KR102010840B1 - 비-바이러스 벡터를 이용한 체세포의 간세포로의 직접교차분화용 조성물 및 직접교차분화 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 비-바이러스 벡터를 이용한 체세포의 간세포로의 직접교차분화용 조성물 및 직접교차분화 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게 본 발명은 비-바이러스성(non-viral) 벡터를 사용함으로써 고효율 직접교차분화된 간줄기세포(converted induced Hepatocyte, iHep)를 제공하고, 이를 이용하여 보다 신속하고 정확하며, 경제적인 체세포에서 간세포로의 고효율의 직접교차분화방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 비-바이러스 벡터를 이용한 체세포의 간세포로의 직접교차분화용 조성물 및 직접교차분화 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게 본 발명은 비-바이러스성(non-viral) 벡터를 사용함으로써 고효율 직접교차분화된 간줄기세포(converted induced Hepatocyte, iHep)를 제공하고, 이를 이용하여 보다 신속하고 정확하며, 경제적인 체세포에서 간세포로의 고효율의 직접교차분화방법에 관한 것이다.
유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells, iPSCs)란 Oct4, Sox2, Klf4, cMyc이라는 4가지의 외래 유전자를 일반 체세포에 도입하여 체내 모든 세포로 분화(differentiation)가 가능한 전능성 배아줄기세포의 상태로 역분화(de-differentiation)시킨 세포를 말한다.
2006년, 생쥐 섬유아세포에 네 개의 전사인자를 도입하여 유도만능줄기세포를 만드는 데 성공한 야마나카 교수는, 이듬해에 인간 피부 섬유아세포에도 같은 네 개의 전사인자로 유도시킨 인간 유도만능줄기세포를 만드는 것도 성공하였다. 같은 해에 미국 위스콘신 메디슨 대학 제임스 톰슨 교수팀은 레트로바이러스로 유전자(Oct4, Sox2, Nanog and Lin28)를 도입하여 인간의 피부세포로부터 유도만능줄기세포를 만드는데 성공하였다.
그러나, 유도만능줄기세포는 배아줄기세포와 같은 전능성(pluripotency)을 가진다는 장점에도 불구하고, 특정 세포로 분화시키는 특수한 배양조건하에서 충분히 분화되지 못한 소량의 '미분화 상태의 세포' 가 잔존할 가능성이 있어, 체내 이식 시 종양(기형종, teratoma)을 형성할 가능성을 가지고 있으므로 사람을 대상으로 하는 임상연구 적용에 큰 장애로 판단된다.
이에 유도만능줄기세포의 단점을 보완하고 극복하기 위해, 직접교차분화(direct conversion)시키는 기술이 각광을 받고 있다. '직접교차분화'는 임의의 체세포(cell type A)를 모든 세포로 분화가 가능한 유도만능줄기세포로 역분화시킨 후 다시 하위로 분화시키는 과정(re-differentiation)을 거치지 않고, 원하는 세포인 B로 직접 전환하는 기술이다. 이러한 다양한 조직 특이적 세포 분화를 유도하는 직접교차분화법(direct conversion)은 효율성이 낮은 문제점이 있다.
본 발명의 배경기술로는 한국공개특허 제10-2015-0052228(2015.05.13.)이 있으며, 상기 특허에는 FOXA3, HNF1A, 및 HNF4A 등의 리프로그래밍 인자를 이용하여, 비-간세포를 리프로그래밍함으로써 유도 간세포를 생성시키는데 사용하기 위한 방법이 개시되어 있다.
본 발명은 바이러스 시스템 기반이 아닌 비-바이러스성 시스템 기반으로, 돼지의 체세포를 대상으로 한 교차분화 간 줄기세포주 확립에 관한 것으로서, 코돈 최적화(codon optimization)와 GC 함량 최적화(GC content optimization)된 HNF1A를 삽입한 에피소말 벡터(episomal vector), 및 hHN4A 및 hFOX3을 삽입한 에피소말 벡터(episomal vector)를 효율적으로 세포 내에 삽입하여, 안정적인 세포 분화가 가능하도록 하였으며, 소분자 화합물(A-83-01)의 첨가와 적합한 배양 방법을 선택하여 증식 가능한 교차 간 줄기세포주를 구축하였다.
