KR102007731B1 - 티카그렐러를 포함하는 자가 미세유화 약물전달시스템 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents

티카그렐러를 포함하는 자가 미세유화 약물전달시스템 조성물 및 이의 제조방법 Download PDF

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이혜진
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Abstract

본 발명은 티카그렐러 함유 자가 미세유화 약물전달시스템 조성물, 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 본 발명의 조성물은 티카그렐러의 난용성 및 낮은 장관 투과도를 개선하여 생체이용률을 향상시킬 수 있는 효과가 있다.

Description

티카그렐러를 포함하는 자가 미세유화 약물전달시스템 조성물 및 이의 제조방법{Composition of self-microemulsifying drug delivery systems containing ticagrelor and manufacturing process thereof}
본 발명은 티카그렐러의 난용성을 개선하고 생체 이용률을 증가시키기 위한 자가 미세유화 약물 전달시스템 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
티카그렐러(Ticagrelor)는 통상적으로는 (1S,2S,3R,5S)-3-[7-[[(1R,2S)-2-(3,4-디플루오로페닐)시클로프로필]아미노]-5-(프로필티오)-3H-1,2,3-트리아졸로[4,5-d]피리미딘-3-일]-5-(2-하이드록시에톡시)-1,2-시클로펜탄디올이라고 명명되며, 하기 화학식 I의 구조를 갖는 화합물이다.
Figure 112018015362594-pat00001
티카그렐러는 브릴린타®(Brilinta®)라는 제품명으로 급성관상동맥증후군[불안정성 협심증, ST 분절 비상승 심근경색(NSTEM) 또는 ST 분절 상승 심근경색(STEMI) 환자에 있어서, 약물치료, 관상중재시술(PCI) 또는 관상동맥회로 우회술(CABG)을 받은 환자를 포함]인 성인 환자에서 아스피린과 병용하여, 혈전성 심혈관 질환(심혈관 이상으로 인한 사망, 심근경색, 뇌졸중)의 발생률 감소 용도로 시판되어 오고 있으며 미국등록특허 US6251910에서 나타낸 것처럼 혈소판응집억제 작용을 통해 심혈관 질환 위험이 잠재된 환자의 위험률을 낮출 수 있는 약물이다.
그러나, 상기 티카그렐러를 유효성분으로 포함하는 종래 약학 조성물은 유효성분의 성질로 물에 대한 용해도는 10μg/mL 이하로 매우 난용성이며, 생체이용률은 36%로 낮다. 더욱이, 티카그렐러는 생물약제학적 분류체계(biopharmaceutics classification system; BCS)에 의거하여 class 4에 속하는 약물로서 용해도가 낮아 위장관내 약물 방출이 적으며, 장관 투과도가 낮아 위장관 점막을 통한 흡수가 덜되어 생체이용률이 낮은 단점이 있다. 미국등록특허 US8425934는 티카그렐러를 적절한 약제학적 부형제와 혼합하여 난용성 약물인 티카그렐러가 단시간에 방출되는 제약조성물을 얻었으나, 이는 일반 방출제제로서 난용성이 여전히 문제된다.
따라서, 이처럼 난용성 약물인 티카그렐러의 생체이용률을 높이기 위해 가용화 기술의 필요성이 제기되고 있으며, 제조가 용이하고 보관과 안정성이 좋으며 약물의 용해도와 체내 흡수를 증가시킬 수 있는 방법에 관한 연구가 지속적으로 시도되고 있다.
종래 선행기술로서 미국공개특허 US2017-0112775는 치료 약물의 생체이용률을 증가시킨 자가조립 나노입자에 관한 기술을 개시하고 있으나, 이는 티카그렐러의 난용성을 개선하고 생체이용률을 향상시키는 데에 적합한 성분 조성, 또는 이를 포함하는 자가조립 나노입자에 대해 제시하지 않고 있다. 또한, 상기 자가조립 나노입자는 약물 수용량이 적어 실제 복용 시 제품의 부피가 매우 커서 복용하기 불편한 단점이 있다.
본 발명자들은 티카그렐러의 난용성을 개선하고 생체이용률을 향상시킬 수 있는 연구를 진행한 결과, 활성성분인 티카그렐러를 자가 미세유화 약물전달시스템(self-microemulsifying drug delivery systems)에 적용한 제형을 개발하였으며, 이러한 제형이 티카그렐러를 가용화하여 안정한 에멀젼 상태로 존재하게 해서 티카그렐러의 생체이용률을 향상시킬 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
미국등록특허 US6251910 (1,2,3-TRIAZOLO[4,5-D]PYRIMIDINES AS P2T RECEPTOR ANTAGONISTS, 2001. 6. 26. 등록) 미국등록특허 US8425934 (PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS, 2013. 4. 23. 등록) 미국공개특허 US2017-0112775 (SITU SELF-ASSEMBLING PRO-NANOPARTICLE COMPOSITIONS AND METHODS OF PREPARATION AND USE THEREOF, 2017. 4. 27. 공개)
본 발명의 목적은, 티카그렐러의 난용성 및 낮은 장관 투과도를 개선하여 생체이용률을 향상시킬 수 있는 자가 미세유화 약물전달시스템(self- microemulsifying drug delivery systems) 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 티카그렐러 함유 자가 미세유화 약물전달시스템 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 티카그렐러 함유 자가 미세유화 약물전달시스템 조성물을 포함하는 경구용 제제를 제공하는 것이다.
본 발명은,
활성 물질로서 티카그렐러; 및
오일, 계면활성제, 및 보조계면활성제를 포함하는 유화 조성물;
을 함유하는 자가 미세유화 약물 전달시스템 조성물에 관한 것이다.
상기 유화 조성물은 유화 조성물의 총 중량 기준으로 오일 10~40중량%, 계면활성제 10~80중량% 및 보조계면활성제 10~80중량%일 수 있다.
상기 자가 미세유화 약물전달시스템 조성물은 유화 조성물과 티카그렐러를 10:1 내지 4:1의 중량비로 함유할 수 있다.
상기 오일은 천연오일류, 폴리옥실글리세라이드류, 카프릴릭/카프릴산 글리세라이드류, 이소프로필 미리스테이트, 이소프로필 팔미테이트, 트리글리세라이드, 프로필렌글리콜 유도체류, 및 글리세릴 모노올리에이트로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 바람직하게는 카프릴릭/카프릴산 글리세라이드류, 프로필렌글리콜 모노카프릴레이트 및 글리세릴 모노올리에이트로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 피마자유 유도체류, 카프릴로카프로일 마크로골 글리세라이드류, 소르비탄 유도체류, 폴리옥시에틸렌 알킬에테르, 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체, 및 폴리옥시에틸렌스테아레이트류로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 바람직하게는 폴리옥시에틸렌 피마자유 유도체류, 카프릴로카프로일 마크로골 글리세라이드류, 및 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 보조계면활성제는 테트라글리콜, 프로필렌글리콜, 디에틸렌글리콜 모노에틸에테르, 및 폴리에틸렌글리콜로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 오일은 카프릴릭/카프릴산 글리세라이드류이고, 상기 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 피마자유 유도체류 및 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 중 1종 이상이며, 상기 보조계면활성제는 디에틸렌글리콜 모노에틸에테르 및 테트라글리콜 중 1종 이상일 수 있다.
