KR102011682B1 - 방사성 세슘 및 방사선에 대한 저항성을 가지는 신규한 엑시구오박테리움 아세틸리쿰 cr1 균주 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 방사성 세슘 및 방사선에 대한 저항성을 가지는 신규한 엑시구오박테리움 아세틸리쿰 CR1 균주 및 상기 CR1 균주에 방사선을 조사하여 제조된 돌연변이 균주에 관한 것이다. 본 발명에 따른 엑시구오박테리움 아세틸리쿰 CR1 균주 및 이의 돌연변이 균주는 방사성 세슘 및 방사선에 대한 저항성을 나타내며 방사성 세슘을 흡착하는 활성을 가지는 바, 방사성 폐기물의 방사성 핵종을 제거하는 제염 분야에서 다양하게 활용할 수 있다.
Description
본 발명은 방사성 세슘 및 방사선에 대한 저항성을 가지는 신규한 엑시구오박테리움 아세틸리쿰 CR1 균주 및 상기 CR1 균주에 방사선을 조사하여 제조된 돌연변이 균주에 관한 것이다.
방사성 폐기물은 원자력 발전소나 연구소에서 주로 발생 되지만 원자력 산업과 관련이 없는 의료계와 석탄, 석유, 천연가스를 가공하면서 자연적으로 방사성 폐기물이 축적되기도 한다. 원자력 발전소 운전 과정에서 발생하는 핵폐기물과 같은 고준위 방사성 폐기물의 관리와 영구 정지가 되는 원자력 발전소의 폐기물 관리가 어렵다.
방사성 폐기물은 일반적으로 여러 가지 방사성 동위원소로 이루어져 있다. 방사성 동위원소란 붕괴하면서 전리방사선을 방출하여 인간과 환경에 해로울 수 있는 불안정한 배열의 원소들을 말하는데 방사성 동위원소들은 각각 다른 시간 동안 다른 종류와 준위의 방사선을 방출한다. 모든 방사성 폐기물의 반감기는 원소마다 다른데, 마이크로 초단위에서 100만년이라는 시간까지 다양하다. 후쿠시마 원자력 발전소 사고 이후 환경에 방출된 주요 방사성 핵종은 요오드, 세슘, 스트론튬으로 요오드와 같이 반감기가 짧은 원소들은 크게 문제가 되지 않지만 세슘과 스토론튬은 반감기가 약 30년으로 한번 자연계에 누출되면 오랜 기간 자연계에 잔존하며 유전자 변형과 같은 생태계에 악영향을 끼치기 때문에 방사성 폐기물중 특히 세슘 오염에 의한 위험성은 상당히 심각하다.
한편, 생광물화(biomineralization)란 살아있는 생물이 광물을 만들어내는 과정을 의미하는 것으로, 이로 인해 기존 조직의 경도나 강도가 높아진다. 체내에서 생광물화를 진행하는 생물종의 생체 내에서 확인된 광물은 60가지가 넘는다. 그 예로는 조류와 규조류의 규산염, 무척추동물의 탄산염, 척추동물의 인산칼슘 및 탄산염이 있다. 또한 포유류나 조류의 뼈 구조는 생광물화로 인해 만들어진다. 원핵생물로는 박테리아를 포함하는 구리, 철 및 금 퇴적층이 있다.
현재, 우라늄 생광물화 미생물을 이용한 우라늄 오염 지하수 개량 방법이 사용되고 있으며, 상기 우라늄 생광물화 미생물은 미생물로부터 방출된 인산염이 우라늄과 반응하여 우라늄 인산 광물을 침전시킴으로서 우라늄을 제거한다. 우라늄 생광물화 미생물 이용 시 미생물에서 방출된 인산염이 우라늄 화합물에 더 특이적으로 반응한다는 점에서 인산염을 지하수에 직접 주입하는 것보다 더 효율적이다.
이에 본 발명자들은 생광물화 미생물을 이용하여 방사성 핵종을 제거하기 위하여, 방사성 세슘 및 방사선에 저항성이 있는 엑시구오박테리움 아세틸리쿰 CR1 균주를 발굴하고, 상기 엑시구오박테리움 아세틸리쿰 CR1 균주에 방사선을 조사하여 돌연변이 균주를 제작함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은, 방사성 세슘 및 방사선에 대한 저항성을 가지는 수탁번호 KCTC18659P인 엑시구오박테리움 아세틸리쿰 CR1 균주 및 이의 돌연변이 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 엑시구오박테리움 아세틸리쿰 CR1 균주, 또는 이의 CR1 균주의 돌연변이 균주, 상기 CR1 균주 또는 이의 돌연변이 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 방사성 세슘 제거용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 엑시구오박테리움 아세틸리쿰 CR1 균주, 또는 이의 CR1 균주의 돌연변이 균주, 상기 CR1 균주 또는 이의 돌연변이 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 방사성 세슘으로 오염된 폐수 또는 토양에 처리하는 단계를 포함하는 방사성 세슘 제거 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 방사성 세슘 및 방사선에 대한 저항성을 가지는 수탁번호 KCTC18659P인 엑시구오박테리움 아세틸리쿰 CR1 균주 및 이의 돌연변이 균주를 제공한다.
