KR102020031B1

KR102020031B1 - Tcf7l2를 유효성분으로 함유하는 비알코올성 지방간의 예방 또는 치료용 약학 조성물

Info

Publication number: KR102020031B1
Application number: KR1020190029866A
Authority: KR
Inventors: 오경진; 배광희; 김원곤; 이다솜; 이상철; 이은우; 한백수
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2019-03-15
Filing date: 2019-03-15
Publication date: 2019-09-09
Also published as: WO2020189970A1

Abstract

본 발명은 TCF7L2 단백질 또는 유전자를 유효성분으로 함유하는 고탄수화물 식이에 의해 유발된 비알코올성 지방간의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 간 조직 특이적으로 TCF7L2가 결손된 동물모델은 고탄수화물 식이에 의해 유도된 지방 생합성을 통해 지방간을 촉진하고, 고탄수화물 식이 유사조건에서 TCF7L2가 과발현된 경우 증가된 지방 생합성 관련 유전자의 발현이 감소되었다. 그러나 고지방 식이에 의해 유도된 지방간에서는 TCF7L2의 발현 조절에 따른 효과의 변화가 거의 없으므로, 본 발명의 TCF7L2 단백질 또는 유전자를 유효성분으로 함유하는 조성물은 고탄수화물 식이 및 고탄수화물 식이에 의한 지방 생합성에 의해 유발된 비알코올성 지방간의 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

TCF7L2를 유효성분으로 함유하는 비알코올성 지방간의 예방 또는 치료용 약학 조성물{Pharmaceutical composition for prevention and treatment of non-alcoholic fatty liver disease comprising transcription factor 7-like 2 as effective component}

본 발명은 TCF7L2 단백질 또는 유전자를 유효성분으로 함유하는 고탄수화물 식이에 의해 유발된 비알코올성 지방간의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

지방간은 간세포 속에 지방이 축적된 상태를 말하며, 정상 간은 지방이 차지하는 비율은 5% 정도인데, 이보다 많은 지방이 축적된 상태를 지방간이라고 한다. 지방간이 악화되어 간세포 속의 지방 덩어리가 커지면 핵을 포함한 세포의 중요한 구성성분이 한쪽으로 밀려 간세포의 기능이 저하되며, 세포 내에 축적된 지방으로 인하여 팽창된 간세포들이 간세포 사이에 있는 미세 혈관과 임파선을 압박하여 간 내의 혈액과 임파액의 순환에 장애가 생기게 된다. 이렇게 되면 간세포는 산소와 영양공급을 적절히 받을 수 없어 간기능이 저하된다.

지방간은 알코올성 지방간과 비알코올성 지방간으로 나눌 수 있다. 알코올성 지방간은 술이 원인이다. 술을 많이 마실수록 잘 발생하며, 지속적으로 술을 섭취하면 간에서 알코올을 대사하는 능력이 떨어져 지방간 발생이 더 심해진다. 또 영양상태가 나쁜 경우에도 잘 발생한다. 알코올성 지방간 중 일부는 알코올성 간염과 간경변으로 진행되어 사망할 수 있다.

비알코올성 지방간은 술 또는 바이러스 감염과 상관없이 간 내 지방축적이 증가한 경우로(간세포의 5% 초과), 간에서 지방 합성 증가 및 배출의 문제로 발생한다. 유리지방산(fatty acid)의 투입(input)과 배출(output)의 불균형에 의해 유발되는 비알코올성 지방간 환자의 약 59%는 외부로부터 유리지방산의 흡수 증가에 의해 발생하고, 약 26% 환자는 간 내 지방 생합성의 증가에 따른 유리지방산의 투입(input) 증가를 원인으로 유발되는 것으로 알려져 있다.

지방간은 병의 원인과 심각성이 밝혀졌고, 식이 조절과 운동을 통하여 증상을 개선해야 하지만, 지방간 환자가 이를 실천하지 못하는 경우가 많다. 따라서 효과적인 지방간 치료 약물의 개발 필요성이 요구되고 있다.

한편, TCF7L2(Transcription factor 7-like 2)는 다른 유전자를 통제하는 전사인자(transcription factor)로, 세포의 발달-성장을 규제하는 핵심 메커니즘인 Wnt 신호전달경로를 조절하는 것으로 알려져 있다. TCF7L2 유전자 두 쌍 중 하나가 변이되면 제2형 당뇨병 발병 가능성이 40% 높아진다.

