KR101990773B1 - Modified green fluorescent protein capable of silica deposition and use thereof - Google Patents

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Abstract

본 발명은 실리카를 합성할 수 있는 변형 녹색형광단백질 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 상온, 상압, 중성 부근의 약염기 조건의 수용액 하에서 실리카 전구체로부터 실리카를 중합할 수 있는 변형 녹색형광단백질을 제공한다. 또한, 이러한 변형 녹색형광단백질은 형광 특성과 자기조립 구조체를 형성할 수 있는 특성으로 인해 실리카 기반의 단백질 고정화, 바이오센서, 약물전달체 등에 사용할 수 있다.The present invention relates to a modified green fluorescent protein capable of synthesizing silica and a use thereof. More particularly, the present invention relates to a modified green fluorescent protein capable of polymerizing silica from a silica precursor under an aqueous solution of weak base conditions at room temperature, normal pressure, to provide. In addition, these modified green fluorescent proteins can be used for silica-based protein immobilization, biosensors, drug delivery systems, etc. due to their fluorescence properties and their ability to form self assembled structures.

Description

실리카를 합성할 수 있는 변형 녹색형광단백질 및 이의 용도{Modified green fluorescent protein capable of silica deposition and use thereof}Modified green fluorescent protein capable of synthesizing silica and its use {

본 발명은 상온, 상압, 중성 부근의 약염기 조건의 수용액 하에서 실리카 전구체 화합물로부터 실리카를 중합할 수 있는 변형 녹색형광단백질 및 이의 용도에 관한 것이다.
The present invention relates to a modified green fluorescent protein capable of polymerizing silica from a silica precursor compound under an aqueous solution of weak base conditions at normal temperature, normal pressure and near neutral, and uses thereof.

실리카는 특정 화학종들과 공유결합이 가능하기 때문에 새로운 하이브리드 소재 (유기-무기 복합체) 합성에 중요하고, 또한 생체 적합한 소재로서 각 개별 소재의 단점을 보완할 수 있는 우수한 특성을 갖고 있다. 현재 실리카의 공업적 생산 공정은 고온, 강산 또는 강염기 조건이 요구되고 환경적으로 유해한 부산물 생성의 문제점이 있다.Silica is important for the synthesis of new hybrid materials (organic-inorganic complexes) because it can be covalently bonded to specific chemical species, and it has excellent properties that can complement the disadvantages of individual materials as biocompatible materials. At present, the industrial production process of silica requires high temperature, strong acid or strong base conditions and has a problem of producing environmentally harmful by-products.

그러나 해양 생명체인 스펀지와 규조류의 추출물 또는 유전학적 정보를 바탕으로 실리카를 생합성 하는 효소 및 펩타이드가 발견됨으로써 이들에 의해 생산된 환경 친화적 바이오실리카 및 이의 다양한 용도로의 응용성으로 인해 전 세계적으로 해양 유래 바이오 실리카 복합 소재 개발이 이슈화되고 있다. 바이오실리카 소재는, 다양한 용도에 적합한 제형화가 가능하고, 에너지효율성, 기계적·화학적 물성, 생체적합성, 대량생산성이 뛰어날 것으로 기대되므로 바이오실리카 소재 확보를 위한 원천 기술의 보유는 매우 중요하다.However, due to the discovery of enzymes and peptides that biosynthesize silica based on the extracts of sponges and diatoms, or genetic information of marine life forms, the environmentally friendly biosilica produced by them and their applicability to various uses, The development of biosilica composite materials is becoming an issue. Since biosilica materials can be formulated for various applications and are expected to be superior in energy efficiency, mechanical and chemical properties, biocompatibility, and mass productivity, it is very important to have the source technology for securing the biosilica material.

현재 스펀지, 규조류의 실리카 합성 메커니즘이 밝혀지면서 이들의 메커니즘을 응용한 생물학적 실리카 합성법들이 보고되고 있다. 실리카테인의 히스티딘과 세린 잔기가 실리카 합성 전구체의 가수분해와 중합에 중요한 역할을 하며, 실라핀의 경우에도 라이신과 세린 잔기가 반복적으로 존재하고 긴 사슬의 폴리아민들이 실리카 형성에 관여하는 것이 밝혀지면서 -SH, -OH 같은 친핵성 잔기, 수소결합을 이룰 수 있는 아민기들이 포함된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드, 아민류, 폴리아민기가 많은 스퍼민, 인공적으로 합성된 펩타이드를 이용한 실리카 합성법이 보고되었다. 또한 트립신을 포함해 다양한 가수분해효소 (hydrolase)들의 실리카 합성 반응이 보고되었다.Currently, silica synthesis mechanisms of sponge and diatomaceous earth have been revealed, and biological silica synthesis methods applying these mechanisms have been reported. It has been found that histidine and serine residues of the silicate precursor play an important role in the hydrolysis and polymerization of the silica synthesis precursor, and in the case of silapine, the lysine and serine residues are repeatedly present and the long chain polyamines are involved in the silica formation, There has been reported a method of synthesizing silica using polypeptides composed of amino acid sequences containing amine groups capable of forming a hydrogen bond, amines, and spermine, which are rich in polyamine groups, and artificially synthesized peptides. Silica synthesis reactions of various hydrolases including trypsin have also been reported.