또한 본 발명은, 상기 엑시구오박테리움 아세틸리쿰 CR1 균주, 또는 이의 돌연변이 균주, 상기 CR1 균주 또는 이의 돌연변이 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 방사성 세슘 제거용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은, 상기 엑시구오박테리움 아세틸리쿰 CR1 균주, 상기 CR1 균주의 돌연변이 균주, 상기 CR1 균주 또는 이의 돌연변이 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 방사성 세슘으로 오염된 폐수 또는 토양에 처리하는 단계를 포함하는 방사성 세슘 제거 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 엑시구오박테리움 아세틸리쿰 CR1 균주 및 이의 돌연변이 균주는 방사성 세슘 및 방사선에 대한 저항성을 나타내며 방사성 세슘을 흡착하는 활성을 가지는 바, 방사성 폐기물의 방사성 핵종을 제거하는 제염 분야에서 다양하게 활용할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 세슘 흡착 균주 발굴을 위한 균주 스크리닝 결과를 나타내는 도이다.
도 2는 본 발명에 따른 발굴된 세슘 흡착 후보 균주의 세슘 저항성을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명에 따른 세슘 저항성 균주의 콜로니 관찰 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 세슘 저항성 균주를 동정한 결과를 나타낸 도이다.
도 5 및 6은 본 발명에 따른 세슘 및 방사선에 대한 저항성을 갖는 돌연변이주의 세슘 저항성을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명에 따른 세슘 및 방사선에 대한 저항성을 갖는 돌연변이주의 세슘 흡착률을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명에 따른 발굴된 세슘 흡착 후보 균주의 세슘 저항성을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명에 따른 세슘 저항성 균주의 콜로니 관찰 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 세슘 저항성 균주를 동정한 결과를 나타낸 도이다.
도 5 및 6은 본 발명에 따른 세슘 및 방사선에 대한 저항성을 갖는 돌연변이주의 세슘 저항성을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명에 따른 세슘 및 방사선에 대한 저항성을 갖는 돌연변이주의 세슘 흡착률을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 방사성 세슘 및 방사선에 대한 저항성을 가지는 수탁번호 KCTC18659P인 엑시구오박테리움 아세틸리쿰 CR1 균주(Exiguobacterium acetylicum CR1) 또는 이의 돌연변이 균주를 제공한다.
본 발명에 있어서, “방사성 세슘”은 원자핵이 붕괴되거나 전자파를 방출하여 붕괴되는 성질을 가지는 방사성 물질의 일종으로, 구체적으로 세슘의 방사선 동위원소인 세슘-137을 의미한다. 이러한 방사성 세슘은 원자력 발전소 사고, 핵무기 실험 등에서 발생하는 방사능 오염 물질 중 가장 위험성이 큰 물질이다. 본 발명에서 방사성 세슘은 137Cs, 135Cs, 또는 134Cs 일 수 있으며, 137Cs인 것이 바람직하다. 상기 137Cs은 핵분열시 발생하는 주요 방사성 동위원소로서, 반감기가 30.17년인 유독 물질이다.
본 발명에 있어서, “방사성 세슘에 대한 저항성”은 방사성 세슘 존재 하에서 미생물이 생존하는 정도를 의미한다. 방사성 세슘에 대한 저항성이 높은 미생물은 방사성 세슘이 존재하는 배지에서 배양하여도 생존율이 우수하다.
본 발명에 있어서, “방사선에 대한 저항성”은 미생물에 방사선 조사 시 생존하는 정도를 의미하며, 방사선에 대한 저항성이 낮은 미생물의 경우 방사선에 의한 직접적인 DNA 파괴 또는 방사선에 의해 생성된 활성산소로 인하여 사멸된다.
