KR102026022B1 - 효과적인 신경 축삭 돌기 재생 연구를 위한 신경 스캐폴드, 이의 제조방법 및 이를 이용한 세포 성장 확인방법 - Google Patents

효과적인 신경 축삭 돌기 재생 연구를 위한 신경 스캐폴드, 이의 제조방법 및 이를 이용한 세포 성장 확인방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신경 재생을 위한 신경 스캐폴드, 이의 제조방법 및 이를 이용한 세포 성장 확인방법에 대한 것이다. 본 발명은 도성 고분자가 형성된 도관이 내부에 형성된 지지체를 포함하여 물리적 및 전기적 특성이 우수한 장점이 있으며, 이를 통해 신경세포의 재생 및 축삭돌기 성장 정도를 동물실험 없이 확인할 수 있다는 장점이 있다.

Description

효과적인 신경 축삭 돌기 재생 연구를 위한 신경 스캐폴드, 이의 제조방법 및 이를 이용한 세포 성장 확인방법{A neuronal scaffold for effective neuronal axon regeneration study, Preparation method thereof, and Indentifying method of cell growth using the same}
본 발명은 신경 재생을 위한 신경 스캐폴드, 이의 제조방법 및 이를 이용한 세포 성장 확인방법에 대한 것이다.
신경 압박이나 파괴 등으로 인한 손상을 치료하기 위한 말초 신경의 재생은 미미한 신경 손상의 경우는 자가적으로 회복이 가능하지만, 회복 과정에서 신경 연결에 문제가 있고, 축삭돌기가 손상되는 등의 심각한 신경 손상이 발생한 경우 이의 회복이 매우 어렵다는 단점이 있어, 이를 회복하기 위한 다양한 연구가 수행되고 있다.
특히 신경 결손을 회복하기 위한 방법으로 신경 스캐폴드를 이용하여 신경 재생을 촉진시키거나 직접 신경 줄기 세포를 신경 회로망 복원에 사용할 수 있도록 하는데, 이를 성공적으로 재생하기 위해서 축삭돌기의 성장이 필수적이다. 손상된 신경 조직에 신경 줄기세포를 이식하는 데에는 신경 발생 과정과는 달리 신경 회로망 복원에 필요한 세포 및 분자적 요인이 없어, 축삭돌기의 재생에 장애가 될 수 있다. 따라서 이를 해결하기 위해서는 신경세포 축삭의 성장과 관련된 치료 과정이 병행되어야 하고, 이러한 치료과정은 신경 세포의 축삭 돌기 길이를 최대화할 수 있는 방향으로 수행되어야 할 것이다.
한편, 신경 조직의 경우에는 배열된 방향성이나 전기적 신호 전달이 매우 중요한 과정이고 실제로 신경세포를 일정한 방향성이 있는 표면 위에 배양하여 전기적 자극을 가하였을 때 신경의 결손을 회복했다는 연구결과가 보고되고 있다.
신경 손상은 신경에 가해진 외상이나 신경 자극의 차단을 가져오는 척수 압박 등으로 발생하게 되는데, 주로 손상된 축삭 돌기의 말초 부분이 신경 세포로부터 단절되어 발생하게 된다. 특히, 신경과학계의 지속적인 연구를 통해 축삭 돌기의 성장을 조절하기 위한 많은 생리 활성 물질 등이 보고되고 최적화할 수 있는 방안들이 고려되고 있으나, 그 방법이 2D 세포 배양 시스템에서 크게 벗어나지 못한다는 한계가 존재한다. 특히 대표적인 방법으로 생리활성 물질들을 함유하는 마이크로 입자를 신경세포 주변에 위치시키거나, 신경세포를 2D의 스캐폴드에 주입하여 축삭돌기의 성장을 보는 것인데, 축삭돌기의 성장 정도가 몇 백 마이크로미터로 한정되고 단일 세포의 축삭돌기만 보게 되어 보다 정확한 연구 결과를 위해서는 동물실험을 반드시 거쳐야 한다는 한계점이 있다. 동물 실험은 현재 보고된 축삭 돌기의 유도 물질 검색 및 신경 손상 환자에게 적합한 물질의 양 등의 환경을 조율하는 과정에서 효율성 및 비용 측면에 큰 제약이 있으므로, 이를 보완하고자 생체모방적이며 신경세포의 축삭돌기 최대 성장 유도를 확인할 수 있는 생체 모방적 스캐폴드 소재의 제조가 요구된다.