녹색형광단백질(Green fluorescent protein; GFP)은 238개의 아미노산으로 이루어진 단백질로서 1962년 일본의 시모무라 오사무에 의해 해파리의 형광물질로부터 발견되었고, 1994년 대장균에서 클로닝이 되어 대량 생산이 가능하게 되었다. 1996년 GFP의 3차 구조가 해석되어 발색단 형성과 주변 아미노산 잔기와의 상호작용을 이해함으로써 이들 잔기들을 변형시켜 형광세기를 증가시키거나 다양한 형광색을 나타내도록 다양한 변종 GFP를 생산하게 되었다. GFP 스스로 형광을 나타내는 성질 때문에 분자·세포 생물학 연구에 있어서 형광세기에 따른 유전자 발현상태를 조사하는 데 이용되기도 하며, 다른 단백질과 결합시켜 생세포 내에서의 이동을 조사하는 데 사용하기도 한다. 또한 이온들, pH 변화에 따른 형광변화를 이용하여 바이오센서로도 이용하고 있다.
Green fluorescent protein (GFP) is a protein consisting of 238 amino acids. It was discovered in 1962 by Osamu Shimomura of Japan in fluorescent material of jellyfish. In 1994, it was cloned in E. coli and mass production became possible. In 1996, the tertiary structure of GFP was interpreted to understand the chromophore formation and interactions with the surrounding amino acid residues, thereby changing these residues to produce various variants of GFP to increase the fluorescence intensity or to display various fluorescent colors. Because of its fluorescence properties, GFP is used in molecular and cellular biology research to investigate gene expression status by fluorescence intensity, and it is also used to investigate movement in living cells by binding with other proteins. In addition, ions are used as biosensors by using fluorescence changes according to pH changes.

1. Cha JN, Stucky GD, Morse DE, Deming TJ (2000) Biomimetic synthesis of ordered silica structures mediated by block copolypeptides. Nature 403:289-292.1. Cha JN, Stucky GD, Morse DE, Deming TJ (2000) Biomimetic synthesis of ordered silica structures mediated by block copolypeptides. Nature 403: 289-292. 2. Corma A, D1'az-Cabanas MJ, Moliner M, Rodr1'guez G (2006) Synthesis of micro- and mesoporous molecular sieves at room temperature and neutral pH catalyzed by functional analogues of silicatein. Chem Commun 27:3137-3139.2. Corma A, D1'az-Cabanas MJ, Moliner M, Rodrl'guez G (2006) Synthesis of micro- and mesoporous molecular sieves at room temperature and neutral pH catalyzed by functional analogues of silicatein. Chem Commun 27: 3137-3139. 3. Roth KM, Zhou Y, Yang W, Morse DE (2004) Bifunctional small molecules are biomimetic catalysts for silica synthesis at neutral pH. J Am Chem Soc 127: 325-330.3. Roth KM, Zhou Y, Yang W, Morse DE (2004) Bifunctional small molecules are biomimetic catalysts for neutral pH. J Am Chem Soc 127: 325-330. 4. Shaner N, Steinbach P, Tsien R (2005). A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods 2 (12):905-909.4. Shaner N, Steinbach P, Tsien R (2005). A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods 2 (12): 905-909. 5. Komorowski M, Finkenstadt B, Rand D (2010). Using a Single Fluorescent Reporter Gene to Infer Half-Life of Extrinsic Noise and Other Parameters of Gene Expression. Biophys J 98 (12):2759-2769.5. Komorowski M, Finkenstadt B, Rand D (2010). Using a Single Fluorescent Reporter Gene to Infer Half-Life of Extrinsic Noise and Other Parameters of Gene Expression. Biophys J 98 (12): 2759-2769. 6. Sun L, Shen X, Liu Y, Zhang G, Wei J, Zhang H, Zhang E, Ma F. (2010). The location of endogenous wild-type p53 protein in 293 T and HEK293 cells expressing low-risk HPV-6E6 fusion protein with GFP. Acta Biochim Biophys Sin. 42(3):230-235.6. Sun L, Shen X, Liu Y, Zhang G, Wei J, Zhang H, Zhang E, Ma F. (2010). The location of endogenous wild-type p53 protein in 293T and HEK293 cells expressing low-risk HPV-6E6 fusion protein with GFP. Acta Biochim Biophys Sin. 42 (3): 230-235.

본 발명의 목적은 실리카를 합성할 수 있는 변형 녹색형광단백질 (mGFP) 및 이의 용도를 제공하는 것이다.
It is an object of the present invention to provide a modified green fluorescent protein (mGFP) capable of synthesizing silica and its use.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 변형 녹색형광단백질을 포함하는 실리카 합성용 조성물을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a composition for synthesizing silica comprising a modified green fluorescent protein represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.

상기 실리카 합성용 조성물은 추가로, 실리카 전구체, 효소 또는 결합 펩타이드, 인지질, 하이드록시아파타이트 등을 포함할 수 있다.
The composition for synthesizing silica may further include a silica precursor, an enzyme or a binding peptide, a phospholipid, a hydroxyapatite, and the like.

본 발명은 또한 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 변형 녹색형광단백질 및 실리카 전구체를 반응시키는 단계를 포함하는 실리카 합성방법을 제공한다.
The present invention also provides a method for synthesizing silica comprising the step of reacting a modified green fluorescent protein represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a silica precursor.

본 발명은 또한 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 변형 녹색형광단백질의 자기조립 구조체의 표면이 실리카로 코팅되어 있는 실리카 복합체를 제공한다.The present invention also provides a silica complex wherein the surface of the self-assembled structure of the modified green fluorescent protein represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is coated with silica.

상기 실리카 복합체는 추가로, 조직 특이적 결합성분, 약제학적 활성성분, 효소 또는 결합 펩타이드, 인지질, 하이드록시아파타이트 등이 결합되어 있을 수 있다.
The silica complex may further comprise a tissue-specific binding component, a pharmaceutically active ingredient, an enzyme or a binding peptide, a phospholipid, a hydroxyapatite, or the like.

본 발명은 또한 상기 실리카 복합체; 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약물전달체를 제공한다.
The present invention also relates to the aforementioned silica complex; And a pharmaceutically acceptable carrier.

본 발명은 또한 상기 실리카 복합체; 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조영제 조성물을 제공한다.
The present invention also relates to the aforementioned silica complex; And a pharmaceutically acceptable carrier.

본 발명은 또한 상기 실리카 복합체; 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 표적 지향형 조영제 조성물을 제공한다.
The present invention also relates to the aforementioned silica complex; ≪ / RTI > and a pharmaceutically acceptable carrier.

