1 입자 및 제2 입자는 서로 다른 크기를 갖는 것일 수 있다.According to one embodiment of the invention the kit comprises: a first particle to which a binding molecule that specifically binds to a first recognition site of the target material is connected; And a second particle connected to a binding molecule that specifically binds to a second recognition site of the target material, wherein the first particle and the second particle may have different sizes.

본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 입자는 금 입자, 은 입자, 실리카 입자 및 고분자 입자 등 입자의 재질에 상관없이 이용될 수 있으나, 폴리스티렌 입자인 것이 바람직하다. 또한, 두 입자의 재질이 동일한 것, 서로 상이한 것 모두 이용할 수 있으나, 두 입자 중 어느 하나는 자성 입자인 것이 바람직하다.According to one embodiment of the present invention, the particles may be used regardless of the material of the particles, such as gold particles, silver particles, silica particles and polymer particles, preferably polystyrene particles. In addition, although the material of the two particles may be the same or different from each other, any one of the two particles is preferably magnetic particles.

본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 입자는 서로 다른 크기를 갖는 것이 바람직하며, 어느 한 입자의 크기가 나노미터 규모인 경우 다른 입자는 그 이상의 나노미터, 또는 마이크로미터 크기일 수 있다. 또한, 어느 한 입자의 크기가 마이크로미터 규모인 경우 다른 입자는 그 이상의 마이크로미터 크기일 수 있으며, 입자 중 크기가 가장 작은 입자가 자성 입자인 것이 바람직하다.According to one embodiment of the present invention, the particles preferably have different sizes, and when the size of one particle is on the nanometer scale, the other particle may be larger than the nanometer or micrometer size. In addition, when the size of one particle is a micrometer scale, the other particles may be larger than the micrometer size, it is preferable that the smallest particle among the particles is a magnetic particle.

본 명세서에서 사용하는 용어, "결합 분자(binding molecules)"란 상기 입자의 표면에 화학 결합을 통해 연결되어 있으며, 표적 물질에 특이적으로 결합할 수 있어 상기 입자와 표적 물질의 특이적인 결합을 매개하는 분자를 의미한다.As used herein, the term "binding molecules" is linked to the surface of the particles through chemical bonding, and can specifically bind to the target material, thereby mediating specific binding of the particle and the target material. It means a molecule.

본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 결합 분자는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 분자이면 어떠한 것이든 가능하며, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 및 지질로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. 상기 결합 분자는 예를 들어, 효소, 항체, 리간드, 앱타머 또는 마이크로 RNA일 수 있다. 바람직하게는, 상기 결합 분자는 항체 또는 앱타머일 수 있다.According to an embodiment of the present invention, the binding molecule may be any molecule capable of specifically binding to a target material, and may be selected from the group consisting of polypeptides, polynucleotides, and lipids, but is not limited thereto. The binding molecule can be, for example, an enzyme, antibody, ligand, aptamer or micro RNA. Preferably, the binding molecule may be an antibody or aptamer.

또한, 상기 결합 분자와 입자를 연결시킬 때 입자의 크기에 따라 입자의 농도를 다르게 할 수 있으며, 입자의 크기가 작은 경우 큰 입자와 비교하여 농도를 증가시켜 결합 분자와 연결시킬 수 있다.In addition, when the binding molecule and the particle is connected, the concentration of the particle may be different depending on the size of the particle. When the particle size is small, the concentration may be increased compared to the larger particle to be connected to the binding molecule.

본 명세서에서 사용하는 용어, "특이적으로 결합(specifically binding)"은 당업자에게 통상적으로 공지되어 있는 의미와 동일한 것으로서, 항원 및 항체가 특이적으로 상호작용하여 면역학적 반응을 하는 것뿐만 아니라 효소, 앱타머, 리간드 등의 분자가 표적에 높은 친화성과 특이성을 가지면서 결합하는 것을 의미한다.As used herein, the term "specifically binding" has the same meaning as is commonly known to those skilled in the art, and the enzyme and the enzyme, This means that molecules such as aptamers and ligands bind to the target with high affinity and specificity.

본 발명의 다른 양상은 상기 키트 및 표적 물질을 포함하는 생물학적 시료를 접촉시키는 단계; 상기 표적 물질의 서로 다른 인식 부위에 특이적으로 결합하지 않은 입자를 제거하는 단계; 및 상기 표적 물질의 서로 다른 인식 부위에 특이적으로 결합한 입자를 정량하는 단계를 포함하는 표적 물질 검출 방법을 제공한다.Another aspect of the invention comprises the steps of contacting a biological sample comprising the kit and a target material; Removing particles that do not specifically bind to different recognition sites of the target material; And it provides a target material detection method comprising the step of quantifying the particles specifically bound to different recognition sites of the target material.