본 발명의 일 구체예에서, 엑시구오박테리움 아세틸리쿰 CR1 균주는 원자력 발전소 인근의 습지에서 채취한 시료로부터 분리된 것으로, 방사성 세슘의 농도가 100 내지 500ppm 함유된 배지에서 배양하였을 때 생존율이 우수하며, 0.5 내지 3kGy의 방사선을 조사하여도 생존한 것을 확인하였다. 따라서, 상기 엑시구오박테리움 아세틸리쿰 CR1 균주를 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2018년 1월 15일자로 기탁하여 기탁번호 KCTC18659P를 부여받았다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 상기 엑시구오박테리움 아세틸리쿰 CR1 돌연변이 균주는 엑시구오박테리움 아세틸리쿰 CR1 균주에 방사선을 조사하여 제조된 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, “돌연변이”는 DNA 분자가 전자기파, 방사선, 화학물질 및 외·내부 유전자와 같은 요인에 의하여 원본과 달라지는 것을 의미한다. 돌연변이가 발생하면 그 유전자에 의해 생산되는 단백질에 변화가 생기며, 이는 유전형질의 변화를 불러온다. 돌연변이의 예로는 점 돌연변이(point mutation), 삽입(insertion), 결실(deletion)을 포함하는 뉴클레오타이드 수준의 돌연변이와, 유전자 중복(gene duplication), 유전자 결실(gene deletion), 염색체 역위(chromosomal inversion), 간질성 결실(interstitial deletion), 염색체 전위(chromosomal transition), 이형접합 소실(Loss of Heterozygosity, LOH)을 포함하는 염색체 수준의 돌연변이가 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 방사선 조사는 60Co를 선원으로 한 감마선을 0.1 내지 10kGy/h의 선량률로 1 내지 3시간 동안 조사하는 것이며, 바람직하게는 0.5 내지 2kGy/h의 선량률로 조사하는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 1kGy/h의 선량률로 조사하는 것이다.
또한, 본 발명의 엑시구오박테리움 아세틸리쿰 CR1 돌연변이 균주는 서열번호 1 내지 6으로 표시되는 염기서열로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 염기서열로 이루어진 16S rRNA 유전자를 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 구체예에서, 엑시구오박테리움 아세틸리쿰 CR1 돌연변이 균주는 원자력 발전소 인근의 습지에서 채취한 시료로부터 분리된 엑시구오박테리움 아세틸리쿰 CR1 균주에 방사선을 조사하여 제조되었으며, 방사선 조사로 인하여 방사성 세슘 및 방사선에 저항성뿐만 아니라 방사성 세슘을 흡착하는 활성이 증가된 것을 확인하였는바, 방사성 오염물질의 방사성 핵종을 제거하는 제염 분야에서 다양하게 활용될 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 엑시구오박테리움 아세틸리쿰 CR1 균주, 또는 이의 CR1 균주의 돌연변이 균주, 상기 CR1 균주 또는 이의 돌연변이 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 방사성 세슘 제거용 조성물을 제공한다.
상기 배양물은 엑시구오박테리움 아세틸리쿰 CR1 균주 또는 이의 돌연변이 균주를 배양배지 또는 배양액에서배양한 것을 의미하고, 상기 배양물은 상기 균주를 포함하는 배양물이다. 상기 배양물 또는 배양 농축물은 그 제형이 한정되지 않고, 일 예로 상기 제형은 액체 또는 고체일 수 있다.
상기 배지는 특정 미생물을 배양하기 위하여, 배양대상 즉, 배양체가 되는 미생물이 필요로 하는 영양물질을 포함하는 것으로 특수한 목적을 위한 물질이 추가로 첨가되어 혼합된 것 일 수 있다. 상기 배지는 배양기 또는 배양액이라고도 할 수 있고, 천연배지, 합성배지 또는 선택배지를 모두 포함하는 개념이다. 배양한 배지로부터 분리하여 얻은 것 일 수 있고, 상기 배지는 엑시구오박테리움 아세틸리쿰 CR1 균주 또는 이의 돌연변이 균주가 성장할 수 있는 것이라면 한정되지 않고 이용할 수 있다.
상기 배지는 일 예로, 보통 한천배지(또는 영양 한천배지; Nutrient agar), TSA(tryptic soy agar) 배지, 표준한천배지(Standard Methods Agar; Plate Count Agar), 유당배지(lactose Broth), BGlB 배지(Brilliant Green lactose Bile Broth), 2배 농도 BGlB 배지, Endo 한천배지(Endo Agar), EMB 한천배지(Eosin methylene blue agar), 보통 배지(또는 영양 배지; Nutrient Broth), 데스옥시콜레이트 유당 한천배지(Desoxycholate lactose Agar), LB 배지(Luria-bertani Broth) 또는 EC 배지(EC Broth)로 일 수 있다.
상기 조성물은 슈도모나스 퓨티다 SJ3 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나에, 계면활성제, 중량제 및 영양제를 첨가하여 제조된 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 오염지역의 특성에 따라서 다른 물질의 분해활성을 갖는 미생물을 선택적으로 포함하여 처리할 수도 있다.