한편, 비알코올성 지방간과 관련된 선행기술로는 한국등록특허 제1856448호에 견사단백질을 갖는 누에를 함유하는 비알코올성 간염의 예방 또는 치료용 조성물이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1727506호에 GDF15 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 지방간의 예방 또는 치료용 약학적 조성물이 개시되어 있지만, 본 발명의 TCF7L2 단백질 또는 유전자를 유효성분으로 함유하는 고탄수화물 식이에 의해 유발된 비알코올성 지방간의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관해 개시된 바 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로, 간 조직 특이적으로 TCF7L2의 발현이 억제된 동물모델에서 비알코올성 지방간을 유발할 수 있는 2가지 주요 요인을 재현하는 식이 조건을 실시하여, 간 내 지방산을 주입하는 고지방식이 또는 간 내 지방 생합성을 유도하는 탄수화물 식이 유사 조건인 재섭식에 따른 지방간 유도 조건에서 간 조직 내의 유전자 발현 정도를 확인하였고, 재섭식 및 탄수화물 식이 유사조건에서 TCF7L2의 과발현 시 해당과정 및 지방 생합성 관련 유전자의 발현을 확인하였고, 고탄수화물 재섭식 조건에서 TCF7L2의 결손 및 복구에 따른 지방 생합성 관련 유전자의 발현을 확인하였으며, TCF7L2의 결손이 만성적 고탄수화물 식이 조건 특이적으로 지방간의 생성을 더욱 촉진시키는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 TCF7L2 단백질 또는 상기 TCF7L2 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 유효성분으로 함유하는 고탄수화물 식이에 의해 유도되는 비알코올성 지방간의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 TCF7L2 단백질 또는 상기 TCF7L2 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 인간을 제외한 동물에게 투여하여 고탄수화물 식이에 의해 유도되는 간 내 지방 생합성을 억제시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 TCF7L2 단백질 또는 유전자를 유효성분으로 함유하는 고탄수화물 식이에 의해 유발된 비알코올성 지방간의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 간 조직 특이적으로 TCF7L2가 결손된 동물모델은 고탄수화물 식이를 통해 유도된 지방간을 촉진하고, 고탄수화물 식이 유사조건에서 TCF7L2가 과발현된 경우 증가된 지방 생합성 관련 유전자의 발현이 감소되었다. 그러나 고지방 식이에 의해 유도된 지방간에서는 TCF7L2의 발현 조절에 따른 효과의 변화가 거의 없었다.

한국을 포함하는 동양인의 탄수화물 과량 섭취는 비알코올성 지방간 유발과 밀접한 관련성을 갖고 있으며, 고탄수화물 식이는 간 내 지방 생합성 증가에 따른 지방간 유발을 조절할 수 있으므로, 본 발명의 TCF7L2 단백질 또는 유전자는 고탄수화물 식이에 의해 유발된 비알코올성 지방간의 치료제로 사용될 수 있다.