대한민국 공개특허 제10-20070-0131880호
본 발명은 전도성 고분자가 형성된 도관이 내부에 형성된 지지체를 포함하는 신경 스캐폴드 및 이의 제조방법을 제공한다.
본 발명은,
수평방향의 단면이 원을 형성하는 원기둥 형상이고 생분해성 고분자로 형성된 지지체; 및
상기 지지체 내에 수직방향으로 배향성을 갖고 다수개 형성되며 전도성 고분자로 형성된 중공구조의 도관을 포함하고,
상기 도관은, 상기 지지체의 수평방향 형상을 기준으로 나선형을 이루면서 연속 또는 불연속적으로 배열된 신경 스캐폴드를 제공한다.
또한, 본 발명은,
전도성 고분자로 코팅된 폴리에스테르계 고분자 섬유가 일방향으로 배향되어 고분자 섬유 다발을 형성하는 단계;
형성된 고분자 섬유 다발을 생분해성 고분자를 포함하는 용액에 침지하여 원기둥 형태의 지지체를 제조하는 단계; 및
상기 제조된 원기둥 형태의 지지체를 유기용매에 담지하는 단계를 포함하는 신경 스캐폴드의 제조방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은, 본 발명에 따른 신경 스캐폴드를 이용한 세포 성장 확인방법을 제공한다.
본 발명에 따른 신경 스캐폴드는 물리적 및 전기적 특성이 우수한 장점이 있으며, 이를 통해 신경세포의 재생 및 축삭돌기 성장 정도를 동물실험 없이 확인할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 신경 스캐폴드를 도시한 이미지이다.
도 2는 본 발명에 따른 신경 스캐폴드의 제조방법을 도식화한 이미지이다.
도 3은 일실시예에 따라 제조된 폴리에스테르계 고분자 섬유를 주사전자현미경(Scanning Electronic Microscope, SEM)으로 촬영한 이미지이다.
도 4는 일실시예에 따라 제조된 폴리에스테르계 고분자 섬유가 내부에 포함된 원기둥 형태의 지지체를 주사전자현미경(Scanning Electronic Microscope, SEM)으로 촬영한 이미지이다.
도 5는 일실시예에 따라 제조된 신경 스캐폴드를 주사전자현미경(Scanning Electronic Microscope, SEM)으로 촬영한 이미지이다.
도 6은 본 발명에 따른 신경 스캐폴드를 이용하여 신경 세포를 재생시킨 것을 도시한 이미지이다.
본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다.
그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명에서, "포함한다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
또한, 본 발명에서 첨부된 도면은 설명의 편의를 위하여 확대 또는 축소하여 도시된 것으로 이해되어야 한다.
아울러, 본 발명에서 "바이오매스"란 식물과 미생물의 광합성에 의하여 생성되는 식물체, 균체와 이를 먹고 살아가는 동물체를 포함하는 생물유기체를 말한다.
본 발명은 신경 재생을 위한 신경 스캐폴드, 이의 제조방법 및 이를 이용한 세포 성장 확인방법에 대한 것이다.
일반적으로 신경 결손을 회복하기 위한 방법으로 신경 스캐폴드를 이용하여 신경 재생을 촉진시키거나 직접 신경 줄기세포를 신경 회로망 복원에 사용할 수 있도록 하는데, 이를 성공적으로 재생하기 위해서 축삭돌기의 성장이 필수적이다. 손상된 신경 조직에 신경 줄기세포를 이식하는 데에는 신경 회로망 복원에 필요한 세포 및 분자적 요인이 없어, 축삭돌기의 재생에 장애가 될 수 있다.