상기 조성물에 있어서, 엑시구오박테리움 아세틸리쿰 CR1 균주 또는 이의 돌연변이 균주, 상기 CR1 균주 또는 이의 돌연변이 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나는 방사성 세슘 제거용 조성물에 포함되어 공급될 수도 있고, 장기간 보존을 위해 별도로 보관하였다가 사용 직전에 혼합하여 사용할 수도 있다. 상기 균주를 장기간 보존하기 위해 별도로 공급되는 경우에는 글리세롤 저장용액에 -70℃ 이하로 보존하거나 -20℃ 내지 -80℃에서 동결건조 보존하여 사용할 수 있다.
상기 조성물은 엑시구오박테리움 아세틸리쿰 CR1 균주 또는 이의 돌연변이 균주의 안정적인 제제화를 목적으로, 수화제, 입제 또는 캡슐제로 제제화하여 사용할 수 있고, 상기 종류에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 수화제는 균주를 접종한 고체배지를 건조시켜 분쇄한 후 계면활성제, 증량제 또는 영양제를 첨가하여 혼합하여 제조할 수 있다. 상기 계면활성제로는 폴리카복실레이트, 소듐 리그노설포네이트, 칼슘 리그노설포네이트, 소듐 디알킬 설포석시네이트, 소듐 알킬 아릴 설포네이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 페닐 에테르, 소듐트리폴리포스페이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 포스포릭 에스테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 에테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 폴리머, 소듐 설포네이트 나프탈렌 포름알데히드, 트리톤 100 및 트윈 80으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 사용하며, 증량제 및 영양제로는 콩가루, 쌀, 밀, 황토, 규조토, 덱스트린 (dextrin), 포도당 및 전분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 입제는 균주를 접종한 고체배지를 건조시켜 분쇄한 후 계면활성제, 증량체 및 영양제는 상기 기재된 것과 동일한 것을 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 입제는 균주의 표면 활성제, 비활성 담체, 보존제, 습윤제, 공급촉진제, 유인제, 캡슐화제, 결합제, 유화제, 염료, UV 보호제, 완충제 및 흐름제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상의 것을 추가로 첨가하여 제조할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 구체예에서, 방사성 세슘 제거용 조성물은 하이드로겔 형태인 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, “하이드로겔”은 친수성 고분자가 공유 또는 비공유 결합으로 가교되어 만들어진 3차원 망상 구조물을 의미하며, 수용액 내에서 용해되지 않지만 많은 양의 물을 흡수하여 팽윤하는 성질 및 액체와 고체의 중간 성질을 가진다. 하이드로겔의 예로는 디펩타이드(di-peptide), 피브린(fibrin), 젤라틴(gelatin), 콜라겐(collagen), 히알루론산(hyaluronic acid), 아가로즈(agarose), 키토산(chitosan), 폴리포스파진(polyphosphazine), 폴리아크릴레이트(polyacrylate), 폴리글락트산(polyglactic acid), 폴리글리콜산(polyglycolic acid), 플루론산 (pluronic acid), 알긴산(alginate) 및 이들의 염(salts) 등이 있다.
본 발명의 하이드로겔 형태의 방사성 세슘 제거용 조성물을 사용하여 방사성 세슘을 제거할 경우, 엑시구오박테리움 아세틸리쿰 CR1 균주, 또는 이의 돌연변이 균주의 생존 시간을 유지 또는 연장 시킬 수 있으므로 방사성 세슘 흡착 효율을 높일 수 있다는 장점이 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 엑시구오박테리움 아세틸리쿰 CR1 균주, 또는 이의 돌연변이 균주, 상기 CR1 균주 또는 이의 돌연변이 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 방사성 세슘으로 오염된 폐수 또는 토양에 처리하는 단계를 포함하는 방사성 세슘 제거 방법을 제공한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
1. 세슘 흡착 균주 발굴을 위한 균주 스크리닝
세슘 흡착 균주를 발굴하기 위하여, 본 연구진은 울산 고리 지역의 원자력 발전소 인근의 토양, 습지 및 하천에서 시료를 채취하였다. 시료 채취한지 24시간 이내에 시료에 포함된 미생물을 분리하였다. 구체적으로, 시료에 포함된 미생물을 분리하기 위하여, 각 시료를 증류수에 희석시키고 LB(Luria-Bertani) 고체배지에 도말하였다. 시료가 도말된 LB 고체배지는 37℃에서 24시간동안 배양하였으며, 배양 결과는 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 배양된 LB 고체배지에서 다양한 미생물 군집을 확인하였다. 상기 미생물 군집으로부터 토양 시료(L)에서는 13종, 습지 시료(S)에서는 7종 및 하천 시료(W)에서는 12종의 서로 다른 콜로니를 선별하였다.
선별된 콜로니로부터 각 미생물을 순수배양하기 위하여, 선별된 콜로니를 각각 LB 고체배지에 재 도말하여 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양된 LB 고체배지는 당업계에 알려진 순수분리 방법으로 각각의 균이 LB 고체배지에서 단일 콜로니로 존재하도록 하였다. 이를 통해 세슘 흡착 균주의 후보인 32종의 서로 다른 균을 획득하였다.