본 명세서에서 사용하는 용어, "생물학적 시료(biological sample)"란 표적 물질이 존재할 것으로 의심되는 대상으로서, 예를 들어 혈액, 혈장, 혈청, 분비물 등의 물질을 의미한다.As used herein, the term "biological sample" refers to a substance suspected of having a target substance, for example, a substance such as blood, plasma, serum, secretion, and the like.

본 명세서에서 사용하는 용어, "복합체(complex)"란 상기 입자에 연결된 결합 분자에 의해 하나의 표적 물질에 다수의 입자가 결합하여 형성된 이합체, 삼합체 등을 의미한다. 예를 들어, 상기 서로 다른 크기의 2종의 입자에 존재하는 결합 분자가 각각 상기 표적 물질의 서로 다른 인식 부위에 결합하면 비대칭의 이합체가 형성된다.As used herein, the term "complex" refers to a dimer, trimer, or the like formed by binding a plurality of particles to one target material by a binding molecule connected to the particles. For example, asymmetric dimers are formed when the binding molecules present in two particles of different sizes bind to different recognition sites of the target material.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 표적 물질의 서로 다른 인식 부위에 특이적으로 결합하지 않은 입자를 제거하는 단계 이후, 상기 표적 물질의 서로 다른 인식 부위에 특이적으로 결합한 입자를 선별하는 단계를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 입자 중 어느 하나가 자성 입자인 경우, 상기 선별 단계에서는 자기장을 이용할 수 있으며, 구체적으로 자기장을 가하면 자성 입자를 포함하는 비대칭의 이합체를 또한 포집할 수 있고, 상기 이합체를 정량하여 표적 물질을 검출할 수 있다.According to an embodiment of the present invention, after removing the particles that do not specifically bind to different recognition sites of the target material, selecting the particles that specifically bind to different recognition sites of the target material. It may further include. For example, when any one of the particles is a magnetic particle, a magnetic field may be used in the screening step. Specifically, when a magnetic field is applied, an asymmetric dimer including magnetic particles may also be collected, and the dimer may be quantified by Target material can be detected.

본 발명의 키트 및 방법을 이용하면 검출하고자 하는 표적 물질에 대하여 서로 다른 결합 분자를 사용하여 입자 간의 비대칭 복합체를 얻을 수 있으며, 이를 분석하여 불특정 응집 효과를 배제하고, 높은 특이적 신호를 확보할 수 있어 각종 표적 물질을 효율적으로 검출할 수 있다.Using the kits and methods of the present invention, it is possible to obtain asymmetric complexes between particles using different binding molecules for the target material to be detected, and to analyze them to exclude unspecific aggregation effects and to obtain high specific signals. Therefore, various target substances can be detected efficiently.

도 1은 H1N1 핵단백질을 첨가한 경우 포집된 입자들을 크기로 분류한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 2는 H1N1 핵단백질 첨가에 따른 자성 입자 및 폴리스티렌 입자 복합체의 포집 정도를 보여주는 그래프이다.
도 3은 H1N1 핵단백질의 농도에 따른 자성 입자 및 폴리스티렌 입자 복합체의 포집 정도를 보여주는 그래프이다.
도 4는 트로포닌의 첨가 유무에 따라 포집된 입자들을 크기로 분류한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 5는 트로포닌의 농도에 따른 자성 입자 및 폴리스티렌 입자 복합체의 포집 비율을 보여주는 그래프이다.
도 6은 이미지 프로세싱 코드에 이용한 원둘레/면적 비율의 계산 방법을 보여주는 도이다.
도 7은 이미지 프로세싱 코드를 이용하여 폴리스티렌 입자-H1N1 핵단백질-자성 입자 복합체와 폴리스티렌 단일 입자를 구분하여 보여주는 사진이다.
도 8은 H1N1 핵단백질 농도에 따른 폴리스티렌 입자-H1N1 핵단백질-자성 입자 복합체의 비율을 보여주는 그래프이다.
도 9는 이미지 프로세싱 코드를 이용하여 폴리스티렌 입자-페리틴-자성 입자 복합체와 폴리스티렌 단일 입자를 구분하여 보여주는 사진이다.
도 10은 페리틴 농도에 따른 폴리스티렌 입자-페리틴-자성 입자 복합체의 비율을 보여주는 그래프이다.1 is a graph showing the results of classifying the collected particles when the H1N1 nucleoprotein is added.
Figure 2 is a graph showing the degree of collection of magnetic particles and polystyrene particle complex with the addition of H1N1 nucleoprotein.
Figure 3 is a graph showing the degree of collection of magnetic particles and polystyrene particle complex according to the concentration of H1N1 nucleoprotein.
4 is a graph showing the results of classifying the collected particles according to the presence or absence of troponin added.
5 is a graph showing the collection ratio of the magnetic particles and the polystyrene particle complex according to the concentration of troponin.
6 is a diagram illustrating a method of calculating a circumference / area ratio used in an image processing code.
FIG. 7 is a photograph showing a polystyrene particle-H1N1 nucleoprotein-magnetic particle composite and a polystyrene single particle by using an image processing code. FIG.
8 is a graph showing the ratio of polystyrene particles-H1N1 nucleoprotein-magnetic particle complexes according to H1N1 nucleoprotein concentrations.
9 is a photograph showing the polystyrene particle-ferritin-magnetic particle composite and the polystyrene single particle by using an image processing code.
10 is a graph showing the ratio of polystyrene particle-ferritin-magnetic particle complexes according to ferritin concentration.

