JP2010091527A - Assay method using surface plasmon - Google Patents

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JP2010091527A
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assay
thin film
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enzyme
fluorescent dye
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JP2008264217A
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Takatoshi Kaya
高敏 彼谷
Hidetaka Ninomiya
英隆 二宮
Kenji Ishida
賢治 石田
Original Assignee
Konica Minolta Holdings Inc
コニカミノルタホールディングス株式会社
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an assay method, apparatus, and kit using surface plasmon. <P>SOLUTION: The assay method includes the steps of: (a) bringing particles with ligands fixed onto a surface thereof into contact with a specimen; (b) reacting a conjugation of enzyme and ligands identical with or different from the above ligands on the particles obtained in (a); (c) further reacting an enzyme fluorescent substrate on the particles obtained in (b) to generate a fluorochrome; (d) isolating the fluorochrome obtained in (c); (e) bringing the fluorochrome obtained in (d) into contact with a thin metal film surface of a plasmon excitation sensor having at least a transparent planar substrate and the thin metal film formed on one surface of the substrate; (f) irradiating the plasmon excitation sensor obtained in (e) with a laser beam via a prism from the other surface of the substrate having no thin metal film to measure a fluorescence amount emitted from the excited fluorochrome; and (g) calculating an amount of analyte in the specimen out of a measurement result obtained in (f). <P>COPYRIGHT: (C)2010,JPO&INPIT

Description

本発明は、表面プラズモンを利用したアッセイ法、該アッセイ用装置および該アッセイ用キットに関する。さらに詳しくは、本発明は、表面プラズモン励起増強蛍光分光法(SPFS;Surface Plasmon−field enhanced Fluorescence Spectroscopy)の原理に基づき、表面プラズモンを利用したアッセイ法、該アッセイ用装置および該アッセイ用キットに関する。   The present invention relates to an assay method using surface plasmon, the assay device, and the assay kit. More specifically, the present invention relates to an assay method utilizing surface plasmon, the assay device, and the assay kit based on the principle of surface plasmon-excited fluorescence spectroscopy (SPFS; Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy).

表面プラズモン励起増強蛍光分光法(SPFS)とは、照射したレーザ光が金薄膜表面で全反射減衰(ATR)する条件において、金属薄膜表面に粗密波(表面プラズモン)を発生させることによって、照射したレーザ光が有するフォトン量を数十倍〜数百倍に増やし(表面プラズモンの電場増強効果)、これにより金薄膜近傍の蛍光色素を効率良く励起させることによって、極微量および/または極低濃度のアナライトを検出することができる方法である。   With surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopy (SPFS), irradiation is performed by generating a dense wave (surface plasmon) on the surface of the metal thin film under the condition that the irradiated laser light is attenuated by total reflection (ATR) on the gold thin film surface. The amount of photons that the laser beam has is increased to several tens to several hundreds times (electric field enhancement effect of surface plasmon), and by this, the fluorescent dye in the vicinity of the gold thin film is efficiently excited, so that a trace amount and / or extremely low concentration can be obtained. It is a method that can detect an analyte.

このようなSPFSの原理に基づいたバイオセンサまたはバイオチップに関する例として、特許文献1には、金属基板表面にカルボキシメチルデキストランを用いたリガンド(1次抗体)固定化膜を配し、表面プラズモンにより増強された電場で、抗原に関係付けられた蛍光色素を検出する方法が示されている。   As an example of a biosensor or biochip based on the principle of SPFS, Patent Document 1 discloses that a ligand (primary antibody) immobilization film using carboxymethyldextran is arranged on the surface of a metal substrate, and surface plasmon is used. A method of detecting a fluorescent dye associated with an antigen with an enhanced electric field is shown.

しかしながら、極微量アナライト(標的抗原)の検出においては、アッセイで抗原に関係付けられるコンジュゲート中の蛍光色素量も極微量であり、このことが蛍光発生量のボトルネックとなるため、プラズモン電場増強を用いても蛍光シグナル量が上がらず、アッセイ感度の向上は難しい。   However, in the detection of trace analytes (target antigens), the amount of fluorescent dye in the conjugate associated with the antigen in the assay is also extremely small, which becomes a bottleneck in the amount of fluorescence generated, and therefore the plasmon electric field Even if enhancement is used, the amount of fluorescence signal does not increase, and it is difficult to improve assay sensitivity.

また、特許文献2では、センサ基板上でアポ酵素、ホロ酵素による反応と免疫反応とを複雑に組み合わせ、シグナル増幅および非特異反応低減を検討している。
しかしながら、このような測定系を成立させるためには、極めて精密な分子配向技術が前提となっていることから、免疫反応よりもアポ/ホロ酵素反応が優先的または支配的な場合、測定系そのものが成立しない危険性が高い。
特許第3294605号 特開2008−139245号公報
Patent Document 2 examines signal amplification and non-specific reaction reduction by complexly combining a reaction with an apoenzyme or holoenzyme and an immune reaction on a sensor substrate.
However, in order to establish such a measurement system, extremely precise molecular orientation technology is premised. Therefore, when the apo / holoenzyme reaction is preferential or dominant over the immune reaction, the measurement system itself There is a high risk that
Japanese Patent No. 3294605 JP 2008-139245 A

本発明は、免疫反応場と検出場とをそれぞれ独立させることによって、高感度かつ高精度であり、イムノアッセイに必要不可欠である特異性に優れた、表面プラズモンを利用したアッセイ法、該アッセイ用装置および該アッセイ用キットを提供することを目的とする。   The present invention relates to an assay method using a surface plasmon, which is highly sensitive and highly accurate by independence of an immune reaction field and a detection field, and has excellent specificity essential for an immunoassay, and the assay device And an assay kit.

本発明者らは、上記の問題を解決すべく鋭意研究した結果、酵素により標識された2次抗体を用いることによって、免疫反応場と検出場とを完全に分離することができ、さらに極微量の標的抗原であってもフォトン量に見合った蛍光発光と特異性とを両立できることを見出し、本発明を完成するに至った。   As a result of diligent research to solve the above-mentioned problems, the present inventors can completely separate the immune reaction field and the detection field by using a secondary antibody labeled with an enzyme. The present invention has been completed by discovering that both the fluorescence emission corresponding to the amount of photons and the specificity can be compatible even with the target antigen of.

すなわち、本発明のアッセイ法は、少なくとも下記工程(a)〜(g)からなることを
特徴とする。
工程(a):リガンドがその表面に固定化された粒子と、検体とを接触させる工程、
工程(b):該工程(a)を経て得られた粒子に、該リガンドとは同じであっても異なっていてもよいリガンドと酵素とのコンジュゲートを反応させる工程、
工程(c):該工程(b)を経て得られた粒子に、さらに酵素蛍光基質を反応させ、蛍光色素が生成される工程、
工程(d):該工程(c)を経て得られた蛍光色素を単離する工程、
工程(e):透明平面基板と、該基板の一方の表面に形成した金属薄膜とを少なくとも有するプラズモン励起センサの、該薄膜表面に、該工程(d)を経て得られた蛍光色素を接触させる工程、
工程(f):該工程(e)で得られたプラズモン励起センサに、該基板の、該薄膜を形成していないもう一方の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程、および
工程(g):該工程(f)で得られた測定結果から、検体中に含有されるアナライト量を算出する工程。
That is, the assay method of the present invention is characterized by comprising at least the following steps (a) to (g).
Step (a): a step of contacting a specimen with particles having a ligand immobilized on the surface thereof,
Step (b): reacting a particle obtained through the step (a) with a conjugate of a ligand and an enzyme, which may be the same as or different from the ligand,
Step (c): a step in which the particles obtained through the step (b) are further reacted with an enzyme fluorescent substrate to produce a fluorescent dye,
Step (d): a step of isolating the fluorescent dye obtained through the step (c),
Step (e): The fluorescent dye obtained through the step (d) is brought into contact with the thin film surface of a plasmon excitation sensor having at least a transparent flat substrate and a metal thin film formed on one surface of the substrate. Process,
Step (f): The plasmon excitation sensor obtained in step (e) was excited by being irradiated with laser light from the other surface of the substrate on which the thin film was not formed via a prism. A step of measuring the amount of fluorescence emitted from the fluorescent dye, and a step (g): a step of calculating the amount of analyte contained in the specimen from the measurement result obtained in the step (f).

上記工程(a)〜(d)の免疫反応場および、上記工程(e)〜(g)の検出場は、それぞれ独立していることが好ましい。
上記検体は、血液、血清、血漿、尿、鼻孔液および唾液からなる群から選択される少なくとも1種の体液であってもよい。
It is preferable that the immune reaction field in the steps (a) to (d) and the detection field in the steps (e) to (g) are independent from each other.
The specimen may be at least one body fluid selected from the group consisting of blood, serum, plasma, urine, nasal fluid and saliva.

上記酵素は、アルカリフォスファダーゼ(ALP)、ペルオキシダーゼ(POD)およびガラクトシダーゼ(GAL)からなる群から選択される少なくとも1種の酵素であってもよい。   The enzyme may be at least one enzyme selected from the group consisting of alkaline phosphatase (ALP), peroxidase (POD), and galactosidase (GAL).

上記金属薄膜は、金、銀、アルミニウム、銅および白金からなる群から選ばれる少なくとも1種の金属から形成されることが好ましい。
上記プラズモン励起センサは、さらにスペーサ層を有し、該スペーサ層は、上記金属薄膜の、上記透明平面基板とは接していないもう一方の表面に形成されることが好ましい。
The metal thin film is preferably formed of at least one metal selected from the group consisting of gold, silver, aluminum, copper and platinum.
The plasmon excitation sensor further includes a spacer layer, and the spacer layer is preferably formed on the other surface of the metal thin film that is not in contact with the transparent flat substrate.

本発明の装置は、上記工程(f)に用いられることを特徴とする。
また、本発明のキットは、本発明のアッセイ法に用いられることを特徴とする。
The apparatus of the present invention is used for the step (f).
The kit of the present invention is characterized by being used in the assay method of the present invention.

本発明は、粒子の除去、すなわち免疫反応場と検出場との完全分離が可能であることから、免疫反応条件および検出条件の最適化をすることができ、散乱ノイズの影響を受けづらく、さらに、3つの感度増幅機構、すなわち免疫反応最適化、化学的増幅および物理的増幅を有するため、極めて高感度・高精度のアッセイ法を提供することができる。   Since the present invention can remove particles, that is, completely separate the immune reaction field and the detection field, the immune reaction conditions and the detection conditions can be optimized, and is less susceptible to scattering noise. Since it has three sensitivity amplification mechanisms, that is, immune reaction optimization, chemical amplification and physical amplification, it is possible to provide an extremely sensitive and highly accurate assay method.

以下、本発明について具体的に説明する。
<アッセイ法>
本発明のアッセイ法は、少なくとも下記工程(a)〜(g)からなることを特徴とするものであって、さらに洗浄工程を含むことが好ましい。
Hereinafter, the present invention will be specifically described.
<Assay method>
The assay method of the present invention comprises at least the following steps (a) to (g), and preferably further comprises a washing step.

工程(a):リガンドがその表面に固定化された粒子と、検体とを接触させる工程、
工程(b):該工程(a)を経て得られた粒子に、該リガンドとは同じであっても異なっていてもよいリガンドと酵素とのコンジュゲートを反応させる工程、
工程(c):該工程(b)を経て得られた粒子に、さらに酵素蛍光基質を反応させ、蛍光色素が生成される工程、
工程(d):該工程(c)を経て得られた蛍光色素を単離する工程、
工程(e):透明平面基板と、該基板の一方の表面に形成した金属薄膜とを少なくとも有するプラズモン励起センサの、該薄膜表面に、該工程(d)を経て得られた蛍光色素を接触させる工程、
工程(f):該工程(e)で得られたプラズモン励起センサに、該基板の、該薄膜を形成していないもう一方の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程、および
工程(g):該工程(f)で得られた測定結果から、検体中に含有されるアナライト量を算出する工程。
Step (a): a step of contacting a specimen with particles having a ligand immobilized on the surface thereof,
Step (b): reacting a particle obtained through the step (a) with a conjugate of a ligand and an enzyme, which may be the same as or different from the ligand,
Step (c): a step in which the particles obtained through the step (b) are further reacted with an enzyme fluorescent substrate to produce a fluorescent dye,
Step (d): a step of isolating the fluorescent dye obtained through the step (c),
Step (e): The fluorescent dye obtained through the step (d) is brought into contact with the thin film surface of a plasmon excitation sensor having at least a transparent flat substrate and a metal thin film formed on one surface of the substrate. Process,
Step (f): The plasmon excitation sensor obtained in step (e) was excited by being irradiated with laser light from the other surface of the substrate on which the thin film was not formed via a prism. A step of measuring the amount of fluorescence emitted from the fluorescent dye, and a step (g): a step of calculating the amount of analyte contained in the specimen from the measurement result obtained in the step (f).