이를 해결하기 위해서 신경과학계의 지속적인 연구를 통해 축삭 돌기의 성장을 조절하기 위한 많은 생리 활성 물질 등이 보고되고 최적화할 수 있는 방안들이 고려되고 있으나, 그 방법이 2D 세포 배양 시스템에서 크게 벗어나지 못한다는 한계가 존재한다. 특히 대표적인 방법으로 생리활성 물질들을 함유하는 마이크로 입자를 신경세포 주변에 위치시키거나, 신경세포를 2D의 스캐폴드에 주입하여 축삭돌기의 성장을 보는 것인데, 축삭돌기의 성장 정도가 몇 백 마이크로미터로 한정되고 단일 세포의 축삭돌기만 보게 되어 보다 정확한 연구 결과를 위해서는 동물실험을 반드시 거쳐야 한다는 한계점이 있다.
이에, 본 발명은 동물실험 없이도 신경세포의 축삭돌기 최대 성장 유도를 확인할 수 있는 생체 모방적 스캐폴드, 이의 제조방법 및 이를 이용한 신경세포 재생방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명은,
수평방향의 단면이 원을 형성하는 원기둥 형상이고 생분해성 고분자로 형성된 지지체; 및
상기 지지체 내에 수직방향으로 배향성을 갖고 다수개 형성되며 전도성 고분자로 형성된 중공구조의 도관을 포함하고,
상기 도관은, 상기 지지체의 수평방향 형상을 기준으로 나선형을 이루면서 연속 또는 불연속적으로 배열된 신경 스캐폴드를 제공한다.
도 1에 나타낸 것과 같이, 본 발명에 따른 신경 스캐폴드는 원기둥 형태의 생분해성 고분자 지지체 내부에 전도성 고분자로 형성된 중공구조의 도관이 형성된 구조이며, 상기 도관은 지지체의 수평방향 형상의 단면을 기준으로 나선형을 이루면서 연속 또는 불연속적으로 배열될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 신경 스캐폴드는 전도성 고분자가 형성된 도관을 통해 신경 재생 및 축삭돌기 성장이 일어날 수 있다.
하나의 예로서, 생분해성 고분자는 폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌이민, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리(카프로락톤), 폴리에틸렌옥사이드 및 젤라틴으로 이루어진 군으로부터 선택된 2종 이상일 수 있다. 구체적으로, 생분해성 고분자는 폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌이민, 폴리락트산 및 폴리글리콜산으로 이루어진 군으로부터 선택된 2종 이상일 수 있다. 보다 구체적으로, 생분해성 고분자는 폴리에틸렌글리콜 및 폴리에틸렌이민을 포함할 수 있다.
또한, 전도성 고분자는 폴리피롤, 폴리아닐린, 폴리티오펜, 폴리 p-페닐렌, 폴리p-페닐렌설파이드 및 폴리에틸렌디옥시티오펜으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다. 구체적으로, 전도성 고분자는 폴리피롤, 폴리아닐린 및 폴리 p-페닐렌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다. 보다 구체적으로 전도성 고분자는 폴리피롤 또는 폴리아닐린을 포함할 수 있다. 상기와 같은 전도성 고분자를 포함함으로써, 신경 재생 및 축삭 돌기의 성장이 우수한 신경 스캐폴드를 제공할 수 있다.
예를 들어, 생분해성 고분자로 형성된 지지체의 평균 직경은 3mm 내지 4mm, 2mm 내지 3mm 또는 1mm 내지 2mm일 수 있다. 구체적으로 생분해성 고분자로 형성된 지지체의 평균 직경은 2mm 내지 3mm 또는 1mm 내지 2mm일 수 있다. 보다 구체적으로, 생분해성 고분자로 형성된 지지체의 평균 직경은 1mm 내지 2mm일 수 있다.
또한, 생분해성 고분자로 형성된 지지체의 평균 길이는 3mm 내지 5mm, 2mm 내지 3mm 또는 1mm 내지 2mm일 수 있다. 구체적으로 생분해성 고분자로 형성된 지지체의 평균 길이는 2mm 내지 3mm 또는 1mm 내지 2mm일 수 있다. 보다 구체적으로, 생분해성 고분자로 형성된 지지체의 평균 길이는 1mm 내지 2mm일 수 있다. 여기서 길이는 지지체의 수직방향의 길이를 나타낸다.