이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, one or more embodiments will be described in more detail with reference to Examples. However, these examples are provided to illustrate one or more embodiments illustratively and the scope of the present invention is not limited to these examples.

실시예Example 1: 마이크로 폴리스티렌 입자(beads) 사이의 응집 확인 1: Check for cohesion between micro polystyrene particles

54 kDa 크기의 인플루엔자 A H1N1 핵단백질(Influenza A H1N1 nucleoprotein; 이하 H1N1 핵단백질로 표기함)과 상기 H1N1 핵단백질에 대한 단일클론항체(monoclonal antibody) 및 다중클론항체(polyclonal antibody)는 한국생명공학연구원(대전, 대한민국)으로부터 제공 받았다.The 54 kDa influenza A H1N1 nucleoprotein (hereinafter referred to as H1N1 nucleoprotein) and monoclonal and polyclonal antibodies to the H1N1 nucleoprotein are Received from (Daejeon, Korea).

각각 2.8 ㎛, 4.3 ㎛ 크기의 카르복시산 폴리스티렌 입자(carboxylic acid polystyrene bead)는 Spherotech(미국)에서 구입하였고, 여기에 EDC-NHS{(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide)-(N-hydroxysuccinimide)}를 처리하여 입자의 활성화를 유도하였다. 이후 활성화시킨 각각의 입자와 H1N1 핵단백질 항체를 접촉시켜 항체와 입자의 공유결합을 유도하였으며, 크기가 다른 입자 사이에서 비대칭 응집이 일어날 수 있도록 각각의 입자에 서로 다른 항체를 결합시켰다. 이후 상기 입자에 검출 항원인 H1N1 핵단백질을 첨가하여 응집을 유도하고, 용액 상에서 입자의 응집 정도를 광학현미경으로 관찰하였다.Carboxylic acid polystyrene beads of 2.8 μm and 4.3 μm sizes, respectively, were purchased from Spherotech (USA), where EDC-NHS {(1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide)-(N -hydroxysuccinimide)} to induce the activation of the particles. Thereafter, each activated particle was brought into contact with the H1N1 nucleoprotein antibody to induce covalent bonding of the antibody and the particle, and different antibodies were bound to each particle so that asymmetric aggregation could occur between particles of different sizes. Thereafter, H1N1 nucleoprotein, a detection antigen, was added to the particles to induce aggregation, and the aggregation degree of the solution was observed under an optical microscope.

도 1은 검출 항원인 H1N1 핵단백질 첨가에 따른 입자들의 응집 정도를 보여주는 것으로, 일반적인 대칭 응집 현상과 다르게 비대칭 응집은 여러 가지 크기의 이합체 및 복합체가 형성되는 것을 확인할 수 있다.Figure 1 shows the degree of aggregation of the particles according to the addition of the detection antigen H1N1 nucleoprotein, unlike the general symmetric aggregation phenomenon it can be seen that asymmetric aggregation is formed of various sizes of dimers and complexes.

실시예Example 2: 마이크로 폴리스티렌 입자 및 나노 자성 입자의 응집 확인 2: Confirmation of agglomeration of micro polystyrene particles and nano magnetic particles