본 발명은, 다른 양태에 따르면, 자가 미세유화 약물 전달시스템 조성물의 제조방법으로서, 오일, 계면활성제 및 보조계면활성제를 혼합하여 유화 조성물을 생성하는 단계(1단계); 및 상기 유화 조성물에 티카그렐러를 첨가하는 단계(2단계);를 포함한다.
본 발명은, 또 다른 양태에 따르면, 상기 자가 미세유화 약물 전달시스템 조성물을 포함하는 경구 투여용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 더 상세하게 설명한다.
본 발명에서, ‘자가 미세유화 약물전달시스템(self-microemulsifying drug delivery systems) 조성물’이란 물이나 생체 내 체액과 접촉하여 활성성분이 용해된 마이크로 에멀젼을 형성하는 조성물을 말한다. 본 발명의 자가 미세유화 약물전달시스템 조성물은 자가 미세유화 되어 안정한 에멀젼 상태로 존재함으로써, 활성성분의 난용성과 낮은 장관투과도를 개선하여, 생체이용률을 향상시킬 수 있는 효과가 있다.
본 발명의 자가 미세유화 약물 전달시스템 조성물은, 오일, 계면활성제 및 보조계면활성제를 혼합하여 유화 조성물을 생성하는 단계(1단계); 및 상기 유화 조성물에 티카그렐러를 첨가하는 단계(2단계);를 포함해서 제조된다.
본 발명에서 ‘유화 조성물’이란 활성 성분인 티카그렐러를 용해시키고 수상과 접촉 시 티카그렐러 마이크로 에멀젼을 형성될 수 있도록 하는 조성물을 말한다.
상기 유화 조성물은 유화 조성물의 총 중량 기준으로 오일 10~40중량%, 계면활성제 10~80중량% 및 보조계면활성제 10~80중량%이 혼합되는 것이 바람직하고, 오일 10~20중량%, 계면활성제 45~65중량%, 및 보조계면활성제 25~45중량%가 혼합되는 것이 보다 바람직하다.
본 발명에서 오일은 계면활성제와 잘 혼합되고 수중에서 유화되어 안정한 에멀젼을 형성하며 활성성분인 티카그렐러에 대한 충분한 용해도를 갖는 약제학적으로 허용 가능한 오일을 사용할 수 있다. 상기 오일은 천연오일류로서 아마인유, 면실유, 해바라기씨유, 광물유, 올레산, 피마자유, 올리브유 등; 폴리옥실글리세라이드류로서 올레오일 폴리옥실글리세라이드(Labrafil M 1944), 리노레오일 폴리옥실글리세라이드(Labrafil M 2125), 라우로일 폴리옥실글리세라이드(Labrafil M 2130) 등; 카프릴릭/카프릴산 글리세라이드류(Capmul MCM); 이소프로필 미리스테이트; 이소프로필 팔미테이트; 트리글리세라이드로서 카프릴릭/카프릭산 트리글리세라이드(Labrafac CC) 및 중쇄(medium-chain) 트리글리세라이드(Labrafac Lipophile WL 1349) 등; 프로필렌글리콜 유도체류로서 프로필렌글리콜 모노카프릴레이트(Capryol 90, Capryol PGMC), 프로필렌글리콜 디카프릴로카프레이트(Labrafac PG), 프로필렌글리콜 모노라우레이트(Lauroglycol 90, Lauroglycol FCC) 등; 및 글리세릴 모노올리에이트(Peceol) 중에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 카프릴릭/카프릴산 글리세라이드류(Capmul MCM), 프로필렌글리콜 모노카프릴레이트(Capryol 90, Capryol PGMC) 및 글리세릴 모노올리에이트(Peceol)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용하며, 보다 바람직하게는 카프릴릭/카프릴산 글리세라이드류를 사용한다.
상기 오일의 함량이 유화 조성물의 총 중량을 기준으로 10중량% 미만일 경우 티카그렐러의 가용화가 어려워 침전이 생길 수 있으며, 40중량%를 초과할 경우 오일의 상분리가 나타나 에멀젼이 생성되지 않는 문제점이 발생할 수 있다. 따라서, 상기 오일은 유화 조성물의 총 중량 기준으로 10~40중량%로 사용하는 것이 바람직하며, 10~20중량%로 사용하는 것이 보다 바람직하다.
본 발명에서 계면활성제는 난용성인 티카그렐러를 용해시키는 용해제로서 작용하며, 위장관에서 약물의 재결정을 막고, pH에 관계없이 오일과 보조계면활성제의 수상에 대한 표면장력을 작게 만들어 제형을 안정하게 에멀젼화 시킴으로써 입도를 작게하고 약물의 효과적인 흡수를 가능하게 한다. 본 발명에서는 비이온성 계면활성제를 사용할 수 있고, 폴리옥시에틸렌 피마자유 유도체류(Cremophor EL); 카프릴로카프로일 마크로골 글리세라이드류(Labrasol); 소르비탄 유도체류(Span); 폴리옥시에틸렌 알킬에테르(Brij); 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산(Tween); 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체(Pluronic); 및 폴리옥시에틸렌스테아레이트류(Myrj) 중에서 선택된 1종 이상의 계면활성제를 사용할 수 있다. 바람직하게는 폴리옥시에틸렌 피마자유 유도체류(Cremophor EL), 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산(Tween), 카프릴로카프로일 마크로골 글리세라이드류(Labrasol), 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체(Pluronic)를 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 폴리옥시에틸렌 피마자유 유도체류(Cremophor EL), 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산(Tween)을 사용할 수 있다.
본 발명에서 유화 조성물의 총 중량 기준으로 10중량% 미만의 계면활성제 사용은 오일과 보조 계면활성제의 표면장력을 충분히 낮추지 못하여 유화가 발생하기 어려우며 이에 따른 침전이 발생할 수 있다. 80중량% 이상의 계면활성제 사용은 오일과 보조계면활성제의 적은 사용으로 상평형 상태를 유지하기 어려우며 활성성분인 티카그렐러를 충분히 가용화시키지 못하게 되고, 위장관내 부작용을 유발할 수 있다. 상기 계면활성제는 유화 조성물의 총 중량기준으로 45~65중량%를 사용하는 것이 보다 바람직하다.