(工程(a))
工程(a)とは、リガンドがその表面に固定化された粒子と、検体とを接触させる工程である。
(Process (a))
The step (a) is a step of bringing the specimen having the ligand immobilized on the surface thereof into contact with the specimen.

「粒子」とは、本発明において、検体中に含有されるアナライトを検出するために使用される水不溶性の担体である。水不溶性の粒子を形成する材料は、水に不溶であればよい。なお、「水不溶性」とは、具体的に水、他のいかなる水溶液に溶解しない固相を意味する。粒子は、固定・分離などの用途に現在広く使用され、提案されている公知の支持体またはマトリックスのいずれであってもよい。   A “particle” is a water-insoluble carrier used in the present invention to detect an analyte contained in a specimen. The material that forms water-insoluble particles may be insoluble in water. The term “water-insoluble” specifically means a solid phase that does not dissolve in water or any other aqueous solution. The particles may be any known support or matrix that is currently widely used and proposed for applications such as fixation and separation.

水不溶性の粒子を形成する材料としては、無機化合物、金属、金属酸化物、有機化合物またはこれらを組み合わせた複合材料を含む。粒子の表面に固定化したリガンドが、検体中に含有されるアナライトを結合できるものであれば、粒子の材質・形状・サイズは特に限定されないが、好ましくは、リガンドの固定化量を多くする観点から、大きい表面積を与え得る材料である。   The material forming the water-insoluble particles includes an inorganic compound, a metal, a metal oxide, an organic compound, or a composite material combining these. If the ligand immobilized on the surface of the particle can bind the analyte contained in the specimen, the material, shape and size of the particle are not particularly limited, but preferably the amount of ligand immobilized is increased. From the viewpoint, it is a material that can provide a large surface area.

粒子として使用される材料は、特に限定されるものではないが、一般に、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアクリレート、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレン、ポリアミド、ラテックス等の合成有機高分子;ガラス、シリカ、二酸化珪素、窒化珪素、酸化ジルコニウム、酸化アルミニウム、酸化ナトリウム、酸化カルシウム、酸化マグネシウム、酸化亜鉛、酸化鉄、酸化クロム等の無機物;またはステンレス、ジルコニア等の金属などであってもよい。また、これらの材料は、一般に多孔質性の不規則な表面を有し、例えば、繊維、ウェブ、焼結体、多孔体などであってもよい。   The material used as particles is not particularly limited, but generally synthetic organic polymers such as polystyrene, polypropylene, polyacrylate, polymethyl methacrylate, polyethylene, polyamide, latex; glass, silica, silicon dioxide, nitriding It may be an inorganic substance such as silicon, zirconium oxide, aluminum oxide, sodium oxide, calcium oxide, magnesium oxide, zinc oxide, iron oxide or chromium oxide; or a metal such as stainless steel or zirconia. These materials generally have a porous irregular surface, and may be, for example, fibers, webs, sintered bodies, porous bodies, and the like.

粒子の形状としては、例えば、球体状、楕円体状、錐体状、立方体状、直方体状などが挙げられる。これらのうち球体状の粒子は、製造が容易であり、使用時に粒子の回転撹拌が容易であることからも好ましい。   Examples of the shape of the particles include a sphere shape, an ellipsoid shape, a cone shape, a cube shape, and a rectangular parallelepiped shape. Of these, spherical particles are preferable because they are easy to produce and easy to rotate and agitate the particles during use.

粒子のサイズ、すなわち平均粒子径としては、0.5〜10μmが好ましく、2〜6μ
mがより好ましい。平均粒子径が0.5μm未満であると、粒子が磁性粒子である場合、
充分な磁気応答性を発現せず、磁性粒子を分離するために相当に長い時間を要し、また分離するために極めて大きい磁力が必要となる。一方、平均粒子径が10μmを超えると、粒子が水溶液中で沈降しやすいものとなるため、検体を接触させる際に媒体を撹拌する操作が必要となる。また、粒子本体の表面積が小さくなるため、検体中に含有されるアナライトを捕捉することが困難となることがある。
The particle size, that is, the average particle diameter is preferably 0.5 to 10 μm, and 2 to 6 μm.
m is more preferable. When the average particle size is less than 0.5 μm, when the particles are magnetic particles,
Sufficient magnetic responsiveness is not exhibited, it takes a considerably long time to separate the magnetic particles, and a very large magnetic force is required to separate them. On the other hand, when the average particle diameter exceeds 10 μm, the particles are likely to settle in the aqueous solution, and thus an operation of stirring the medium is required when contacting the specimen. Further, since the surface area of the particle body is small, it may be difficult to capture the analyte contained in the specimen.

その表面も含めた粒子全体が同一の材料から構成されている態様の他に、必要に応じて複数の素材から構成されるハイブリット体から構成されていてもよい。例えば、分析の自動化に対応することができるために、コア部分は酸化鉄、酸化クロム等の磁気応答性材料で作製され、その表面を有機合成ポリマーで被覆された複合ビーズなどが挙げられる。   In addition to the aspect in which the entire particle including the surface is composed of the same material, it may be composed of a hybrid body composed of a plurality of materials as required. For example, in order to be able to cope with the automation of analysis, the core portion is made of a magnetically responsive material such as iron oxide or chromium oxide, and the surface thereof is coated with an organic synthetic polymer.

このような「粒子」として、下記リガンドの表面固定化密度を容易に調節でき、B/F分離さらには固液分離が容易な観点から、磁性粒子が好ましく、図2に記載の工程(d)のように、磁性粒子を磁石の磁力によって容易に(固液)分離・回収することができる点で、該磁性粒子は、常磁性体、強常磁性体または強磁性体などの磁性体を含有してなるものが好ましく、常磁性体および/または強常磁性体を含有してなるものがより好ましい。特に残留磁化がないかまたは少ない点で、強常磁性体を用いることが好ましい。   As such a “particle”, the surface immobilization density of the following ligand can be easily adjusted, and from the viewpoint of easy B / F separation and further solid-liquid separation, magnetic particles are preferable, and the step (d) shown in FIG. The magnetic particles contain a magnetic material such as a paramagnetic material, a strong paramagnetic material, or a ferromagnetic material in that the magnetic particles can be easily (solid-liquid) separated and recovered by the magnetic force of the magnet. What is formed is preferable, and what contains a paramagnetic substance and / or a strong paramagnetic substance is more preferable. In particular, it is preferable to use a strong paramagnetic substance in that there is no or little residual magnetization.

このような「磁性体」の具体例としては、四三酸化鉄(Fe34)、γ−重三二酸化鉄(γ−Fe23)、各種フェライト、鉄、マンガン、コバルト、クロム等の金属;コバルト・ニッケル・マンガン等の各種合金を挙げることができ、これらのうち、四三酸化鉄が特に好ましい。なお、コバルトおよびニッケルは、ヒスチジンタグと親和性を有する。 Specific examples of such a “magnetic material” include triiron tetroxide (Fe 3 O 4 ), γ-heavy sesquioxide (γ-Fe 2 O 3 ), various ferrites, iron, manganese, cobalt, chromium, and the like. And various alloys such as cobalt, nickel, and manganese, and among these, triiron tetroxide is particularly preferable. Cobalt and nickel have an affinity for the histidine tag.

粒子に用いられる「磁性体」は、小粒径の粒子よりなるビーズであって、優れた磁気分離性(すなわち、磁気によって短時間で分離する性能)を有し、かつ緩い上下震盪の操作によって再分散し得るものであることが好ましい。   The “magnetic material” used for the particles is a bead made of particles having a small particle diameter, has excellent magnetic separation (ie, ability to separate in a short time by magnetism), and is operated by a gentle up-and-down shaking operation. It is preferable that it can be redispersed.

磁性粒子における磁性体の含有割合は、非磁性体の有機物質などの含有割合が30重量%以上であることから、70重量%以下とされ、好ましくは20〜70重量%、より好ましくは30〜70重量%であることが望ましい。このような含有割合が20重量%未満であると、充分な磁気応答性が発現されず、所要の磁力によって短時間で粒子を分離することが困難となることがある。一方、この含有割合が70重量%を超えると、粒子本体表面に露出する磁性体の量が多くなるため、該磁性体の構成成分、例えば、鉄イオンなどの溶出が発生し、使用時に他の材料に悪影響を及ぼすことがあり、また、粒子本体が脆くなって実用的な強度が得られないことがある。   The content ratio of the magnetic substance in the magnetic particles is 70% by weight or less, preferably 20 to 70% by weight, more preferably 30 to 30% because the content ratio of the non-magnetic organic substance or the like is 30% by weight or more. 70% by weight is desirable. When such a content is less than 20% by weight, sufficient magnetic responsiveness is not exhibited, and it may be difficult to separate particles in a short time by a required magnetic force. On the other hand, when the content exceeds 70% by weight, the amount of the magnetic substance exposed on the surface of the particle main body increases, so that elution of constituent components of the magnetic substance, for example, iron ions occurs. The material may be adversely affected, and the particle body may become brittle and a practical strength may not be obtained.

このような磁性粒子として、市販品も用いることができ、例えば、Dynabeadsシリーズ(Dynal Biotech ASA社製)などが挙げられる。
「リガンド」とは、検体中に含有されるアナライトを特異的に認識し(または、認識され)結合し得る分子または分子断片であって、このような「分子」または「分子断片」としては、例えば、核酸(一本鎖であっても二本鎖であってもよいDNA、RNA、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、PNA(ペプチド核酸)等、またはヌクレオシド、ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子)、タンパク質(ポリペプチド、オリゴペプチド等)、アミノ酸(修飾アミノ酸も含む。)、糖質(オリゴ糖、多糖類、糖鎖等)、脂質、またはこれらの修飾分子、複合体などであれば、特に限定されない。
A commercial item can also be used as such a magnetic particle, for example, Dynabeads series (made by Dynal Biotech ASA) etc. are mentioned.
A “ligand” is a molecule or molecular fragment that can specifically recognize (or be recognized) and bind to an analyte contained in a specimen, and as such a “molecule” or “molecular fragment” For example, nucleic acids (DNA, RNA, polynucleotides, oligonucleotides, PNA (peptide nucleic acids), or nucleosides, nucleotides and their modified molecules, which may be single-stranded or double-stranded), proteins ( Polypeptides, oligopeptides, etc.), amino acids (including modified amino acids), carbohydrates (oligosaccharides, polysaccharides, sugar chains, etc.), lipids, or modified molecules and complexes thereof are not particularly limited.

「タンパク質」としては、例えば、抗体などが挙げられ、具体的には、抗αフェトプロテイン(AFP)モノクローナル抗体((株)日本医学臨床検査研究所などから入手可能)、抗ガン胎児性抗原(CEA)モノクローナル抗体、抗CA19−9モノクローナル抗体、抗PSAモノクローナル抗体などが挙げられる。   Examples of the “protein” include antibodies and the like, specifically, anti-α-fetoprotein (AFP) monoclonal antibody (available from Japan Medical Laboratory), anti-carcinoembryonic antigen (CEA) ) Monoclonal antibody, anti-CA19-9 monoclonal antibody, anti-PSA monoclonal antibody and the like.

なお、本発明において、「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、遺伝子組換えにより得られる抗体、および抗体断片を包含する。
粒子表面へのリガンドの固定化方法としては、粒子表面末端官能基に応じた最適な架橋方法を選択することができる。また、粒子表面の性状によっては、表面に直接物理的に吸着させる方法も有効な手段として挙げられる。
In the present invention, the term “antibody” includes polyclonal antibodies or monoclonal antibodies, antibodies obtained by gene recombination, and antibody fragments.
As a method for immobilizing a ligand on the particle surface, an optimum crosslinking method can be selected in accordance with the particle surface terminal functional group. In addition, depending on the properties of the particle surface, a method of directly adsorbing directly to the surface can also be mentioned as an effective means.

「検体」としては、例えば、血液、血清、血漿、尿、鼻孔液、唾液、便、体腔液(髄液、腹水、胸水等)などが挙げられ、所望する溶媒、緩衝液等によって適宜希釈して用いてもよい。これら検体のうち、血液、血清、血漿、尿、鼻孔液および唾液が好ましい。これ
らは1種単独でも、2種併用してもよい。
Examples of the “specimen” include blood, serum, plasma, urine, nasal fluid, saliva, stool, body cavity fluid (spinal fluid, ascites, pleural effusion, etc.) and the like, and appropriately diluted with a desired solvent, buffer solution, etc. May be used. Of these samples, blood, serum, plasma, urine, nasal fluid and saliva are preferred. These may be used alone or in combination of two.