본 발명의 목적은 상기 비-바이러스 벡터를 이용한 체세포의 간세포로의 직접 교차분화용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 이용함으로써 고효율 직접교차분화된 줄기세포주(converted induced Hepatocyte, iHep)를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 이용하여 신속하고 정확하며, 경제적인 체세포에서 간세포로의 고효율의 직접교차분화 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 서열번호 1의 HNF1A 유전자 단편을 포함하는 비-바이러스성 벡터; 및 서열번호 2의 Hnf4a-F2A-Foxa3 유전자 단편을 포함하는 비-바이러스성 벡터를 포함하는, 체세포의 간세포로의 직접교차분화용 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 비-바이러스성 벡터는 에피소말 벡터(episomal vector)인, 체세포의 간세포로의 직접교차분화용 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 비-바이러스성 벡터는 코돈 최적화(codon optimization)와 GC 함량 최적화(GC content optimization)된 전사 인자가 삽입된 벡터인, 체세포의 간세포로의 직접교차분화용 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 소분자 화합물 A83-01을 더 포함하는 체세포의 간세포로의 직접교차분화 촉진용 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 체세포는 돼지의 섬유아세포인 것을 특징으로 하는, 체세포의 간세포로의 직접교차분화용 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 조성물을 이용하여 직접교차분화된 줄기세포주가 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, (a) 서열번호 1의 HNF1A 유전자 단편을 포함하는 비-바이러스성 벡터 및 서열번호 2의 Hnf4a-F2A-Foxa3 유전자 단편을 포함하는 비-바이러스성 벡터로, 전사인자를 체세포에 도입하여 배양하는 단계; 및 (b) 상기 전사 인자가 도입된 체세포를 소분자 화합물을 포함하는 배양액에서 배양하여 체세포를 간세포로 직접교차분화(direct reprogramming)시키는 단계;를 포함하는 체세포에서 간세포로의 직접교차분화 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 체세포는 돼지 유래의 섬유아세포인 체세포에서 간세포로의 직접교차분화 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 비-바이러스성 벡터는 에피소말 벡터(episomal vector) 인 체세포에서 간세포로의 직접교차분화 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 소분자 화합물은 A83-01인, 체세포를 간세포로 직접교차분화 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 코돈 최적화(codon optimization)와 GC 함량 최적화(GC content optimization)된 전사 인자가 삽입된 벡터를 포함하여, 체세포의 간세포로의 직접교차분화에 이용 가능한 비-바이러스성 벡터를 제공할 수 있다. 상기 비-바이러스성(nonviral) 벡터를 사용함으로써 일반적으로 면역반응을 유도하지 않고, 독성이 낮으며, 대량생산이 용이하다는 장점이 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 체세포의 간세포로의 직접교차분화에 이용 가능한 체세포의 간세포로의 직접교차분화용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 비-바이러스성 벡터를 이용하여 직접 교차분화된 줄기세포주를 제공할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 보다 신속하고 정확하며, 경제적인 체세포에서 간세포로의 고효율의 직접교차분화방법을 제공하여, 이종 장기 공급을 확대할 수 있고, 부족한 장기 이식문제 해결에 도움이 된다.
본 발명에 의하면, 신약개발을 위한 독성 테스트용 세포주로 개발이 가능하고, 간 부전 환자에 맞춤형인 안전한 세포치료제의 개발에 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 의한, HNF1A 유전자 단편을 포함하는 비-바이러스성 벡터의 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 의한, Hnf4a-F2A-Foxa3 유전자 단편을 포함하는 비-바이러스성 벡터의 모식도이다.
도 3a 및 도 3b는 본 발명의 일 실시예에 의한, 코돈 최적화(codon optimization) 및 GC 함량 최적화(GC content optimization)를 보여주는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 체세포의 간세포로의 직접교차분화용 조성물을 이용하여 직접교차분화된 간세포의 2번째 계대배양 및 3번째 계대배양을 한 세포의 형태학적 변화 양상을 보여주는 사진이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 의한, 직접교차분화된 간세포에 대한 소분자 화합물(A83-01)의 첨가 기간에 따른 piHep의 유전자 발현 특성을 나타내는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 의한, 직접교차분화된 간세포의 생리학적 특성을 조직면역염색(immunohistochemistry, IHC) 분석한 결과를 보여주는 사진이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 의한, 직접교차분화된 간세포의 생리학적 특성을 Integrated Optical Density(IOD)로 보여주는 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 의한, 직접교차분화된 간세포에 간특이 유도자(inducer)를 처리한 후 CYP 효소의 발현 양상을 보여주는 그래프이다.
도 9a 및 도 9b는 본 발명의 일 실시예에 의한, 직접교차분화된 간세포의 성숙도를 지방분화를 통해 보여주는 사진 및 그래프이다.
도 10a 및 도 10b는 본 발명의 일 실시예에 의한, 직접교차분화된 간세포의 성숙도를 글라이코겐 축적을 통해 보여주는 사진 및 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 의한, Hnf4a-F2A-Foxa3 유전자 단편을 포함하는 비-바이러스성 벡터의 모식도이다.
도 3a 및 도 3b는 본 발명의 일 실시예에 의한, 코돈 최적화(codon optimization) 및 GC 함량 최적화(GC content optimization)를 보여주는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 체세포의 간세포로의 직접교차분화용 조성물을 이용하여 직접교차분화된 간세포의 2번째 계대배양 및 3번째 계대배양을 한 세포의 형태학적 변화 양상을 보여주는 사진이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 의한, 직접교차분화된 간세포에 대한 소분자 화합물(A83-01)의 첨가 기간에 따른 piHep의 유전자 발현 특성을 나타내는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 의한, 직접교차분화된 간세포의 생리학적 특성을 조직면역염색(immunohistochemistry, IHC) 분석한 결과를 보여주는 사진이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 의한, 직접교차분화된 간세포의 생리학적 특성을 Integrated Optical Density(IOD)로 보여주는 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 의한, 직접교차분화된 간세포에 간특이 유도자(inducer)를 처리한 후 CYP 효소의 발현 양상을 보여주는 그래프이다.