본 발명에서 보조계면활성제는 자가 미세유화 약물전달시스템의 가용화능력을 제공하고 성상의 안정성을 향상시킬 수 있어, 제형의 층분리 및 활성성분의 침전의 발생을 막고 에멀젼의 균일성을 확보할 수 있다. 본 발명에서는 테트라글리콜(tetraglycol), 프로필렌글리콜(proplyene glycol), 디에틸렌글리콜 모노에틸에테르(Transcutol), 폴리에틸렌글리콜(PEG 400) 중에서 선택된 1종 이상의 보조계면활성제를 사용할 수 있다. 바람직하게는 테트라글리콜, 디에틸렌글리콜 모노에틸에테르(Transcutol)를 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 디에틸렌글리콜 모노에틸에테르(Transcutol)를 사용할 수 있다. 본 발명에서 유화 조성물의 총 중량 기준으로 10 중량% 미만의 보조계면활성제는 티카그렐러의 충분한 가용화가 어려우며, 80 중량% 초과의 보조계면활성제는 충분한 유화를 어렵게 하며 수상 희석 시 상분리로 침전이 발생하는 문제가 있어 바람직하지 않다. 따라서, 상기 보조계면활성제는 10~80중량%를 사용하는 것이 바람직하며, 25~45중량%를 사용하는 것이 보다 바람직하다.
상기 오일, 계면활성제 및 보조계면활성제를 혼합하여 유화 조성물을 제조한 후 활성성분 티카그렐러를 첨가하여 액상의 자가 미세유화 약물전달시스템 조성물을 제조할 수 있다.
상기 유화 조성물과 티카그렐러는 10:1 내지 4:1의 중량비로 혼합될 수 있다. 유화 조성물과 티카그렐러의 중량비가 4:1인 경우에 비해 티카그렐러의 양이 증가하면 티카그렐러가 유화 조성물에 충분히 용해되지 못하며 투여 후 수상과 접촉 시 침전 형성이 많아지고 불투명 정도가 높아 바람직하지 않다. 또한, 상기 유화 조성물과 티카그렐러의 중량비 10:1인 경우에 비해 티카그렐러의 양이 적으면 유화 조성물의 양이 많기 때문에 복용에 불편한 문제가 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 상기 자가 미세유화 약물전달시스템 조성물을 포함하는 경구 투여용 약제학적 조성물을 제공한다.
상기 약제학적 조성물은, 급성관상동맥증후군, 뇌졸중 등의 혈전으로 인한 질환 치료 등에 우수한 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 투여용 제형, 예를 들면, 정제, 트로키제(troches), 로진지(lozenge), 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 경질 또는 연질 캡슐, 시럽 또는 엘릭실제(elixirs) 등으로 제제화된다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해, 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 첨가제로서, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제; 스테아린산 마그네슘, 스테아린산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨과 같은 활택제가 함유될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 환자의 질환 종류, 질환의 경중, 제형의 종류, 환자의 연령, 성별, 체중, 건강 상태, 식이, 약제학적 치료용 조성물의 투여 시간 및 투여 방법, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 성인 기준으로 1일당 0.001~100mg/kg이고, 보다 바람직하게는 0.01~80mg/kg(체중)이며, 가장 바람직하게는 0.1~60mg/kg(체중)이다. 또한, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.
본 발명의 자가 미세유화 약물전달시스템 조성물은 혈소판응집억제제인 티카그렐러의 난용성 및 낮은 장관 투과도를 개선하여 생체이용률을 현저히 향상시킬 수 있는 효과가 있다. 또한, 본 발명에 따른 티카그렐러의 약제 조성물은 활성성분의 효과를 증진시키고 사용량을 줄일 수 있어 다양한 경구 투여용 제제로 개발이 가능하다.
도 1은 본 발명에서 오일 Capmul MCM, 계면활성제 Cremophor EL, 보조계면활성제 Transcutol P의 조성에 따른 특성 변화를 상평형도로 나타낸 것이다. 노란색 범위는 입자크기가 150nm 이하의 에멀젼을 형성하였고 투과율(transmittance)는 95% 이상을 보여주었다. 파란색 범위는 입자크기가 150~300nm의 에멀젼을 형성하였으며 투과율은 90~95%를 나타내었다. 초록색 범위는 입자크기가 300nm의 에멀젼을 형성하였으며 투과율은 75% 이상을 나타내었다. 파란색 범위와 노란색 범위 내 비율이 Design expert 10에 적용하기 위한 범위이다.
도 2는 오일 Capmul MCM, 계면활성제 Tween 20, 보조계면활성제 Transcutol P를 사용하여 조성에 따른 특성 변화를 상평형도로 나타낸 것이다.
도 3은 인자인 오일(X1), 계면활성제(X2), 보조계면활성제(X3)의 조성에 따른 반응변수의 상관관계를 그래프로 나타낸 것이다.
도 4는 목표하는 반응변수를 갖는 인자 조성을 만족도 함수(Desirability function)를 통해 최적의 조성을 제시한 그래프이다.
도 5는 정제수 용출액에서 대조약 브릴린타®(Brilinta®)와 실시예 1 내지 5 과 비교예 1 및 2의 용출 비교 시험 결과이다.
도 6는 정제수, pH 1.2, pH 4.0, pH 6.8 용출액에서 대조약 브릴린타®(Brilinta®)와 본 발명의 티카그렐러 함유 자가 미세유화 약물전달시스템 조성물(실시예 1)의 용출 비교 시험 결과이다.
도 7은 본 발명의 티카그렐러 함유 자가 미세유화 약물전달시스템 조성물(실시예 1)의 에멀젼 형성을 확인한 TEM(Transmission electron microscopy) 사진이다.
도 8은 세포독성실험 결과로 티카그렐러 용액(ticagrelor), 티카그렐러 미함유 자가 미세유화 약물전달시스템(Blank-실시예 1), 본 발명의 티카그렐러 함유 자가 미세유화 약물전달시스템 조성물(실시예 1)의 농도에 따른 세포독성 시험 결과이다.
도 9는 본 발명의 티카그렐러 함유 자가 미세유화 약물전달시스템 조성물(실시예 1)과 대조군인 티카그렐러 현탁액(Control)의 약물동력학적 프로파일 결과이다.
도 10는 본 발명의 티카그렐러 함유 자가 미세유화 약물전달시스템(실시예 1)의 투여량 10 mg/kg, 5 mg/kg, 2mg/kg에 따른 약력학적 프로파일 결과이다.
도 11는 대조군인 티카그렐러 함유 현탁액(control)의 투여량 10 mg/kg, 5 mg/kg, 2mg/kg에 따른 약력학적 프로파일 결과이다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
< 실험예 1. 자가 미세유화 약물전달시스템 조성물의 오일, 계면활성제, 및 보조계면활성제 선정>
1-1. 용해도 실험
티카그렐러에 대한 높은 용해도를 갖는 물질을 선정하기 위해 각 오일, 계면활성제, 및 보조계면활성제에 대한 포화 용해도 실험을 실시하였다.
시험은 다음과 같이 실시하였다. 티카그렐러 20mg을 각 물질 1 mL에 가한 뒤 상온에서 교반하고 티카그렐러가 모두 녹을 경우 원료를 더 추가한 후 72시간 동안 교반하여 포화시켰다. 이를 원심분리기 15,000rpm에서 10분간 원심분리한 후 상등액을 취하여 프로판올로 희석하고 0.45um의 시린지 필터(syringe filter)로 여과한 뒤 여과액을 HPLC로 분석하였다.