도 1은 22주 동안 고탄수화물 식이한 동물모델의 간 내 TCF7L2 및 지방합성효소(FAS 및 ACC)의 단백질 발현량을 확인한 결과이다.
도 2는 간 특이적 TCF7L2 결손 마우스의 간 조직에서 지질 대사(lipid metabolism) 및 당 대사(glucose metabolism) 관련 유전자의 발현을 스크리닝한 결과이다. HFD는 고지방 식이 군이고, Refed는 금식 후 24시간 동안 재섭식한 군이다. 고지방 식이는 유리지방산을 흡수하는 조건이고, 재섭식은 지방 생합성을 유도하는 탄수화물 식이 조건이다. 스크리닝 결과는 간 특이적 TCF7L2 결손 마우스(TCF7L2 LKO)에서 측정된 값을 TCF7L2가 정상적으로 발현되는 마우스(TCF7L2 WT)에서 측정된 값으로 나눈 결과로 표시하였다.
도 3은 간 특이적 TCF7L2 결손 마우스(TCF7L2 LKO)의 간 조직에서, 자유 식이, 금식, 금식 후 6시간 동안 재섭식 및 금식 후 24시간 동안 재섭식에 따른 지방 생합성(해당과정+지방합성과정) 관련 유전자(GLUT2, GK. LPK, Acly, ACC, FAS 및 DGAT1) 발현 정도를 확인한 결과이다. TCF7L2 WT은 TCF7L2가 정상적으로 발현되는 마우스이다.
도 4는 고탄수화물 식이로 재섭식시킨 간 특이적 TCF7L2 결손 마우스(TCF7L2 LKO)의 간 조직에서 지방 생합성(해당과정+지방합성과정) 촉진효과를 확인한 결과이다. TCF7L2 WT은 TCF7L2가 정상적으로 발현되는 마우스이다.
도 5는 간 내 TCF7L2 결손에 따른 일반 식이 재섭식(A) 및 고탄수화물 식이 재섭식 조건(B)에서의 혈중 인슐린 및 글루코오스 함량을 확인한 결과이다.
도 6은 고탄수화물 재섭식(HCR)에 의해 TCF7L2 간 내 결손 및 복구에 따른 지방합성효소(SREBP1, ChREBP, ACC, FAS) 단백질 발현을 확인한 결과이다. Ad-TCF7L2는 TCF7L2를 발현하는 아데노 바이러스 벡터이고, Ad-GFP는 TCF7L2를 발현하지 않는 아데노 바이러스 벡터이다. TCF7L2 WT은 TCF7L2가 정상적으로 발현되는 마우스이고, TCF7L2 LKO는 간 특이적 TCF7L2 결손 마우스이다.
도 7은 고탄수화물 재섭식 조건에서 TCF7L2 간 내 결손 및 복구에 따른 지방 생합성 관련 유전자(GK. LPK, ACC, FAS, SCD1 및 DGAT2)의 발현을 확인한 결과이다. TCF7L2 WT-GFP는 TCF7L2가 정상적으로 발현되는 마우스에 TCF7L2를 발현하지 않는 아데노 바이러스를 주입한 대조군이고, TCF7L2 LKO-GFP는 간 조직 특이적으로 TCF7L2의 발현이 결손된 마우스에 TCF7L2를 발현하지 않는 아데노 바이러스를 주입한 군이며, TCF7L2 LKO-TCF7L2는 간 조직 특이적으로 TCF7L2의 발현이 결손된 마우스에 TCF7L2를 발현하는 아데노 바이러스를 주입하여 TCF7L2의 발현을 복구시킨 군이다.
도 8은 TCF7L2 발현 조절에 따른 지방간 유도 및 제어 효과를 확인한 결과이다. (A)는 TCF7L2 발현 조절에 따른 자유식이, 금식 및 재섭식에 의한 간에서의 TG 함량을 확인한 결과이고, (B)는 TCF7L2 발현 조절에 따른 금식, 재섭식 및 고탄수화물 재섭식에 의한 간에서의 TG 함량을 확인한 결과이고, (C)는 일차 간 세포주에서 TCF7L2 발현 조절에 따른 지방 생합성의 결과로써 TG 함량을 확인한 결과이며, (D)는 TCF7L2 발현 조절에 따른 금식 및 고탄수화물 재섭식에 의한 간에서의 TG 함량을 확인한 결과이다. TCF7L2 WT은 TCF7L2가 정상적으로 발현되는 마우스이고, TCF7L2 LKO는 간 특이적 TCF7L2 결손 마우스이다. TCF7L2 WT-GFP는 TCF7L2가 정상적으로 발현되는 마우스에 TCF7L2를 발현하지 않는 아데노 바이러스를 주입한 대조군이고, TCF7L2 LKO-GFP는 간 조직 특이적으로 TCF7L2의 발현이 결손된 마우스에 TCF7L2를 발현하지 않는 아데노 바이러스를 주입한 군이며, TCF7L2 LKO-TCF7L2는 간 조직 특이적으로 TCF7L2의 발현이 결손된 마우스에 TCF7L2를 발현하는 아데노 바이러스를 주입하여 TCF7L2의 발현을 복구시킨 군이다.
도 9는 탄수화물에 의한 지방 생합성을 유도하는 주요 물질인 글루코오스 및 인슐린을 처리한 상황에서, TCF7L2 과발현에 의한 지방 생합성에 따른 TG 함량 변화(A) 및 TCF7L2 과발현에 의한 지방 생합성 관련 유전자 발현(B)을 확인한 결과이다. Ad-GFP는 TCF7L2를 발현하지 않는 아데노 바이러스 처리군이고, Ad-TCF7L2는 TCF7L2를 발현하는 아데노 바이러스 처리군이다.
도 10은 외부로부터 유리지방산을 흡수하는 고지방 식이 조건에서, TCF7L2의 간 내 결손(TCF7L2 LKO)(A) 또는 TCF7L2의 과발현(Ad-TCF7L2)(B)에 의한 간 내 TG 함량을 확인한 결과이다. TCF7L2 WT은 TCF7L2가 정상적으로 발현되는 마우스이고, TCF7L2 LKO는 간 특이적 TCF7L2 결손 마우스이다. Ad-GFP는 TCF7L2를 발현하지 않는 아데노 바이러스를 주입한 군이고, Ad-TCF7L2는 TCF7L2를 발현하는 아데노 바이러스 주입하여 TCF7L2의 발현을 복구시킨 군이다.
도 11은 22주 동안 고탄수화물 식이(HCD) 및 고지방 식이(HFD)한 마우스 간에서 TCF7L2 결손에 따른 지방간 유도 효과를 지방 염색으로 확인한 결과(A) 및 간 내 TG 함량을 확인한 결과(B)이다.