상기와 같은 크기의 지지체를 가짐으로써, 작은 부피에 신경 분화 및 신경 축삭돌기에 관한 실험을 수행할 수 있다는 이점이 있다.
하나의 예시에서, 지지체 내에 수직방향으로 배향성을 갖고 다수개 형성되며 전도성 고분자로 형성된 중공구조의 도관은 5개 이상일 수 있다. 구체적으로, 전도성 고분자로 형성된 중공구조의 도관은 5 개 이상, 10개 이상 10 내지 30개 또는 10 내지 20개의 도관이 수평방향의 단면을 기준으로 나선형으로 불연속적으로 배열된 구조를 가질 수 있다.
예를 들어, 지지체 내에 전도성 고분자로 형성된 도관의 평균 직경은 0.8㎛ 내지 2㎛일 수 있다. 구체적으로, 상기 고분자로 형성된 도관의 평균 직경은 0.8㎛ 내지 1.4㎛, 0.8㎛ 내지 1.2㎛ 또는 1.2㎛ 내지 1.5㎛일 수 있다. 보다 구체적으로 상기 고분자로 형성된 도관의 평균 직경은 0.8㎛ 내지 1.2㎛일 수 있다. 각각의 도관의 직경은 독립적으로 상이할 수 있다. 상기와 같은 도관을 가짐으로써, 신경 세포 및 축삭돌기 성장을 확인할 수 있다.
또한, 본 발명은, 전도성 고분자로 코팅된 폴리에스테르계 고분자 섬유가 일방향으로 배향되어 고분자 섬유 다발을 형성하는 단계;
형성된 고분자 섬유 다발을 생분해성 고분자를 포함하는 용액에 침지하여 원기둥 형태의 지지체를 제조하는 단계; 및
상기 제조된 원기둥 형태의 지지체를 유기용매에 담지하는 단계를 포함하는 신경 스캐폴드의 제조방법을 제공한다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 폴리에스테르계 고분자(예를 들어, 폴리카프로락톤)을 전기방사하여 일정 범위의 직경을 갖는 폴리에스테르계 고분자 섬유로 제조한 후, 전도성 고분자를 포함하는 용액에 담지하여 고분자 섬유 상에 전도성 고분자를 코팅한다. 전도성 고분자가 코팅된 폴리에스테르계 고분자 섬유를 일방향으로 배열하여 섬유 길이의 평행한 방향으로 말아서 폴리에스테르계 고분자 섬유 다발을 제조한다. 제조된 폴리에테르계 고분자 섬유 다발을 일정 길이로 자른 다음 생분해성 고분자(예를 들어, 폴리에틸렌글리콜 및 폴리에틸렌이민) 및 광개시제를 포함하는 용액에 넣고 자외선을 조사하여 원기둥 형태의 생분해성 고분자 지지체를 제조한다. 상기 생분해성 고분자 지지체는 내부에 폴리에스테르계 고분자 섬유 다발을 포함한다. 상기 제조된 신경 스캐폴드에 유기용매(예를 들어, 클로로포름)를 부어 폴리에스테르계 고분자를 제거하여 생분해성 고분자 지지체 내부에 도관을 형성하여 신경 스캐폴드를 제조한다.
본 발명에 따른 전도성 고분자로 코팅된 폴리에스테르계 고분자 섬유는,
폴리에스테르계 고분자 수지를 전기방사하여 제조하며,
전기방사로 제조된 폴리에스테르계 고분자 섬유를 전도성 고분자를 포함하는 용액에 8시간 이상 담지하여 제조할 수 있다.