<HPLC 분석법>
컬럼 : Xterra® RP18 (C18, 5um, 4.6 × 250mm, Waters)
이동상 : 아세토나이트릴 : 50mM 아세트산 암모늄 (pH 8.2, pH는 6M 수산화 암모늄으로 조절) = 58:42 (v/v)
주입량 : 20μL
유속 : 1.0mL/min
검출파장 : 254nm
그 결과, 표 1에 기재된 바와 같이, 오일은 Capmul MCM에서 용해도가 다른 오일에 비해 월등히 높았으며, 카프리올 90(Capryol 90), 카프리올 PGMC(Capryol PGMC), 및 퍼세올(Peceol) 순으로 용해도가 우수하였다. 계면활성제는 트윈 20(Tween 20), 트윈 80(Tween 80), 라브라솔(Labrasol), 크레모포어 EL(Cremophor EL)가 높은 용해도를 보여주었다. 보조계면활성제는 테트라글리콜(Tetraglycol), 트랜스큐톨 P(Transcutol P)가 높은 용해도를 보여주었다. 다음 실험예에서 다양한 첨가제를 사용하여 조성물을 제조하였다.
첨가제 용해도 (mg/mL)
오일 Capryol 90 42.97±2.751
Capryol PGMC 32.94±1.776
Capmul MCM 101.19±6.554
Labrafil M 1944 10.58±0.572
Labrafil M 2125 9.37±0.36
Labrafac lipiphile WL 1349 0.45±0.025
Peceol 27.55±0.932
Lauroglycol 90 22.40±1.250
Lauroglycol FCC 8.81±0.215
Labrafac CC 0.40±0.071
Isopropyl myristate 0.2±0.015
Isopropyl palmitate 0.12±0.009
Linseed oil 0.28±0.008
Cotton seed oil 0.15±0.001
Sunflower oil 0.03±0.001
Mineral oil < 0.01
Oleic acid 8.41±0.014
Castor oil 4.71±0.005
Olive oil 0.09±0.001
계면활성제 Cremophor EL 152.16±6.527
Pluronic L64 113.12±7.513
Labrasol 160.3±3.006
Tween 80 165.48±6.981
Tween 20 181.54±1.215
보조계면활성제 Propylene glycol 104.13±2.713
Tetraglycol 420.34±20.324
Transcutol P 369.51±9.961
PEG 400 225.86±2.664
1-2. 에멀젼화 평가
상기 용해도 실험 결과를 기반으로, 하기 표에서와 같이 오일 :계면활성제:보조계면활성제 = 2:4:4의 조성으로 제조한 후 정제수, pH 1.2, pH 4.0, pH 6.8 액에 제제를 각 용액으로 1:100 비율로 희석하여 에멀젼화를 평가하였다. 비교예 1 및 2는 선행문헌 US2017-0112775의 실시예에서 제시한 조성으로 제조하였다. 에멀젼화는 입도크기, 투과율로 평가하였으며 성상과 침전 형성 유무는 육안으로 확인하였다. 표 2의 기준에 따라 등급으로 분류하였고, 실험결과는 표 3에 나타내었다.
등급 에멀젼화 정도 입도(nm) 투과율(%) 성상
A Excellent <150 >95 Clear and transparent
B Good 150 ~ 300 90 ~ 95 Slightly less clear
C Fair 300 ~ 500 75 ~ 90 Bluish white
D Poor >500 <75 Milky
오일 계면활성제 보조계면활성제 희석 용액
정제수 pH 1.2 pH 4.0 pH 6.8
등급 등급 등급 등급
Capmul MCM Pluronic L64 Transcutol P C C D C
Tetraglycol C C C C
Tween 80 Transcutol P A B B B
Tetraglycol B B B B
Tween 20 Transcutol P A A A B
Tetraglycol B B A B
Cremophor EL Transcutol P A A A A
Tetraglycol A A A A
Capyol 90 Labrasol Tetraglycol B B B B
Peceol Tween 80 Transcutol P B B B B
비교예11 ) Oleic aicd TPGS - D D D D
비교예 22) Miglyol 812 TPGS - D D D D
1) 비교예 1은 Oleic acid:TPGS(D-alpha-tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate)의
중량비가 1:2임
2) 비교예 2는 Miglyol 812(Caprylic/capric triglyceride):TPGS의 중량비가 1:1임
상기 표 3에서 확인되는 바와 같이, 오일 및 계면활성제의 종류가 에멀젼 형성에 많은 영향을 주었다. 오일로서 Capmul MCM을 사용하고 계면활성제로서 Tween 20 또는 Cremophor EL을 사용할 경우 보조 계면활성제의 종류에 관계없이 A 또는 B 등급의 우수한 에멀젼화를 나타내었고 침전 형성도 거의 없음을 확인할 수 있었다. 보조계면활성제는 Transcutol P를 사용하는 경우, 계면활성제로 Tween 20 또는 Cremophor EL를 사용하여 제조한 에멀젼의 에멀젼화 등급이 높았다.
또한, 오일로서 Capryol 90 또는 Peceol을 사용하고, 계면활성제로서 Labrasol, Tween 80, Tween 20, Cremophor EL을 사용할 경우에도 B 등급 이상의 우수한 에멀젼화를 나타내었다.
비교예 1의 경우 시간이 지나면 침전형성이 발견되며 투과율은 약 60~70%로 낮았다. 또한, 비교예 2의 경우 침전형성이 발견되지 않았으나 투과율이 60~70%로 에멀전화 정도는 D로 평가되었다.
< 실험예 2. 자가 미세유화 약물 전달시스템 조성물의 최적화를 위한 실험설계법>
2-1. 3 성분계 상평형도 작성 및 실험설계법(DOE)의 인자(Factor) 범위 선정
실험예 1-1 및 1-2의 결과를 기반으로, 오일로서 Capmul MCM, 계면활성제로서 Tween 20 또는 Cremophor EL, 보조계면활성제로서 Transcutol P를 사용하여 3성분계 상평형도를 작성하고 에멀젼화를 평가하였다. 상기 3성분을 혼합한 유화 조성물을 제조하고 나서, 활성성분인 티카그렐러를 첨가하지 않은 상태에서, 정제수로 1:100 으로 희석한 후 평가하여 에멀젼 형성 영역을 표시하였다. 계면활성제의 종류를 달리하여 에멀젼이 형성되는 범위가 더 넓은 조성물을 선택한 후 실험설계법(DOE)을 진행하고자 하였다. 에멀젼 형성 평가는 입도, 투과율, 육안으로 평가하였다.