본 발명은 TCF7L2 단백질 또는 상기 TCF7L2 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 유효성분으로 함유하는 고탄수화물 식이에 의해 유도되는 비알코올성 지방간의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

상기 TCF7L2 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것이지만, 이에 한정하는 것은 아니다.

본 발명에 따른 TCF7L2 단백질의 범위는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 고탄수화물 식이에 의해 유도되는 비알코올성 지방간의 예방 또는 치료 활성을 의미한다.

상기 TCF7L2 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터는 재조합 바이러스 벡터, 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터 또는 박테리오파아지 벡터일 수 있으며, 바람직하게는 재조합 바이러스 벡터인 것이지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 재조합 바이러스는 아데노 바이러스, 아데노 부속 바이러스(adeno-associated virus), 레트로 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 및 렌티바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 바람직하게는 아데노 바이러스인 것이지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 TCF7L2 단백질 또는 상기 TCF7L2 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 간에서 지방 생합성을 억제하는 효과가 있다.

본 발명의 약학 조성물은 상기 TCF7L2 단백질 또는 상기 TCF7L2 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한, 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화 하여 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose) 또는 락토오스(Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(Witepsol), 마크로골, 트윈(Tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.

본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분의 농도는 치료 목적, 환자의 상태, 필요기간 등을 고려하여 결정할 수 있으며, 특정 범위의 농도로 한정되지 않는다.

또한, 본 발명은 TCF7L2 단백질 또는 상기 TCF7L2 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 인간을 제외한 동물에게 투여하여 고탄수화물 식이에 의해 유도되는 간 내 지방 생합성을 억제시키는 방법에 관한 것이다.

이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.

실시예 1. 고탄수화물 식이 마우스의 간 조직에서 TCF7L2의 발현 변화

8주령 C557BL/6 수컷 마우스에 22주 동안 고탄수화물 식이(70%(w/w) carbohydrate, TD.98090) 또는 일반 식이(Teklad gloval 18% protein, 2018S)를 진행한 후, 간 조직 내 TCF7L2의 발현 및 핵심 지방합성 효소인 FAS 및 ACC의 단백질 발현량을 웨스턴 블랏을 이용하여 확인하였다.

그 결과, 도 1에 개시된 바와 같이 일반 식이 군(NCD)에 비해 22주 동안 만성적으로 고탄수화물 식이한 군(HCD)에서 TCF7L2의 발현이 감소하였고, 지방합성 효소인 FAS 및 ACC는 발현이 증가되었다. 이를 통해 고탄수화물에 의해 지방간이 유도될 때, TCF7L2의 발현이 감소한다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 2. 간 특이적 TCF7L2 결손 마우스의 확립

Cre-LoxP 시스템을 이용하여 간 특이적으로 TCF7L2의 발현이 결손된 C57BL/6 마우스(이하, TCF7L2 LKO라 칭함)를 제작하였다.

간에서 특이적으로 활성화되는 알부민 프로모터 유전자 이후에 cre 유전자를 가지는 cre 마우스와 TCF7L2 유전자 전, 후로 loxP 유전자를 가지는 loxP 마우스를 교배하여, 간 조직 특이적으로 발현된 cre 단백질에 의해 loxP 유전자 부분이 절단되어 간 특이적으로 TCF7L2가 결손된 마우스를 확립하였다.

대조군으로는 cre 마우스와 loxP 마우스를 교배하였지만, cre 유전자를 발현하지 않아 TCF7L2가 정상적으로 발현하는 C57BL/6 마우스(이하, TCF7L2 WT이라 칭함)를 사용하였다.

실시예 3. 간 특이적 TCF7L2 결손 마우스의 간 조직에서 지질 대사( lipid metabolism) 및 당 대사( glucose metabolism ) 관련 유전자의 발현 스크리닝

상기 실시예 2에서 확립된 간 특이적 TCF7L2 결손 마우스를 이용하여, 식이에 따른 간 조직에서의 지질 대사 및 당 대사 변화를 확인하기 위해, 지질 대사 및 당 대사 관련 유전자의 발현을 RNA 서열분석(RNA-seq)을 이용하여 스크리닝하였다.

유전자 발현 변화량은 TCF7L2 WT 대비 TCF7L2 LKO의 발현량 변화로 나타냈으며, 그 결과, 도 2에 개시된 바와 같이 고지방 식이(60% fat, D1249) 및 24시간 동안 단식 후 24시간 동안 재섭식시킨 그룹(탄수화물 식이 조건, Teklad gloval 18% protein, 2018S)에서 지질 대사 및 당 대사 관련 유전자의 발현이 증가하였으며, 특히 24시간 동안 단식 후 재섭식시킨 탄수화물 식이 조건에서 지질 대사 및 당 대사 관련 유전자의 발현이 현저히 증가되어 있었다.