500 ㎚ 크기의 나노 자성 입자(magnetic beads) 100 fM 및 2.8 ㎛ 크기의 마이크로 폴리스티렌 입자(polystyrene beads) 10 fM을 준비하여 EDC-NHS로 활성화시켰다. 이후 상기 활성화시킨 폴리스티렌 입자와 다중클론항체 또는 활성화시킨 자성 입자와 단일클론항체를 접촉시켜 입자와 항체 사이에 공유결합이 형성되도록 하였다. 다음으로 상기 입자-항체 복합체와 H1N1 핵단백질(100 fM, 1 pM 및 10 pM)을 접촉시켜 응집을 유도하고, 충분한 시간이 흐른 뒤에 용액의 외부에 자기장을 가한 채로 용액을 세척하여 자성 입자를 포집하였다. 마이크로 폴리스티렌 입자-H1N1 핵단백질-나노 자성 입자 복합체의 경우 자성에 의하여 포집되기 때문에 포집된 입자들의 이미지를 광학현미경으로 캡쳐하여 이미지에서 보이는 마이크로 폴리스티렌 입자의 수를 조사하였다.100 fM of nano magnetic particles (500 nm size) and 10 fM of micro polystyrene particles (size 2.8 μm) were prepared and activated with EDC-NHS. Thereafter, the activated polystyrene particles and the polyclonal antibody or the activated magnetic particles and the monoclonal antibody were contacted to form a covalent bond between the particles and the antibody. Next, the particle-antibody complex and H1N1 nucleoprotein (100 fM, 1 pM and 10 pM) are brought into contact with each other to induce aggregation, and after sufficient time, the solution is washed with a magnetic field applied to the outside of the solution to collect magnetic particles. It was. In the case of the micro polystyrene particle-H1N1 nucleoprotein-nano magnetic particle composite, the number of the micro polystyrene particles shown in the image was investigated by capturing an image of the collected particles with an optical microscope.

도 2는 포집된 입자들을 입자 및 복합체의 크기로 분류한 결과를 보여주는 것으로, BSA를 첨가한 대조군의 경우 BSA 첨가 여부에 관계 없이 마이크로 폴리스티렌 입자가 거의 포획되지 않지만 H1N1 핵단백질을 첨가한 경우에는 마이크로 폴리스티렌 입자의 포획이 증가한 것을 확인하여 마이크로 폴리스티렌 입자-H1N1 핵단백질-나노 자성 입자 복합체, 즉 비대칭 복합체가 형성된 것을 알 수 있다.FIG. 2 shows the results of classifying the collected particles into the size of particles and complexes. In the control group with BSA, micro-polystyrene particles are hardly captured regardless of whether BSA is added, but when H1N1 nucleoprotein is added, The increase in the capture of the polystyrene particles can be seen that the micro-polystyrene particles-H1N1 nucleoprotein-nano magnetic particle complex, that is, the asymmetric complex was formed.

도 3은 H1N1 핵단백질의 농도에 따른 비대칭 복합체의 비율을 보여주는 것으로 단백질의 농도가 감소함에 따라 포집된 비대칭 복합체의 비율도 점진적으로 감소하는 것을 확인할 수 있다.Figure 3 shows the ratio of the asymmetric complex according to the concentration of the H1N1 nucleoprotein can be seen that the proportion of the asymmetric complex collected gradually decreases as the concentration of the protein decreases.

실시예Example 3: 마이크로 자성 입자 및 마이크로 폴리스티렌 입자의 응집 확인 3: Confirmation of aggregation of micro magnetic particles and micro polystyrene particles

2.8 ㎛ 크기의 마이크로 자성 입자 100 fM 및 4.3 ㎛ 크기의 마이크로 폴리스티렌 입자 10 fM을 준비하여 EDC-NHS로 활성화시켰다. 이후 상기 활성화 시킨 각각의 입자와 인식 부위가 서로 상이한 트로포닌(troponin) 앱타머를 혼합하여 입자와 앱타머의 공유결합을 유도하였다. 다음으로 상기 앱타머-입자 복합체와 트로포닌(200 pM)을 접촉시켜 응집을 유도하고, 충분한 시간이 흐른 뒤에 용액의 외부에 자기장을 가한 채로 용액을 세척하여 자성 입자를 포집하였다. 마이크로 폴리스티렌 입자-트로포닌-마이크로 자성 입자 복합체의 경우 자성에 의하여 포집되기 때문에 포집한 입자들의 이미지를 광학현미경으로 캡쳐하여 이미지에서 보이는 입자들을 확인하였다.100 fM of micro magnetic particles of 2.8 μm size and 10 fM of micro polystyrene particles of 4.3 μm size were prepared and activated by EDC-NHS. Thereafter, the activated particles and the recognition site were mixed with different troponin aptamers to induce covalent bonds between the particles and the aptamers. Next, the aptamer-particle complex and troponin (200 pM) were contacted to induce agglomeration, and after sufficient time, the solution was washed with a magnetic field applied to the outside of the solution to collect magnetic particles. In the case of the micro polystyrene particle-troponin-micro magnetic particle composite, the particles captured by the magnetic were captured by an optical microscope to identify the particles shown in the image.