실험결과는 도 1과 도 2에 나타낸 바와 같이, 계면활성제를 Cremophor EL로 사용한 경우 Tween 20을 사용한 경우보다 더 넓은 에멀젼 형성 범위를 나타냈다. 이를 바탕으로 하여 인자의 범위를 오일(Capmul MCM)은 10~40중량%, 계면활성제(Cremophor EL)는 10~80중량%, 보조계면활성제(Transcutol P)는 10~80중량%에서 마이크로에멀젼을 형성할 수 있는 조성 비율이 나타났으며 이 범위로 제형 개발 범위를 선정하고 자가 미세유화 약물전달시스템의 조성물을 최적화하기 위해 실험설계법 중 D-optimal mixture design을 사용하였다. 하기 표 4에 인자 범위와 반응변수를 기재하였다.
요인(Factors) 조성물 범위
최소 (w/w %) 최대 (w/w %)
X1: 오일 Capmul MCM 10 40
X2: 계면활성제 Cremophor EL 10 80
X3: 보조계면활성제 Transcutol P 10 80
반응(Responses) 목표
Y1: 용해도 (mg/mL) 최대
Y2: 침전 정도 (%) 최소
Y3: 입도 (nm) 최소
Y4: 투과율 (%) 최대
2-2. 실험설계법(DOE)의 실험 진행
3 성분계 상평형도 작성에서 에멀젼을 형성하는 오일, 계면활성제, 보조계면활성제의 비율 범위를 사용하여, 실험 설계법을 진행하였다. 실험 설계법은 Design Expert 10를 사용하여 D-optimal mixture design 실험 방법으로 17회의 실험 조성을 진행하였다. 인자는 오일, 계면활성제, 보조계면활성제의 비율이며 반응변수는 자가 미세유화 약물전달시스템 제제에 대한 티카그렐러의 용해도, 에멀젼 형성 후 침전정도, 에멀젼의 입자크기, 투과율로 선정하여 진행하였다. 하기 표 5에 실험 인자의 비율과 반응변수의 결과를 기재하였다.
실험 인자(Factors) 반응(Responses)
X1 X2 X3 Y1 Y2 Y3 Y4
Capmul MCM Cremophor EL Transcutol P 용해도 침전 정도 입도 투과율
(w/w %) (w/w %) (w/w %) (mg/mL) (%) (nm) (%)
1 24.8307 65.1693 10 169.4±0.93 30.9±11.2 152.3±12.4 96.7±0.02
2 10 25.8795 64.1205 279.1±1.94 17.2±0.9 525.9±23.8 66.1±0.59
3 10 10 80 330.59±0.93 66.3±0.9 894.9±34.1 49.5±0.37
4 24.9753 46.7603 28.2644 188.7±0.91 9.4±0.4 218.3±14.8 89.2±0.11
5 38.6 38.2553 23.1447 165±3.85 13.1±0.4 306.7±25.6 79.6±0.48
6 10 10 80 316.05±3.55 67.7±0.3 1023.6±85.1 50.3±0.52
7 10 62.3288 27.6712 211.71±2.63 21.7±0.4 98.8±5.7 98.4±0.06
8 24.9753 46.7603 28.2644 194.85±1.76 16.5±1.5 214.7±15.6 89.2±0.06
9 40 50 10 126.51±1.98 7.2±0.4 234.6±21.4 92.9±0.10
10 10 80 10 148.28±2.67 6.3±0.3 54.7±8.6 99.2±0.02
11 24.8307 65.1693 10 129.27±3.39 0.2±3.2 189.5±11.9 93.1±0.04
12 32.9684 10 57.0316 237.49±2.70 18.8±0.4 631.8±32.2 54.8±0.42
13 23.9412 27.95 48.1089 254.79±1.41 13.6±0.0 372.3±24.7 64.9±0.35
14 32.9684 10 57.0316 231.22±2.66 21±0.1 686.2±34.5 56.3±0.28
15 10 45.642 44.358 239.32±1.42 12.2±0.4 129.9±11.8 95.1±0.11
16 40 25.75 34.25 191.07±1.32 16.2±0.3 884±64.8 55.3±0.43
17 24.9753 46.7603 28.2644 187.13±2.60 7±0.2 225.8±21.0 93.2±0.07
위 표 5의 결과는 최적의 반응을 나타내는 비율을 선정하기 위한 실험을 진행한 것으로 오일, 계면활성제, 및 보조계면활성제의 3성분으로 조성된 유화 조성물에 티카그렐러가 최대로 용해될 수 있는 양을 첨가해서 진행한 실험이다. 일부 침전 정도, 입도 및 불투명 정도가 앞서 실험예 2-1 보다 높은 결과가 포함되어 있으나, 유화 조성물에 대한 티카그렐러의 중량비가 낮아질 경우 적합한 에멀젼 형성이 이루어질 수 있다. 이 결과를 기반으로 다음 실험예에서 통계적 분석을 진행하였다.
2-3.자가 미세유화 약물전달시스템 조성물의 최적 비율 선정
상기 실험예 2-2의 실험설계법에 따른 결과를 통계적 분석과 모델 방정식으로 분석하였다.
모델 방정식은 다음과 같다.
용해도(Y1) = 88.84X1 + 163.03X2 + 321.54X3
침전 정도(Y2) = 10.13X1 + 12.67X2 + 60.77X3 + 15.91X1X2 - 96.06X1X3 - 86.73X3
입도(Y3) = 47658.71X1 + 53.30X2 + 965.31X3 - 90213.26X1X2 - 85963.82X1X3 - 1304.24X2X3 + 97272.71X1X2X3 - 53069.49X1X2(X1-X2) - 43814.17X1X3(X1-X3) + 468.88X2X3(X2-X3)
투과율(Y4) = 100.75X1 + 99.57X2 + 48.88X3 - 28.52X1X2 - 47.41X1X3 + 62.62X2X3 - 1453.67X1 2X2X3 + 1025.35X1X2 2X3 - 652.61X1X2X3 2
통계적 분석은 표 6에 나타낸 바와 같이, 선정된 모델에 대해 p-Value 0.05 이하, Lack of fit 0.05 이상을 만족하였으며 이는 모델이 적합하다는 것을 확인할 수 있었다.
반응변수
(Responses)		 모델 Sequential p-value Lack of Fit p-value Adjusted R-Squared Remark
Y1: 용해도 Linear <0.0001 0.7558 0.9596 Suggested
Y2: 침전 Quadratic 0.0432 0.4149 0.6701 Suggested
Y3: 입도 Cubic 0.0018 0.2559 0.9731 Suggested
Y4: 투과율 Special Quartic 0.0022 0.0606 0.9757 Suggested
도 3에 각 인자의 조성에 따른 반응변수의 양상을 통계적 예측을 통해 그래프로 나타내었다.
도 4는 반응변수의 목표를 용해도(Y1)를 최대화하고 침전 정도(Y2)는 최소화, 입도(Y3) 최소화, 투과율(Y4) 최대화한 인자의 조성을 만족도 함수(Desirability)를 통해 예측하여 나타내었다. 최적화된 조성에서 예측값과 실측값을 실험을 통해 확인하였으며, 그 결과를 표 7에 나타내었다.