실시예
2. 후보 균주의 세슘 저항성 측정
세슘 흡착 균주는 방사성 세슘에 대한 저항성이 있어야 한다. 따라서 실시예 1에서 획득한 32종의 후보 균주의 세슘 저항성을 측정하였다. 세슘 저항성은 후보 균주를 세슘 존재 하에 배양하고, 시간에 따른 생존율을 측정하여 확인하였다.
구체적으로, 32종의 후보 균주를 각각 세슘의 농도가 100 또는 500ppm인 LB 배지에 접종한 후 37℃에서 12시간동안 진탕배양 하였다. 배양 중 2시간마다 배양액의 광학밀도(optical density, OD)를 측정하여 생존율을 측정하였다. 32종 후보 균주의 생존율 측정 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2A에 나타낸 바와 같이, 13종의 토양 시료(L) 유래의 균주를 세슘 100ppm 조건에서 배양한 결과, 13종의 균주 중 L10 균주가 배양 8시간 이후 OD값이 급격히 감소하였다. 반면에 L4, L5, L6, L7, L12 및 L13 균주는 배양하는 12 시간 동안 OD값이 계속 증가하였으며, 이는 세슘에 대한 저항성이 우수한 것을 의미한다.
도 2B에 나타낸 바와 같이, 세슘에 대한 저항성이 우수한 토양 시료(L) 유래의 L4, L5, L6, L7, L12 및 L13 균주를 세슘 농도가 500ppm인 조건에서 배양한 결과, L4, L5, L12 및 L13 균주는 OD값이 0.7 이하로 감소하였다. 반면에 L11 균주는 세슘의 농도가 100ppm일 때보다 500ppm일 때 생존율이 높았고, 이는 L11균주가 세슘에 대한 저항성이 매우 우수하다는 것을 의미한다.
도 2C에 나타낸 바와 같이, 7종의 습지 시료(S) 유래의 균주를 세슘 100ppm 조건에서 배양한 결과, 7종의 균주 중 S1, S2 및 S3 균주가 세슘 저항성이 우수한 것을 알 수 있었다.
도 2D에 나타낸 바와 같이, S2 및 S3 균주는 세슘의 농도가 500ppm에서 생존율이 감소하였으나, 세슘의 농도가 500ppm인 경우 S1 균주의 생존율은 100ppm일 때와 유사하였다. 따라서 S1 균주는 S2 및 S3 균주보다 세슘에 대한 저항성이 우수하다는 것을 알 수 있다.
도 2E에 나타낸 바와 같이, 12종의 하천 시료(W) 유래의 균주를 세슘 100ppm 조건에서 배양한 결과, W1, W5 및 W9 균주는 OD값이 0.8미만으로 측정되어 세슘 저항성이 다소 낮았다. 그러나 W1, W5 및 W9 균주를 제외한 9종의 균주는 OD값이 0.8이상으로, 세슘에 대한 저항성이 우수한 것을 알 수 있다.
도 2F에 나타낸 바와 같이, 9종의 하천 시료 유래 균주(W2, W3, W4, W6, W7, W8, W10, W11, W12)는 세슘 100ppm 조건에서 비슷한 양상으로 생장하였으나, 세슘 500ppm 조건에서는 전혀 다른 양상으로 생장하였다. 특히 W6 및 W11 균주는 12시간까지 배양했을 때, OD값이 1.6 이상으로 증가하여 다른 7종의 균주보다 세슘에 대한 저항성이 매우 우수하였다.
종합적으로, 토양 및 습지 시료 유래의 균주는 세슘의 농도가 증가하면서 생존율이 감소하였다. 반면에, 하천 시료 유래의 균주는 세슘 농도가 100 및 500ppm 조건에서 비슷한 OD값을 보였으며 다른 시료 유래의 균주보다 세슘에 대한 저항성이 우수하였다. 또한 세슘의 농도가 500ppm인 LB 배지에서 OD값이 1 이상인 L11, S1, S3, W6, W7 및 W11 균주를 세슘에 대한 저항성이 우수한 균주로 선정하고, 다음 실험에 이용하였다.
실시예
3. 세슘 저항성 균주의
콜로니
관찰 및 동정
세슘에 대한 저항성을 나타내는 L11, S1, S3, W6, W7 및 W11 균주를 LB 고체배지에서 24시간 동안 배양하였고, 배양 후 형성된 콜로니를 관찰하였다. 형성된 콜로니는 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, L11 균주의 콜로니는 하얗고 광이 없으며, S1 균주의 콜로니는 주황색이고 콜로니의 형태가 다른 균주보다 움푹 패인 형태임을 확인하였다. 또한 S3 균주의 콜로니는 하얗고 단단하였으며, W6 및 W7 균주의 콜로니는 하얗고 점성이 있었다. 마지막으로 W11 균주의 콜로니는 진한 노랑색임을 확인하였다.