도 9a 및 도 9b는 본 발명의 일 실시예에 의한, 직접교차분화된 간세포의 성숙도를 지방분화를 통해 보여주는 사진 및 그래프이다.
도 10a 및 도 10b는 본 발명의 일 실시예에 의한, 직접교차분화된 간세포의 성숙도를 글라이코겐 축적을 통해 보여주는 사진 및 그래프이다.
본 발명을 더 쉽게 이해하기 위해 편의상 특정 용어를 본원에 정의한다. 본원에서 달리 정의하지 않는 한, 본 발명에 사용된 과학 용어 및 기술 용어들은 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 또한, 문맥상 특별히 지정하지 않는 한, 단수 형태의 용어는 그것의 복수 형태도 포함하는 것이며, 복수 형태의 용어는 그것의 단수 형태도 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 측면에 의하면, 서열번호 1의 HNF1A 유전자 단편을 포함하는 비-바이러스성 벡터; 및 서열번호 2의 Hnf4a-F2A-Foxa3 유전자 단편을 포함하는 비-바이러스성 벡터를 포함하는, 체세포의 간세포로의 직접교차분화용 조성물을 제공할 수 있다.
여기서, 직접교차분화란, 임의의 체세포(cell type A)를 모든 세포로 분화가 가능한 유도만능줄기세포로 역분화시킨 후 다시 하위로 분화시키는 과정(re-differentiation)을 거치지 않고, ‘직접’원하는 특정 세포(cell type B)로 전환시키는 기술이다.
유전자 치료법에 있어서 기존에 사용되어 오던 바이러스성 벡터 시스템은 숙주 유전자에 외래 유전자가 삽입되어 추후 임상 적용에 있어서 면역원성 등의 생물학적 안정성의 문제점이 있었다. 한편, 비-바이러스성 벡터 시스템은 전달 효율이 낮은 문제점이 있었다. 본 발명자들은 상기 문제점을 동시에 해결하기 위해 간 전사인자 유전자를 목적 세포에 효율적으로 전달할 수 있으며, 상기 유전자를 지속적이고 오랫동안 발현시킬 수 있는 안전성이 높은 비-바이러스성 벡터 시스템을 개발하였다.
즉, 본 발명은 HNF1A 유전자 단편을 포함하는 비-바이러스성 벡터 및 Hnf4a-F2A-Foxa3 유전자 단편을 포함하는 비-바이러스성 벡터를 이용하는 것을 특징으로 하여, 이러한 특징에 의해 비-바이러스성 벡터 시스템이지만 전달 효율을 높일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 비-바이러스성 벡터는 에피소말(episomal) 벡터인, 고효율 형질전환 세포주 제작이 가능한 체세포의 간세포로의 직접교차분화용 조성물이 제공된다.
“에피소말 벡터(episomal vector)”는 비삽입성(integration-free) 벡터로서, 유전적 삽입 없이, 염색체 외로 감염된 세포에서 복제하고 전파할 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 비-바이러스성 벡터는 발현 최적화를 위해 코돈 최적화(codon optimization) 및 GC 함량 최적화(GC content optimization)된 전사 인자가 삽입된 벡터인, 체세포의 간세포로의 직접교차분화용 조성물이 제공된다. 이에 한정되는 것은 아니나, 종내 발현 최적화를 위해 GC 함량은 80% 이상이나 30% 이하를 피해서 조정하는 것이 발현 최적화에 적합하다.
본 발명의 경우, 돼지의 유전자의 코돈에 맞추어 유전자 최적화 프로그램(GeneOptimizer)를 사용하여, HNF1A 유전자의 경우 평균 GC함량이 65%가 되도록 하였으며, Hnf4a-F2A-Foxa3 유전자의 경우 평균 GC함량이 64%가 되도록 최적화하였다(도 3a 및 3b 참조). 상기 최적화 과정에서 하기의 시스-액팅 서열 모티브(cis-acting sequence motifs)는 회피되었다.
- internal TATA-boxes, chi-sites and ribosomal entry sites
- AT-rich or GC-rich sequence stretches
- RNA instability motifs
- repeat sequences and RNA secondary structures
- (cryptic) splice donor and acceptor sites in higher eucaryotes
본 발명에서, "코돈 최적화(Codon Optimization)"란 단백질을 코딩하는 부위의 아미노산 코돈 중에서 편중되어 사용되는 코돈(prefered codon)을 부각시키고 희귀 코돈(rare codom)을 변형시켜 단백질의 생산을 증진시키는 방법을 말한다.
본 발명에 있어서, 상기 코돈 최적화된 염기서열은 서열번호 1의 HNF1A 유전자 단편 및 서열번호 2의 Hnf4a-F2A-Foxa3 유전자 단편을 나타내며, 이러한 코돈 최적화에 의해 비-바이러스성 벡터 시스템이지만 전달 효율을 높일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 체세포는 돼지의 섬유아세포인 것을 특징으로 한다.