본 발명은 또한 상기 실리카 복합체; 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 동시 진단 또는 치료용 조영제 조성물을 제공한다.
The present invention also relates to the aforementioned silica complex; And a pharmaceutically acceptable carrier. ≪ Desc / Clms Page number 2 >

본 발명은 또한 상기 실리카 복합체; 및 진단 프로브를 포함하는 다중 진단 프로브를 제공한다.
The present invention also relates to the aforementioned silica complex; And a diagnostic probe.

본 발명은 또한 상기 실리카 복합체가 전기방사된 섬유를 제공한다.
The present invention also provides fibers wherein said silica composite is electrospun.

본 발명은 또한 상기 실리카 복합체가 전기방사된 섬유를 포함하는 필터를 제공한다.
The present invention also provides a filter wherein said silica composite comprises an electrospun fiber.

본 발명은 또한 상기 실리카 복합체를 포함하는 골대체제를 포함한다.
The present invention also encompasses a framework comprising the silica complex.

본 발명은 또한 상기 실리카 복합체를 포함하는 포토닉스 소자를 제공한다.
The present invention also provides a photonics device comprising the silica complex.

본 발명은 또한 상기 실리카 복합체를 포함하는 바이오분자 검출용 바이오센서를 제공한다.
The present invention also provides a biosensor for detecting biomolecules comprising the silica complex.

본 발명은 새로운 바이오실리카 소재로서 변형 녹색형광단백질 (mGFP)을 제공하는 효과가 있다. The present invention has the effect of providing a modified green fluorescent protein (mGFP) as a new biosilica material.

또한, 본 발명은 GFP의 자체 발광능력을 이용하여 유용효소와 융합하여 효소의 고정화 및 고정화 정도와 안정성 등을 가시적으로 쉽게 확인할 수 있다. Further, the present invention can easily confirm the immobilization and immobilization degree and stability of the enzyme by fusing with the useful enzyme using the self-luminescent ability of GFP.

본 발명은 또한 변형 녹색형광단백질의 자기조립 구조체의 표면에 실리카가 코팅된 실리카 복합체를 약물전달체, 조영제 등에 사용할 수 있어 생세포 내에서의 추적이 가능하고 방출속도계산 등이 용이하다.
The present invention can also use a silica complex coated with silica on the surface of a self-assembled structure of a modified green fluorescent protein to be used in a drug delivery system or a contrast agent, so that it can be traced in living cells and the release rate can be easily calculated.

도 1은 본 발명의 변형 녹색형광단백질 (mGFP)의 DNA 서열과 발현 벡터의 모식도이다.
도 2는 본 발명의 변형 녹색형광단백질 (mGFP)와 GFP의 아미노산 서열을 비교한 것이다.
도 3은 변형 녹색형광단백질 (mGFP)의 SDS-PAGE 전기영동(A), 웨스턴 블럿 (B) 및 정제 그림 (C)이다.
도 4는 변형 녹색형광단백질 (mGFP), GFP의 실리카 형성반응 후 (A), 원심분리하여 실리카 침전물 회수 (B)와 상청액 (C)을 비교한 그림이다.
도 5는 침전된 실리카 합성물의 양을 암모늄 몰리브데이트법으로 정량화 한 그래프 (A)와 상청액에 실리카에 결합되지 않고 남은 단백질 양을 비교한 그래프 (B)이다.
도 6은 변형 녹색형광단백질 (mGFP)에 의해 형성된 실리카 침전물의 형광현미경 사진도 (A) 및 주사전자현미경사진도 (B)를 나타낸 것이다.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 is a schematic diagram of a DNA sequence and an expression vector of the modified green fluorescent protein (mGFP) of the present invention. FIG.
2 compares the amino acid sequence of the modified green fluorescent protein (mGFP) of the present invention with that of GFP.
Figure 3 is SDS-PAGE electrophoresis (A), Western blot (B) and tablet image (C) of the modified green fluorescent protein (mGFP).
FIG. 4 is a graph comparing the number of recovered silica precipitates (B) and the supernatant (C) after the silica forming reaction (A) of the modified green fluorescent protein (mGFP), GFP and centrifuging.
Figure 5 is a graph (A) quantifying the amount of precipitated silica compound by the ammonium molybdate method and a graph (B) comparing the amount of protein remaining in the supernatant without remaining bound to silica.
FIG. 6 is a fluorescence microscopic photograph (A) and a scanning electron microscopic photograph (B) of the silica precipitate formed by the modified green fluorescent protein (mGFP).

이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.Hereinafter, the configuration of the present invention will be described in detail.

본 발명자들은 실리카 합성 시 녹색형광단백질의 열 안정성을 증가시키기 위해 도 2에 기재된 녹색형광단백질의 아미노산 서열 중 31번째 세린, 81번째 글루타민, 195번째 류신 잔기를 표면에 이온결합력을 높이는 아르기닌 잔기로, 151번째 아스파라진을 라이신 잔기로 치환시키고, 65번째와 100번째 페닐알라닌을 각각 시스테인과 세린 등으로 치환시켜 변형 녹색형광단백질 (mGFP)을 제조하고, 변형 전과 후를 비교하여 상온, 상압, 중성 부근 pH에서 실리카 전구체로부터 실리카를 침전시키는 활성을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다. In order to increase the thermal stability of the green fluorescent protein in the synthesis of silica, the present inventors have found that the 31st serine, the 81st glutamine and the 195th leucine residue in the amino acid sequence of the green fluorescent protein shown in Fig. 2 are arginine residues, The modified green fluorescent protein (mGFP) was prepared by replacing the 151th asparagine with a lysine residue and replacing the 65th and 100th phenylalanine with cysteine and serine, respectively. The present inventors have completed the present invention by confirming the activity of precipitating silica from a silica precursor.

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 변형 녹색형광단백질을 포함하는 실리카 합성용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for synthesizing silica comprising a modified green fluorescent protein represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.