또한 세슘 저항성 균주인 L11, S1, S3, W6, W7 및 W11 균주를 동정하였으며, 그 결과는 도 4에 나타내었다.
도 4A에 나타낸 바와 같이, S1 균주는 엑시구오박테리움 아세틸리쿰(Exiguobacterium acetylicum)임을 확인하였으며, 상기 엑시규오박테리움 속 균주는 염, 온도, pH 등 다양한 환경에 강한 내성을 가지고 있다.
도 4B에 나타낸 바와 같이, S3 균주는 바실러스 아리압하타이 B8W22(Bacillus aryabhattai B8W22)이며, L11 균주는 바실러스 세리우스 ATCC14579(Bacillus cereus ATCC14579)임을 확인하였다.
도 4C에 나타낸 바와 같이, W6 균주는 아에로모나스 텍타 CECT7082(Aeromonas tecta CECT7082)이며, W7 균주는 아에로모나스 메디아 RM(Aeromonas media RM)임을 확인하였다.
도 4D에 나타낸 바와 같이, W11 균주는 장내 세균인 에스케리아 헤르마니 CIP103176(Escherichia hermannii CIP103176)임을 확인하였다.
실시예
4. 세슘 저항성 균주의 방사선에 대한 저항성 확인
세슘 저항성 균주인 S1, S3, W6 및 W11 균주에 방사선을 조사하여 방사선에 대한 저항성을 확인하였다. 구체적으로, 세슘 저항성 균주에 각각 0.5, 1, 2 및 3kGy의 방사선을 조사한 후 LB 고체배지에 도말하여 37℃에서 24시간동안 배양하였다.
세슘 저항성 균주의 방사선 저항성 확인한 결과, 습지 시료에서 유래한 S1 균주는 방사선에 대하여 높은 저항성을 나타내었으며, 이외의 균주는 사멸된 것을 확인하였다. 사멸된 균주는 방사선에 의한 직접적인 DNA 파괴 또는 방사선으로 인해 생성된 활성산소로 인한 DNA 파괴로 인하여 사멸된 것으로 사료된다.
본 발명자들은 세슘 및 방사선에 대한 저항성을 갖는 S1 균주를 CR1으로 명명하고, 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2018년 1월 15일자로 기탁하여 기탁번호 KCTC18659P를 부여받았다.
실시예
5. 세슘 및 방사선에 대한 저항성을 갖는 S1 균주의
돌연변이주
제작 및 세슘 저항성 확인
세슘 및 방사선에 대한 저항성을 갖는 S1 균주(CR1 균주)의 세슘 흡착률을 높이기 위하여, 상기 S1 균주에 방사선을 조사하여 돌연변이주를 제작하였다. 구체적으로, 상기 S1 균주에 60Co를 선원으로 한 감마선을 1 kGy/h의 선량률로 1시간동안 방사선을 조사한(누적선량 1kGy) 후 LB 고체배지에서 24시간동안 배양하였다. 배양된 LB 고체배지에서 95개의 콜로니를 확인하였고, 확인된 95종의 돌연변이주를 순수배양하기 위하여 각 콜로니를 떼어내어 LB 배지에 접종하였다. LB 배지에 접종된 돌연변이주는 37℃에서 24시간동안 진탕배양 하였다. 순수배양된 돌연변이주를 세슘 농도가 750ppm인 LB 배지에 접종하였으며, 120시간동안 배양하면서 24시간마다 OD값을 측정하여 세슘에 대한 저항성을 확인하였다. 돌연변이주의 세슘에 대한 저항성 확인 결과는 도 5에 나타내었다. 또한 95종의 돌연변이주 중 대표적으로 S1_1, S1_3, S1_4, S1_11, S1_23 및 S1_35 균주의 생장곡선은 도 6에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 95종의 돌연변이주의 생장곡선은 세슘 및 방사선에 대한 저항성을 갖는 S1 균주의 생장곡선과 유사한 것을 알 수 있다.
또한, 도 6에 나타낸 바와 같이, 돌연변이주의 생장 곡선을 보다 면밀하게 분석한 결과, 상기 돌연변이 균주인 S1_1, S1_3, S1_4, S1_11, S1_23 및 S1_35 균주는 대조군인 S1 균주와 유사한 생장곡선을 가지는 것을 확인하였다.
상기 결과로부터, 세슘 및 방사선에 대한 저항성을 갖는 S1 균주뿐만 아니라, 상기 S1 균주에 방사선을 조사하여 제조된 돌연변이 균주도 방사선 및 세슘에 대한 저항성을 나타낸다는 것을 알 수 있다.