하나의 예로서, 폴리에스테르계 고분자 수지를 7 내지 15kHz로 시린지 펌프는 0.5mL/hr. 내지 1.0mL/hr., 시린지 니들은 직경 23G, 내지 27G., 23G 내지 25G 또는 25 G 내지 27 G를 사용하여 전기방사하여 폴리에스테르계 고분자 섬유를 제조할 수 있다. 상기와 같은 조건으로 폴리에스테르계 고분자 수지를 전기 방사하여 0.8㎛ 내지 1.2㎛의 평균 직경을 가지는 폴리에스테르계 고분자 섬유를 제조할 수 있다
상기 폴리에스테르계 고분자 섬유는 폴리카프로락톤, 폴리락트산 및 폴리락틱코카프로락톤으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상으로 제조할 수 있다. 구체적으로, 폴리에스테르계 고분자 섬유는 리카프로락톤 또는 폴리락트산으로 제조할 수 있다.
구체적으로, 전기방사로 제조된 폴리에스테르계 고분자 섬유를 전도성 고분자를 포함하는 용액에 8시간 이상 담지하여 제조할 수 있다. 보다 구체적으로, 전기방사로 제조된 폴리에스테르계 고분자 섬유는 전도성 고분자를 포함하는 용액에 8시간 내지 24시간을 담지하여 전도성 고분자로 코팅된 폴리에스테르계 고분자 섬유를 제조할 수 있다. 이때, 전도성 고분자를 포함하는 용액에 폴리에스테르계 고분자 섬유를 담지하는 온도는 4 내지 10℃일 수 있다.
예를 들어, 전도성 고분자는 폴리피롤, 폴리아닐린, 폴리티오펜, 폴리 p-페닐렌, 폴리p-페닐렌설파이드 및 폴리에틸렌디옥시티오펜으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 전도성 고분자로 코팅하여 제조할 수 있다. 구체적으로, 폴리에스테르계 고분자 섬유는 폴리피롤, 폴리아닐린 및 폴리 p-페닐렌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 전도성 고분자로 코팅하여 제조할 수 있다. 보다 구체적으로, 폴리에스테르계 고분자 섬유는 폴리피롤 또는 폴리아닐린을 포함하는 전도성 고분자로 코팅하여 제조할 수 있다. 상기와 같은 전도성 고분자를 코팅함으로써, 신경 재생 및 축삭 돌기의 성장이 우수한 신경 스캐폴드를 제조할 수 있다.
구체적으로, 상기 전도성 고분자를 섬유 표면에 코팅시키기 위하여 제작하는 용액에서 전도성 고분자의 단량체는 100㎕/L 내지 400㎕/L의 함량으로 포함될 수 있다. 보다 구체적으로, 전도성 고분자의 단량체는 100㎕/L 내지 200㎕/L 또는 200㎕/L 내지 400㎕/L의 함량으로 포함될 수 있다. 상기 전도성 고분자는 섬유표면에 코팅을 진행하기 위해 섬유를 전도성 고분자 단량체 용액에 개시제와 함께 넣으며, 이때 전도성 고분자의 단량체량을 농도로 계산한 것이다.
또한, 상기 전도성 고분자가 코팅된 폴리에스테르계 고분자 섬유는 50nm 내지 150nm 두께의 전도성 고분자를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 전도성 고분자가 코팅된 폴리에스테르계 고분자 섬유는 50nm 내지 80nm, 80nm 내지 120nm 또는 120nm 내지 150nm 두께의 전도성 고분자를 포함할 수 있다. 상기와 같은 두께의 전도성 고분자를 포함함으로써 우수한 전도도를 나타낼 수 있다.
하나의 예로서, 전도성 고분자로 코팅된 폴리에스테르계 고분자 섬유가 일방향으로 배향되어 고분자 섬유 다발을 형성하는 단계는,
5개 이상의 폴리에스테르계 고분자 섬유를 평행한 방향으로 배열하여 섬유 패턴과 평행한 방향으로 말아서 제조할 수 있다.
구체적으로, 10개 이상, 10 내지 30개 또는 10 내지 20개의 전도성 고분자가 코팅된 폴리에스테르계 고분자 섬유를 평행한 방향으로 배열하여 섬유 패턴과 평행한 방향으로 말아서 고분자 섬유 다발을 형성할 수 있다.