본 발명의 변형 녹색형광단백질은 서열번호 2에 기재된 녹색형광단백질의 2, 31, 40, 43, 47, 65, 81, 100, 106, 107, 120, 125, 146, 150, 154, 164, 172, 195, 207-210, 222번째 아미노산 잔기들이 치환 또는 삭제된 것으로, 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열로 표시될 수 있으며, 실리카 합성 활성을 나타내는 특징이 있다.The modified green fluorescent protein of the present invention is a green fluorescent protein of 2, 31, 40, 43, 47, 65, 81, 100, 106, 107, 120, 125, 146, 150, 154, 164, 172 , 195, 207-210, and 222 amino acid residues are substituted or deleted, which can be represented by the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and has a characteristic of exhibiting silica synthesis activity.

상기 변형 녹색형광단백질은 펩타이드를 합성하는 당해 분야의 공지된 방법에 의하여 제조할 수 있다. 예를 들어 유전자 재조합과 단백질 발현 시스템 또는 펩타이드 합성기 등을 통하여 시험관내에서 합성하는 방법에 의하여 제조할 수 있다.The modified green fluorescent protein can be prepared by a known method in the art to synthesize a peptide. For example, by a method of synthesizing in vitro through gene recombination and protein expression system or peptide synthesizer.

따라서, 본 발명은 상기 변형 녹색형광단백질을 발현하는 재조합 벡터를 제공한다. Accordingly, the present invention provides a recombinant vector expressing the modified green fluorescent protein.

본 발명에서 "재조합 벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.The term "recombinant vector" as used herein refers to a gene construct containing an essential regulatory element operatively linked to the expression of a gene insert, which is capable of expressing a desired protein in a suitable host cell.

상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 발현 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며, 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주세포를 선택하기 위한 선택마커를 포함하고, 복제가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다.Such vectors include, but are not limited to, plasmid vectors, cosmid vectors, bacteriophage vectors, and viral vectors. Suitable expression vectors include signal sequence or leader sequences for membrane targeting or secretion in addition to expression control elements such as promoter, operator, initiation codon, termination codon, polyadenylation signal and enhancer, and may be prepared in various ways depending on the purpose. The promoter of the vector may be constitutive or inducible. Further, the expression vector includes a selection marker for selecting a host cell containing the vector, and includes a replication origin in the case of a replicable expression vector.

본 발명의 재조합 벡터는 바람직하게는 일반적인 대장균 균주 발현용 벡터, pETDuet, pQE80 등에 변형 녹색형광단백질 (mGFP)을 삽입함으로써 제조될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 대장균 발현용 벡터로 pETDuet, pQE80 등을 사용하였지만 반드시 이에 한정되는 것은 아니며, 일반적으로 사용할 수 있는 모든 대장균주 발현용 벡터가 제한없이 사용될 수 있다.The recombinant vector of the present invention can be preferably prepared by inserting a modified green fluorescent protein (mGFP) into a general E. coli strain expression vector, pETDuet, pQE80 and the like. In a preferred embodiment of the present invention, pETDuet, pQE80 and the like are used as the vectors for E. coli expression, but the present invention is not limited thereto, and all commonly used vectors for Escherichia coli expression can be used without limitation.

본 발명은 또한 상기 변형 녹색형광단백질을 발현하는 재조합 벡터로 형질도입된 형질전환체를 제공한다. The present invention also provides a transformant transformed with a recombinant vector expressing said modified green fluorescent protein.

상기 형질전환은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산 칼슘(CaPO4) 침전, 염화 칼슘(CaCl2) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.Such transformation includes any method of introducing the nucleic acid into an organism, cell, tissue or organ, and can be carried out by selecting a suitable standard technique depending on the host cell, as is known in the art. Such methods include electroporation, protoplast fusion, calcium phosphate (CaPO 4 ) precipitation, calcium chloride (CaCl 2 ) precipitation, agitation with silicon carbide fibers, Agrobacterium mediated transformation, PEG, dextran sulfate, ≪ / RTI > lipofectamine, and the like.

또한, 숙주세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용하면 된다.In addition, since the expression amount of the protein and the expression are different depending on the host cell, the host cell most suitable for the purpose may be selected and used.

숙주세포로는 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)와 같은 원핵 숙주 세포가 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 또한, 진균(예를 들어, 아스페르길러스(Aspergillus)), 효모(예를 들어, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세르비시애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스(Schizosaccharomyces), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa))등과 같은 하등 진핵 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵생물 유래의 세포를 숙주세포로 사용할 수 있다.Examples of host cells include Escherichia coli), Bacillus subtilis (Bacillus subtilis), Streptomyces (Streptomyces), Pseudomonas (Pseudomonas), Proteus Mira Billy's (Proteus but are not limited to, prokaryotic host cells such as mirabilis or Staphylococcus . In addition, fungi (e.g., Aspergillus ), yeast (e. G., Pichia < pastoris), Mai access to the Yasaka Auxerre Vichy kids (Saccharomyces cerevisiae), investigating car break in Rome Seth (Schizosaccharomyces), Castello La Neuro Chrysler Corporation (Neurospora can be used lower eukaryotic cells, insect cells, plant cells, mammalian cells, such as in higher eukaryotic origin, including such as crassa)) as a host cell.

상기 형질전환체는 상기 재조합 벡터를 임의의 숙주세포에 도입시킴으로써 용이하게 제조될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 재조합 벡터 pETDuet-mGFP를 대장균 균주 BL21(DE3)에 도입하여 형질전환체를 제조하였다.The transformant can be easily prepared by introducing the recombinant vector into any host cell. In a preferred embodiment of the present invention, a recombinant vector pETDuet-mGFP was introduced into E. coli strain BL21 (DE3) to prepare a transformant.

본 발명은 또한 상기 변형 녹색형광단백질을 발현하는 재조합 벡터로 형질도입된 형질전환체의 배양물을 분리 정제하는 단계를 포함하는 변형 녹색형광단백질의 제조방법을 제공한다.The present invention also provides a method for preparing a modified green fluorescent protein comprising the step of isolating and purifying a culture of a transformant transformed with a recombinant vector expressing the modified green fluorescent protein.