본원발명은 이종 간 장기이식 시 장기 이식용 공여자(donor)로 이용되는 돼지의 섬유아세포를 이용하였다.
“돼지”는 이종 이식에 적합한 동물로 현재로서는 돼지가 가장 뛰어난 후보로 꼽히고 있다. 돼지는 공급가용성이 높으며, 이들 장기는 인간의 것과 크기가 비슷하다. 게다가, 의약용이 아니더라도 수세기 동안 인간에 의해 사육되어 온 동물이기 때문에 취급이 비교적 용이하다고 평가받고 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 소분자 화합물 A83-01을 더 포함하는, 체세포의 간세포로의 직접교차분화용 조성물이 제공된다.
상기 소분자 화합물인 A83-01은 조합 1(hHNF1A) 및 조합 2(hHF4A 및 hFOX3)으로 각각 처리된 체세포를 Tgfβ 신호전달(signaling)을 차단 및 억제하는 효과가 있어 체세포의 간세포로의 직접교차분화 효율을 높일 수 있다.
본 발명의 조성물에는 공지의 소분자 화합물이 추가로 더 포함될 수 있다. 이에 한정되는 것은 아니나 예를 들어 세포의 증식을 유도하는 Wnt 신호전달활성화 소분자화합물(CHIR99021)을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 체세포의 간세포로의 직접교차분화용 조성물을 이용하여 직접교차 분화된 줄기세포주가 제공된다.
본 발명에 의한 직접교차 분화된 줄기세포주는 야생주에 비하여, 돼지의 대표적인 효소인 CYP의 상대적인 유전자 발현이 높고, 계대배양이 진행됨과 상관없이 iHep의 간 기능을 확인할 수 있는 지방세포와 글리코겐 축적 정도가 높은 것으로 나타났다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, (a) 서열번호 1의 HNF1A 유전자 단편을 포함하는 비-바이러스성 벡터; 및 서열번호 2의 Hnf4a-F2A-Foxa3 유전자 단편을 포함하는 비-바이러스성 벡터로, 전사인자를 도입하여 배양하는 단계; 및 (b) 상기 전사 인자가 도입된 체세포를 소분자 화합물을 포함하는 배양액에서 배양하여 체세포를 간세포로 직접교차분화(direct reprogramming)시키는 단계;를 포함하는 체세포에서 간세포로의 직접교차분화 방법이 제공된다.
상기 단계 (a)는 체세포에 간세포로 전사를 유도하는 전사인자인 HNF1A, HF4A, 및 FOX3를 조합 1(hHNF1A) 및 조합 2(hHF4A 및 hFOX3)으로 도입한 후, 배양하는 단계이다.
상기 체세포는 섬유아세포 유래의 세포를 사용하는 것이 바람직하며, 돼지의 섬유아세포가 바람직하다.
상기 단계 (b)에서는 상기와 전사 유전자가 도입되어 직접교차분화가 유도된 체세포에 직접교차분화 효율을 향상시킬 수 있도록, 상기 체세포를 소분자 화합물을 포함하는 배양액에서 배양하여 체세포를 간세포로 직접교차분화시켜 직접교차분화 효율을 향상시키도록 구성할 수 있다.
이를 위해, 소분자화합물을 간세포 특이적인 배양액에서 상기 전사 유전자가 도입된 체세포를 48시간 배양하도록 구성할 수 있으며, 상기 배양액의 조성은 표 2와 같다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 체세포는 돼지 유래의 섬유아세포인 체세포에서 간세포로의 직접교차분화 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 비-바이러스성 벡터는 에피소말(episomal) 벡터인 체세포에서 간세포로의 직접교차분화 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 소분자 화합물이 A83-01인, 체세포를 간세포로 직접교차분화 방법이 제공된다. 상기 소분자 화합물인 A83-01은 조합 1(hHNF1A) 및 조합 2(hHF4A 및 hFOX3)으로 각각 처리된 체세포를 Tgfβ 신호전달(signaling)을 차단 및 억제하는 효과가 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1: 코돈 최적화(
codon
optimization)와
GC
함량 최적화(
GC
content optimization)된 3개의 전사 인자를 2개의 에피소말 벡터(episomal vectors)에 삽입된 고효율 벡터 시스템 구축
사람의 간 전사 인자 (hHNF1A, hHNF4A, hFOX3) 3개를 선택하고 각 유전자의 크기를 고려하여, 조합 1(hHNF1A) 및 조합 2(hHF4A 및 hFOX3)으로, 돼지의 섬유아세포에서 사용 시 가장 적절한 단백질 합성이 가능하도록 HNF1A(1914 bp)와 HNF4A-2A-hFOX3FH(2577bp)로 구성된 2개의 코돈 최적화(codon optimization)와 GC 함량 최적화(GC content optimization)된 백터를 구축하였다(도 1 및 도 2 참조).