도 4는 검출 항원인 트로포닌의 첨가 유무에 따라 포집된 입자들을 분류한 결과를 보여주는 것으로, 대조군과 비교하여 트로포닌을 첨가한 경우 비대칭 복합체의 수가 증가한 것을 확인할 수 있다. 도 4의 그래프에서 X축에 표시된 1은 4.3 ㎛ 크기를 의미한다.Figure 4 shows the results of classifying the collected particles according to the presence or absence of the addition of the detection antigen troponin, it can be seen that the number of asymmetric complexes increased when added to the troponin compared to the control. In the graph of FIG. 4, 1 indicated on the X axis means 4.3 μm.

실시예Example 4:  4: 트로포닌(troponin)을Troponin 이용한 비대칭 응집 확인 Asymmetric coagulation

상기 실시예 2 및 3에서 이용한 방법을 트로포닌을 이용하여 추가로 실험하였다. 구체적으로, 500 ㎚ 크기의 나노 자성 입자 1000 fM 및 4.3 ㎛ 크기의 마이크로 폴리스티렌 입자 10 fM을 준비하여 EDC-NHS로 활성화시켰다. 이후 상기 활성화 시킨 각각의 입자와 인식 부위가 서로 상이한 트로포닌 앱타머를 혼합하여 입자와 앱타머의 공유결합을 유도하였다. 다음으로 앱타머-입자 복합체와 트로포닌(10 pM 또는 200 pM)을 접촉시켜 응집을 유도하고, 충분한 시간이 흐른 뒤에 용액의 외부에 자기장을 가한 채로 용액을 세척하여 자성 입자를 포집하였다. 마이크로 폴리스티렌 입자-트로포닌-나노 자성 입자 복합체의 경우 자성에 의하여 포집되기 때문에 포집한 입자들의 이미지를 광학현미경으로 캡쳐하여 이미지에서 보이는 마이크로 입자의 비율을 조사하였다.The method used in Examples 2 and 3 was further tested using troponin. Specifically, 1000 fM of nano-magnetic particles having a size of 500 nm and 10 fM of micro polystyrene particles having a size of 4.3 μm were prepared and activated by EDC-NHS. Thereafter, the activated particles and the recognition site were mixed with different troponin aptamers to induce covalent bonds between the particles and the aptamers. Next, the aptamer-particle complex and troponin (10 pM or 200 pM) were contacted to induce aggregation, and after sufficient time, the solution was washed with a magnetic field applied to the outside of the solution to collect magnetic particles. In the case of the micro polystyrene particle-troponin-nano magnetic particle complex, the magnetic particles were captured by the magnetic material, and the captured particles were captured by an optical microscope to investigate the proportion of the micro particles in the image.

도 5는 트로포닌의 농도에 따른 자성 입자 및 폴리스티렌 입자 복합체의 포집 비율을 보여주는 것으로, 대조군과 비교하여 트로포닌을 첨가한 경우 남아있는 마이크로 폴리스티렌 입자의 비율이 증가하는 것을 알 수 있다.Figure 5 shows the collection ratio of the magnetic particles and polystyrene particle complex according to the concentration of troponin, it can be seen that the proportion of the remaining micro polystyrene particles when the troponin is added compared to the control.

실시예Example 5: 인플루엔자 A  5: Influenza A H1N1H1N1 핵단백질 농도에 따른 입자의 비대칭 응집 확인 Confirmation of Asymmetric Coagulation of Particles by Nuclear Protein Concentration

2.8 ㎛ 크기의 카르복시산 폴리스티렌 입자(carboxylic acid polystyrene bead; 4.18x109/㎖)는 Spherotech에서 구입하였고, 1.05 ㎛ 크기의 카르복시산 자성 입자(carboxylic acid magnetic bead; 1.19x1010/㎖)는 Dynabead(미국)에서 구입하였다.2.8 μm carboxylic acid polystyrene beads (4.18 × 10 9 / mL) were purchased from Spherotech, and 1.05 μm carboxylic acid magnetic beads (1.19 × 10 10 / mL) were purchased from Dynabead (USA). Purchased.