실시예
6. 세슘 및 방사선에 대한 저항성을 갖는 S1 균주의
돌연변이주의
동정
상기 실시예 5에서 분리한 S1_1, S1_3, S1_4, S1_11, S1_23 및 S1_35 균주의 16S rRNA를 (주) 제노텍에 의뢰하여 16S rRNA의 서열을 분석하였다.
돌연변이 균주의 16S rRNA를 분석한 결과, S1_1, S1_3, S1_4, S1_11, S1_23 및 S1_35 균주의 16S rRNA 유전자는 각각 서열번호 1 내지 6으로 표시되며, 이는 모균주인 S1 균주의 16S rRNA 유전자와와 97% 이상의 상동성을 보이는 것을 확인하였다.
실시예
7. 유도결합 플라스마 질량분석기를 이용한 S1 균주의
돌연변이주의
세슘 흡착률 측정
상기 실시예 5에서 분리한 S1 균주의 돌연변이주인 S1_1, S1_3, S1_4, S1_11, S1_23 및 S1_35 균주의 세슘 흡착률을 측정하였다. 구체적으로, 세슘 흡착률을 확인하기 위하여, 세슘 농도가 750ppm인 LB 배지에 OD값이 2인 세균 배양액 1ml를 각각 첨가하여 37℃에서 5일 동안 배양하였다. 세슘 이온 흡착 여부를 확인하기 위하여, 배양을 시작한 후 1일마다 균을 채취하였다. 채취된 균은 유도결합 플라즈마 질량분석기 및 투과전자 현미경 이미지 분석을 통해 세슘 이온 흡착 여부를 확인하였다. 대조군으로는 S1 균주를 사용하였다. 세슘 및 방사선 저항성 돌연변이주의 세슘 이온 흡착 여부 확인 결과는 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, S1 균주의 돌연변이주인 S1_1, S1_3, S1_4, S1_11, S1_23 및 S1_35 균주는 모두 S1 균주보다 세슘 흡착률이 증가한 것을 확인하였다. 상기 결과에서, 세슘 흡착률이 증가하는 것은 방사선 조사로 인한 효과인 것으로 사료된다.
종합적으로 본 발명자들은 방사성 세슘 및 방사선에 대한 저항성을 갖는 신규한 엑시구오박테리움 아세틸리쿰 CR1 균주를 분리하였으며, 상기 CR1 균주에 방사선을 조사하여 엑시구오박테리움 아세틸리쿰 CR1 돌연변이주를 제조하였다. 상기 엑시구오박테리움 아세틸리쿰 CR1 균주 및 이의 돌연변이 균주는 방사성 세슘 및 방사선에 저항성뿐만 아니라 방사성 세슘을 흡착하는 활성을 가지는 바, 본 발명의 엑시구오박테리움 아세틸리쿰 CR1 균주 및 이의 돌연변이 균주는 방사성 오염물질의 방사성 핵종을 제거하는 제염 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
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<120> Novel Exiguobacterium acetylamcum CR1 with resistance to
radioactive cesium and radiation
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<210> 1
<211> 1492
<212> RNA
<213> Exiguobacterium acetylicum
<220>
<221> rRNA
<222> (1)..(1492)
<223> Exiguobacterium acetylicum S1_1 16S rRNA
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<220>
<221> rRNA
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<223> exiguobacterium acetylicum S1_3 16S rRNA
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<213> Exiguobacterium acetylicum
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<221> rRNA
<222> (1)..(1492)
<223> Exiguobacterium acetylicum S1_4 16S rRNA
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ggggacccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga agaaccttac 960
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gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa 1080
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ccgtcacacc acgagagttt gcaacacccg aagccggtga ggtaaccgca ggagccagcc 1440
gtcgaagtgg ggtaatgatt gggggtgatc taaaaggggg gggcgttcta ataaa 1495
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<211> 1487
<212> RNA
<213> Exiguobacterium acetylicum
<220>
<221> rRNA
<222> (1)..(1487)
<223> Exiguobacterium acetylicum S1_23 16S rRNA
<400> 5
ctgcaaactg cagtcgagcg caggaactga cggaactctt cggagggaag gcagtggaat 60
gagcggcgga cgggtgagta acacgtaagg aacctgcctc aaggattggg ataactccga 120
gaaatcggag ctaataccgg atagttcaac ggaccgcatg gtccgctgat gaaaggcgct 180
tcggcgtcac cttgagatgg ccttgcggtg cattagctag ttggtggggt aacggcccac 240
caaggcgacg atgcatagcc gacctgagag ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg 300
gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttcca caatggacga aagtctgatg 360
gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt cggatcgtaa aactctgttg taagggaaga 420
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tggtgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg 1080
caacccctat ccttagttgc cagcattgag ttgggcactc tagggagact gccggtgaca 1140