실시예 4. 재섭식에 따른 간 특이적 TCF7L2 결손 마우스 간 조직 내 지방 생합성 관련 유전자 발현

실시예 3에서 지질 대사 및 당 대사관련 유전자의 발현 증가가 가장 컸던 탄수화물 식이 조건에서 지방 생합성(de novo lipogenesis) 관련 유전자 발현 변화를 확인하였다. 간 조직 내에서 지방 생합성은 해당과정 및 지방합성 과정으로 이루어지므로, 해당과정 및 지방합성 관련 유전자의 발현변화를 통해 간 조직 내 지방 생합성 변화를 확인하였다.

실험 그룹은 10주령의 마우스를 사용하여 자유 식이군(Ad, ad libitum), 금식군(F, fasting), 24시간 동안 금식 후 6시간 동안 재섭식한 군(6(R), 6 refeeding) 및 24시간 동안 금식 후 24시간 동안 재섭식한 군(24(R), 24 refeeding)으로 분류하였다.

그 결과, 도 3에 개시된 바와 같이 TCF7L2 WT에 비해 TCF7L2 LKO 마우스에서 지방 생합성 관련 유전자의 발현이 증가하였으며, 특히 지방 생합성 촉진조건인 24시간 동안 재섭식한 조건(24(R))에서 지방 생합성 관련 유전자인 GLUT2(Glucose transporter 2), GK(Glycerol kinase), LPK(Liver type pyruvate kinase), Acly(ATP citrate lyase), ACC(Acetyl-CoA carboxylase), FAS(Fatty acid synthase) 및 GPAT1(Glycerol-3-phosphate acyltransferase 1)의 발현이 TCF7L2 LKO 마우스에서 TCF7L2 WT에 비해 모두 현저히 증가하였다.

실시예 5. 고탄수화물 재섭식에 따른 간 특이적 TCF7L2 결손 마우스 간 조직 내 지방 생합성 관련 유전자 발현

실시예 4에서 탄수화물 식이 조건인 재섭식에 따라 지방 생합성 관련 유전자의 발현이 증가하였으므로, 고탄수화물 식이에 의한 지방 생합성 관련 유전자의 발현 증가가 더욱 촉진되는지 확인하기 위해 고탄수화물 재섭식을 통해 실험을 진행하였다.

실험 그룹은 10주령의 마우스르 사용하여 금식군(F, fasting), 24시간 동안 금식 후 24시간 동안 재섭식한 군(refeeding, Teklad gloval 18% protein, 2018S) 및 24시간 동안 금식 후 24시간 동안 고탄수화물 식이(70% carbohydrate, TD. 98090)를 재섭식한 군(HCR, High-carbohydrate refeeding)으로 분류하였다.

그 결과, 도 4에 개시된 바와 같이 TCF7L2 WT에 비해 TCF7L2 LKO 마우스에서 지방 생합성 관련 유전자의 발현이 증가하였으며, 특히 고탄수화물 재섭식 군에서 유전자의 증가량이 현저하였다.

이를 통해 TCF7L2 LKO 마우스는 TCF7L2 WT에 비해 고탄수화물 식이에 의해 간에서의 지방 생합성이 현저히 증가된다는 것을 확인하였다.

실시예 6. 재섭식에 따른 간 특이적 TCF7L2 결손 마우스의 혈중 글루코오스 및 인슐린 농도 변화

재섭식에 따른 간 특이적 TCF7L2 결손 마우스의 혈중 글루코오스 및 인슐린 농도 변화를 측정하였다.

그 결과, 도 5A에 개시된 바와 같이 자유 식이, 금식, 6시간 재섭식군에서는 혈중 글루코오스 및 인슐린 농도가 TCF7L2 WT과 비교하여 TCF7L2 LKO 마우스에서 변화가 거의 없었으나, 24시간 동안 재섭식한 군에서는 TCF7L2 WT에 비해 TCF7L2 LKO 마우스에서 혈중 글루코오스 및 인슐린 농도가 증가되어 있었다.

또한, 고탄수화물 재섭식에 따른 간 특이적 TCF7L2 결손 마우스의 혈중 글루코오스 및 인슐린 농도 변화를 측정하기 위해, 실험 그룹을 금식군(F, fasting), 24시간 동안 금식 후 24시간 동안 재섭식한 군(refeeding, Teklad gloval 18% protein, 2018S) 및 24시간 동안 금식 후 24시간 동안 고탄수화물 식이(70% carbohydrate, TD. 98090)를 재섭식한 군(HCR, High-carbohydrate refeeding)으로 분류하여 실험을 진행하였으며, 고탄수화물 식이를 재섭식한 실험에서는 도 5B에 개시된 바와 같이 고탄수화물을 재섭식 하였을 때, 혈중 글루코오스 농도의 변화는 미미하지만 혈중 인슐린 농도가 급격히 증가하는 것을 확인하였고, 혈중 글루코오스 농도를 일정 수준 유지하기 위해 혈중 인슐린 농도를 증가시켰다는 것을 알 수 있었다.