하나의 예로서, 형성된 고분자 섬유 다발을 생분해성 고분자를 포함하는 용액에 침지하여 원기둥 형태의 지지체를 제조하는 단계는, 10 내지 400 nm의 자외선을 2 내지 10 분 동안 조사하여 수행할 수 있다.
구체적으로, 형성된 고분자 섬유 다발을 생분해성 고분자를 포함하는 용액에 침지하여 원기둥 형태의 지지체를 제조하는 단계는 10 내지 400 nm의 자외선을 3 내지 8 분, 4 내지 7 분 또는 4 내지 6 분 동안 조사하여 수행할 수 있다. 보다 구체적으로, 10 내지 400 nm의 자외선을 5 분 동안 조사하여 수행할 수 있다.
하나의 예로서, 원기둥 형태의 지지체는 폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌이민, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리(카프로락톤), 폴리에틸렌옥사이드 및 젤라틴으로 이루어진 군으로부터 선택된 2종 이상의 생분해성 고분자를 포함하는 용액으로 제조될 수 있다. 구체적으로, 원기둥 형태의 지지체는 폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌이민, 폴리락트산 및 폴리글리콜산으로 이루어진 군으로부터 선택된 2종 이상의 생분해성 고분자로 제조될 수 있다. 보다 구체적으로, 폴리에틸렌글리콜 및 폴리에틸렌이민을 포함하는 생분해성 고분자로 제조될 수 있다.
구체적으로, 폴리에스테르계 고분자 섬유 다발을 원통형 시린지(syringe)에 넣고 생분해성 고분자 및 광개시제를 포함하는 용액을 부어 생분해성 고분자 지지체를 제조할 수 있다.
예를 들어, 생분해성 고분자의 함량은 전체 용액을 기준으로 40 내지 50중량%일 수 있다. 구체적으로, 생분해성 고분자의 함량은 전체 용액을 기준으로 40 내지 45중량%, 45 내지 50중량% 또는 42 내지 47중량%일 수 있다. 또한, 상기 광개시제는 2-히드록시-2메틸프로피오페논(HOMPP) 또는 2,2-디메톡시-2-페닐아세토페논(DMPA)일 수 있으며, 구체적으로 광개시제는 2-히드록시-2메틸프로피오페논(HOMPP)일 수 있다.
하나의 예로서, 생분해성 고분자를 포함하는 원통형 지지체 내에서 폴리에스테르계 고분자 섬유를 제거하는 단계는 유기용매를 이용하며, 상기 유기용매는 클로로포름, 테트라하이드로퓨란 및 n-헥산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있다.
구체적으로, 제조된 폴리에스테르계 고분자 섬유 다발을 포함하는 생분해성 고분자 지지체에 유기용매를 부어 폴리에스테르계 고분자를 제거할 수 있다. 예를 들어, 유기용매는 클로로포름, 테트라하이드로퓨란 및 n-헥산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있으며, 구체적으로 유기용매는 클로로포름 또는 테트라하이드로퓨란일 수 있다.
아울러, 본 발명은,
본 발명에 따른 신경 스캐폴드를 이용한 세포 성장 확인 방법을 제공한다.
하나의 예로서, 상기 신경 스캐폴드는 수평방향의 단면이 원을 형성하는 원기둥 형상이고 생분해성 고분자로 형성된 지지체; 및 상기 지지체 내에 수직방향으로 배향성을 갖고 다수개 형성되며 전도성 고분자로 형성된 중공구조의 도관을 포함하고, 상기 도관은, 상기 지지체의 수평방향 형상을 기준으로 나선형을 이루면서 연속 또는 불연속적으로 배열된 구조일 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 세포 성장 확인 방법은 세포의 증식 및 분화 양상을 확인하려는 신경 세포가 함유된 배지에 신경 스캐폴드를 넣고 3 내지 5일 배양하여 신경 세포를 성장시킬 수 있다. 보다 구체적으로, 신경세포가 함유된 배지에 1시간 내지 2시간 배양하고, 배지를 더 추가하여 3 내지 5일 배양하여 신경세포를 성장시켜 확인할 수 있다.