반응변수
(Responses)		 예상값 실측값 예상값와 실측값 차이(%)
Y1: 용해도 222.33 mg/mL 236.22 mg/mL 6.25
Y2: 침전 정도 10.35 % 10.6 % 2.50
Y3: 입도 116.75 nm 110.2 nm 5.61
Y4: 투과율 95.3 % 96.6 % 1.36
< 실험예 3. 최적화된 자가 미세유화 약물전달시스템 제형 평가>
실험예 2를 통해 최적화된 조성인 오일(Capmul MCM) 10 중량%, 계면활성제(Cremophor EL) 54 중량%, 보조계면활성제(Transcutol P) 36 중량%를 포함하도록 순차적으로 정밀히 달아 충분히 혼합하여 단일상의 유화 조성물을 제조한다. 제조된 혼합물 400 mg에 90 mg의 티카그렐러를 녹인 것을 실시예 1이라 한다.
또한, 표 8에서와 같이, 실시예 2 내지 5의 유화 조성물을 제조하였고, 비교예 1 및 2는 선행문헌 US2017-0112775에 기반하여 제조하였다. 다음 실험예에서 이 제제의 특성을 평가하였다.
3-1. 실시예 1~5, 및 비교예 1~2의 자가 미세유화 약물전달시스템 조성물의 티카그렐러 용해도 및 에멀젼화 평가
표 8의 조성으로 제조된 실시예 1 내지 5와 비교예 1 및 2의 각 제형에 대한 티카그렐러의 용해도를 확인하였다. 그 용해도를 「실험예 1-1. 용해도 실험」에 기재된 방법과 동일하게 평가하였고, 에멀젼화 등급을 「실험예 1-2. 에멀젼화 평가」방법으로 진행하되 정제수에 분산하여 평가하였다.
그 결과, 표 8에서 확인되는 바와 같이, 실시예 1의 경우 에멀젼화 등급이 A로 가장 높고 용해도도 두 번째로 높은 값이었다. 다른 실시예 2 및 3의 경우 용해도는 실시예 1과 비슷하였으나 투과도가 낮아 에멀젼화 등급이 B였다. 다른 비교예 1 및 2의 경우 용해도가 50 mg/mL 미만으로 매우 낮았으며, 투과율이 낮아 에멀젼화 등급이 D로 나타났다.
제형 오일 중량% 계면
활성제
 중량% 보조
계면활성제
 중량% 용해도
(mg/mL)		 에멀젼화
등급
실시예 1 Capmul MCM 10 Cremophor EL 54 Transcutol P 36 236.22 A
실시예 2 Capryol 90 10 Labrasol 54 Tetraglycol 36 240.36 B
실시예 3 Peceol 10 Tween 80 54 Transcutol P 36 224.62 B
실시예 4 Oleic acid 10 Pluronic L64 54 Propylene glycol 36 98.15 C
실시예
5		 Labrafil M 1944 10 Tween 20 54 PEG 400 36 181.35 C
비교예 1 Oleic acid 33.3 TPGS 66.7 - 32.4 D
비교예 2 Miglyol 812 50 TPGS 50 - 11.5 D
3-2. 용출률 평가
용출 시험은 USP 용출시험법 Ⅱ법 (패들법)에 따라 진행하였다. 패들의 회전 속도는 50rpm이며 용출액의 온도는 37±0.5℃로 설정하였다. 용출 시험액은 정제수, pH 1.2, pH 4.0, pH 6.8에서 각각 실시하였으며, 티카그렐러 90mg를 함유하는 자가 미세유화 약물전달 시스템 조성물을 크기 0호의 캡슐에 넣고 용출 시험을 실시하였다. 대조군으로 현재 시판되고 있는 티카그렐러 제제인 브릴린타®(Brilinta®)를 사용하였다.
도 5의 실험결과에서 확인되는 바와 같이, 실시예 1 내지 5의 경우 대조군에 비해 상승된 용출률을 보였고, 특히 실시예 1 내지 3의 용출률 상승이 현저하였다. 비교예 1 및 2의 경우, 실시예들 보다 낮은 용출률을 보여주었으며, 용해도 값 역시 현저히 낮은 값을 보여주었다. 이러한 결과를 통해, 본 발명의 제제는 난용성 약물인 티카그렐러를 가용화시켜 용해도를 증가시키고 용출률을 향상시킬 수 있고, 이에 따라 대조군에 비해 높은 생체이용률을 나타낼 것으로 기대할 수 있다.
도 6에서 여러 용출 시험액에서 실시예 1 및 대조약 브릴린타®의 용출률을 보면 실시예 1의 용출률은 활성성분의 용해도 개선을 통하여 모든 용출액에서 높은 결과를 보여주었으며, 대조약의 경우 모든 용출 시험액에서 활성성분의 용해도가 향상되지 않아 용출률이 낮은 값을 보여주었다.
3-3. 나노에멀젼 형성 확인
본 발명에 따른 자가 미세유화 약물전달시스템 조성물의 에멀젼 형성 확인은 투과전자현미경(Transmission electron microscope, JEM 1010, JEOL Ltd, Tokyo, Japan)로 확인하였다. 그 결과, 도 7에 나타낸 것과 같이 실시예 1의 자가 미세유화 약물전달시스템 조성물이 구형의 약 100~130 나노미터 범위 에멀젼을 형성한다는 것을 확인하였다.
3-4. 조성물의 세포독성시험
본 발명에 따른 제형의 장관막세포(Caco-2 cell)에 대한 독성을 확인하기 위해 세포독성시험을 시행하였다.
<세포 배양>
Caco-2 세포는 한국세포주은행에서 구입하였다. Caco-2 세포는 Dulbecco modified Eagle medium(DMEM)에 10% 소태아혈청과 1% 페니실린/스트렙토마이신 (100 unit/mL 단위)을 넣은 배지에서 온도 37℃, CO2 5% 조건으로 배양한다.
<세포독성시험>
96-웰 플레이트(96-well plate)에 각 웰당 Caco-2 세포가 5.0 × 104개/well의 개수가 되는 100μL 배양액을 분주한다. 24시간 세포 배양 후, 티카그렐러 용액(ticagrelor), 실시예 1의 조성이되 티카그렐러를 미함유한 자가 미세유화 약물전달시스템 조성물(Blank 실시예 1), 티카그렐러 함유 자가 미세유화 약물전달시스템 조성물(실시예 1)을 티카그렐러 농도 90, 67.5, 45, 22.5, 9, 1.8, 0.9, 0.09, 0.009μg/mL의 농도에 해당하는 양을 달아 1% DMSO를 함유하는 DMEM 배지로 희석하여 각 well에 100μL를 적용하였다. 검체를 적용하고 24시간 후, 각 well에 30μL의 MTT solution (5mg/mL)을 넣고 온도 37℃에서 3시간 배양한다. 결과는 microplate reader (Sunrise, Tecan, Austria)로 570 nm 파장에서 흡광도를 측정한다.