실시예 7. 간 특이적 TCF7L2 결손 및 복구에 따른 지방 생합성 관련 단백질의 변화

고탄수화물 식이 조건하에, 간 특이적 TCF7L2 결손에 의해 증가된 지방 생합성 유전자의 발현이 TCF7L2에 의해 나타나는 것인지 확인하기 위해 TCF7L2를 발현하는 GFP가 표지된 아데노 바이러스(Ad-TCF7L2)를 TCF7L2 LKO 마우스 꼬리 정맥에 주입(tail vein injection)한 후, 주입 5일 후에 간 조직을 적출하여 지방 생합성 관련 단백질의 변화를 확인하였다. 대조군으로는 TCF7L2 유전자 없이 GFP만 표지된 아데노 바이러스(Ad-GFP)를 동일 방법으로 주입하여 사용하였다.

그 결과, 도 6에 개시된 바와 같이 TCF7L2 LKO 마우스에서 결손되었던 TCF7L2 단백질이 Ad-TCF7L2 주입 5일 후 정상적으로 복구되는 것을 확인하였으며, TCF7L2의 결손에 의해 증가되었던 지방 생합성효소 단백질인 pSREBP1, nSREBP1, ChREBP, ACC 및 FAS의 발현이 TCF7L2의 발현이 복구된 이후 감소하는 것을 확인하였다.

이를 통해 고탄수화물 식이에 의해 나타나는 간에서의 지방 생합성은 TCF7L2에 의해 조절된다는 것을 확인하였다.

실시예 8. 간 특이적 TCF7L2 결손 및 복구에 따른 지방 생합성 관련 유전자의 변화

고탄수화물 재섭식(HCR, high-carbohydrate refeeding) 조건하에서, 간 특이적 TCF7L2 발현의 결손 및 복구에 따른 지방 생합성 관련 유전자의 발현 변화를 확인하였다.

그 결과, 도 7에 개시된 바와 같이 고탄수화물 재섭식 조건에서, TCF7L2의 결손(TCF7L2 LKO-GFP)에 의해 증가되었던 지방 생합성 관련 유전자인 GK, LPK, ACC, FAS, SCD1 및 DGAT2의 발현이 TCF7L2의 발현을 복구(TCF7L2 LKO-TCF7L2)시킨 후 감소되어 TCF7L2 WT(TCF7L2 WT-GFP)과 유사한 정도로 회복되는 것을 확인하였다.

실시예 9. TCF7L2 발현 조절에 따른 지방간 유도 및 제어

TCF7L2의 결손 및 발현 복구에 따른 간 내 TG(triglycerides) 함량을 확인하였다.

그 결과, 도 8A 및 8B에 개시된 바와 같이 재섭식 및 고탄수화물 재섭식 조건에서 TCF7L2의 결손에 의해 간 내 TG 함량이 증가하는 것을 확인할 수 있었고, 고탄수화물 재섭식 조건에서 간 내 TG 함량이 더욱 증가하였다.

또한, 간 조직으로부터 일차간세포를 분리하고, 4시간 후 Ad-GFP, Ad-TCF7L2를 감염(infection)시킨 다음, 24시간 후 무혈청 배양액 조건에서 1μCi [¹⁴C] 글루코오스 및 100nM 인슐린을 처리한 후 48시간 동안 반응시킨 후 세포 내 TG 함량을 확인하였다. 글루코오스 및 인슐린은 탄수화물에 의한 지방 생합성을 유도하는 주요 물질이다.

그 결과, 도 8C에 개시된 바와 같이 TCF7L2의 결손에 의해 증가되었던 세포 내 TG 함량은 TCF7L2의 발현을 복구시켰을 때 감소되어 TCF7L2 WT-GFP와 유사한 함량을 나타냈다.

또한, 고탄수화물 식이 조건에서 간 특이적 TCF7L2 결손 마우스에 아데노 바이러스의 꼬리 정맥 주입을 통해 TCF7L2의 발현을 복구시켰을 때, 도 8D에 개시된 바와 같이 증가되었던 간 내 TG 함량이 TCF7L2 WT과 유사한 정도로 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

이를 통해 TCF7L2는 간 내 지방 생합성을 조절하여 지방축적 정도를 조절한다는 것을 확인하였다.