또한, 성장시킨 세포(예를 들어, 신경세포)의 증식 및 분화 양상을 확인하기 위해, 염색을 수행할 수 있다. 구체적으로, 세포가 성장된 신경 스캐폴드를 배지로 여러 번 씻어낸 뒤 염색약을 넣고 1분 내지 5분 동안 암실에 보관하여 염색 과정을 수행할 수 있다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 신경 스캐폴드를 대상으로 신경세포(PC12 세포)를 배양하여 신경세포의 증식 및 분화 양상을 확인할 수 있다. 배양된 신경세포는 신경 스캐폴드 내부에 형성된 도관을 따라 성장할 수 있다.
이하 본 발명에 따르는 실시예 등을 통해 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1
18mm*18mm 슬라이드 글라스를 감싼 알루미늄 호일 위에 전기방사 기술을 통해 폴리카프로락톤(PCL ; poly(caprolactone) 나노 및 마이크로 섬유를 평행하게 뽑아냈다. 이 때 전기방사에는 2,2,2-트리플루오로에틸렌(분자량: 100.04 g/mol)을 15중량%로 녹여낸 용액을 사용하였다. 내부 도관의 직경을 다양하게 하기 위해 전기 방사에 사용되는 용액의 농도 및 전기 방사시 시린지 펌프의 속도, 전압 등은 조절할 수 있으며, 일정 농도 범위를 벗어나면 전기방사가 되지 않고 전압은 일정범위 이상의 전압을 가할 경우 섬유가 잘 뽑히지 않는다.
이를 통해 제작된 폴리카프로락톤 섬유를 알루미늄 호일에서 떼내어 염화나트륨 및 피롤이 함께 용해된 용액에 담근 후 8시간에서 24시간 4C 온도를 유지하는 냉장고에 넣고 반응시켰다. 이후 반응 시간이 종료되면 염화나트륨 및 피롤 용액으로부터 폴리피롤이 코팅된 폴리카프로락톤 섬유를 꺼내 물로 3회 씻은 뒤 건조시켰다.
이를 면도날로 4분의 1의 면적으로 잘라낸 뒤 각각의 잘린 폴리카프로락톤 섬유를 평행한 방향으로 포개어놓고 섬유 패턴과 평행한 방향으로 말아서 짧게 잘라낸 소형 플라스틱 시린지 (1mL)에 넣고 폴리에틸렌글리콜 디아크릴레이트 (poly(ethylene-glycol diacrylate) 5mL, 증류수 5mL, 폴리에틸렌이민 (poly(ethylene imine) 0.1g 및 광개시제로 사용되는 HOMPP 50uL를 섞은 용액을 부어 감겨있는 폴리카프로락톤 섬유 사이에 잘 스며들도록 했다. 직후에 UV를 300초 조사한 뒤 이를 꺼내어 증류수에 넣어 잔여물을 제거하여 원기둥 지지체(폴리카프로락톤 섬유 포함)을 제조하였다. 이로써 제작된 원기둥 지지체(폴리카프로락톤 섬유 포함) 위에 클로로포름을 200 내지 500uL 부어 폴리카프로락톤 섬유를 녹여냄으로써 원기둥 지지체 내부에 표면이 폴리피롤로 코팅된 도관이 형성된 신경 스캐폴드를 제조하였다.
실험예 1
본 발명에 따른 신경 스캐폴드의 형태를 알아보기 위해, 실시예 1에서 제조된 신경 스캐폴드를 대상으로 주사전자현미경(Scanning Electronic Microscope, SEM) 촬영을 진행하였으며, 그 결과는 도 3 내지 도 5에 나타내었다.
도 3은 실시예 1에서 폴리카프로락톤 고분자로 제조한 고분자 섬유를 주사전자현미경으로 촬영한 이미지이다. 도 3을 살펴보면, 폴리에스테르계 수지 섬유가 폴리에틸렌글리콜 지지체 내에 담지된 것으로, 구체적으로 폴리에틸렌글리콜 지지체 내부에 폴리카프로락톤 섬유가 수직으로 담지되어 고정되어있는 것을 확인하였다.