폴리스티렌 입자 0.5 ㎕(2.09x106개)를 취하여 0.05% 트윈(tween)을 포함하는 100 ㎕ DIW(deionized water)로 세척하고, 2,000 g에서 2분 동안 원심분리하여 입자를 포집하였다. 이 과정을 3회 반복하였으며, 세척이 끝난 후 DIW를 1X PBS로 교체하였다. 자성 입자는 1.5 ㎕(1.79x107개)를 취하여 같은 방법으로 세척하였으며, 원심분리 대신 자석을 이용하여 2분 동안 자성 입자를 포집하였다. 입자를 세척한 후 0.05% 트윈을 포함하는 DIW를 1X PBS로 교체하였다. 다음으로 각각의 입자에 EDC-NHS를 처리하여 활성화시키고, 폴리스티렌 입자와 다중클론항체 또는 자성 입자와 단일클론항체를 반응시켜 입자와 항체 사이에 공유결합이 형성되도록 하였다. 반응이 끝난 후 0.1%(w/v) BSA를 포함하는 1X PBS로 각각의 입자-항체 복합체를 3회 세척하고, 세척이 끝난 후 각각의 입자-항체 복합체의 부피를 320 ㎕로 조정하였다.0.5 μl (2.09 × 10 6 ) of polystyrene particles were taken, washed with 100 μl deionized water (DIW) containing 0.05% tween, and centrifuged at 2,000 g for 2 minutes to collect particles. This process was repeated three times, after which the DIW was replaced with 1X PBS. Magnetic particles were washed in the same manner by taking 1.5 μl (1.79 × 10 7 pieces), and magnetic particles were collected for 2 minutes using a magnet instead of centrifugation. After washing the particles, DIW containing 0.05% Tween was replaced with 1 × PBS. Next, each particle was treated with EDC-NHS and activated, and polystyrene particles and polyclonal antibodies or magnetic particles and monoclonal antibodies were reacted to form covalent bonds between the particles and the antibodies. After the reaction, each particle-antibody complex was washed three times with 1 × PBS containing 0.1% (w / v) BSA, and after the washing, the volume of each particle-antibody complex was adjusted to 320 μl.

상기 입자-항체 복합체에서 각각 50 ㎕(폴리스티렌 입자:자성 입자 비율=1:8.5)를 취하여 서로 혼합하고, 여기에 희석한 H1N1 핵단백질 50 ㎕를 첨가하여 실온에서 30분 동안 접촉시켰다. 사용한 H1N1 핵단백질의 농도는 0 g/㎖, 5.4 pg/㎖, 54 pg/㎖, 540 pg/㎖, 5.4 ng/㎖ 및 54 ng/㎖이다.In the particle-antibody complex, 50 μl each (polystyrene particle: magnetic particle ratio = 1: 8.5) was taken and mixed with each other, and 50 μl of diluted H1N1 nucleoprotein was added thereto and contacted at room temperature for 30 minutes. The concentrations of H1N1 nucleoprotein used are 0 g / ml, 5.4 pg / ml, 54 pg / ml, 540 pg / ml, 5.4 ng / ml and 54 ng / ml.

30분 후 광학 현미경 및 자체 개발한 MATLAB(matrix laboratory) 기반 이미지 프로세싱 코드를 이용하여 입자의 응집 여부를 확인하였다.After 30 minutes, agglomeration of the particles was confirmed using an optical microscope and a self-developed matrix laboratory (MATLAB) based image processing code.

상기 MATLAB 기반 이미징 프로세싱 코드는 입자의 원둘레(perimeter)/면적(area) 비율(P/A 비율)을 이용한 것으로, 입자 이미지에서 폴리스티렌 입자 크기 이상의 입자를 선택하여 각 입자의 P/A 비율을 계산하고, 계산된 P/A 비율이 평균보다 약 10% 이상 높은 입자는 비대칭 복합체로 판단하는 방법을 이용하였다.The MATLAB-based imaging processing code uses the perimeter / area ratio (P / A ratio) of the particles, and selects particles larger than the polystyrene particle size in the particle image to calculate the P / A ratio of each particle. In this case, the particles having a calculated P / A ratio of about 10% or more than the average were used as asymmetric composites.

상기 방법은 단일 입자(반지름=r)의 경우 입자 이미지에서 원둘레:면적의 비율이 2/r가 되지만 비대칭 복합체(반지름=R*)의 경우 완전한 원형이 아니기 때문에 원둘레:면적의 비율이 2/R*보다 큰 것을 응용한 것이다. 예를 들어, 각각 3.0 및 1.0 ㎛ 크기의 입자를 이용한다고 가정하면 입자의 응집 이후 원둘레:면적 비율이 1.265배 이상 증가하는 경우 비대칭 복합체로 인식하는 조건을 지정하여 비대칭 복합체를 선별할 수 있다. 또한, 비대칭 복합체의 경우 응집된 입자의 수에 따라 크기가 증가하므로 원둘레:면적의 비율을 적절히 지정하면 95% 이상의 정확도로 비대칭 복합체를 선별해 낼 수 있으며, 입자의 응집 비율도 계산할 수 있다.The method uses a 2 / r ratio of circumference: area in the particle image for a single particle (radius = r), but a ratio of circumference: area is 2 / R because asymmetric complexes (radius = R * ) are not perfectly circular. * Larger than the application. For example, assuming that 3.0 and 1.0 μm particles are used, asymmetric complexes can be selected by specifying conditions recognized as asymmetric complexes when the circumference: area ratio increases by 1.265 times or more after the aggregation of the particles. In addition, the size of the asymmetric composite increases with the number of aggregated particles, so if the ratio of circumference: area is properly specified, the asymmetric complex can be selected with an accuracy of 95% or more, and the aggregation ratio of the particles can be calculated.