上記検体中に含有される「アナライト」とは、上記粒子表面に固定化されたリガンドを特異的に認識され(または、認識し)結合し得る分子または分子断片であって、このような「分子」または「分子断片」としては、例えば、核酸(一本鎖であっても二本鎖であってもよいDNA、RNA、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、PNA(ペプチド核酸)等、またはヌクレオシド、ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子)、タンパク質(ポリペプチド、オリゴペプチド等)、アミノ酸(修飾アミノ酸も含む。)、糖質(オリゴ糖、多糖類、糖鎖等)、脂質、またはこれらの修飾分子、複合体などが挙げられ、具体的には、AFP(αフェトプロテイン)等のがん胎児性抗原や腫瘍マーカー、シグナル伝達物質、ホルモンなどであってもよく、特に限定されない。   The “analyte” contained in the specimen is a molecule or molecular fragment capable of specifically recognizing (or recognizing) and binding to a ligand immobilized on the particle surface. “Molecules” or “molecular fragments” include, for example, nucleic acids (DNA, RNA, polynucleotides, oligonucleotides, PNA (peptide nucleic acids), etc., which may be single-stranded or double-stranded, or nucleosides, nucleotides And modified molecules thereof), proteins (polypeptides, oligopeptides, etc.), amino acids (including modified amino acids), carbohydrates (oligosaccharides, polysaccharides, sugar chains, etc.), lipids, or modified molecules and complexes thereof. Specifically, it may be a carcinoembryonic antigen such as AFP (α-fetoprotein), a tumor marker, a signal transmitter, a hormone, etc. It is not particularly limited.

リガンドがその表面に固定化された粒子と、検体とを接触させる条件として、温度は、通常4〜50℃、好ましくは10〜40℃、時間としては、通常0.5〜180分間、好ましくは5〜60分間である。   As a condition for contacting the specimen with the ligand immobilized on the surface of the ligand, the temperature is usually 4 to 50 ° C., preferably 10 to 40 ° C., and the time is usually 0.5 to 180 minutes, preferably 5 to 60 minutes.

(洗浄工程)
洗浄工程とは、下記工程(b)の前および/または後に含まれることが好ましく、上記工程(a)で得られた粒子または下記工程(b)で得られた粒子の表面を洗浄する工程である。
(Washing process)
The washing step is preferably included before and / or after the following step (b), and is a step of washing the surface of the particles obtained in the above step (a) or the particles obtained in the following step (b). is there.

該工程に使用される洗浄液としては、Tween20、TritonX100などの界面活性剤を、工程(a)および(b)の反応で用いたものと同じ溶媒または緩衝液に溶解させ、好ましくは0.00001〜1重量%含有するものが望ましい。   As the washing solution used in the step, a surfactant such as Tween 20 or Triton X100 is dissolved in the same solvent or buffer used in the reaction of steps (a) and (b), preferably 0.00001 to Those containing 1% by weight are desirable.

洗浄液を循環させる温度および流速は、上記工程(a)の「送液を循環させる温度および流速」に等しいことが好ましい。
洗浄液を循環させる時間は、通常0.5〜180分間、好ましくは5〜60分間である。
The temperature and flow rate at which the cleaning liquid is circulated are preferably equal to the “temperature and flow rate at which the liquid feed is circulated” in step (a).
The time for circulating the cleaning liquid is usually 0.5 to 180 minutes, preferably 5 to 60 minutes.

(工程(b))
工程(b)とは、上記工程(a)、好ましくは上記洗浄工程を経て得られた粒子に、該工程(a)で用いたリガンドとは同じであっても異なっていてもよいリガンドと酵素とのコンジュゲートを反応させる工程である。
(Process (b))
Step (b) refers to a ligand and an enzyme that may be the same as or different from the ligand used in step (a) on the particles obtained through step (a), preferably the washing step. And a conjugate reaction.

工程(b)で用いるリガンドとは、検体中に含有されるアナライトを特異的に認識し結合し得る分子または分子断片であって、このような「分子」または「分子断片」としては、例えば、核酸(一本鎖であっても二本鎖であってもよいDNA、RNA、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、PNA(ペプチド核酸)等、またはヌクレオシド、ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子)、タンパク質(ポリペプチド、オリゴペプチド等)、アミノ酸(修飾アミノ酸も含む。)、糖質(オリゴ糖、多糖類、糖鎖等)、脂質、またはこれらの修飾分子、複合体などであれば、特に限定されず、また上記工程(a)で用いたリガンドと同じであっても異なっていてもよい。   The ligand used in step (b) is a molecule or molecular fragment capable of specifically recognizing and binding to the analyte contained in the specimen. Examples of such “molecule” or “molecular fragment” include, for example, , Nucleic acids (DNA that may be single-stranded or double-stranded, RNA, polynucleotides, oligonucleotides, PNA (peptide nucleic acids), etc., or nucleosides, nucleotides and modified molecules thereof), proteins (polypeptides , Oligopeptides, etc.), amino acids (including modified amino acids), carbohydrates (oligosaccharides, polysaccharides, sugar chains, etc.), lipids, or modified molecules or complexes thereof, etc. It may be the same as or different from the ligand used in the above step (a).

「タンパク質」としては、例えば、抗体などが挙げられ、抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体に関わらず特に限定されるものではない。ただし、粒子表面に固定化された「リガンド」(工程(a))が、モノクローナル抗体である場合、工程(b)で用いられる「リガンド」は、工程(a)で用いた「リガンド」が認識する部位以外を認識することが好ましい。   Examples of the “protein” include an antibody, and the antibody is not particularly limited regardless of whether it is a monoclonal antibody or a polyclonal antibody. However, when the “ligand” immobilized on the particle surface (step (a)) is a monoclonal antibody, the “ligand” used in step (a) is recognized by the “ligand” used in step (b). It is preferable to recognize parts other than the part to be performed.

「酵素」としては、例えば、アルカリフォスファダーゼ(ALP)、ペルオキシダーゼ(POD)、ガラクトシダーゼ(GAL)などが挙げられ、免疫反応、すなわちリガンドとアナライトとの反応に影響を及ぼしづらい分子サイズを有するという観点から、ALP、PODおよびGALであってもよいが、本発明は特にこれらの酵素に限定されない。なお、これらの酵素は1種単独で用いることもでき、また2種以上併用することもできる。   Examples of the “enzyme” include alkaline phosphatase (ALP), peroxidase (POD), galactosidase (GAL) and the like, and have a molecular size that hardly affects the immune reaction, that is, the reaction between the ligand and the analyte. In view of the above, ALP, POD and GAL may be used, but the present invention is not particularly limited to these enzymes. These enzymes can be used alone or in combination of two or more.

「リガンドと酵素とのコンジュゲート」とは、酵素により標識されたリガンドのことである。リガンドに酵素を標識する方法としては、ストレプトアビジン化された酵素をビオチン化されたリガンドと反応させる方法などが挙げられる。ストレプトアビジン化された酵素としては、市販品を用いてもよく、例えば、Phosphatase−labeled streptoavidin(KPL社製)などが挙げられる。   A “conjugate of a ligand and an enzyme” is a ligand labeled with an enzyme. Examples of the method for labeling an enzyme with a ligand include a method in which a streptavidinized enzyme is reacted with a biotinylated ligand. A commercially available product may be used as the streptavidinated enzyme, and examples thereof include phosphatase-labeled streptavidin (manufactured by KPL).

このように作製された「酵素により標識されたリガンド」の濃度は、0.001〜10,000μg/mLが好ましく、1〜1,000μg/mLがより好ましい。
反応条件として温度および時間は、それぞれ上記工程(a)の場合と同じであってもよい。
The concentration of the “ligand labeled with an enzyme” thus prepared is preferably 0.001 to 10,000 μg / mL, more preferably 1 to 1,000 μg / mL.
As reaction conditions, the temperature and time may be the same as those in the above step (a).

(工程(c))
工程(c)とは、上記工程(b)、好ましくは上記洗浄工程を経て得られた粒子に、さらに酵素蛍光基質を反応させ、蛍光色素が生成される工程である。
(Process (c))
The step (c) is a step in which a fluorescent dye is generated by further reacting an enzyme fluorescent substrate with the particles obtained through the step (b), preferably the washing step.

「酵素蛍光基質」とは、上記「酵素」によって加水分解されることにより、蛍光色素を生成することができる物質であって、例えば、表1に記載の1〜8などが挙げられる。
「蛍光色素」とは、本発明において、所定の励起光を照射する、または電界効果を利用して励起することによって蛍光を発光する物質の総称であり、該「蛍光」は、燐光など各種の発光も含む。
The “enzyme fluorescent substrate” is a substance that can generate a fluorescent dye by being hydrolyzed by the “enzyme”, and examples thereof include 1 to 8 listed in Table 1.
The “fluorescent dye” is a general term for substances that emit fluorescence by irradiating predetermined excitation light in the present invention, or excited by using an electric field effect. Including luminescence.

なお、表1中、PODは、ペルオキシダーゼ;βGluは、βグルコシダーゼ;GALは、ガラクトシダーゼ;ALPは、アルカリホスファターゼを表す。
これら酵素蛍光基質のうち、下記「プラズモン励起センサ」が含む金属薄膜が、金を含む金属から形成されている場合、金の透過率や励起波長の観点から、1,3−dicloro−9,9−dimethyl−acridine−2−one−7−yl phosphate(DDAO phosphate)(Molecular Probes社製)が好ましい。
In Table 1, POD represents peroxidase; βGlu represents β glucosidase; GAL represents galactosidase; ALP represents alkaline phosphatase.
Among these enzyme fluorescent substrates, when the metal thin film included in the “plasmon excitation sensor” described below is formed of a metal including gold, 1,3-dicroro-9,9 is used from the viewpoint of gold transmittance and excitation wavelength. -Dimethyl-acid-2-one-7-yl phosphate (DDAO phosphate) (manufactured by Molecular Probes) is preferred.

酵素蛍光基質の自家蛍光波長は、該自家蛍光波長と蛍光色素の蛍光波長との差が大きいほどバックグラウンドシグナルの影響を回避しやすく高精度な測定が可能となるが、特に制限されるものではない。   The autofluorescence wavelength of the enzyme fluorescent substrate is such that the greater the difference between the autofluorescence wavelength and the fluorescence wavelength of the fluorescent dye, the easier it is to avoid the influence of the background signal, and high-accuracy measurement is possible. Absent.

(工程(d))
工程(d)とは、上記工程(c)を経て得られた蛍光色素を単離する工程である。
蛍光色素を単離する方法としては、例えば、粒子が磁性粒子である場合は、磁力または遠心分離により、蛍光色素が含まれる溶液と粒子とを固液分離する方法が挙げられ、粒子が焼結体、多孔体または基板などの場合は、固液分離の方法を用いずに蛍光色素が含まれる溶液と粒子とを単離することができる。
(Process (d))
Step (d) is a step of isolating the fluorescent dye obtained through the step (c).
As a method of isolating the fluorescent dye, for example, when the particle is a magnetic particle, a method of solid-liquid separation of the solution containing the fluorescent dye and the particle by magnetic force or centrifugation may be used. In the case of a body, a porous body or a substrate, a solution and particles containing a fluorescent dye can be isolated without using a solid-liquid separation method.

(工程(e))
工程(e)とは、透明平面基板と、該基板の一方の表面に形成した金属薄膜とを少なくとも有するプラズモン励起センサの、該薄膜表面に、該工程(d)を経て得られた蛍光色素を接触させる工程である。
(Process (e))
In step (e), the fluorescent dye obtained through step (d) is applied to the surface of the plasmon excitation sensor having at least a transparent flat substrate and a metal thin film formed on one surface of the substrate. It is a process of making it contact.

「プラズモン励起センサ」とは、透明平面基板と、該基板の一方の表面に形成した金属薄膜とを有し、さらにスペーサ層を有することが好ましく、該スペーサ層は、該金属薄膜の、該透明平面基板とは接していないもう一方の表面に形成されることが望ましい。   The “plasmon excitation sensor” includes a transparent flat substrate and a metal thin film formed on one surface of the substrate, and preferably further includes a spacer layer, and the spacer layer is formed of the transparent metal thin film. It is desirable to form on the other surface not in contact with the flat substrate.

このようなプラズモン励起センサは、例えば、GEヘルスケア バイオサイエンス(株)製のBiacoreシステムに用いられるセンサーチップなどのように基板と金薄膜とを有するもの、さらに該金薄膜にスペーサ層を形成したものも包含する。   Such a plasmon excitation sensor has a substrate and a gold thin film, such as a sensor chip used in a Biacore system manufactured by GE Healthcare Biosciences, and a spacer layer is formed on the gold thin film. Also included.