세포 생존률(%) = 100 × 실험군 흡광도 / Blank 흡광도
Blank는 1% DMSO를 함유하는 DMEM 배양액을 적용한 것이다.
그 결과, 도면 8의 결과에서 보듯이, 티카그렐러 미함유 자가 미세유화 약물전달시스템 조성물(Blank 실시예 1)의 장관막세포에 대한 독성은 실험 농도 범위에서 나타나지 않았다. 하지만, 활성성분인 티카그렐러 자체의 장관막세포 독성은 활성성분 농도 22.5ug/mL 이상의 범위에서 나타났으며, 이러한 양상은 티카그렐러 함유 자가 미세유화 약물전달시스템 조성물(실시예 1)도 유사하게 나타났다.
상기 결과를 통해 활성성분을 함유하지 않은 제형은 장관막세포에 대한 독성이 없으며 제조된 실시예 1의 독성은 약물 자체의 독성이 나타난 결과로 확인할 수 있었다. 따라서, 이 결과를 비교하여 제형의 장관막세포에 대한 독성이 적으며 현재 실험예에서 나타나는 독성은 활성성분에 의한 독성임을 확인하였다.
본 발명에 따른 자가 미세유화 약물전달시스템의 에멀젼 형성 확인은 투과전자현미경(JEM 1010, JEOL Ltd, Tokyo, Japan)으로 확인하였다. 그 결과, 도 7에 나타낸 것과 같이 본 발명에 따른 자가 미세유화 약물전달시스템이 구형의 나노미터 범위 에멀젼을 형성한다는 것을 확인하였다.
3-5. 장관막세포에 대한 제형의 투과도 시험
제조된 제형(실시예 1)에 의한 티카그렐러의 투과도 향상을 측정하기 위해 투과도 시험(permeability study)을 진행하였다. 24-웰 플레이트(24-well plate) 내 직경 6.5mm의 트랜스웰 인서트(transwell insert)에 각 인서트 당 Caco-2 세포가 5×104개/well의 개수가 되는 배양액 200μL를 상층부(apical side)에 분주한다. 웰 플레이트의 기저측부(basolateral side)에는 800μL의 배양액을 넣어 인서트의 하부가 잠기도록 한다. 2~3일 마다 새로운 배양액으로 갈아주며 21일간 세포를 배양한다. 충분한 배양 후 인서트와 플레이트의 배양액을 제거하고 세포막 투과도 향상을 알아보기 위해 대조군인 티카그렐러 용액과 실험군인 티카그렐러 함유 자가 미세유화 약물전달시스템 조성물(실시예 1)을 배양액에 9μg/mL의 같은 약물 농도로 희석한 뒤 희석액 250μL를 트랜스웰 인서트의 상층부에 적용하고 약물을 함유하지 않는 배양액을 기저측부에 800μL를 넣는다(Papp A→B 측정). P-당단백질(P-glycoprotein) 펌프의 영향을 알아보기 위해 같은 약물의 농도를 함유한 배양액 800μL를 기저측부에 적용하고 약물을 함유하지 않은 배양액을 인서트의 상층부에 넣는다(Papp B→A 측정). 정해진 시간인 0, 30, 60, 120, 180 분에 각 상층부 또는 기저측부에서 100μL씩 취한 샘플을 LC/MS/MS로 분석한다.
<LC/MS/MS 분석법>
컬럼 : Kinetex®XB-C18 (C18, 2.6 μm, 2.1 × 50 mm, Phenomenex)
이동상 : 0.1% v/v 포름산(formic acid) 수용액, 0.1% v/v 포름산(formic acid) 아세토나이트릴 용액의 농도 구배 사용
주입량 : 10 μL
유속 : 0.4 mL/min
검출조건 : 티카그렐러 m/z는 523.1→153.0 으로 분석하였다. 이온 스프레이 모세관 전압은 5.5 kV이며, 모세관 온도는 500℃이다.
그 결과, 표 9에서 확인되는 바와 같이, 대조군의 Papp A→B에 비해 실시예 1의 Papp A→B가 상승한 양상을 보여주었다(p<0.05). Papp B→A결과는 대조군과 실시예 1이 유사한 양상을 보여주었으나(p>0.05), A→B 의 투과도가 증가함에 따라 B→A로의 펌핑아웃효과도 증가하였으나 A→B 증가에 비례하여 증가하지 않았다. 유출비(Efflux ratio, ER) 값을 계산하여 투과도 증가를 확인하였으며 그 결과, 대조군에 비해 자가 미세유화 약물전달시스템 제형(실시예 1)이 약 34% 증가한 결과를 나타냈다.
구분 Papp A→B
(cm/s × 10-7)		 Papp B→A
(cm/s × 10-7)		 Efflux ratio (ER)
Figure 112018015362594-pat00002
대조군 2.64 ± 0.57 5.96 ± 0.47 2.26
실시예 1 4.30 ± 0.64 7.24 ± 1.56 1.68
< 실험예 4. 티카그렐러의 생체 이용률 비교 평가 시험>
<약물 투약 및 혈액 채취>
본 발명에 따른 자가 미세유화 약물전달시스템 조성물의 체내 동태와 생체이용률을 대조군과 비교하기 위해 시험을 다음과 같이 실시하였다.
시험 동물은 Sprague Dawley 랫트를 사용하였으며, 약 250~300g의 무게의 랫트를 실험군당 각각 9마리씩 사용하였다. 랫트는 7일 이상 순화하였으며, 제형을 투여하기 24시간 전에 절식시켰으며, 물은 계속 제공하였다. 대조군의 티카그렐러 투여량은 10mg/kg으로 랫트의 무게에 맞추어 티카그렐러 원료를 0.5w/v% 카르복시메틸셀룰로오스 소듐(carboxymethylcellulose sodium, low viscosity)에 현탁하여 경구 투여하였다. 실험군은 자가 미세유화 약물전달시스템 제형(실시예 1)으로 대조군의 투여량과 동일한 티카그렐러 양을 갖는 중량을 정밀히 달아 정제수에 희석하여 경구 투여하였다. 채혈은 0, 0.17, 0.33, 0.66, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24 시간에 진행하였으며, 채혈된 샘플은 채혈 직후 15,000rpm으로 15분간 원심분리하고 상층의 혈장을 취하여 분석을 진행하기 전까지 80℃에서 냉동 보관하였다.
<혈장 전처리>
혈장 시료 20μL와 디메틸설폭사이드 4μL를 취하여 100μL 아세토나이트릴 (내부표준물질 500ng/mL 베라파밀)에 가하고 혼합하였다. 충분히 혼합하여 추출한 뒤 15,000rpm에서 5분간 원심분리 후, 상층액 50μL를 정제수 100μL에 넣고 혼합한 뒤 바이알에 담은 후, LC/MS/MS에 주입하였다.