도 6은 이미지 프로세싱 코드에 이용한 원둘레/면적 비율의 계산 방법을 보여주는 것이다.6 shows a method of calculating the circumference / area ratio used in the image processing code.

도 7은 광학 현미경으로 캡쳐한 입자 이미지 사진 및 상기 이미지 사진을 이미지 프로세싱 코드를 이용하여 분석한 결과를 보여주는 것으로, 파란원은 폴리스티렌 입자를 표시한 것이며, 노란원은 폴리스티렌 입자-자성 입자의 비대칭 복합체를 표시한 것이다.7 shows a particle image photograph captured by an optical microscope and the result of analyzing the image photograph using an image processing code, in which blue circles represent polystyrene particles and yellow circles are asymmetric complexes of polystyrene particle-magnetic particles. It is displayed.

도 8은 H1N1 핵단백질 농도에 따른 폴리스티렌 입자-H1N1 핵단백질-자성 입자 복합체의 비율을 이미지 프로세싱 코드로 확인한 결과를 보여주는 것으로, H1N1 핵단백질 농도가 증가함에 따라 폴리스티렌 입자-H1N1 핵단백질-자성 입자 복합체의 수도 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 그래프에 표시된 에러 바(error bar)는 표준편차(standard deviation)를 의미한다.8 shows the results of confirming the ratio of the polystyrene particles-H1N1 nucleoprotein-magnetic particle complex according to the H1N1 nucleoprotein concentration by the image processing code. The number of people was increasing. The error bar shown in the graph represents the standard deviation.

실시예 6: 페리틴(ferritin)의 농도에 따른 입자의 비대칭 응집 확인Example 6: Confirmation of Asymmetric Aggregation of Particles According to Ferritin Concentration

450 kDa 크기의 인간 페리틴 단백질 및 바이오티닐화된 페리틴 항체(bitotinylated anti-ferritin polyclonal antibody, 1 ㎎/㎖, IgG 항체)는 Abcam(영국)에서 구입하였고, 2.1 ㎛ 크기의 스트렙타아비딘 폴리스티렌 입자(streptavidin polystyrene bead; 9.92x108/㎖)와 1.05 ㎛ 크기의 스트렙타아비딘 자성 입자(streptavidin magnetic bead; 5.29x109/㎖)는 Spherotech에서 구입하였다.450 kDa human ferritin protein and biotinylated anti-ferritin polyclonal antibody (1 mg / ml, IgG antibody) were purchased from Abcam (UK) and streptavidin polystyrene particles of 2.1 μm size (streptavidin) polystyrene bead; 9.92x10 8 / ml) and streptavidin magnetic particles (5.29x10 9 / ml) of 1.05 µm size were purchased from Spherotech.

폴리스티렌 입자 4 ㎕(3.97x106개)를 취하여 0.05% 트윈을 포함하는 100 ㎕ DIW로 세척하고, 2,000 g에서 2분 동안 원심분리하여 입자를 포집하였다. 이 과정을 3회 반복하였으며, 세척이 끝난 후 DIW를 1X PBS로 교체하였다. 자성 입자는 6 ㎕(3.17x107개)를 취하여 같은 방법으로 세척하였으며, 원심분리 대신 자석을 이용하여 2분 동안 자성 입자를 포집하였다. 입자를 세척한 후 페리틴 항체 3 ㎕를 각각 폴리스티렌 입자 또는 자성 입자와 실온에서 30분 동안 반응시키고, 30분 후 각각의 입자-페리틴 항체 복합체를 0.1%(w/v) BSA를 포함하는 1X PBS로 3회 세척하였다. 세척이 끝난 후 각각의 입자-페리틴 항체 복합체의 부피를 320 ㎕로 조정하였다.4 μl (3.97 × 10 6 ) of polystyrene particles were taken, washed with 100 μl DIW containing 0.05% Tween and centrifuged at 2,000 g for 2 minutes to collect particles. This process was repeated three times, after which the DIW was replaced with 1X PBS. Magnetic particles were washed in the same manner by taking 6 μl (3.17 × 10 7 pieces), and magnetic particles were collected for 2 minutes using a magnet instead of centrifugation. After washing the particles, 3 μl of ferritin antibody was reacted with polystyrene particles or magnetic particles, respectively, at room temperature for 30 minutes, and after 30 minutes, each particle-ferritin antibody complex was treated with 1 × PBS containing 0.1% (w / v) BSA. Wash three times. After washing, the volume of each particle-ferritin antibody complex was adjusted to 320 μl.