「透明平面基板」としては、ガラス製であっても、ポリカーボネート(PC)、シクロオレフィンポリマー(COP)などのプラスチック製であってもよく、屈折率〔nd〕が好ましくは1.40〜2.20であり、厚さが好ましくは0.01〜10mm、より好ましくは0.5〜5mmであれば、大きさ(縦×横)は特に限定されない。   The “transparent flat substrate” may be made of glass or plastic such as polycarbonate (PC) or cycloolefin polymer (COP), and the refractive index [nd] is preferably 1.40-2. As long as it is 20 and the thickness is preferably 0.01 to 10 mm, more preferably 0.5 to 5 mm, the size (length × width) is not particularly limited.

なお、ガラス製の透明平面基板は、市販品として、SCHOTT AG社製のBK7(屈折率〔nd〕1.52)およびLaSFN9(屈折率〔nd〕1.85)、(株)住田光
学ガラス製のK−PSFn3(屈折率〔nd〕1.84)、K−LaSFn17(屈折率〔nd〕1.88)およびK−LaSFn22(屈折率〔nd〕1.90)、(株)オハラ製のS−LAL10(屈折率〔nd〕1.72)などが光学的特性と洗浄性との観点から好ましい。
The transparent glass substrate made of glass is commercially available from BK7 (refractive index [nd] 1.52) and LaSFN9 (refractive index [nd] 1.85) manufactured by SCHOTT AG, manufactured by Sumita Optical Glass Co., Ltd. K-PSFn3 (refractive index [nd] 1.84), K-LaSFn17 (refractive index [nd] 1.88) and K-LaSFn22 (refractive index [nd] 1.90), manufactured by OHARA INC. -LAL10 (refractive index [nd] 1.72) or the like is preferable from the viewpoint of optical characteristics and detergency.

透明平面基板は、その表面に金属薄膜を形成する前に、その表面を酸および/またはプラズマにより洗浄することが好ましい。
酸による洗浄処理としては、0.001〜1Nの塩酸中に、1〜3時間浸漬することが好ましい。
The transparent flat substrate is preferably cleaned with acid and / or plasma before forming a metal thin film on the surface.
As the cleaning treatment with an acid, it is preferable to immerse in 0.001 to 1N hydrochloric acid for 1 to 3 hours.

プラズマによる洗浄処理としては、例えば、プラズマドライクリーナー(ヤマト科学(株)製のPDC200)中に、0.1〜30分間浸漬させる方法が挙げられる。
「金属薄膜」は、上記「透明平面基板」の一方の表面に形成され、好ましくは、金、銀、アルミニウム、銅、および白金からなる群から選ばれる少なくとも1種の金属からなり、より好ましくは金からなることが望ましく、これら金属の合金であってもよい。このような金属種は、酸化に対して安定であり、かつ表面プラズモンによる電場増強が大きくなることから好適である。
Examples of the plasma cleaning treatment include a method of immersing in a plasma dry cleaner (PDC200 manufactured by Yamato Scientific Co., Ltd.) for 0.1 to 30 minutes.
The “metal thin film” is formed on one surface of the above “transparent flat substrate”, preferably made of at least one metal selected from the group consisting of gold, silver, aluminum, copper, and platinum, more preferably It is preferably made of gold and may be an alloy of these metals. Such metal species are preferable because they are stable against oxidation and increase in electric field due to surface plasmons increases.

なお、上記「透明平面基板」としてガラス製平面基板を用いる場合に限り、ガラスと上記金属薄膜とをより強固に接着することができることから、あらかじめクロム、ニッケルクロム合金またはチタンの薄膜を形成することが好ましい。   In addition, only when a glass flat substrate is used as the “transparent flat substrate”, the glass and the metal thin film can be bonded more firmly, so that a thin film of chromium, nickel chromium alloy or titanium is formed in advance. Is preferred.

透明平面基板上に金属薄膜を形成する方法としては、例えば、スパッタリング法、蒸着法(抵抗加熱蒸着法、電子線蒸着法等)、電解メッキ、無電解メッキ法などが挙げられる
。薄膜形成条件の調整が容易なことから、スパッタリング法または蒸着法によりクロムの薄膜および/または金属薄膜を形成することが好ましい。
Examples of the method for forming a metal thin film on a transparent flat substrate include sputtering, vapor deposition (resistance heating vapor deposition, electron beam vapor deposition, etc.), electrolytic plating, electroless plating, and the like. Since it is easy to adjust the thin film formation conditions, it is preferable to form a chromium thin film and / or a metal thin film by sputtering or vapor deposition.

金属薄膜の厚さとしては、金:5〜500nm、銀:5〜500nm、アルミニウム:5〜500nm、銅:5〜500nm、白金:5〜500nm、およびそれらの合金:5〜500nmが好ましく、クロムの薄膜の厚さとしては、1〜20nmが好ましい。   The thickness of the metal thin film is preferably gold: 5 to 500 nm, silver: 5 to 500 nm, aluminum: 5 to 500 nm, copper: 5 to 500 nm, platinum: 5 to 500 nm, and alloys thereof: 5 to 500 nm. The thickness of the thin film is preferably 1 to 20 nm.

電場増強効果の観点から、金:20〜70nm、銀:20〜70nm、アルミニウム:10〜50nm、銅:20〜70nm、白金:20〜70nm、およびそれらの合金:10〜70nmがより好ましく、クロムの薄膜の厚さとしては、1〜3nmがより好ましい。   From the viewpoint of the electric field enhancing effect, gold: 20-70 nm, silver: 20-70 nm, aluminum: 10-50 nm, copper: 20-70 nm, platinum: 20-70 nm, and alloys thereof: 10-70 nm are more preferable, and chromium The thickness of the thin film is more preferably 1 to 3 nm.

金属薄膜の厚さが上記範囲内であると、表面プラズモンが発生し易いので好適である。また、このような厚さを有する金属薄膜であれば、大きさ(縦×横)は特に限定されない。   When the thickness of the metal thin film is within the above range, surface plasmons are easily generated, which is preferable. Moreover, if it is a metal thin film which has such thickness, a magnitude | size (length x width) will not be specifically limited.

「スペーサ層」は、上記「金属薄膜」による蛍光色素の金属消光を防止することを目的として、該金属薄膜の、上記「透明平面基板」と接していないもう一方の表面に形成したものであって、例えば、SAM(Self Assembled Monolayer;自己組織化単分子膜)、誘電体からなるものなどであってもよい。   The “spacer layer” is formed on the other surface of the metal thin film not in contact with the “transparent flat substrate” for the purpose of preventing metal quenching of the fluorescent dye by the “metal thin film”. For example, a SAM (Self Assembled Monolayer) or a dielectric material may be used.

「SAM」が含む単分子としては、通常、炭素原子数4〜20程度のカルボキシアルカンチオール(例えば、(株)同仁化学研究所、シグマ アルドリッチ ジャパン(株)などから入手可能)、特に好ましくは10−カルボキシ−1−デカンチオールが用いられる。炭素原子数4〜20のカルボキシアルカンチオールは、それを用いて形成されたSAMの光学的な影響が少ない、すなわち透明性が高く、屈折率が低く、膜厚が薄いなどの性質を有していることから好適である。   As a single molecule contained in “SAM”, usually a carboxyalkanethiol having about 4 to 20 carbon atoms (for example, available from Dojindo Laboratories Co., Ltd., Sigma Aldrich Japan Co., Ltd.), particularly preferably 10 -Carboxy-1-decanethiol is used. Carboxyalkanethiol having 4 to 20 carbon atoms has properties such as little optical influence of SAM formed using it, that is, high transparency, low refractive index, and thin film thickness. Therefore, it is preferable.

SAMの形成方法としては、特に限定されず、従来公知の方法を用いることができる。具体例として、金属薄膜がその表面に形成されたガラス製平面基板を、10−カルボキシ−1−デカンチオール((株)同仁化学研究所製)を含むエタノール溶液に浸漬する方法などが挙げられる。このように、10−カルボキシ−1−デカンチオールが有するチオール基が、金属と結合し固定化され、金薄膜の表面上で自己組織化し、SAMを形成する。   The method for forming the SAM is not particularly limited, and a conventionally known method can be used. As a specific example, there is a method of immersing a glass flat substrate having a metal thin film formed on the surface thereof in an ethanol solution containing 10-carboxy-1-decanethiol (manufactured by Dojindo Laboratories). In this way, the thiol group of 10-carboxy-1-decanethiol binds to the metal and is immobilized, and self-assembles on the surface of the gold thin film to form a SAM.

「誘電体」としては、光学的に透明な、各種の無機物、または天然もしくは合成ポリマーを用いることもでき、化学的安定性、製造安定性および光学的透明性の観点から、二酸化ケイ素(SiO2)または二酸化チタン(TiO2)を含むことが好ましい。 As the “dielectric”, various inorganic substances that are optically transparent, or natural or synthetic polymers can be used. From the viewpoint of chemical stability, production stability, and optical transparency, silicon dioxide (SiO 2 ) Or titanium dioxide (TiO 2 ).

誘電体からなるスペーサ層の厚さは、通常10nm〜1mmであり、共鳴角安定性の観点からは、好ましくは30nm以下、より好ましくは10〜20nmである。一方、電場増強の観点から、好ましくは200nm〜1mmであり、さらに電場増強の効果の安定性から、400nm〜1,600nmがより好ましい。   The thickness of the spacer layer made of a dielectric is usually 10 nm to 1 mm, and preferably 30 nm or less, more preferably 10 to 20 nm from the viewpoint of resonance angle stability. On the other hand, it is preferably 200 nm to 1 mm from the viewpoint of electric field enhancement, and more preferably 400 nm to 1,600 nm from the stability of the effect of electric field enhancement.

誘電体からなるスペーサ層の形成方法としては、例えば、スパッタリング法、電子線蒸着法、熱蒸着法、ポリシラザン等の材料を用いた化学反応による形成方法、またはスピンコータによる塗布などが挙げられる。   Examples of the method for forming a spacer layer made of a dielectric include a sputtering method, an electron beam evaporation method, a thermal evaporation method, a formation method by a chemical reaction using a material such as polysilazane, or an application with a spin coater.

このような「プラズモン励起センサ」のスペーサ層側表面に、上記工程(d)を経て得られた蛍光色素を接触させる方法としては、該蛍光色素を含有した溶液の滴下、吹付、塗布などの方法が挙げられる。また、プラズモン励起センサ上に下記のような流路を構成し
、該蛍光色素を含有した溶液をプラズモン励起センサ表面に接触させるような方法も挙げられる。
As a method of bringing the fluorescent dye obtained through the step (d) into contact with the spacer layer side surface of such a “plasmon excitation sensor”, a method of dropping, spraying, or applying a solution containing the fluorescent dye Is mentioned. Further, there may be mentioned a method in which the following flow path is formed on the plasmon excitation sensor and a solution containing the fluorescent dye is brought into contact with the surface of the plasmon excitation sensor.

「流路」とは、微量な薬液の送達を効率的に行うことができ、反応促進を行うために送液速度を変化させたり、循環させたりすることができる直方体または管状のものであって、プラズモン励起センサを設置する個所近傍は直方体構造を有することが好ましく、薬液を送達する個所近傍は管状を有することが好ましい。   The “flow channel” is a rectangular parallelepiped or a tube that can efficiently deliver a small amount of a chemical solution and can change the liquid feeding speed or circulate in order to promote the reaction. The vicinity of the place where the plasmon excitation sensor is installed preferably has a rectangular parallelepiped structure, and the vicinity of the place where the drug solution is delivered preferably has a tubular shape.

その材料としては、プラズモン励起センサ部ではメチルメタクリレート、スチレン等を原料として含有するホモポリマーまたは共重合体、ポリエチレン、ポリオレフィン等からなり、薬液送達部ではシリコンゴム、テフロン(登録商標)、ポリエチレン、ポリプロピレン等のポリマーを用いる。   As the material, the plasmon excitation sensor part consists of a homopolymer or copolymer, polyethylene, polyolefin, etc. containing methyl methacrylate, styrene or the like as a raw material, and silicon rubber, Teflon (registered trademark), polyethylene, polypropylene, etc. Etc. are used.

プラズモン励起センサ部においては、検体との接触効率を高め、拡散距離を短くする観点から、プラズモン励起センサ部の流路の断面として、縦×横がそれぞれ独立に100nm〜1mm程度が好ましい。   In the plasmon excitation sensor unit, from the viewpoint of increasing the contact efficiency with the specimen and shortening the diffusion distance, it is preferable that the cross section of the channel of the plasmon excitation sensor unit is independently about 100 nm to 1 mm in length and width.