상기 변형 녹색형광단백질은 통상의 배양방법에 따라 형질전환체를 배양하여 정제하는 것이 바람직하다. 상기 변형 녹색형광단백질은 재조합 벡터에 도입되는 인서트 즉, 코딩 유전자의 염기서열에 따라 사이토카인 생산능에 영향을 주지 않을 정도로 아미노산 서열의 일부에 얼마든지 변형이 있을 수 있다. 상기 변형은 결실, 삽입 또는 치환에 의한 변형을 의미한다. The modified green fluorescent protein is preferably purified by culturing the transformant according to a conventional culture method. Depending on the base sequence of the insert, that is, the coding gene, the modified green fluorescent protein may have any variation in a part of the amino acid sequence so as not to affect cytokine production ability. The modification means modification by deletion, insertion or substitution.

본 발명은 또한 상기 변형 녹색형광단백질에 특이적으로 결합하는 다클론성 항체를 제공한다.The present invention also provides a polyclonal antibody that specifically binds to the modified green fluorescent protein.

상기 다클론성 항체의 제조방법은 특별히 제한하지는 않으나, 다음의 방법에 따라 제조하는 것이 바람직하다. The method for producing the polyclonal antibody is not particularly limited, but it is preferable to prepare it by the following method.

본 발명의 변형 녹색형광단백질을 SPF (specific pathogen free) 동물에 1 내지 수회 주사하여 면역화시킨다. 최종 면역 후 일정 시간이 지난 뒤에 전혈하여 혈청만 취해 본 발명의 단백질에 대한 다클론성 항체를 얻는다.The modified green fluorescent protein of the present invention is inoculated into SPF (specific pathogen free) animals by one to several injections. After a certain period of time after the final immunization, whole blood is collected and serum alone is taken to obtain a polyclonal antibody to the protein of the present invention.

상기 면역화 동물은 통상 면역화에 사용되는 동물이면 특별히 제한하지 않으나, 랫트인 것이 바람직하다. 상기 면역화를 위한 주사 횟수, 기간 및 투여방법은 당업자 수준에서 변형 또는 변경가능하므로 특별히 제한하지 않는다.The immunized animal is not particularly limited as long as it is an animal normally used for immunization, but it is preferably a rat. The number of times, the period of time and the method of administration for immunization are not particularly limited as they can be modified or changed at the level of a person skilled in the art.

또한, 상기 실리카 합성 활성이 있는 변형 녹색형광단백질은 상온 및 상압의 조건에서 약염기의 수용액 하에서 실리카 전구체와 반응하여 실리카를 합성할 수 있다.In addition, the modified green fluorescent protein having the silica synthesis activity can be synthesized by reacting with a silica precursor under an aqueous solution of a weak base at normal temperature and normal pressure.

상기 실리카 전구체는 테트라에틸 오르토실리케이트, 테트라메틸 오르토실리케이트, 메틸 트리에톡시실란, 페닐 트리에톡시실란, 디메틸 디메톡시 실란, 에틸 트리에톡시실란, 티타니아 테트라이소프로폭사이드, 또는 테트라에틸 게르마늄 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있다.The silica precursor may be selected from the group consisting of tetraethylorthosilicate, tetramethylorthosilicate, methyltriethoxysilane, phenyltriethoxysilane, dimethyldimethoxysilane, ethyltriethoxysilane, titania tetraisopropoxide, tetraethylgermanium, They may be used singly or in combination of two or more.

또한, 본 발명의 실리카 합성 활성이 있는 변형 녹색형광단백질은 실리카 상에 효소 또는 결합 펩타이드를 고정하는데 사용할 수 있다. In addition, the modified green fluorescent protein having the silica synthesis activity of the present invention can be used for immobilizing an enzyme or a binding peptide on silica.

따라서, 본 발명의 실리카 합성용 조성물은 효소 또는 결합 펩타이드를 더 포함할 수 있다. Accordingly, the composition for synthesizing silica of the present invention may further comprise an enzyme or a binding peptide.

이를 위해, 효소 또는 결합 펩타이드의 유전자에 실리카 합성 활성이 있는 변형 녹색형광단백질 유전자를 결합시켜 융합 단백질을 제조할 수 있다.For this purpose, a fusion protein can be prepared by binding a modified green fluorescent protein gene having a silica synthesis activity to an enzyme or a peptide of a binding peptide.

상기 효소의 종류는 적용 용도에 따라 적절히 선택하여 사용할 수 있어 특별히 제한하지는 않는다.The kind of the enzyme can be appropriately selected depending on the application, and is not particularly limited.

상기 결합 펩타이드는 항체, DNA 또는 RNA와 특이적으로 결합하는 펩타이드, 또는 수용체 등을 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.The binding peptide may be a peptide, a receptor, or the like that specifically binds to an antibody, DNA or RNA, but is not particularly limited thereto.

상기 실리카 합성 활성이 있는 변형 녹색형광단백질은 효소 또는 결합 펩타이드의 N-말단, C-말단, 또는 N-말단과 C-말단 양쪽에 동시에 결합하거나, 리간드를 통해 고유의 성질에 영향을 미치지 않는 범위에서 그의 위치에 상관없이 결합될 수 있다.The modified green fluorescent protein having the silica synthesis activity can bind to the N-terminal, C-terminal, or both N-terminal and C-terminal of the enzyme or the binding peptide at the same time, Lt; RTI ID = 0.0 > position. ≪ / RTI >

따라서, 본 발명의 융합 단백질은 고유의 성질에 영향을 미치지 않는 범위에서 그의 위치에 상관없이 결합되어 형성된 모든 융합 단백질을 의미한다. Accordingly, the fusion protein of the present invention means any fusion protein formed by binding regardless of its position to the extent that it does not affect its inherent properties.

또한, 상기 융합 단백질은 발현 및 정제 효율을 높이기 위해 N-말단, C-말단, 또는 N-말단과 C-말단 양쪽에 동시에 His-Tag을 포함할 수 있다. In addition, the fusion protein may contain N-terminal, C-terminal, or both His-Tag at both the N-terminus and C-terminus to enhance expression and purification efficiency.