실시예
2:
에피소말
벡터(
Episomal
vectors)의 삽입방법 최적화
돼지 섬유아세포 5x105 cells을 콜라겐이 코팅된 35 mm dish에 담고 이때 배양액 속에 1 uM 5 azacitidine을 첨가하여 세포를 디메틸화를 1일간 유도하였다. 24시간 후 Lipofectamine 3000을 이용하여 2개의 벡터를 넣고 48시간 동안 2 ml의 혈청과 항생제가 존재하지 않는 opti-MEM 배양액속에서 배양하였다. 4일차에 배양액을 간분화 배양액으로 교체하였다.
익스팬드 유도 간세포(Expand iHep)를 제작하기 위한 배양 방법 및 배양액 조성을 하기 표 1과 같이 구축하였다.
실시예
3:
익스팬드
유도 간세포(Expand
iHep
)의 제작
2주간 배양을 한 후 세포를 1:4로 나누어 계대배양을 실시하였다. 이때를 passage 1로 잡고 passage 2까지는 전체 세포를 계대배양하고 passage 3-4부터는 형성된 콜로니만을 따서 트립신 EDTA를 사용하여 단일 세포(single cell)로 만들어 35mm dish에 접종(seeding)하여 계속해서 배양하였다. 상기 세포주를 계대배양하여 passage 13까지 보관하였다(도 4 참조).
계대배양 0 내지 1단계까지는 전체 세포를 계대 배양하여 콜로니(colony)의 수를 증폭하고, 그 후에 계대배양 2 내지 3단계에서 콜로니(colonies)만을 채취하여 빈도와 순도를 높이고, 지속적으로 배양하면 도 4와 같이, 다각형과 다핵을 가진 전형적인 간세포 유사 세포로 유도가 가능하다.
또한, 소분자 화합물이 A83-01는 TGF-β-induced epithelial-to-mesenchymal transition을 차단하여 iHep의 형성을 촉진함을 확인하였다.
소분자 화합물(A83-01)의 첨가기간에 따른 piHep의 효율은 도 5에 나타내었다. 소분자 화합물인 a83-01을 사용하여 이것들이 얼마나 전사인자들의 발현을 도울 수 있는지 확인하였고 1주부터 4주까지 처리한 군(+)과 처리하지 않은 군(-)을 주수에 따라 비교하였다. 외부에서 주입한 3개의 유전자는 시간이 지남에 따라 침묵하는 것을 확인할 수 있었지만(도 5의 B), 같은 주에 처리하지 않은 군보다는 증가함을 확인할 수 있었다.
외부 전사인자의 도입은 내부 전자인자의 활성을 유도할 수 있는지를 확인 하였고(도 5의 C), 약물의 첨가는 유의적으로 내부전자 인자의 발현을 개선할 수 있음이 확인 되었다.
그리고 약물은 지속적으로 처리하는 것이 유전자 발현율을 높이는데 기여함을 확인할 수 있었다. (+ → - VS. + → +). 간의 대표적인 기능인 알부민과 트란스페린 분비에서 동일한 결과를 보였다.
실험예 1: 면역형광법
본 발명에 의한 직접교차분화 간세포의 생리 기능 및 특성을 확인하고자 하기와 같이 조직면역염색을 실시하였다.
4 Well culture dish속 커버글라스 위에 배양된 세포에 3.7% formaldehyde를 넣고 실온에서 20분간 고정시킨 후, 1% BSA가 함유된 PBS로 세 번 씻어내었다. 그 후 0.1% Triton X-100(Sigma)와 1% BSA가 포함된 PBS를 이용하여 상온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다(E-cadherin을 제외, 세포표면 인자). 1시간 후, 1차 안티바디를 넣고 4℃에서 오버나잇 동안 반응을 유도하였다. 실험을 위해 사용된 자세한 항체의 정보는 아래와 같다.
그 후, 1% BSA가 함유된 PBS로 세 번 씻어내고 형광이 부착된 2차 안티바디를 넣고 상온에서 1시간동안 인큐베이션 시켰다. 인큐베이션 후, 1% BSA가 함유된 PBS로 세 번 씻어내고 대조염색으로 DAPI Solution (1 mg/mL) (Thermo Scientific™)를 이용하여 세포핵을 염색후 형광현미경 아래에서 관찰하였다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 의한, 직접교차분화된 간세포의 생리학적 특성을 조직면역염색(immunohistochemistry, IHC) 분석한 결과를 보여주는 사진이다. 도 6에 나타난 바와 같이, 대표적인 간의 약물독성 분해에 관여된 CYP 유전자들의 발현과 간세포에서 발현되는 알부민 등의 단백질 및 간세포들간에 연접에 관련 단백질의 발현을 확인하였다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 의한, 직접교차분화된 간세포의 생리학적 특성을 Integrated Optical Density(IOD)로 보여주는 그래프이다. 도 7에 나타난 바와 같이, 형광 발현량을 확인하였을 때, 본 발명에 의한 코돈 최적화 벡터를 사용한 그룹이 보다 효율적임이 확인되었다.