流路にプラズモン励起センサを固定する方法としては、小規模ロット(実験室レベル)では、まず、該プラズモン励起センサの金属薄膜が形成されている表面に、流路高さ0.5mmを有するポリジメチルシロキサン(PDMS)製シートを該プラズモン励起センサの金属薄膜が形成されている部位を囲むようにして圧着し、次に、該ポリジメチルシロキサン(PDMS)製シートと該プラズモン励起センサとをビス等の閉め具により固定する方法が好ましい。   As a method of fixing the plasmon excitation sensor to the flow path, in a small-scale lot (laboratory level), first, on the surface on which the metal thin film of the plasmon excitation sensor is formed, A dimethylsiloxane (PDMS) sheet is pressure-bonded so as to surround a portion where the metal thin film of the plasmon excitation sensor is formed, and then the polydimethylsiloxane (PDMS) sheet and the plasmon excitation sensor are closed with screws or the like. A method of fixing with a tool is preferred.

工業的に製造される大ロット(工場レベル)では、流路にプラズモン励起センサを固定する方法としては、プラスチックの一体成形品に金基板を形成、または別途作製した金基板を固定し、金表面に誘電体層、蛍光色素層およびリガンド固定化を行った後、流路の天板に相当するプラスチックの一体成形品により蓋をすることで製造できる。必要に応じてプリズムを流路に一体化することもできる。   In large lots (factory level) manufactured industrially, as a method of fixing the plasmon excitation sensor to the flow path, a gold substrate is formed on a plastic integrally molded product, or a separately manufactured gold substrate is fixed, and the gold surface is fixed. Further, after the dielectric layer, the fluorescent dye layer, and the ligand are immobilized, it can be manufactured by covering with a plastic integrally formed product corresponding to the top plate of the flow path. If necessary, the prism can be integrated into the flow path.

「送液」としては、検体を希釈した溶媒または緩衝液と同じものが好ましく、例えば、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、トリス緩衝生理食塩水(TBS)などが挙げられるが、特に限定されるものではない。   The “liquid feeding” is preferably the same as the solvent or buffer in which the specimen is diluted, and examples thereof include phosphate buffered saline (PBS) and Tris buffered saline (TBS), but are not particularly limited. It is not something.

送液を循環させる温度および時間としては、検体の種類などにより異なり、特に限定されるものではないが、通常20〜40℃×1〜60分間、好ましくは37℃×5〜15分間である。   The temperature and time for circulating the liquid supply vary depending on the type of specimen and are not particularly limited, but are usually 20 to 40 ° C. × 1 to 60 minutes, preferably 37 ° C. × 5 to 15 minutes.

送液中の検体中に含有されるアナライトの初期濃度は、100μg/mL〜0.001pg/mLであってもよい。
送液の総量、すなわち流路の容積としては、通常0.001〜20mL、好ましくは0.1〜1mLである。
The initial concentration of the analyte contained in the specimen being sent may be 100 μg / mL to 0.001 pg / mL.
The total amount of liquid feeding, that is, the volume of the flow path is usually 0.001 to 20 mL, preferably 0.1 to 1 mL.

送液の流速は、通常1〜2,000μL/min、好ましくは5〜500μL/min
である。
(工程(f))
工程(f)とは、上記工程(e)で得られたプラズモン励起センサに、該基板の、該薄膜を形成していないもう一方の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程である。
The flow rate of liquid feeding is usually 1 to 2,000 μL / min, preferably 5 to 500 μL / min.
It is.
(Process (f))
In step (f), the plasmon excitation sensor obtained in step (e) is irradiated with laser light from the other surface of the substrate on which the thin film is not formed via a prism. In this step, the amount of fluorescence emitted from the fluorescent dye is measured.

レーザ光は、光学フィルタおよび偏光フィルタを通して、プリズムに入射する直前のエネルギーおよびフォトン量を調節することが望ましい。
レーザ光の照射により、全反射減衰条件(ATR)において、金属薄膜の表面に表面プラズモンが発生する。表面プラズモンの電場増強効果により、照射したフォトン量の数十〜数百倍に増えたフォトンにより蛍光色素を励起する。なお、該電場増強効果によるフォトン増加量は、基板となるガラスの屈折率、金属薄膜の金属種および膜厚に依存するが、通常、金では約10〜20倍の増加量となる。
It is desirable to adjust the energy and photon amount immediately before the laser light enters the prism through an optical filter and a polarizing filter.
Irradiation with laser light generates surface plasmons on the surface of the metal thin film under the total reflection attenuation condition (ATR). Due to the electric field enhancement effect of the surface plasmon, the fluorescent dye is excited by photons increased to several tens to several hundred times the amount of photons irradiated. The amount of increase in photons due to the electric field enhancement effect depends on the refractive index of the glass serving as the substrate, the metal species and the film thickness of the metal thin film, but is usually about 10 to 20 times that of gold.

蛍光色素は光吸収により分子内の電子が励起され、短時間のうちに第一電子励起状態に移動し、この状態(準位)から基底状態に戻る際、そのエネルギー差に相当する波長の蛍光を発する。   In the fluorescent dye, the electrons in the molecule are excited by light absorption, move to the first electronic excited state in a short time, and when returning from this state (level) to the ground state, the fluorescent dye has a wavelength corresponding to the energy difference. To emit.

「レーザ光」としては、波長200〜900nm、0.001〜1,000mWのLDレーザ、または波長230〜800nm、0.01〜100mWの半導体レーザが好ましい。   As the “laser light”, an LD laser having a wavelength of 200 to 900 nm and 0.001 to 1,000 mW, or a semiconductor laser having a wavelength of 230 to 800 nm and 0.01 to 100 mW is preferable.

「プリズム」は、各種フィルタを介したレーザ光が、プラズモン励起センサに効率よく入射することを目的としており、屈折率が上記「透明平面基板」と同じであることが好ましい。本発明は、全反射条件を設定できる各種プリズムを適宜選択することができることから、角度、形状に特に制限はなく、例えば、60度分散プリズムなどであってもよい。このようなプリズムの市販品としては、上述した「ガラス製の透明平面基板」の市販品と同様のものが挙げられる。   The “prism” is intended to allow the laser light through various filters to efficiently enter the plasmon excitation sensor, and the refractive index is preferably the same as that of the “transparent flat substrate”. In the present invention, various prisms for which total reflection conditions can be set can be selected as appropriate, and therefore, there is no particular limitation on the angle and shape. For example, a 60-degree dispersion prism may be used. Examples of such commercially available prisms include those similar to the above-mentioned commercially available “glass-made transparent flat substrate”.

「光学フィルタ」としては、例えば、減光(ND)フィルタ、ダイアフラムレンズなどが挙げられる。
「減光(ND)フィルタ」は、入射レーザ光量を調節することを目的とするものである。特に、ダイナミックレンジの狭い検出器を使用するときには精度の高い測定を実施する上で用いることが好ましい。
Examples of the “optical filter” include a neutral density (ND) filter and a diaphragm lens.
The “darkening (ND) filter” is intended to adjust the amount of incident laser light. In particular, when a detector with a narrow dynamic range is used, it is preferable to use it for carrying out a highly accurate measurement.

「偏光フィルタ」は、レーザ光を、表面プラズモンを効率よく発生させるP偏光とするために用いられるものである。
「カットフィルタ」は、外光(装置外の照明光)、励起光(励起光の透過成分)、迷光(各所での励起光の散乱成分)、プラズモンの散乱光(励起光を起源とし、プラズモン励起センサ表面上の構造体または付着物などの影響で発生する散乱光)、酵素蛍光基質の自家蛍光、などの各種ノイズ光を除去するフィルタであって、例えば、干渉フィルタ、色フィルタなどが挙げられる。
The “polarizing filter” is used to make the laser light P-polarized light that efficiently generates surface plasmons.
“Cut filters” are external light (illumination light outside the device), excitation light (excitation light transmission component), stray light (excitation light scattering component in various places), plasmon scattering light (excitation light originated from plasmon A filter that removes various types of noise light such as scattered light generated by the influence of structures or deposits on the surface of the excitation sensor), autofluorescence of the enzyme fluorescent substrate, and examples thereof include interference filters and color filters. It is done.

「集光レンズ」は、検出器に蛍光シグナルを効率よく集光することを目的とするものであり、任意の集光系でよい。簡易な集光系として、顕微鏡などで使用されている、市販の対物レンズ((株)ニコン製またはオリンパス(株)製)を転用してもよい。対物レンズの倍率としては、10〜100倍が好ましい。   The “collecting lens” is intended to efficiently collect the fluorescent signal on the detector, and may be an arbitrary condensing system. As a simple condensing system, a commercially available objective lens (manufactured by Nikon Corporation or Olympus Corporation) used in a microscope or the like may be diverted. The magnification of the objective lens is preferably 10 to 100 times.

「SPFS検出部」としては、超高感度の観点からは光電子増倍管(浜松ホトニクス(株)製のフォトマルチプライヤー)が好ましい。また、これらに比べると感度は下がるが、画像として見ることができ、かつノイズ光の除去が容易なことから、多点計測が可能なCCDイメージセンサも好適である。   As the “SPFS detection unit”, a photomultiplier (a photomultiplier manufactured by Hamamatsu Photonics Co., Ltd.) is preferable from the viewpoint of ultrahigh sensitivity. Also, although the sensitivity is lower than these, a CCD image sensor capable of multipoint measurement is also suitable because it can be viewed as an image and noise light can be easily removed.

表2に、蛍光色素として、それぞれAlexa Fluor(登録商標)647(表2中、条件1〜3)およびHiLyte Fluor(登録商標)647(表2中、条件4〜6)を用いて、プラズモン励起センサによるSPFS蛍光シグナルを示す。   In Table 2, plasmon excitation using Alexa Fluor (registered trademark) 647 (in Table 2, conditions 1 to 3) and HiLyte Fluor (registered trademark) 647 (in Table 2, conditions 4 to 6) as fluorescent dyes, respectively. The SPFS fluorescence signal by a sensor is shown.

表2中、プラズモン励起センサに、それぞれ濃度調整した蛍光色素溶液を送液した条件におけるCCD観察時の蛍光シグナル値と、MilliQ水を送液した条件におけるCCD観察時の蛍光シグナル値との差を、各濃度に調整した蛍光色素のSPFSシグナルとする。   In Table 2, the difference between the fluorescence signal value at the time of CCD observation under the condition in which the concentration-adjusted fluorescent dye solution was fed to the plasmon excitation sensor and the fluorescence signal value at the time of CCD observation under the condition in which MilliQ water was fed. The SPFS signal of the fluorescent dye adjusted to each concentration is used.

表2から、蛍光色素が極微量な溶液においても高感度な測定が実施できていることがわかる。この結果は、酵素反応により酵素蛍光基質から生成した蛍光色素が、少なくとも表2程度に極微量存在する条件においても、測定が可能であることを示している。すなわち、酵素蛍光基質を用いた本願のアッセイ法において、免疫測定結果として、高感度な測定の実現が可能であることを示している。   From Table 2, it can be seen that highly sensitive measurement can be carried out even in a solution with a very small amount of fluorescent dye. This result indicates that the measurement is possible even under the condition that the fluorescent dye produced from the enzyme fluorescent substrate by the enzyme reaction is present at least in a trace amount as shown in Table 2. That is, in the assay method of the present application using an enzyme fluorescent substrate, it is shown that a highly sensitive measurement can be realized as an immunoassay result.

また、表3は、プラズモン励起センサが、「Signal」と「Noise」との比が大きく、蛍光色素量により変化する「Signal」の数値が「Noise」と比較して相対的に大きく、高感度な測定が可能となることを示している。   Table 3 also shows that the plasmon excitation sensor has a large ratio between “Signal” and “Noise”, and the value of “Signal” that changes depending on the amount of the fluorescent dye is relatively large compared to “Noise”. It is shown that it is possible to measure easily.

なお、プラズモン励起センサに対して、MilliQ水を送液した時に、CCDから観察したときのシグナル値を「Noise」(プラズモン散乱ノイズ)とし、10nM Alexa Fluor(登録商標)647水溶液を送液した時に、CCDから観察したときの蛍光シグナルの数値を「Signal」とする。   When MilliQ water was sent to the plasmon excitation sensor, the signal value when observed from the CCD was “Noise” (plasmon scattering noise), and a 10 nM Alexa Fluor (registered trademark) 647 aqueous solution was sent. The numerical value of the fluorescence signal when observed from the CCD is “Signal”.

表2中のプラズモン励起センサ1は、以下のように作製するものである。
屈折率〔nd〕1.72、厚さ1mmのガラス製の透明平面基板((株)オハラ製のS−LAL 10)をプラズマ洗浄し、該基板の片面にクロム薄膜をスパッタリング法により形成した後、その表面にさらに金薄膜をスパッタリング法により形成した。なお、クロム薄膜の厚さは1〜3nm、金薄膜の厚さは44〜52nmである。
The plasmon excitation sensor 1 in Table 2 is manufactured as follows.
A glass transparent flat substrate (S-LAL 10 manufactured by OHARA INC.) Having a refractive index [nd] of 1.72 and a thickness of 1 mm is plasma-cleaned, and a chromium thin film is formed on one surface of the substrate by sputtering. A gold thin film was further formed on the surface by sputtering. The chromium thin film has a thickness of 1 to 3 nm, and the gold thin film has a thickness of 44 to 52 nm.