aaccggagga aggtggggat gacgtcaaat catcatgccc cttatgagtt gggctacaca 1200
cgtgctacaa tggacggtac aaagggcagc gagaccgcga ggtggagcca atcccataaa 1260
gccgttccca gttcggattg caggctgcaa ctcgcctgca tgaagtcgga atcgctagta 1320
atcgcaggtc agcatactgc ggtgaatacg ttcccgggtc ttgtacacac cgcccgtcac 1380
accacgagag ttttgcacac ccgaagccgg tgaggtaacc gcaggagcca gccgtcgaag 1440
gtgggtagat gattgggtga gcaaaaaggg gggggnccca aaaaaaa 1487
<210> 6
<211> 1493
<212> RNA
<213> Exiguobacterium acetylicum
<220>
<221> rRNA
<222> (1)..(1493)
<223> Exiguobacterium acetylicum S1_35 16S rRNA
<400> 6
ggctgcgcgc taactgcagt cgagcgcagg aactgacgga actcttcgga gggaaggcag 60
tggaatgagc ggcggacggg tgagtaacac gtaaggaacc tgcctcaagg attgggataa 120
ctccgagaaa tcggagctaa taccggatag ttcaacggac cgcatggtcc gctgatgaaa 180
ggcgcttcgg cgtcaccttg agatggcctt gcggtgcatt agctagttgg tggggtaacg 240
gcccaccaag gcgacgatgc atagccgacc tgagagggtg atcggccaca ctgggactga 300
gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtagggaat cttccacaat ggacgaaagt 360
ctgatggagc aacgccgcgt gagtgatgaa ggttttcgga tcgtaaaact ctgttgtaag 420
ggaagaacac gtacgagagg gaatgctcgt accttgacgg taccttacga gaaagccacg 480
gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttgtc cggaattatt 540
gggcgtaaag cgcgcgcagg cggcctttta agtctgatgt gaaagccccc ggctcaaccg 600
gggagggcca ttggaaactg gaaggcttga gtacagaaga gaagagtgga attccacgtg 660
tagcggtgaa atgcgtagag atgtggagga acaccagtgg cgaaggcgac tctttggtct 720
gtaactgacg ctgaggcgcg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac cctggtagtc 780
cacgccgtaa acgatgagtg ctaggtgttg gggggtttcc gcccctcagt gctgaagcta 840
acgcattaag cactccgcct ggggagtacg gccgcaaggc tgaaactcaa aggaattgac 900
ggggacccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga agaaccttac 960
caactcttga catcccattg accgcttgag agatcaagtt ttcccttcgg ggacaatggt 1020
gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa 1080
cgagcgcaac ccctatcctt agttgccagc attgagttgg gcactctagg gagactgccg 1140
gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta tgagttgggc 1200
tacacacgtg ctacaatgga cggtacaaag ggcagcgaga ccgcgaggtg gagccaatcc 1260
cataaagccg ttcccagttc ggattgcagg ctgcaactcg cctgcatgaa gtcggaatcg 1320
ctagtaatcg caggtcagca tactgcggtg aatacgttcc cgggtcttgt acacaccgcc 1380
cgtcacacca cgagagtttg caacacccga agccggtgag gtaaccgcag ggagcagccg 1440
tcgaagtggg taatgattgg gggtgatcan nnnggggggg ggtgcaaaaa aaa 1493
Claims (7)
- 방사성 세슘 및 방사선에 대한 저항성을 가지는, 수탁번호 KCTC18659P인 엑시구오박테리움 아세틸리쿰 CR1 균주(Exiguobacterium acetylicum CR1).
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 따른 엑시구오박테리움 아세틸리쿰 CR1 균주, 상기 CR1 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는, 방사성 세슘 제거용 조성물.
- 제5항에 있어서,
상기 방사성 세슘 제거용 조성물은 하이드로겔 형태인 것인, 방사성 세슘 제거용 조성물.
- 제1항에 따른 엑시구오박테리움 아세틸리쿰 CR1 균주, CR1 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 방사성 세슘으로 오염된 폐수 또는 토양에 처리하는 단계;를 포함하는 방사성 세슘 제거 방법.
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| KR1020180045095A KR102011682B1 (ko) | 2018-04-18 | 2018-04-18 | 방사성 세슘 및 방사선에 대한 저항성을 가지는 신규한 엑시구오박테리움 아세틸리쿰 cr1 균주 |
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| KR102011682B1 true KR102011682B1 (ko) | 2019-08-19 |
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2018
- 2018-04-18 KR KR1020180045095A patent/KR102011682B1/ko active IP Right Grant
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