실험예
2:
piHep의
약물 대사 활성(Drug Metabolic activity)
계대배양된 passage 7-10 사이의 에피소말 벡터(episomal vectors)을 이용한 간교차 분화 세포들이 잘 증식하고 있으며, 간 특이 유전자들의 발현이 관찰되고 특히 잠자고 있던 돼지 간 전사인자들이 활성화됨이 확인되었다. 특히 코돈 최적화(codon optimization)와 GC 함량 최적화(GC content optimization)된 벡터를 사용한 세포주는 야생형 형태보다 상대적으로 높은 iHep 발생율을 보였고, CYP 발현과 면역 단백질 염색에서 우수한 결과를 보였다(도 8 참조).
도 8은 본 발명의 일 실시예에 의한, 직접교차분화된 간세포에 간특이 유도자(inducer)를 처리한 후 CYP 효소의 발현 양상을 보여주는 그래프이다. 도 8에 나타난 바와 같이, 돼지에서 대표적인 CYP 효소의 발현을 확인하였고 계대배양 10에 도달한 세포주에서 약물 사용 전후 벡터에 따른 반응력을 확인하였고, 약물 처리 전후 모두 코돈 최적화(codon optimization)와 GC 함량 최적화(GC content optimization)된 그룹이 높게 발현됨을 확인하였다.
생성된 iHep에서 간특이 Cyp450 발현은 유도물질(inducer)들을 처리한 후 확인하여 코돈 최적화(codon optimization)와 GC 함량 최적화(GC content optimization)된 벡터가 우수함을 확인하였다(도 8 참조).
상기 Cyp 효소의 종류와 원형 유도자(Prototypical inducer)의 종류 및 유도 시간(Induction time)을 하기 표 2에 나타내었다.
Cyp1A2 효소의 경우, 유도자(inducer)는 3-Methylcholanthrene(3-MC)로, 유도시간(Induction rime)는 72시간으로 하였다.
Cyp1A4 효소의 경우, 유도자(inducer)는 Rifampicin(RIF)로, 유도시간(Induction rime)는 72시간으로 하였다.
실험예
3: 생성된 유도 간세포(
iHep
)의 성숙도 확인
교차분화 간세포의 성숙도를 확인하기 위해 지방 분화를 확인하였다.
도 9a 및 도 9b는 본 발명의 일 실시예에 의한, 직접교차분화된 간세포의 성숙도를 지방분화를 통해 보여주는 사진 및 그래프이다. 도 9a 및 도 9b에 나타난 바와 같이, 계대배양이 진행됨과 상관없이 모두 코돈 최적화(codon optimization)와 GC 함량 최적화(GC content optimization) 그룹(Opti-)이 상대적으로 높은 mRNA 발현과 Oil Red O 염색 반응을 보였다.
성숙된 간세포는 글리코겐이 축적되는 양상을 보임으로써, 이를 염색을 통하여 확인하였다.
도 10a 및 도 10b는 본 발명의 일 실시예에 의한, 직접교차분화된 간세포의 성숙도를 글라이코겐 축적을 통해 보여주는 사진 및 그래프이다. 도 9a 및 도 9b에 나타난 바와 같이, 계대배양이 진행됨과 상관없이 모두 코돈 최적화(codon optimization)와 GC 함량 최적화(GC content optimization) 그룹(Opti-)이 상대적으로 높은 mRNA 발현과 PAS 염색 반응을 보였다.
따라서, 본원발명의 교차분화 간줄기세포주는 초기 배양(early passage P1-2)된 세포와 후기 배양(Late passage P9-10)된 세포는 모두 상대적으로 높은 mRNA의 발현과 Oil red O 염색반응을 나타내었고, 이를 통하여, 초기 배양된 간줄기세포의 경우에도, 높은 성숙도를 갖는다는 것을 알 수 있다.
이상으로, 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION
<120> Composition for direct conversion of somatic cell into hepatocyte
using non-viral vector and method of direct conversion using the
same
<130> NPF-31254
<160> 2
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 1914
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 1
aagcttgcca ccatggtttc caagctgagc cagctgcaga ccgaactgct ggctgctctg 60
ctggaaagcg gcctgtctaa agaggccctg attcaggccc tgggagagcc tggaccttat 120
ctgcttgctg gcgagggccc actggataag ggcgaatctt gtggcggagg aagaggcgaa 180
ctggccgagc tgcctaatgg actgggcgag acaagaggca gcgaggacga gacagatgac 240
gacggcgagg atttcacccc tcctatcctg aaagagctgg aaaatctgag ccccgaggaa 300
gccgctcacc agaaagctgt ggtggaaacc ctgctgcaag aggacccttg gagagtggcc 360
aagatggtca agagctacct gcagcagcac aacatccctc agcgcgaggt ggtggatacc 420
acaggcctga accagagcca cctgtctcag cacctgaaca agggcacccc tatgaagacc 480
cagaagcggg ctgccctgta cacttggtac gtgcggaagc agagagaggt ggcccagcag 540
tttacacacg ctggacaagg cggactgatc gaggaaccta caggcgacga gctgcccacc 600
aagaaaggca gacggaaccg gtttaagtgg ggccctgcct ctcagcagat cctgtttcag 660
gcctacgagc ggcagaagaa ccccagcaaa gaggaaagag agacactggt cgaggaatgc 720
aaccgggccg agtgtatcca gaggggcgtt agtccttctc aggcccaagg cctgggcagc 780
aatctggtta cagaagtgcg ggtctacaat tggttcgcca accggcggaa agaggaagcc 840
ttcagacaca agctggccat ggacacctac agcggacctc cacctggacc aggacctgga 900