プラズモン励起センサ2は、プラズモン励起センサ1の作製方法において、スパッタリングの代わりに抵抗加熱蒸着法を用いる以外はプラズモン励起センサ1と同様にして作製したものであって、プラズモン散乱をより増加させたものであり、プラズモン励起センサ
3は、プラズモン励起センサ2の表面に、平均粒径約100nmのポリスチレン微粒子(Polysciences Inc.社製)を分散させた塩濃度調整液を滴下し、数分間静置後、MilliQ水にて洗浄することで、センサ表面に該微粒子を表面に有したものである。
The plasmon excitation sensor 2 is manufactured in the same manner as the plasmon excitation sensor 1 except that the resistance heating vapor deposition method is used instead of sputtering in the method of manufacturing the plasmon excitation sensor 1, and the plasmon excitation sensor 1 further increases plasmon scattering. The plasmon excitation sensor 3 drops a salt concentration adjusting solution in which polystyrene fine particles (manufactured by Polysciences Inc.) having an average particle diameter of about 100 nm are dispersed on the surface of the plasmon excitation sensor 2, and is allowed to stand for several minutes. By washing with MilliQ water, the sensor surface has the fine particles on the surface.

表3から、SignalとNoiseの比(S/N比)は、Noiseの増加に伴い低下していることがわかる。すなわち、高感度な測定を実現するためには、プラズモン散乱ノイズができる限り小さなプラズモン励起センサが適していることが明らかである。   From Table 3, it can be seen that the ratio of Signal to Noise (S / N ratio) decreases with increasing Noise. That is, it is apparent that a plasmon excitation sensor with as small a plasmon scattering noise as possible is suitable for realizing a highly sensitive measurement.

また、プラズモン励起センサ3では金属箔膜状に固定化された粒子によってNoiseが大幅に上昇している。すなわち、プラズモン増強場を用いた蛍光測定においては、センサ表面に微粒子等が存在するとノイズが上昇してしまうことで、高感度な測定の実現が困難となることが明らかである。よって、プラズモン増強場を用いた蛍光測定において、免疫反応場と検出場の完全分離が高感度測定実現のための1つの解決策となる。   In the plasmon excitation sensor 3, Noise is significantly increased by particles fixed in a metal foil film shape. That is, in the fluorescence measurement using the plasmon enhancement field, it is apparent that it is difficult to realize high-sensitivity measurement because noise increases if fine particles or the like are present on the sensor surface. Therefore, in the fluorescence measurement using the plasmon enhancement field, complete separation of the immune reaction field and the detection field is one solution for realizing high-sensitivity measurement.

(工程(g))
工程(g)とは、上記工程(f)で得られた測定結果から、検体中に含有されるアナライト量を算出する工程である。
(Process (g))
The step (g) is a step of calculating the amount of analyte contained in the specimen from the measurement result obtained in the step (f).

より具体的には、既知濃度の標的抗原もしくは標的抗体での測定を実施することで検量線を作成し、作成された検量線に基づいて被測定検体中の標的抗原量もしくは標的抗体量を測定シグナルから算出する工程である。   More specifically, a calibration curve is created by performing measurement with a target antigen or target antibody at a known concentration, and the target antigen amount or target antibody amount in the sample to be measured is measured based on the created calibration curve. This is a step of calculating from the signal.

<装置>
本発明の装置は、上記工程(f)に用いられることを特徴とするものである。
すなわち、本発明の装置は、上記プラズモン励起センサを用いて、本発明のアッセイ法を実施するためのものである。
<Device>
The apparatus of the present invention is used in the step (f).
That is, the apparatus of the present invention is for carrying out the assay method of the present invention using the plasmon excitation sensor.

「装置」としては、少なくとも光源、各種光学フィルタ、プリズム、カットフィルタ、集光レンズおよびSPFS検出部を含むものとする。なお、検体液、洗浄液または標識抗体液などを取り扱う際に、プラズモン励起センサと組み合った送液系を有することが好ましい。送液系としては、送例えば、液ポンプと連結したマイクロ流路デバイスなどでもよい。   The “apparatus” includes at least a light source, various optical filters, a prism, a cut filter, a condenser lens, and an SPFS detection unit. It is preferable to have a liquid feeding system combined with a plasmon excitation sensor when handling a sample liquid, a washing liquid, a labeled antibody liquid, or the like. As the liquid feeding system, for example, a microchannel device connected to a liquid pump may be used.

また、表面プラズモン共鳴(SPR)検出部、すなわちSPR専用の受光センサとしてのフォトダイオード、SPRおよびSPFSの最適角度を調製するための角度可変部(サーボモータで全反射減衰(ATR)条件を求めるためにフォトダイオードと光源とを同期して、45〜85°の角度変更を可能とする。分解能は0.01°以上が好ましい。)、
SPFS検出部に入力された情報を処理するためのコンピュータなども含んでもよい。
In addition, a surface plasmon resonance (SPR) detection unit, that is, a photodiode as a light receiving sensor dedicated to SPR, an angle variable unit for adjusting the optimum angle of SPR and SPFS (to determine total reflection attenuation (ATR) conditions with a servomotor) The angle of 45 to 85 ° can be changed by synchronizing the photodiode and the light source with a resolution of 0.01 ° or more).
A computer for processing information input to the SPFS detection unit may also be included.

光源、光学フィルタ、カットフィルタ、集光レンズおよびSPFS検出部の好ましい態様は上述したものと同様である。
「送液ポンプ」としては、例えば、送液が微量な場合に好適なマイクロポンプ、送り精度が高く脈動が少なく好ましいが循環することができないシリンジポンプ、簡易で取り扱い性に優れるが微量送液が困難な場合があるチューブポンプなどが挙げられる。
Preferred embodiments of the light source, the optical filter, the cut filter, the condensing lens, and the SPFS detection unit are the same as those described above.
As the “liquid feed pump”, for example, a micro pump suitable for a small amount of liquid feed, a syringe pump with high feed accuracy and low pulsation, which is preferable but cannot be circulated, a simple and excellent handleability but a small amount of liquid feed For example, a tube pump may be difficult.

<キット>
本発明のキットは、本発明のアッセイ法に用いられることを特徴とするものであって、本発明のアッセイ法を実施するにあたり、1次抗体、抗原などのリガンド、検体および2次抗体以外に必要とされるすべてのものを含むことが好ましい。
<Kit>
The kit of the present invention is characterized by being used in the assay method of the present invention. In performing the assay method of the present invention, a primary antibody, a ligand such as an antigen, a specimen, and a secondary antibody are used. It is preferable to include everything needed.

例えば、本発明のキットと、検体として血液または血清と、特定の腫瘍マーカーに対する抗体とを用いることによって、特定の腫瘍マーカーの含有量を、高感度かつ高精度で検出することができる。この結果から、触診などによって検出することができない前臨床期の非浸潤癌(上皮内癌)の存在も高精度で予測することができる。   For example, by using the kit of the present invention, blood or serum as a specimen, and an antibody against a specific tumor marker, the content of the specific tumor marker can be detected with high sensitivity and high accuracy. From this result, the presence of a preclinical noninvasive cancer (carcinoma in situ) that cannot be detected by palpation or the like can be predicted with high accuracy.

このような「キット」としては、具体的に、透明平面基板の一方の表面に金属薄膜を形成したプラズモン励起センサ;検体を溶解または希釈するための溶解液または希釈液;プラズモン励起センサと検体とを反応させるための各種反応試薬および洗浄試薬が挙げられ、本発明のアッセイ法を実施するために必要とされる各種器材または資材や上記「装置」を含めることもできる。   Specifically, such a “kit” includes a plasmon excitation sensor in which a metal thin film is formed on one surface of a transparent flat substrate; a solution or dilution liquid for dissolving or diluting the specimen; a plasmon excitation sensor and a specimen; These include various reaction reagents and washing reagents for reacting, and can also include various equipment or materials required for carrying out the assay method of the present invention and the above-mentioned “device”.

さらに、キット要素として、検量線作成用の標準物質、説明書、多数検体の同時処理ができるマイクロタイタープレートなどの必要な器材一式などを含んでもよい。   Further, the kit element may include a standard material for preparing a calibration curve, instructions, a necessary set of equipment such as a microtiter plate capable of simultaneously processing a large number of samples, and the like.

次に、本発明について実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
[作製例1](プラズモン励起センサの作製)
屈折率〔nd〕1.72、厚さ1mmのガラス製の透明平面基板((株)オハラ製のS−LAL 10)をプラズマ洗浄し、該基板の片面にクロム薄膜をスパッタリング法により形成した後、その表面にさらに金薄膜をスパッタリング法により形成した。クロム薄膜の厚さは1〜3nm、金薄膜の厚さは44〜52nmであった。
Next, although an Example is shown and this invention is demonstrated further in detail, this invention is not limited by these.
[Production Example 1] (Production of plasmon excitation sensor)
A glass transparent flat substrate (S-LAL 10 manufactured by OHARA INC.) Having a refractive index [nd] of 1.72 and a thickness of 1 mm is plasma-cleaned, and a chromium thin film is formed on one surface of the substrate by sputtering. A gold thin film was further formed on the surface by sputtering. The chromium thin film had a thickness of 1 to 3 nm, and the gold thin film had a thickness of 44 to 52 nm.

このようにして得られた基板を、10−カルボキシ−1−デカンチオールを1mM含むエタノール溶液に24時間以上浸漬し、金薄膜の片面にSAM(Self Assembled Monolayer;自己組織化単分子膜)を形成した。基板を該溶液から取り出し、エタノールおよびイソプロパノールで洗浄した後、エアガンで乾燥させた。   The substrate thus obtained is immersed in an ethanol solution containing 1 mM of 10-carboxy-1-decanethiol for 24 hours or more to form a SAM (Self Assembled Monolayer) on one surface of a gold thin film. did. The substrate was removed from the solution, washed with ethanol and isopropanol, and then dried with an air gun.

SAMの表面に、流路高さ0.5mmを有するポリジメチルシロキサン(PDMS)製シートを設け、SAM表面が流路の内側となるように基板を配置し(ただし、該シリコンゴムスペーサは送液に触れない状態とする。)、流路の外側から圧着し、ビスで流路シートと該プラズモン励起センサとを固定した。   A polydimethylsiloxane (PDMS) sheet having a flow path height of 0.5 mm is provided on the surface of the SAM, and the substrate is arranged so that the SAM surface is inside the flow path (however, the silicon rubber spacer is used for liquid feeding). The pressure-sensitive adhesive sheet was pressed from the outside of the flow path, and the flow path sheet and the plasmon excitation sensor were fixed with screws.

[作製例2](アルカリフォスファダーゼ標識2次抗体の作製)
2次抗体として抗αフェトプロテイン(AFP)モノクローナル抗体((株)日本医学臨床検査研究所などから入手可能)を、ビオチン化キット((株)同仁化学研究所製)を用いてビオチン化した。手順は、該キットに添付のプロトコールに従った。
[Preparation Example 2] (Preparation of secondary antibody labeled with alkaline phosphatase)
An anti-α-fetoprotein (AFP) monoclonal antibody (available from Nippon Medical Laboratory, Inc.) as a secondary antibody was biotinylated using a biotinylation kit (manufactured by Dojindo Laboratories). The procedure followed the protocol attached to the kit.

次に、得られたビオチン化抗AFPモノクローナル抗体の溶液とストレプトアビジン標識アルカリフォスファダーゼ(ALP)(Phosphatase−labeled streptoavidin(KPL社製))溶液とを混合し、4℃で60分間、攪拌混合することで反応させた。   Next, the obtained biotinylated anti-AFP monoclonal antibody solution and a streptavidin-labeled alkaline phosphatase (ALP) solution (Phosphatase-labeled streptavidin (KPL)) solution are mixed and stirred at 4 ° C. for 60 minutes. It was made to react by doing.

最後に、未反応抗体および未反応酵素を、分子量カットフィルタ(日本ミリポア(株)製)を用いて精製することで、アルカリフォスファダーゼ標識抗AFPモノクローナル抗体溶液を得た。得られた抗体溶液はタンパク定量後、4℃で保存した。   Finally, the unreacted antibody and the unreacted enzyme were purified using a molecular weight cut filter (manufactured by Nippon Millipore) to obtain an alkaline phosphatase-labeled anti-AFP monoclonal antibody solution. The obtained antibody solution was stored at 4 ° C. after protein quantification.