실시예 10. 일차 간세포주 내 TCF7L2 과발현에 따른 지방 생합성 변화

정상 마우스로부터 분리한 일차 간세포주에 탄수화물에 의한 지방 생합성을 유도하는 주요 물질인 글루코오스 및 인슐린을 처리한 상황에서, TCF7L2 과발현에 의한 지방 생합성 및 관련 유전자 발현을 확인하였다.

그 결과, 도 9에 개시된 바와 같이 일차 간세포주 내 TCF7L2의 과발현(Ad-TCF7L2)은 탄수화물에 의한 지방 생합성 과정의 주요 물질인 글루코오스 및 인슐린 처리에 의해, TCF7L2를 과발현하지 않는 대조군(Ad-GFP) 대비 지방 생합성을 현저히 감소시키고, 지방 생합성 관련 유전자(GK, LPK, FAS 및 ACC)의 발현도 현저히 감소시키는 것을 확인하였다.

이를 통해 TCF7L2는 탄수화물에 의한 지방 생합성 유도 조건에서 간 내 지방 생합성 및 TG 함량을 감소시키는 역할을 하는 것을 확인하였다.

실시예 11. 고지방 식이에 따른 TCF7L2의 간 내 지방 생합성 조절

외부로부터 유리지방산을 흡수하는 고지방 식이 조건에서, TCF7L2의 간 내 결손(TCF7L2 LKO) 또는 TCF7L2의 과발현(Ad-TCF7L2)에 의한 간 내 TG 함량의 변화를 확인하였다.

그 결과, 도 10A에 개시된 바와 같이 고지방 식이를 12주 동안 섭취한 TCF7L2 LKO 마우스는 TCF7L2 WT 마우스와 비교하여 간 내 TG 함량의 변화가 거의 없었다.

또한, 12주 동안 고지방 식이를 먹인 야생형의 C57BL/6 마우스에 Ad-TCF7L2 또는 Ad-GFP를 꼬리 정맥 주입한 후 5일 뒤 간 조직 내 TG 함량을 분석한 결과도 간 조직 특이적 TCF7L2 결손 마우스와 유사하게 간 내 TG 함량의 변화가 거의 없었다.

이를 통해 TCF7L2는 특이적으로 지방 생합성을 조절하는 고탄수화물 식이에 의해서 간 내 TG 함량을 제어한다는 것을 확인하였다.

실시예 12. 식이에 따른 지방간 유도 조건에서, 간 내 TCF7L2 결손에 따른 지방간 유도 효과

22주 동안 고탄수화물 식이(HCD) 및 고지방 식이(HFD)한 마우스 간에서 TCF7L2 결손에 따른 지방간 유도 효과 및 간 내 TG 함량을 확인하였다.

그 결과, 도 11에 개시된 바와 같이 22주 동안 고탄수화물 식이한 간 조직 특이적 TCF7L2 결손 마우스는 간 내 지방축적이 TCF7L2 WT 마우스와 비교하여 현저히 촉진되었으나, 22주 동안 고지방식이한 마우스는 상기 실시예 11과 유사하게 TCF7L2의 결손에 의한 지방축적의 차이를 확인할 수 없었다.