상기 융합 단백질은 펩타이드를 합성하는 당해 분야의 공지된 방법에 의하여 제조할 수 있다. 예를 들어 유전자 재조합과 단백질 발현 시스템 또는 펩타이드 합성기 등을 통하여 시험관내에서 합성하는 방법에 의하여 제조할 수 있다.The fusion protein can be prepared by known methods in the art for synthesizing peptides. For example, by a method of synthesizing in vitro through gene recombination and protein expression system or peptide synthesizer.

상기 효소 또는 결합 펩타이드가 고정된 실리카는 상기 융합 단백질과 실리카 전구체를 반응시켜 실리카에 의해 상기 융합 단백질이 코팅되도록 하거나, 상기 실리카 합성 활성이 있는 변형 녹색형광단백질, 실리카 전구체 및 효소 또는 결합 펩타이드를 일정 비율로 혼합하여 반응시켜 원심분리하여 제조할 수 있다.The enzyme or the binding peptide-immobilized silica may be prepared by reacting the fusion protein with a silica precursor to coat the fusion protein with the silica, or to modify the modified green fluorescent protein, silica precursor and enzyme or binding peptide having the silica synthesis activity And then centrifuging the reaction mixture.

또한, 상기 실리카 합성 활성이 있는 변형 녹색형광단백질과 실리카 전구체를 반응시켜 실리카를 합성할 때 침전물로 뭉치지 않고 단일막으로 도포될 수 있도록 인지질을 함께 사용할 수 있다.When the silica is synthesized by reacting the modified green fluorescent protein having the silica synthesis activity with the silica precursor, the phospholipid can be used together with the phospholipid so that the silica can be applied as a single membrane without aggregation as a precipitate.

상기 실리카 단일막은 통상의 실리카 합성 조건에서 상기 실리카 합성 활성이 있는 변형 녹색형광단백질, 실리카 전구체 및 인지질을 반응시켜 얻을 수 있다. The silica monolayer can be obtained by reacting the modified green fluorescent protein, silica precursor and phospholipid having the activity of synthesizing silica under the usual silica synthesis conditions.

또한, 상기 실리카 합성 활성이 있는 변형 녹색형광단백질 및 실리카 전구체에 인지질을 적당한 비율로 혼합하여 유무기 복합체를 형성한 후 상기 유무기 복합체에 열이나 유기용매를 처리하여 유기물을 제거함으로써 다공성 실리카 구조체를 제조할 수 있다.In addition, the phospholipid is mixed with the modified green fluorescent protein and the silica precursor having the silica synthesizing activity to form the organic-inorganic hybrid material, and then the organic or inorganic hybrid material is treated with heat or an organic solvent to remove the organic material, Can be manufactured.

또한, 본 발명의 실리카 합성용 조성물은 유기물 외에 하이드록시아파타이트와 같은 무기물을 이용하여 실리카 합성에 사용함으로써 실리카 복합체를 제조할 수 있다. In addition, the silica synthesis composition of the present invention can be used to synthesize a silica complex by using an inorganic material such as hydroxyapatite in addition to an organic material.

상기 실리카 복합체는 통상의 실리카 합성 조건에서 상기 실리카 합성 활성이 있는 변형 녹색형광단백질, 실리카 전구체 및 하이드록시아파타이트를 반응시켜 얻을 수 있다. The silica complex can be obtained by reacting a modified green fluorescent protein having silica synthesis activity, a silica precursor and hydroxyapatite under conventional silica synthesis conditions.

상기 실리카 복합체는 골대체 소재 및 치아 대체 소재로 활용될 수 있으며 골세포분화 배지의 세포배양 코팅제, 3차원 스캐폴더에 활용될 수 있다.
The silica complex can be utilized as a bone replacement material and a tooth replacement material, and can be applied to a cell culture coating agent of a bone cell differentiation medium and a three-dimensional scaffold.

본 발명은 또한 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 변형 녹색형광단백질 및 실리카 전구체를 반응시키는 단계를 포함하는 실리카 합성방법에 관한 것이다.The present invention also relates to a method of synthesizing silica comprising the step of reacting a modified green fluorescent protein represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a silica precursor.

본 발명의 실리카 합성 활성이 있는 변형 녹색형광단백질은 상온 및 상압의 조건에서 약염기 즉, pH 6 에서 8의 수용액 하에서 실리카 전구체와 반응하여 실리카를 합성할 수 있다.The modified green fluorescent protein having the silica synthesis activity of the present invention can be synthesized by reacting with a silica precursor under a weak base, that is, an aqueous solution having a pH of from 6 to 8 under normal temperature and normal pressure conditions.

본 발명의 실리카 합성방법을 보다 구체적으로 설명하면, 25mM Tris-HCl 용액(pH 6 내지 8)에 녹아 있는 실리카 전구체 및 본 발명의 변형 녹색형광단백질을 1 % 내지 10% 의 중량비로 혼합하고, 상온, 상압의 조건에서 반응시킨 후 원심분리하여 실리카를 침전시킨다. The silica synthesis method of the present invention will be described in more detail. The silica precursor dissolved in a 25 mM Tris-HCl solution (pH 6 to 8) and the modified green fluorescent protein of the present invention are mixed at a weight ratio of 1% to 10% , The reaction is carried out under atmospheric pressure, and the silica is precipitated by centrifugation.

상술한 바와 같이, 실리카 합성 활성이 있는 변형 녹색형광단백질을 이용하여 상온, 상압의 조건에서 약염기의 수용액 하에서 다기능성 실리카를 합성할 수 있어 환경적으로 유해한 부산물의 생성에 따른 종래기술의 문제점을 해소할 수 있다.As described above, it is possible to synthesize a multifunctional silica in an aqueous solution of weak base at room temperature and atmospheric pressure using a modified green fluorescent protein having silica synthesis activity, thereby solving the problems of the prior art due to the generation of environmentally harmful byproducts can do.

또한, 본 발명의 실리카 합성방법은 변형 녹색형광단백질, 실리카 전구체 및 효소 또는 결합 펩타이드를 반응시키거나, 변형 녹색형광단백질과 효소 또는 결합 펩타이드의 융합 단백질과 실리카 전구체의 반응을 통해 효소 또는 결합 펩타이드가 고정된 실리카를 합성할 수 있다.In addition, the silica synthesis method of the present invention can be carried out by reacting a modified green fluorescent protein, a silica precursor and an enzyme or a binding peptide, or by reacting a modified green fluorescent protein with a fusion protein of an enzyme or a binding peptide with a silica precursor, Fixed silica can be synthesized.