[作製例3](Alexa Fluor(登録商標)647標識2次抗体の作製)
作製例2で得られたビオチン化抗AFPモノクローナル抗体の溶液とストレプトアビジン標識Alexa Fluor(登録商標)647(Molecular Probes社製)溶液とを混合し、4℃で60分間、攪拌混合することで反応させた。
[Preparation Example 3] (Preparation of Alexa Fluor (registered trademark) 647-labeled secondary antibody)
The biotinylated anti-AFP monoclonal antibody solution obtained in Preparation Example 2 and the streptavidin-labeled Alexa Fluor (registered trademark) 647 (Molecular Probes) solution are mixed and reacted by stirring at 4 ° C. for 60 minutes. I let you.

次に、未反応抗体および未反応酵素を、分子量カットフィルタ(日本ミリポア(株)製)を用いて精製することで、Alexa Fluor(登録商標)647標識抗AFPモノクローナル抗体溶液を得た。得られた抗体溶液はタンパク定量後、4℃で保存した。   Next, the unreacted antibody and the unreacted enzyme were purified using a molecular weight cut filter (manufactured by Nippon Millipore) to obtain an Alexa Fluor (registered trademark) 647-labeled anti-AFP monoclonal antibody solution. The obtained antibody solution was stored at 4 ° C. after protein quantification.

[実施例1]
工程(a)として、まず抗αフェトプロテイン(AFP)モノクローナル抗体((株)日本医学臨床検査研究所から入手)を1次抗体として用いて、磁性粒子であるDynabeads(Dynal Biotech ASA社製)に固定化した。その固定化方法は、Dynabeadsに添付のプロトコールに準じた。
[Example 1]
As step (a), first, anti-α-fetoprotein (AFP) monoclonal antibody (obtained from Nippon Medical Laboratory) is immobilized on Dynabeads (manufactured by Dynal Biotech ASA) as magnetic particles. Turned into. The immobilization method was in accordance with the protocol attached to Dynabeads.

抗AFPモノクローナル抗体がその表面に固定化された磁性粒子(0.015重量%のTBS溶液に調製)100μLに、標的抗原としてAFP(1ng/mLのTBS溶液に調製)を含有する検体を接触させ、10分間反応させた。   A specimen containing AFP (prepared in a 1 ng / mL TBS solution) as a target antigen is brought into contact with 100 μL of magnetic particles (prepared in a 0.015 wt% TBS solution) on which the anti-AFP monoclonal antibody is immobilized. The reaction was allowed for 10 minutes.

洗浄工程として、上記工程(a)を経て得られた粒子を磁石により集めることで固液分離し、該工程(a)を経た反応溶液の液体のみを廃棄した。残存した該粒子に対して、Tween20を0.05重量%含むTBS300μLを分注し、1分間攪拌した後に該粒
子を磁石により集めた。このような洗浄工程を3回繰り返した。
As the washing step, the particles obtained through the step (a) were collected with a magnet for solid-liquid separation, and only the liquid of the reaction solution after the step (a) was discarded. To the remaining particles, 300 μL of TBS containing 0.05% by weight of Tween 20 was dispensed, stirred for 1 minute, and collected by a magnet. Such a washing process was repeated three times.

工程(b)として、上記洗浄工程を経て得られた粒子に、作製例2で得られた、アルカリフォスファダーゼ標識抗AFPモノクローナル抗体(1,000ng/mLに調製した
TBS溶液)を200μL添加し、10分間反応させた。
In step (b), 200 μL of the alkaline phosphatase-labeled anti-AFP monoclonal antibody (TBS solution prepared at 1,000 ng / mL) obtained in Preparation Example 2 was added to the particles obtained through the washing step. The reaction was allowed for 10 minutes.

洗浄工程として、上記工程(b)を経て得られた粒子を磁石により集めることで固液分離し、該工程(b)を経た反応溶液の液体のみを廃棄した。残存した該粒子に対し、Tween20を0.05重量%含むTBS300μLを分注し、1分間攪拌した後に粒子を
磁石により集めた。このような洗浄工程を3回繰り返した。
As the washing step, the particles obtained through the step (b) were collected with a magnet for solid-liquid separation, and only the liquid of the reaction solution after the step (b) was discarded. To the remaining particles, 300 μL of TBS containing 0.05% by weight of Tween 20 was dispensed and stirred for 1 minute, and then the particles were collected by a magnet. Such a washing process was repeated three times.

工程(c)として、上記洗浄工程を経て得られた粒子に、TBSで調整した酵素蛍光基質溶液(1,3−dicloro−9,9−dimethyl−acridine−2−one−7−yl phosphate(DDAO phosphate)(Molecular Probes社製))100μLを分注し、攪拌後、5分間反応させた。   As the step (c), the particles obtained through the washing step described above were added to an enzyme fluorescent substrate solution (1,3-dicilo-9,9-dimethyl-acid-2-one-7-yl phosphate (DDAO) prepared with TBS. 100 μL of phosphate (manufactured by Molecular Probes) was dispensed and allowed to react for 5 minutes after stirring.

工程(d)として、上記工程(c)を経て得られた反応溶液を、磁石により粒子を集めることで固液分離を行い、蛍光色素溶液として単離した。
工程(e)として、上記工程(d)を経て得られた蛍光色素溶液を、作製例1で得られたプラズマ励起センサの表面に送液することで接触させた。
As the step (d), the reaction solution obtained through the step (c) was subjected to solid-liquid separation by collecting particles with a magnet and isolated as a fluorescent dye solution.
As the step (e), the fluorescent dye solution obtained through the step (d) was brought into contact with the surface of the plasma excitation sensor obtained in Production Example 1 by liquid feeding.

工程(f)として、上記工程(e)で得られたプラズモン励起センサに、ガラス製の透明平面基板の、金薄膜を形成していないもう一方の表面から、プリズム(シグマ光機(株)製)を経由してレーザ光(640nm、40μW)を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量をCCDから観察したときのシグナル値を計測し「アッセイシグナル」とした。   As the step (f), the prism (Sigma Kogyo Co., Ltd. product) is applied to the plasmon excitation sensor obtained in the step (e) from the other surface of the glass transparent flat substrate on which the gold thin film is not formed. ) Was irradiated with laser light (640 nm, 40 μW), and the signal value when the amount of fluorescence emitted from the excited fluorescent dye was observed from the CCD was measured and used as an “assay signal”.

なお、AFPが0ng/mL時のSPFS測定シグナルを「アッセイノイズシグナル」とした。
工程(g)として、上記工程(f)で得られた測定結果から、感度に関しては、アッセイS/N比を以下の式で評価し、精度に関しては、CV値を算出することで評価した。CV値は、同条件の6回測定の結果より、平均値に対する標準偏差の100分率の値を算出した。
The SPFS measurement signal when AFP was 0 ng / mL was defined as “assay noise signal”.
As the step (g), from the measurement results obtained in the step (f), the sensitivity was evaluated by evaluating the assay S / N ratio by the following formula, and the accuracy was evaluated by calculating the CV value. As the CV value, the value of 100 percent of the standard deviation with respect to the average value was calculated from the result of six measurements under the same conditions.

アッセイS/N比=|(アッセイ蛍光シグナル)|/|(アッセイノイズシグナル)|
すなわち、アッセイS/N比から、抗原量に比例する蛍光色素量により変化する蛍光シグナルの数値が大きく、またアッセイノイズシグナルがアッセイ蛍光シグナルに対して数値が充分小さければ、イムノアッセイ測定の信頼性が高いことがわかる。
Assay S / N ratio = | (assay fluorescence signal) | / | (assay noise signal) |
That is, if the value of the fluorescent signal that changes depending on the amount of fluorescent dye proportional to the amount of antigen is large from the assay S / N ratio, and the assay noise signal is sufficiently small relative to the assay fluorescent signal, the reliability of the immunoassay measurement can be improved. I understand that it is expensive.

得られた結果を表4に示す。
[比較例1]
まず、作製例1で得られたプラズモン励起センサを流路に固定し、送液として超純水を10分間、その後PBSを20分間、ペリスタポンプにより、室温、流速500μL/minで循環させ、その表面を平衡化した。
Table 4 shows the obtained results.
[Comparative Example 1]
First, the plasmon excitation sensor obtained in Production Example 1 was fixed to a flow path, and ultrapure water was fed as a liquid for 10 minutes, and then PBS was circulated for 20 minutes with a peristaltic pump at room temperature and a flow rate of 500 μL / min. Was equilibrated.

続いて、N−ヒドロキシコハク酸イミド(NHS)を50mMと、水溶性カルボジイミド(WSC)を100mMとを含むPBSを5mL送液し、20分間循環送液させた後に、抗αフェトプロテイン(AFP)モノクローナル抗体(1D5、2.5mg/mL、(株)日本医学臨床検査研究所製)溶液2.5mLを30分間循環送液することで、SAM
上に1次抗体を固相化した。なお、1重量%牛血清アルブミン(BSA)を含むPBS緩衝生理食塩水にて30分間循環送液することで、非特異的吸着防止処理を行った。
Subsequently, 5 mL of PBS containing 50 mM N-hydroxysuccinimide (NHS) and 100 mM water-soluble carbodiimide (WSC) was fed and circulated for 20 minutes, followed by anti-α-fetoprotein (AFP) monoclonal. By circulating 2.5 mL of antibody (1D5, 2.5 mg / mL, manufactured by Nippon Medical Laboratory) for 30 minutes, SAM
The primary antibody was immobilized on the top. In addition, the nonspecific adsorption | suction prevention process was performed by circulating 30 minutes by PBS buffer physiological saline containing 1weight% bovine serum albumin (BSA).

送液をPBSに代え、AFPを1ng/mL含むPBS溶液を0.5mL添加し、25分間循環させた。
Tween20を0.05重量%含むTBSを送液として10分間循環させることによ
って洗浄した。
Instead of PBS, 0.5 mL of a PBS solution containing 1 ng / mL of AFP was added and circulated for 25 minutes.
Washing was carried out by circulating TBS containing 0.05% by weight of Tween 20 for 10 minutes.

Alexa Fluor(登録商標)647を標識した2次抗体(1,000ng/m
Lとなるように調製したPBS溶液)を2.5mL添加し、20分間循環させた。
その後、Tween20を0.05重量%含むTBSを送液として20分間循環させる
ことによって洗浄した。
Secondary antibody labeled with Alexa Fluor (registered trademark) 647 (1,000 ng / m
2.5 mL of PBS solution prepared to be L) was added and circulated for 20 minutes.
Then, it was cleaned by circulating TBS containing 0.05% by weight of Tween 20 for 20 minutes.

CCDから観察したときのシグナル値を計測しアッセイシグナルとした。なお、AFPを0ng/mL時のSPFS測定シグナルをアッセイノイズシグナルとした。アッセイ評価としては実施例1と同様のアッセイS/N比を算出することで評価した。   The signal value observed from the CCD was measured and used as an assay signal. The SPFS measurement signal when AFP was 0 ng / mL was used as the assay noise signal. The assay was evaluated by calculating the same assay S / N ratio as in Example 1.

得られた結果を表4に示す。
[比較例2]
まず、作製例1で得られたプラズモン励起センサを流路に固定し、送液として超純水を10分間、その後PBSを20分間、ペリスタポンプにより、室温で流速500μL/minで循環させ、その表面を平衡化した。
Table 4 shows the obtained results.
[Comparative Example 2]
First, the plasmon excitation sensor obtained in Production Example 1 was fixed to the flow path, and ultrapure water was fed as a liquid for 10 minutes, and then PBS was circulated for 20 minutes using a peristaltic pump at room temperature at a flow rate of 500 μL / min. Was equilibrated.

続いて、N−ヒドロキシコハク酸イミド(NHS)を50mMと、水溶性カルボジイミド(WSC)を100mMとを含むPBSを5mL送液し、20分間循環送液させた後に、抗αフェトプロテイン(AFP)モノクローナル抗体(1D5、2.5mg/mL、(株)日本医学臨床検査研究所製)溶液2.5mLを30分間循環送液することで、SAM
上に1次抗体を固相化した。なお、重量1%牛血清アルブミン(BSA)を含むPBS緩衝生理食塩水にて30分間循環送液することで、非特異的吸着防止処理を行った。
Subsequently, 5 mL of PBS containing 50 mM N-hydroxysuccinimide (NHS) and 100 mM water-soluble carbodiimide (WSC) was fed and circulated for 20 minutes, followed by anti-α-fetoprotein (AFP) monoclonal. By circulating 2.5 mL of antibody (1D5, 2.5 mg / mL, manufactured by Nippon Medical Laboratory) for 30 minutes, SAM
The primary antibody was immobilized on the top. In addition, the nonspecific adsorption | suction prevention process was performed by circulating 30 minutes by PBS buffer physiological saline containing 1% bovine serum albumin (BSA).