cctgcacttc ctgctcattc tagccctgga ctgcctcctc ctgctctgtc tccatctaag 960
gtgcacggcg tcagatatgg ccagcctgcc acatctgaga cagccgaggt tccatctagc 1020
tctggcggac ctctggtcac cgtgtctaca cctctgcatc aggtgtcccc aaccggcctg 1080
gaaccttctc acagcctgct gagcacagag gccaaactgg tgtcagctgc aggcggacca 1140
ctgcctccag tctctacact gacagccctg cacagcctgg aacagacaag ccccggactg 1200
aatcagcagc cccagaacct gattatggcc tctctgcccg gcgtgatgac aatcggacct 1260
ggcgaacctg cttctctggg ccccaccttt acaaacaccg gcgccagcac actggtcatc 1320
ggactggctt ctacacaggc ccagagcgtg cccgtgatca atagcatggg cagcagcctg 1380
accacactgc agcctgtgca gtttagccag cctctgcacc cctcttacca gcagcctctg 1440
atgccaccag tgcagagcca cgtgacacag agccctttca tggccacaat ggcccagctg 1500
caaagccctc acgctctgta ctctcacaag cccgaagtgg cccagtacac ccacacagga 1560
ctgctgcctc agaccatgct gatcaccgac accaccaatc tgagcgccct ggctagcctg 1620
acacctacca aacaggtgtt caccagcgac accgaggcca gctctgaatc tggactgcac 1680
acaccagcca gccaggccac aacactgcat gtgccatctc aggatccagc cggcatccag 1740
catctgcagc cagctcatag actgagcgcc tctccaacag tgtccagctc tagcctggtg 1800
ctgtaccaga gcagcgacag cagcaatggc cagagccatc tgctgcctag caaccacagc 1860
gtgatcgaga cattcatcag cacccagatg gccagcagca gccagtaggg atcc 1914
<210> 2
<211> 2577
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 2
aagcttgcca ccatgcggct gagcaagacc ctggtggata tggacatggc cgactacagc 60
gccgctctgg atcctgccta caccacactg gaattcgaga acgtgcaggt cctgaccatg 120
ggcaacgaca catctccaag cgagggcacc aacctgaacg cccctaatag cctgggagtg 180
tctgccctgt gtgccatctg tggcgataga gccacaggca agcactacgg cgccagctct 240
tgtgatggct gcaagggctt ctttcggcgg agcgtgcgga agaaccacat gtacagctgc 300
cggttcagcc ggcagtgcgt ggtggacaag gacaagagaa accagtgccg gtactgcaga 360
ctgaagaagt gcttcagagc cggcatgaag aaagaggccg tccagaacga gcgggacaga 420
atcagcacca gaagaagcag ctacgaggac agcagcctgc ctagcatcaa tgccctgctg 480
caggccgagg ttctgagcag acagatcaca agccctgtgt ccggcatcaa cggcgacatc 540
agagccaaga agatcgccag cattgccgac gtgtgcgaga gcatgaagga acagctgctg 600
gtgctggtgg aatgggccaa gtacatcccc gccttttgcg agctgcccct ggatgatcaa 660
gtggccctgc tgagagcaca cgccggcgaa catttgctgc tgggagccac caagcggagc 720
atggtgttca aggatgtgct gctgctcggc aacgattaca tcgtgcccag acactgtcct 780
gagctggccg agatgagccg ggtgtccatc agaatcctgg acgaactggt gctgcccttc 840
caagagctgc agatcgacga caacgagtac gcctacctga aggccatcat ctttttcgac 900
cccgacgcca agggcctgag cgatcctgga aagatcaagc ggctgcggag ccaggtgcaa 960
gtgtccctgg aagattacat caacgaccgg cagtacgaca gccggggcag atttggagaa 1020
ctgctgctcc tgctgccaac actgcagagc atcacctggc agatgatcga gcagatccag 1080
ttcatcaagc tgttcggcat ggccaagatc gacaacctgc tgcaagagat gctgcttggc 1140
ggcagccctt ctgatgcccc tcatgctcat caccctctgc accctcacct gatgcaagaa 1200
cacatgggca ccaatgtgat cgtggccaac acaatgccca cacacctgag caacggccag 1260
atgtgcgaat ggcctagacc tagaggacag gccgccacac ctgaaacacc tcagccttct 1320
ccacctggcg gatctggcag cgagccttac aaacttctgc ctggcgctgt ggccaccatc 1380
gtgaaacctc tgtctgccat tcctcagcct accatcacca agcaagaagt gatccggaag 1440
cggagagccc ctgtgaagca gaccctgaac ttcgacctgc tgaaactggc cggcgacgtg 1500
gaaagcaacc ctggacctat gctgggcagc gtgaagatgg aagcccatga tctggccgag 1560
tggtcttact atcctgaggc cggcgaggtg tacagccctg tgacacctgt tcctacaatg 1620