이 경우, 실리카에 의해 상기 융합 단백질이 코팅되도록 하거나, 상기 실리카 합성 활성이 있는 변형 녹색형광단백질, 실리카 전구체 및 효소 또는 결합 펩타이드를 일정 비율로 혼합하여 반응시켜 원심분리하여 제조할 수 있다.In this case, the fusion protein may be coated with the silica, or the modified green fluorescent protein, silica precursor and enzyme or the binding peptide having the silica synthesis activity may be mixed at a certain ratio and reacted and centrifuged.

또한, 본 발명의 실리카 합성방법은 통상의 실리카 합성 조건에서 상기 실리카 합성 활성이 있는 변형 녹색형광단백질, 실리카 전구체 및 인지질을 반응시켜 실리카를 합성할 때 침전물로 뭉치지 않고 단일막으로 도포될 수 있도록 실리카 단일막 형태로 제조할 수 있다. In addition, the silica synthesis method of the present invention is a method for synthesizing silica by reacting modified green fluorescent protein, silica precursor and phospholipid having the activity of synthesizing silica under the usual silica synthesis conditions to prepare a silica It can be produced in a single membrane form.

또한, 본 발명의 실리카 합성방법은 상기 변형 녹색형광단백질, 실리카 전구체 및 인지질을 반응시켜 유무기 복합체를 제조하는 단계; 및 상기 유무기 복합체에 열 또는 유기용매 처리하여 유기물을 제거하는 단계를 거쳐 다공성 실리카를 합성할 수 있다. Also, the method for synthesizing silica of the present invention comprises the steps of: preparing an organic-inorganic hybrid material by reacting the modified green fluorescent protein, a silica precursor and a phospholipid; And subjecting the organic / inorganic hybrid material to heat or organic solvent treatment to remove the organic material, thereby synthesizing the porous silica.

또한, 본 발명의 실리카 합성방법은 유기물 외에 하이드록시아파타이트와 같은 무기물을 이용하여 실리카 합성에 사용함으로써 실리카 복합체를 제조할 수 있다. In addition, the silica synthesis method of the present invention can produce a silica complex by using an inorganic material such as hydroxyapatite in the synthesis of silica in addition to the organic material.

상기 실리카 복합체는 통상의 실리카 합성 조건에서 상기 실리카 합성 활성이 있는 변형 녹색형광단백질, 실리카 전구체 및 하이드록시아파타이트를 반응시켜 얻을 수 있다.
The silica complex can be obtained by reacting a modified green fluorescent protein having silica synthesis activity, a silica precursor and hydroxyapatite under conventional silica synthesis conditions.

본 발명은 또한 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 변형 녹색형광단백질의 자기조립 구조체의 표면이 실리카로 코팅되어 있는 실리카 복합체에 관한 것이다.The present invention also relates to a silica complex wherein the surface of the self assembled structure of the modified green fluorescent protein represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is coated with silica.

본 발명의 변형 녹색형광단백질은 자기조립이 가능하여 실리카 합성 반응에 의해 자기 캡슐화 (autoencapsulation) 반응이 나타나 구형의 자기조립 구조체 형태를 띠며, 합성된 실리카는 상기 자기조립 구조체의 표면을 코팅하여 실리카 복합체를 형성할 수 있다.The modified green fluorescent protein of the present invention can self-assemble and undergo a self-encapsulation reaction by a silica synthesis reaction to form a spherical self-assembled structure. The synthesized silica is coated on the surface of the self-assembled structure, Can be formed.

상기 실리카 복합체는 복합 쉘 내에 빈 공동이 형성되는 캡슐형과 변형 녹색형광단백질이 코어부를 형성하고 실리카가 쉘부를 형성하는 코어-쉘 구조 둘 다를 가질 수 있다. The silica complex may have both a capsule-like structure in which empty cavities are formed in the composite shell and a core-shell structure in which the modified green fluorescent protein forms a core portion and the silica forms a shell portion.

캡슐형을 위해서는 코어를 형성할 수 있는 구형단백질 예를 들어 12nm 정도의 구를 형성할 수 있는 페리틴 단백질과 융합하거나 코어-쉘 고분자 나노구형체와 융합하여 변형 녹색형광단백질에 의해 구형의 실리카 구조체를 형성 후 소결을 통해 내부를 태우면 캡슐형을 얻을 수 있다. For encapsulation, a spherical protein capable of forming a core may be fused with a ferritin protein capable of forming a sphere of about 12 nm, or may be fused with a core-shell polymer nanocrystal to form a spherical silica structure by a modified green fluorescent protein. After forming, burning the inside through sintering can give a capsule type.

리포좀을 주형으로 할 경우 속이 빈 캡슐형 실리카를 얻을 수 있다. 또한 변형 녹색형광단백질이 코어-쉘 구조를 이룰 수 있으므로 이를 코어로 실리카가 쉘부를 형성하는 코어-쉘 구조를 가질 수 있다.When the liposome is used as a template, hollow encapsulated silica can be obtained. In addition, the modified green fluorescent protein can have a core-shell structure in which silica forms a shell-part, because it can form a core-shell structure.

따라서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 변형 녹색형광단백질 및 실리카 전구체를 반응시켜 자기 캡슐화 (autoencapsulation)를 통해 상기 변형 녹색형광단백질의 자기조립 구조체의 표면이 실리카로 코팅되어 있는 실리카 복합체를 제조하는 단계를 포함하는 실리카 복합체의 제조방법을 제공한다.Accordingly, the present invention relates to a silica complex in which the surface of the self-assembled structure of the modified green fluorescent protein is coated with silica through autoencapsulation by reacting a modified green fluorescent protein represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a silica precursor To produce a silica composite.