送液をPBSに代え、AFPを1ng/mL含むPBS溶液を0.5mL添加し、25分間循環させた。
Tween20を0.05重量%含むTBSを送液として10分間循環させることによ
って洗浄した。
Instead of PBS, 0.5 mL of a PBS solution containing 1 ng / mL of AFP was added and circulated for 25 minutes.
Washing was carried out by circulating TBS containing 0.05% by weight of Tween 20 for 10 minutes.

作製例2で得られたアルカリフォスファダーゼ標識抗AFPモノクローナル抗体(1,
000ng/mLとなるように調製したPBS溶液)を2.5mL添加し、20分間循環させた。
Alkaline phosphatase-labeled anti-AFP monoclonal antibody obtained in Preparation Example 2 (1,
2.5 mL of PBS solution prepared to be 000 ng / mL) was added and circulated for 20 minutes.

Tween20を0.05重量%含むTBSを送液として10分間循環させることによ
って洗浄した。
TBSで調製した酵素蛍光基質溶液(1,3−dicloro−9,9−dimethyl−acridine−2−one−7−yl phosphate(DDAO phosphate)(Molecular Probes社製))100μLをプラズモン励起センサに導入し、5分間反応させた。
Washing was carried out by circulating TBS containing 0.05% by weight of Tween 20 for 10 minutes.
100 μL of an enzyme fluorescent substrate solution (1,3-dicilo-9,9-dimethyl-2-one-7-yl phosphate (DDAO phosphate) (manufactured by Molecular Probes)) prepared with TBS was introduced into the plasmon excitation sensor. The reaction was allowed for 5 minutes.

CCDから観察したときのシグナル値を計測しアッセイシグナルとした。なお、AFPを0ng/mL時のSPFS測定シグナルをアッセイノイズシグナルとした。アッセイ評価としては実施例1と同様のアッセイS/N比を算出することで評価した。   The signal value observed from the CCD was measured and used as an assay signal. The SPFS measurement signal when AFP was 0 ng / mL was used as the assay noise signal. The assay was evaluated by calculating the same assay S / N ratio as in Example 1.

得られた結果を表4に示す。   Table 4 shows the obtained results.

表4から、免疫反応場と検出場とをそれぞれ完全に分離し、プラズモン励起を用いた蛍光測定イムノアッセイである実施例1は、比較例1と比較して、高い蛍光シグナル値とアッセイS/N比を達成しており、極めて高感度かつダイナミックレンジの広い測定が可能であることがわかった。   From Table 4, Example 1 which is a fluorometric immunoassay using plasmon excitation in which an immune reaction field and a detection field are completely separated from each other has a higher fluorescence signal value and assay S / N. The ratio was achieved, and it was found that measurement with extremely high sensitivity and a wide dynamic range is possible.

また、センサ基板上で酵素増幅させたイムノアッセイ結果である比較例2は、比較例1と比べるとシグナルが増幅された。しかしながら、ノイズも同様に上昇しており、同一基板上での増幅反応が、アッセイS/N比では優位性を見出すことができない。   Further, in Comparative Example 2, which is an immunoassay result obtained by enzyme amplification on the sensor substrate, the signal was amplified as compared with Comparative Example 1. However, the noise rises as well, and the amplification reaction on the same substrate cannot find an advantage in the assay S / N ratio.

それに対して、実施例1においては、免疫反応(洗浄工程も含む)、増幅反応および検出反応のそれぞれを完全に分離することにより、各反応系を最適化することができ、高感度測定が可能となった。また、精度に関しても、比較例1および2と比較して実施例1のCV値結果が良好となった。特にAFP(1ng/mL)シグナル時に関して有意性が認められ、本発明が高感度かつ高精度な測定方法であることがわかった。   On the other hand, in Example 1, each reaction system can be optimized by completely separating each of the immune reaction (including the washing step), the amplification reaction, and the detection reaction, and highly sensitive measurement is possible. It became. Also, regarding the accuracy, the CV value result of Example 1 was better than that of Comparative Examples 1 and 2. In particular, significance was recognized with respect to the time of AFP (1 ng / mL) signal, and it was found that the present invention is a highly sensitive and highly accurate measurement method.

本発明のアッセイ法は、高感度かつ高精度に検出することができる方法であるから、例えば、血液中に含まれる極微量の腫瘍マーカーであっても検出することができ、この結果から、触診などによって検出することができない前臨床期の非浸潤癌(上皮内癌)の存在も高精度で予測することができる。   Since the assay method of the present invention can be detected with high sensitivity and high accuracy, for example, even a very small amount of tumor marker contained in blood can be detected. The presence of pre-clinical non-invasive cancer (carcinoma in situ) that cannot be detected by, for example, can be predicted with high accuracy.

図1は、免疫反応場において、検体中に含有される標的抗原3を、粒子1の表面に固定化した1次抗体2と、酵素により標識された2次抗体4とが認識し結合し、さらに蛍光基質(図示せず)を添加することによって、蛍光色素10が生成し、単離した蛍光色素10を、検出場である、ガラス製の透明平面基板6と、該基板6の一方の表面に形成された金薄膜7と、該薄膜7の、該基板とは接していないもう一方の表面に形成したスペーサ層(図示せず)とを有するプラズモン励起センサの該スペーサ層側の表面に接触させ、該基板6の、該薄膜7を形成していないもう一方の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し(図示せず)、蛍光色素10が表面プラズモンによって励起され発光している、本発明のアッセイ法の模式図を示す。FIG. 1 shows that, in an immune reaction field, a primary antibody 2 immobilized on the surface of a particle 1 with a target antigen 3 contained in a specimen is recognized and bound to a secondary antibody 4 labeled with an enzyme, Further, by adding a fluorescent substrate (not shown), the fluorescent dye 10 is generated, and the isolated fluorescent dye 10 is converted into a glass transparent flat substrate 6 as a detection field, and one surface of the substrate 6. A surface of the plasmon excitation sensor having a gold thin film 7 formed on the substrate and a spacer layer (not shown) formed on the other surface of the thin film 7 not in contact with the substrate. Then, laser light is irradiated from the other surface of the substrate 6 where the thin film 7 is not formed via a prism (not shown), and the fluorescent dye 10 is excited by the surface plasmon and emits light. , Shows a schematic diagram of the assay method of the present invention 図2は、工程(a)〜(c):免疫反応場である試験管12中で、検体中に含有される標的抗原3を、磁性を有する粒子1の表面に固定化した1次抗体2と、酵素により標識された2次抗体4とが認識し結合して、さらに蛍光基質(図示せず)を添加することによって、蛍光色素10が生成し、工程(d):試験管12の外側から磁石11を近づけることにより、蛍光色素10を単離し、工程(e)、(f):検出場である、ガラス製の透明平面基板6と、該基板6の一方の表面に形成された金薄膜7と、該薄膜7の、該基板とは接していないもう一方の表面に形成した誘電体からなるスペーサ層(図示せず)とを有するプラズモン励起センサの該スペーサ層側の表面に、単離した蛍光色素10を接触させ、該基板6の、該薄膜7を形成していないもう一方の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し(図示せず)、蛍光色素10が表面プラズモンによって励起され発光している、本発明のアッセイ法の模式図を示す。2 shows steps (a) to (c): a primary antibody 2 in which a target antigen 3 contained in a specimen is immobilized on the surface of magnetic particles 1 in a test tube 12 which is an immune reaction field. And the secondary antibody 4 labeled with the enzyme are recognized and bound to each other, and a fluorescent substrate (not shown) is further added to produce a fluorescent dye 10. Step (d): outside of the test tube 12 The fluorescent dye 10 is isolated by bringing the magnet 11 closer to the surface, and the steps (e) and (f): a transparent flat substrate 6 made of glass, which is a detection field, and gold formed on one surface of the substrate 6 On the surface of the plasmon excitation sensor having a thin film 7 and a spacer layer (not shown) made of a dielectric formed on the other surface of the thin film 7 not in contact with the substrate, The separated fluorescent dye 10 is contacted to form the thin film 7 of the substrate 6 From no other surface, through the prism is irradiated with a laser beam (not shown), a fluorescent dye 10 is emitting light when excited by the surface plasmon, a schematic view of the assay of the present invention.

符号の説明Explanation of symbols

1・・・粒子
2・・・1次抗体
3・・・検体中に含有される標的抗原
4・・・2次抗体
5・・・ルテニウム錯体
6・・・ガラス製の透明平面基板
7・・・金薄膜
9・・・酵素
10・・・蛍光色素
11・・・磁石
12・・・試験管
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 ... Particle 2 ... Primary antibody 3 ... Target antigen contained in a specimen 4 ... Secondary antibody 5 ... Ruthenium complex 6 ... Transparent flat substrate made of glass 7. -Gold thin film 9 ... Enzyme 10 ... Fluorescent dye 11 ... Magnet 12 ... Test tube

Claims (8)

少なくとも下記工程(a)〜(g)からなることを特徴とするアッセイ法。
工程(a):リガンドがその表面に固定化された粒子と、検体とを接触させる工程、
工程(b):該工程(a)を経て得られた粒子に、該リガンドとは同じであっても異なっていてもよいリガンドと酵素とのコンジュゲートを反応させる工程、
工程(c):該工程(b)を経て得られた粒子に、さらに酵素蛍光基質を反応させ、蛍光色素が生成される工程、
工程(d):該工程(c)を経て得られた蛍光色素を単離する工程、
工程(e):透明平面基板と、該基板の一方の表面に形成した金属薄膜とを少なくとも有するプラズモン励起センサの、該薄膜表面に、該工程(d)を経て得られた蛍光色素を接触させる工程、
工程(f):該工程(e)で得られたプラズモン励起センサに、該基板の、該薄膜を形成していないもう一方の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程、および
工程(g):該工程(f)で得られた測定結果から、検体中に含有されるアナライト量を算出する工程。
An assay method comprising at least the following steps (a) to (g).
Step (a): a step of contacting a specimen with particles having a ligand immobilized on the surface thereof,
Step (b): reacting a particle obtained through the step (a) with a conjugate of a ligand and an enzyme, which may be the same as or different from the ligand,
Step (c): a step in which the particles obtained through the step (b) are further reacted with an enzyme fluorescent substrate to produce a fluorescent dye,
Step (d): a step of isolating the fluorescent dye obtained through the step (c),
Step (e): The fluorescent dye obtained through the step (d) is brought into contact with the thin film surface of a plasmon excitation sensor having at least a transparent flat substrate and a metal thin film formed on one surface of the substrate. Process,
Step (f): The plasmon excitation sensor obtained in step (e) was excited by being irradiated with laser light from the other surface of the substrate on which the thin film was not formed via a prism. A step of measuring the amount of fluorescence emitted from the fluorescent dye, and a step (g): a step of calculating the amount of analyte contained in the specimen from the measurement result obtained in the step (f).
上記工程(a)〜(d)の免疫反応場および、上記工程(e)〜(g)の検出場が、それぞれ独立している請求項1に記載のアッセイ法。   The assay method according to claim 1, wherein the immunoreaction field in steps (a) to (d) and the detection field in steps (e) to (g) are independent of each other. 上記検体が、血液、血清、血漿、尿、鼻孔液および唾液からなる群から選択される少なくとも1種の体液である請求項1または2に記載のアッセイ法。   The assay method according to claim 1 or 2, wherein the specimen is at least one body fluid selected from the group consisting of blood, serum, plasma, urine, nasal fluid and saliva. 上記酵素が、アルカリフォスファダーゼ(ALP)、ペルオキシダーゼ(POD)およびガラクトシダーゼ(GAL)からなる群から選択される少なくとも1種の酵素である請求項1〜3のいずれかに記載のアッセイ法。   The assay method according to any one of claims 1 to 3, wherein the enzyme is at least one enzyme selected from the group consisting of alkaline phosphatase (ALP), peroxidase (POD) and galactosidase (GAL). 上記金属薄膜が、金、銀、アルミニウム、銅および白金からなる群から選ばれる少なくとも1種の金属から形成される請求項1〜4のいずれかに記載のアッセイ法。   The assay method according to any one of claims 1 to 4, wherein the metal thin film is formed of at least one metal selected from the group consisting of gold, silver, aluminum, copper and platinum. 上記プラズモン励起センサが、さらにスペーサ層を有し、
該スペーサ層が、上記金属薄膜の、上記透明平面基板とは接していないもう一方の表面に形成される請求項1〜5のいずれかに記載のアッセイ法。
The plasmon excitation sensor further has a spacer layer,
The assay method according to claim 1, wherein the spacer layer is formed on the other surface of the metal thin film that is not in contact with the transparent flat substrate.
請求項1に記載の工程(f)に用いられることを特徴とする装置。   The apparatus used for the process (f) of Claim 1. 請求項1〜6のいずれかに記載のアッセイ法に用いられることを特徴とするキット。   A kit for use in the assay method according to claim 1.
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