<LC/MS/MS를 이용한 혈중 분석>
컬럼 : Kinetex®XB-C18 (C18, 2.6 μm, 2.1 × 50 mm, Phenomenex)
이동상 : 0.1% v/v 포름산(formic acid) 수용액, 0.1% v/v 포름산(formic acid) 아세토나이트릴 용액의 농도 구배 사용
주입량 : 10 μL
유속 : 0.4 mL/min
검출조건 : 티카그렐러 m/z는 523.1→153.0 으로 분석하였으며, 내부표준물질 베라파밀의 m/z는 455.3→165.1 로 분석하였다. 이온 스프레이 모세관 전압은 5.5 kV이며, 모세관 온도는 500℃이다.
<약물동력학적 평가>
최고 혈중 농도(Cmax), 혈중 농도 면적(AUC0 →∞), 최고 혈중 농도 도달시간(Tmax), 반감기(T1/2)를 WinNolin을 사용하여 구하였다. 티카그렐러 현탁액과 티카그렐러 자가 미세유화 약물전달시스템 제형의 약물동력학적 파라미터를 비교하였으며, 얻어진 파라미터들은 아래 표 10에 나타내었다. 상대적 생체이용률(Relative Bioavailability)은 대조군인 티카그렐러 현탁액의 AUC0 →∞와 제형의 AUC0 →∞ 비율로 구하였다.
약동학적 파라미터 구분
대조군 실시예 1
Tmax(hr) 1.02 ± 0.52 0.71 ± 0.24
Cmax(ng/mL) 68.94 ± 25.67 382.69 ± 68.86
AUC0 →∞(hr·ng/mL) 402.20 ± 110.42 2063.64 ± 463.44
T1/2(hr) 5.97 ± 4.91 4.34 ± 2.26
상대적 생체이용률(%) - 513.08
그 결과, 도 9과 같이, 본 발명에 따른 티카그렐러 자가 미세유화 약물전달시스템이 대조군 제제보다 약 5.13배 정도 상승된 생체이용률을 나타냄을 확인할 수 있었다.
< 실험예 5. 티카그렐러의 약효 비교 평가>
본 발명에 따른 자가 미세유화 약물전달시스템 조성물의 체내 동태와 생체이용률을 대조군과 비교하기 위해 시험을 다음과 같이 실시하였다.
시험 동물은 Sprague Dawley 랫트를 사용하였으며, 약 250~300g의 무게의 랫트를 실험군당 각각 9 마리씩 사용하였다. 랫트는 7일 이상 순화하였으며, 제형을 투여하기 24시간 전에 절식시켰으며, 물은 계속 제공하였다. 대조군의 티카그렐러 투여량은 10mg/kg, 5mg/kg 및 2mg/kg 로 랫트의 무게에 맞추어 티카그렐러 원료를 0.5w/v% 카르복시메틸셀룰로오스 소듐(carboxymethylcellulose sodium, low viscosity)에 현탁하여 경구 투여하였다. 실험군은 자가 미세유화 약물전달시스템 제형(실시예 1)으로 대조군의 투여량과 동일한 티카그렐러 양을 갖는 중량을 정밀히 달아 정제수에 희석하여 경구 투여하였다. 채혈은 0, 1, 2, 5, 10, 24 시간에 진행하였으며, 채혈된 샘플은 채혈 직후 210×g로 15분간 원심분리하고 상층액을 취하여 혈소판 풍부 혈장(Platelet-Rich Plasma, PRP)로 하고 잔여혈액을 2,000×g로 10분간 원심분리하고 상층액을 취하여 혈소판 결핍 혈장(Platelet-Poor Plasema, PPP)으로 한다. 분석은 혈소판 응집 측정기 (Model 700-4, Chrono-log, PA, USA)를 사용하여 측정하였으며 20 uM의 ADP를 처리하여 흡광도 변화를 관측하였다.
그 결과, 도 10 및 11에서 확인되는 바와 같이, 활성성분 티카그렐러를 10mg/kg으로 투여할 경우, 대조군인 티카그렐러 현탁액과 티카그렐러 함유 자가 미세유화 약물전달시스템 모두 투여 후 10시간 까지 높은 혈소판응집억제능을 보였다.
그러나, 티카그렐러를 5mg/kg으로 투여할 경우, 대조군인 티카그렐러 현탁액은 투여 후 10시간에서 다시 낮아지는 혈소판응집억제능을 보였으나 티카그렐러 함유 자가 미세유화 약물전달시스템 제형은 투여 후 10시간에서 높게 유지된 약효를 보여주었다.
이는 10mg/kg의 높은 용량 투여에서는 대조군과 실험군 모두 약효 발현 농도에 도달하여 약효를 나타내었으나, 5mg/kg의 낮은 용량 투여에서는 대조군의 혈중 농도는 투여 후 10시간에 약효 발현 농도 이하로 떨어져 혈소판응집억제능이 사라진 것을 확인하였다. 또한, 티카그렐러 함유 자가 미세유화 약물전달시스템의 경우 5mg/kg 투여 시에도 높은 혈중 농도 유지로 인해 약물 혈중 농도가 약물 흡수의 증가에 따라 약효 발현 농도 이상이므로 약효 발현이 유지됨을 예측할 수 있었다. 또한, 티카그렐러를 2mg/kg으로 투여할 경우, 대조군보다 실시예 1의 약효가 높게 유지되는 것을 확인할 수 있었으며 다른 용량의 경우에도 모두 대조군보다 실시예 1에서 더 약효가 높게 나타났다.

Claims (9)

  1. 활성 물질로서 티카그렐러; 및
    오일, 계면활성제 및 보조계면활성제를 포함하는 유화 조성물;을 함유하며,
    상기 오일은 카프릴릭/카프릴산 글리세라이드류이고,
    상기 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 피마자유 유도체류 및 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 중 1종 이상이며,
    상기 보조계면활성제는 디에틸렌글리콜 모노에틸에테르 및 테트라글리콜 중 1종 이상인 것을 특징으로 하는 자가 미세유화 약물 전달시스템 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 유화 조성물은 유화 조성물의 총 중량 기준으로 오일 10~40중량%, 계면활성제 10~80중량% 및 보조계면활성제 10~80중량%인 것을 특징으로 하는 자가 미세유화 약물전달시스템 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 자가 미세유화 약물전달시스템 조성물은 유화 조성물과 티카그렐러를 10:1 내지 4:1의 중량비로 함유하는 것을 특징으로 하는 자가 미세유화 약물전달시스템 조성물.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 자가 미세유화 약물 전달시스템 조성물의 제조방법으로서,
    오일, 계면활성제 및 보조계면활성제를 혼합하여 유화 조성물을 생성하는 단계(1단계); 및
    상기 유화 조성물에 티카그렐러를 첨가하는 단계(2단계);
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 자가 미세유화 약물 전달시스템 조성물의 제조방법.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 자가 미세유화 약물 전달시스템 조성물을 포함하는 경구 투여용 약제학적 조성물.
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