gcccctctga acagctatat gaccctgaat cctctgagca gcccctatcc tcctggtgga 1680
cttcctgcta gccctctgcc ttctggacct cttgctcctc ctgctccagc tgctcctctg 1740
ggccctacat ttcctggact gggagtttct ggcggctcta gcagctctgg atatggcgct 1800
cctggaccag gactggtgca cggcaaagag atgcccaagg gctacagaag gcctctggct 1860
cacgccaagc ctccatacag ctacatcagc ctgatcacca tggccatcca gcaggcccct 1920
ggcaagatgc tgacactgag cgagatctac cagtggatca tggatctgtt cccttactac 1980
cgcgagaacc agcagcggtg gcagaacagc attagacaca gcctgagctt caacgactgc 2040
ttcgtgaagg tggccagatc tcccgacaag cctggcaagg gctcttactg ggctctgcat 2100
cctagcagcg gcaacatgtt cgagaatggc tgctacctgc ggcggcagaa gcggttcaag 2160
ctggaagaga aagtgaagaa aggcggctcc ggcgctgcca ccacaaccag aaatggaaca 2220
ggatctgccg ccagcaccac aacaccagcc gctacagtta caagccctcc tcagccacct 2280
cctccagcac ctgaacctga agctcaaggc ggagaagatg tgggcgccct ggattgtgga 2340
agccctgcca gctctacccc ttacttcacc ggacttgagc tgcccggcga gctgaaactc 2400
gacgcccctt acaacttcaa tcaccccttc agcatcaaca acctgatgtc cgagcagacc 2460
cctgctcctc caaagctgga tgttggcttt ggcggctatg gcgctgaagg cggcgaacct 2520
ggtgtctact atcagggcct gtacagcaga agcctgctga acgcctcttg aggatcc 2577
Claims (10)
- 서열번호 1의 HNF1A 유전자 단편을 포함하는 비-바이러스성 벡터; 및
서열번호 2의 Hnf4a-F2A-Foxa3 유전자 단편을 포함하는 비-바이러스성 벡터를 포함하고,
상기 비-바이러스성 벡터는 에피소말(episomal) 벡터이고,
체세포의 간세포로의 직접교차 분화를 유도하고,
상기 체세포는 섬유아세포인, 체세포의 간세포로의 직접교차분화용 조성물.
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 비-바이러스성 벡터는 코돈 최적화(codon optimization)와 GC 함량 최적화(GC content optimization)된 전사 인자가 삽입된 벡터인, 체세포의 간세포로의 직접교차분화용 조성물.
- 제1항에 있어서,
소분자 화합물 A83-01을 더 포함하는, 체세포의 간세포로의 직접교차분화용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 체세포는 돼지의 섬유아세포인 것을 특징으로 하는, 체세포의 간세포로의 직접교차분화용 조성물.
- 제5항에 기재된 체세포의 간세포로의 직접교차분화용 조성물을 이용하여 직접교차 분화되고, CYP(Cytochrome P-450)의 유전자가 발현되는, 돼지의 간세포.
- (a) 서열번호 1의 HNF1A 유전자 단편을 포함하는 비-바이러스성 벡터; 및 서열번호 2의 Hnf4a-F2A-Foxa3 유전자 단편을 포함하는 비-바이러스성 벡터로, 전사인자를 체세포에 도입하여 배양하는 단계; 및
(b) 상기 전사인자가 도입된 체세포를 소분자 화합물을 포함하는 배양액에서 배양하여 체세포를 간세포로 직접교차분화(direct reprogramming)시키는 단계;를 포함하고,
상기 비-바이러스성 벡터는 에피소말(episomal) 벡터이고,
상기 체세포는 섬유아세포인, 체세포에서 간세포로의 직접교차분화 방법.
- 제7항에 있어서,
상기 체세포는 돼지에서 유래된 것인, 체세포에서 간세포로의 직접교차분화 방법.
- 삭제
- 제7항에 있어서,
상기 소분자 화합물은 A83-01인, 체세포에서 간세포로의 직접교차분화 방법.
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Applications Claiming Priority (1)
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| KR1020170132734A KR102010840B1 (ko) | 2017-10-12 | 2017-10-12 | 비-바이러스 벡터를 이용한 체세포의 간세포로의 직접교차분화용 조성물 및 직접교차분화 방법 |
Publications (2)
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| KR20190041304A KR20190041304A (ko) | 2019-04-22 |
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| KR1020170132734A KR102010840B1 (ko) | 2017-10-12 | 2017-10-12 | 비-바이러스 벡터를 이용한 체세포의 간세포로의 직접교차분화용 조성물 및 직접교차분화 방법 |
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| KR101768451B1 (ko) * | 2014-10-27 | 2017-08-31 | 건국대학교 글로컬산학협력단 | 비-바이러스성 벡터를 이용하여 체세포를 간세포로 직접 교차분화시키는 방법 |
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-
2017
- 2017-10-12 KR KR1020170132734A patent/KR102010840B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (1)
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| Cell Stem Cell,18(6),797-808 |
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