이를 통해 TCF7L2는 고탄수화물 식이에 의한 간 내 지방축적을 특이적으로 조절한다는 것을 확인하였다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Pharmaceutical composition for prevention and treatment of non-alcoholic fatty liver disease comprising transcription factor 7-like 2 as effective component <130> PN19021 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 598 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Met Pro Gln Leu Asn Gly Gly Gly Gly Asp Asp Leu Gly Ala Asn Asp 1 5 10 15 Glu Leu Ile Ser Phe Lys Asp Glu Gly Glu Gln Glu Glu Lys Asn Ser 20 25 30 Glu Asn Ser Ser Ala Glu Arg Asp Leu Ala Asp Val Lys Ser Ser Leu 35 40 45 Val Asn Glu Ser Glu Thr Asn Gln Asn Ser Ser Ser Asp Ser Glu Ala 50 55 60 Glu Arg Arg Pro Pro Pro Arg Ser Glu Ser Phe Arg Asp Lys Ser Arg 65 70 75 80 Glu Ser Leu Glu Glu Ala Ala Lys Arg Gln Asp Gly Gly Leu Phe Lys 85 90 95 Gly Pro Pro Tyr Pro Gly Tyr Pro Phe Ile Met Ile Pro Asp Leu Thr 100 105 110 Ser Pro Tyr Leu Pro Asn Gly Ser Leu Ser Pro Thr Ala Arg Thr Tyr 115 120 125 Leu Gln Met Lys Trp Pro Leu Leu Asp Val Gln Ala Gly Ser Leu Gln 130 135 140 Ser Arg Gln Thr Leu Lys Asp Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ala His Ile 145 150 155 160 Val Ser Asn Lys Val Pro Val Val Gln His Pro His His Val His Pro 165 170 175 Leu Thr Pro Leu Ile Thr Tyr Ser Asn Glu His Phe Thr Pro Gly Asn 180 185 190 Pro Pro Pro His Leu Pro Ala Asp Val Asp Pro Lys Thr Gly Ile Pro 195 200 205 Arg Pro Pro His Pro Pro Asp Ile Ser Pro Tyr Tyr Pro Leu Ser Pro 210 215 220 Gly Thr Val Gly Gln Ile Pro His Pro Leu Gly Trp Leu Val Pro Gln 225 230 235 240 Gln Gly Gln Pro Val Tyr Pro Ile Thr Thr Gly Gly Phe Arg His Pro 245 250 255 Tyr Pro Thr Ala Leu Thr Val Asn Ala Ser Met Ser Arg Phe Pro Pro 260 265 270 His Met Val Pro Pro His His Thr Leu His Thr Thr Gly Ile Pro His 275 280 285 Pro Ala Ile Val Thr Pro Thr Val Lys Gln Glu Ser Ser Gln Ser Asp 290 295 300 Val Gly Ser Leu His Ser Ser Lys His Gln Asp Ser Lys Lys Glu Glu 305 310 315 320 Glu Lys Lys Lys Pro His Ile Lys Lys Pro Leu Asn Ala Phe Met Leu 325 330 335 Tyr Met Lys Glu Met Arg Ala Lys Val Val Ala Glu Cys Thr Leu Lys 340 345 350 Glu Ser Ala Ala Ile Asn Gln Ile Leu Gly Arg Arg Trp His Ala Leu 355 360 365 Ser Arg Glu Glu Gln Ala Lys Tyr Tyr Glu Leu Ala Arg Lys Glu Arg 370 375 380 Gln Leu His Met Gln Leu Tyr Pro Gly Trp Ser Ala Arg Asp Asn Tyr 385 390 395 400 Gly Lys Lys Lys Lys Arg Lys Arg Asp Lys Gln Pro Gly Glu Thr Asn 405 410 415 Glu His Ser Glu Cys Phe Leu Asn Pro Cys Leu Ser Leu Pro Pro Ile 420 425 430 Thr Asp Leu Ser Ala Pro Lys Lys Cys Arg Ala Arg Phe Gly Leu Asp 435 440 445 Gln Gln Asn Asn Trp Cys Gly Pro Cys Arg Arg Lys Lys Lys Cys Val 450 455 460 Arg Tyr Ile Gln Gly Glu Gly Ser Cys Leu Ser Pro Pro Ser Ser Asp 465 470 475 480 Gly Ser Leu Leu Asp Ser Pro Pro Pro Ser Pro His Leu Leu Gly Ser 485 490 495 Pro Pro Gln Asp Ala Lys Ser Gln Thr Glu Gln Thr Gln Pro Leu Ser 500 505 510 Leu Ser Leu Lys Pro Asp Pro Leu Ala His Leu Ser Met Met Pro Pro 515 520 525 Pro Pro Ala Leu Leu Leu Ala Glu Ala Ala His Gly Lys Ala Ser Ala 530 535 540 Leu Cys Pro Asn Gly Ala Leu Asp Leu Pro Pro Ala Ala Leu Gln Pro 545 550 555 560 Ser Met Val Pro Ser Ser Ser Leu Ala Gln Pro Ser Thr Ser Ser Leu 565 570 575 His Ser His Asn Ser Leu Ala Gly Thr Gln Pro Gln Pro Leu Ser Leu 580 585 590 Val Thr Lys Ser Leu Glu 595

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 TCF7L2 단백질 또는 상기 TCF7L2 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 유효성분으로 함유하는 고탄수화물 식이에 의해 유도되는 비알코올성 지방간의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 TCF7L2 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터는 재조합 바이러스 벡터, 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터 또는 박테리오파아지 벡터인 것을 특징으로 하는 고탄수화물 식이에 의해 유도되는 비알코올성 지방간의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제3항에 있어서, 상기 재조합 바이러스는 아데노 바이러스, 아데노 부속 바이러스(adeno-associated virus), 레트로 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 및 렌티바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 고탄수화물 식이에 의해 유도되는 비알코올성 지방간의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 TCF7L2 단백질 또는 상기 TCF7L2 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 간에서 지방 생합성을 억제하는 것을 특징으로 하는 고탄수화물 식이에 의해 유도되는 비알코올성 지방간의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 TCF7L2 단백질 또는 상기 TCF7L2 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 인간을 제외한 동물에게 투여하여 고탄수화물 식이에 의해 유도되는 간 내 지방 생합성을 억제시키는 방법.