또한, 도 4는 실시예 1에서 폴리피롤이 코팅된 폴리카프로락톤 고분자 섬유가 내부에 형성된 원기둥 형태의 폴리에틸렌글리콜 지지체를 수평방향으로 절단한 단면을 주사전자현미경으로 촬영한 이미지이다. 도 4를 살펴보면, 생분해성 고분자 스캐폴드 내부에 전도성 고분자가 코팅된 폴리에스테르계 고부자 섬유가 수직으로 담지된 것으로, 구체적으로 폴리에틸렌글리콜 지지체 내부에 원형의 폴리카프로락톤 고분자 섬유가 수직으로 담지된 모습을 확인하였다.
이와 더불어, 도 5는 실시예 1에서 제조된 신경 스캐폴드의 단면(수평방향)을 주사전자현미경으로 촬영한 이미지이다. 도 5를 살펴보면, 폴리에틸렌글리콜 지지체 내부에 중공 형태의 도관이 형성된 것을 알 수 있다.
10: 신경 스캐폴드
11: 원기둥 형태의 지지체
12: 전도성 고분자가 형성된 도관
20:PC12 세포

Claims (14)

  1. 삭제
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  5. 삭제
  6. 전도성 고분자로 코팅된 폴리에스테르계 고분자 섬유가 일방향으로 배향되어 고분자 섬유 다발을 형성하는 단계;
    형성된 고분자 섬유 다발을 생분해성 고분자를 포함하는 용액에 침지하여 원기둥 형태의 지지체를 제조하는 단계; 및
    상기 제조된 원기둥 형태의 지지체를 유기용매에 담지하는 단계를 포함하는 신경 스캐폴드의 제조방법.
  7. 제6항에 있어서,
    생분해성 고분자는 폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌이민, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리(카프로락톤), 폴리에틸렌옥사이드 및 젤라틴으로 이루어진 군으로부터 선택된 2종 이상인 것을 특징으로 하는 신경 스캐폴드의 제조방법.
  8. 제6항에 있어서,
    폴리에스테르계 고분자 섬유는 폴리카프로락톤, 폴리락트산 및 폴리락틱코카프로락톤으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 신경 스캐폴드의 제조방법.
  9. 제6항에 있어서,
    전도성 고분자는 폴리피롤, 폴리아닐린, 폴리티오펜, 폴리 p-페닐렌, 폴리p-페닐렌설파이드 및 폴리에틸렌디옥시티오펜으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 신경 스캐폴드의 제조방법.
  10. 제6항에 있어서,
    전도성 고분자로 코팅된 폴리에스테르계 고분자 섬유는,
    폴리에스테르계 고분자 수지를 전기방사하여 제조하며,
    전기방사로 제조된 폴리에스테르계 고분자 섬유를 전도성 고분자를 포함하는 용액에 8시간 이상 담지하여 제조하는 것을 특징으로 하는 신경 스캐폴드의 제조방법.
  11. 제6항에 있어서,
    전도성 고분자로 코팅된 폴리에스테르계 고분자 섬유가 일방향으로 배향되어 고분자 섬유 다발을 형성하는 단계는,
    5개 이상의 폴리에스테르계 고분자 섬유를 평행한 방향으로 배열하여 섬유 패턴과 평행한 방향으로 말아서 제조하는 것을 특징으로 하는 신경 스캐폴드의 제조방법.
  12. 제11항에 있어서,
    형성된 고분자 섬유 다발을 생분해성 고분자를 포함하는 용액에 침지하여 원기둥 형태의 지지체를 제조하는 단계는,
    10 내지 400 nm의 자외선을 2 내지 10 분 동안 조사하는 것을 특징으로 하는 신경 스캐폴드의 제조방법.
  13. 제6항에 있어서,
    생분해성 고분자를 포함하는 원통형 지지체 내에서 폴리에스테르계 고분자 섬유를 제거하는 단계는 유기용매를 이용하며,
    상기 유기용매는 클로로포름, 테트라하이드로퓨란 및 n-헥산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 신경 스캐폴드의 제조방법.
  14. 삭제
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