상기 입자-페리틴 항체 복합체에서 각각 50 ㎕(폴리스티렌 입자:자성 입자 비율=1:7.98)를 취하여 서로 혼합하고, 여기에 희석한 페리틴 단백질 50 ㎕를 첨가하여 실온에서 30분 동안 반응시켰다. 사용한 페리틴 단백질의 농도는 0 g/㎖, 5.4 pg/㎖, 54 pg/㎖, 540 pg/㎖, 5.4 ng/㎖ 및 54 ng/㎖이다. 30분 후 광학 현미경 및 MATLAB 기반 이미지 프로세싱 코드를 이용하여 입자의 응집 여부를 확인하였다.Each 50 μl (polystyrene particle: magnetic particle ratio = 1: 7.98) was taken from the particle-ferritin antibody complex, mixed with each other, and 50 μl of the diluted ferritin protein was added thereto and reacted at room temperature for 30 minutes. The concentrations of ferritin protein used are 0 g / ml, 5.4 pg / ml, 54 pg / ml, 540 pg / ml, 5.4 ng / ml and 54 ng / ml. After 30 minutes, agglomeration of particles was confirmed using an optical microscope and MATLAB based image processing code.

도 9는 광학 현미경으로 캡쳐한 입자 이미지 사진 및 상기 이미지 사진을 이미지 프로세싱 코드를 이용하여 분석한 결과를 보여주는 것으로, 파란원은 폴리스티렌 입자를 표시한 것이며, 노란원은 폴리스티렌 입자-자성 입자의 비대칭 복합체를 표시한 것이다.9 shows a particle image photograph captured by an optical microscope and the result of analyzing the image photograph using an image processing code, in which a blue circle represents polystyrene particles and a yellow circle is an asymmetric complex of polystyrene particle-magnetic particles. It is displayed.

도 10은 페리틴 농도에 따른 폴리스티렌 입자-페리틴-자성 입자 복합체의 비율을 이미지 프로세싱 코드로 확인한 결과를 보여주는 것으로, 페리틴 농도에 비례하여 폴리스티렌 입자-페리틴-자성 입자 복합체, 즉 비대칭 복합체의 비율 또한 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 그래프에 표시된 에러 바는 표준편차를 의미한다.10 shows the result of confirming the ratio of the polystyrene particle-ferritin-magnetic particle complex according to the ferritin concentration by the image processing code. I could confirm that. Error bars in the graph represent standard deviations.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.So far I looked at the center of the preferred embodiment for the present invention. Those skilled in the art will appreciate that the present invention can be implemented in a modified form without departing from the essential features of the present invention. Therefore, the disclosed embodiments should be considered in descriptive sense only and not for purposes of limitation. The scope of the present invention is shown in the claims rather than the foregoing description, and all differences within the scope will be construed as being included in the present invention.

Claims (6)

삭제delete 삭제delete 삭제delete a) 서로 다른 크기를 갖는 두 종류의 입자를 포함하는 표적 물질 검출 키트와 표적 물질을 포함하는 생물학적 시료를 접촉시키는 단계;
b) 자기장을 가하여 상기 입자를 포집하는 단계;
c) 포집된 입자를 광학 현미경으로 촬영하여 이미지를 획득하는 단계;
d) 상기 이미지에서, 상기 두 종류의 입자 중 더 큰 단일 입자의 평균 원둘레(perimeter, P)/면적(area A) 비율 대비, 10% 이상 P/A 비율이 높은 입자를 비대칭 복합체로 선별하는 단계; 및
e) 상기 비대칭 복합체를 정량하는 단계를 포함하고,
상기 두 종류의 입자는 자성 입자 및 폴리스티렌 입자이고,
상기 자성 입자 및 상기 폴리스티렌 입자에는 각각 표적 물질의 서로 다른 인식 부위에 특이적으로 결합하는 결합 분자가 연결된 것인
표적 물질 검출 방법.
a) contacting a target material detection kit comprising two kinds of particles having different sizes with a biological sample comprising the target material;
b) collecting the particles by applying a magnetic field;
c) photographing the collected particles with an optical microscope to obtain an image;
d) screening the asymmetric composite with particles having a P / A ratio of at least 10% relative to the average perimeter (P) / area A ratio of the larger single particles of the two kinds of particles in the image. ; And
e) quantifying the asymmetric complex,
The two kinds of particles are magnetic particles and polystyrene particles,
The magnetic particles and the polystyrene particles are linked to a binding molecule that specifically binds to different recognition sites of the target material.
Target substance detection method.
삭제delete 제4항에 있어서, 상기 결합 분자는 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 및 지질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 표적 물질 검출 방법.The method of claim 4, wherein the binding molecule is selected from the group consisting of polypeptide, polynucleotide, and lipid.
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