상기 실리카 복합체는 상온 및 상압의 조건에서 pH 6 내지 8의 수용액 하에서 상기 변형 녹색형광단백질 및 실리카 전구체를 반응시켜 합성할 수 있다. The silica complex can be synthesized by reacting the modified green fluorescent protein and the silica precursor under an aqueous solution of pH 6 to 8 at normal temperature and normal pressure.

상기 실리카 전구체의 종류는 전술한 바와 같다.The kind of the silica precursor is as described above.

상기 실리카 복합체에 있어서, 변형 녹색형광단백질의 N-말단, C-말단, 또는 N-말단과 C-말단 양쪽에는 화학적, 물리적 공유 또는 비공유 결합에 의하여 직접 또는 다른 매개체를 이용하여 간접적으로 연결될 수 있는 조직 특이적 성분, 약제학적 활성 성분, 효소 또는 결합 펩타이드, 인지질, 또는 하이드록시아파타이트 등을 추가로 포함할 수 있다. In the silica complex, the N-terminal, C-terminal, or both the N-terminal and the C-terminal of the modified green fluorescent protein can be indirectly connected by chemical or physical covalent or non- A tissue-specific component, a pharmaceutically active ingredient, an enzyme or a binding peptide, a phospholipid, or hydroxyapatite.

상기 조직 특이적 결합성분은 항원, 항체, RNA, DNA, 합텐(hapten), 아비딘(avidin), 스트렙타비딘(streptavidin), 뉴트라비딘(neutravidin), 프로테인 A, 프로테인 G, 렉틴(lectin), 셀렉틴(selectin), 방사선 동위원소 표지성분, 또는 종양 마커 등과 특이적으로 결합할 수 있는 물질일 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다. The tissue specific binding component may be selected from the group consisting of antigen, antibody, RNA, DNA, hapten, avidin, streptavidin, neutravidin, protein A, protein G, lectin, a selectin, a radioisotope labeled component, or a tumor marker, but the present invention is not limited thereto.

상기 약제학적 활성성분은 siRNA, 안티센스, 항암제, 항생제, 호르몬, 호르몬길항제, 인터루킨, 인터페론, 성장 인자, 종양 괴사 인자, 엔도톡신, 림포톡시, 유로키나제, 스트렙토키나제, 조직 플라스미노겐 활성제, 프로테아제 저해제, 알킬포스포콜린, 방사선 동위원소로 표지된 성분, 심혈관계 약물, 위장관계 약물, 또는 신경계 약물 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.The pharmaceutical active ingredient may be selected from the group consisting of siRNA, antisense, anticancer, antibiotic, hormone, hormone antagonist, interleukin, interferon, growth factor, tumor necrosis factor, endotoxin, lymphotoxin, urokinase, streptokinase, tissue plasminogen activator, A substance labeled with a radioisotope, a cardiovascular drug, a gastrointestinal drug, or a nervous system drug may be used alone or in combination of two or more. However, the present invention is not limited thereto.

상기 실리카 복합체에 있어서, 효소 또는 결합 펩타이드가 실리카 복합체에 고정되어 있는 경우, 형광단백질의 형광성에 의해 특정 핵산, 단백질, 다당류 또는 병원균 등을 검출할 수 있는 바이오센서로 사용할 수 있다. In the silica complex, when the enzyme or the binding peptide is immobilized on the silica complex, it can be used as a biosensor capable of detecting specific nucleic acids, proteins, polysaccharides or pathogens by the fluorescence of the fluorescent protein.

상기 효소 또는 결합 펩타이드의 종류는 상술한 바와 같다.The kind of the enzyme or the binding peptide is as described above.

상기 실리카 복합체에 인지질이 포함될 경우, 실리카 유무기 복합체를 형성하거나, 유기물 제거 과정을 통한 다공성 실리카 구조체가 형성될 수 있다.When a phospholipid is included in the silica complex, a porous silica structure may be formed by forming a silica-based organic complex or by removing an organic material.

상기 실리카 복합체에 하이드록시아파타이트가 포함될 경우, 무기물과의 실리카 기반 복합체가 형성될 수 있다.When hydroxyapatite is included in the silica composite, a silica-based composite with an inorganic material can be formed.

따라서, 다양한 기능성 성분들이 결합된 본 발명의 실리카 복합체는 약물전달체, 핵산, 단백질, 다당류 또는 병원균 검출용 바이오센서, 골대체재, 세포배양 코팅제, 3차원 스캐폴드, 조영제, 진단 프로브 등에 사용할 수 있다.
Therefore, the silica complex of the present invention to which various functional components are combined can be used for a biosensor for detection of a drug delivery system, a nucleic acid, a protein, a polysaccharide or a pathogen, a goal frame, a cell culture coating agent, a three dimensional scaffold, a contrast agent and a diagnostic probe.

본 발명은 상기 실리카 복합체; 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약물전달체에 관한 것이다.The present invention relates to the aforementioned silica complex; And a pharmaceutically acceptable carrier.

본 발명의 약물전달체는 코어-쉘 구조를 하고 있어 상술한 바와 같은 약제학적 활성성분을 운반하는데 특히 적합하다. The drug delivery vehicle of the present invention has a core-shell structure and is particularly suitable for delivering the pharmaceutically active ingredient as described above.

상기 약제학적으로 허용 가능한 담체는 의약 분야에서 통상 사용되는 담체 및 비히클을 포함하며, 구체적으로 이온 교환 수지, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질(예, 사람 혈청 알부민), 완충 물질(예, 각종 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물), 물, 염 또는 전해질(예, 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소캄륨, 염화나트륨 및 아연 염), 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌 글리콜 또는 양모지 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. Such pharmaceutically acceptable carriers include carriers and vehicles commonly used in the medical field and specifically include ion exchange resins, alumina, aluminum stearate, lecithin, serum proteins (e.g., human serum albumin), buffer substances Water, salts or electrolytes (e.g., protamine sulfate, disodium hydrogen phosphate, potassium hydrogen phosphate, sodium chloride and zinc salts), colloidal silicon dioxide But are not limited to, silica, magnesium trisilicate, polyvinylpyrrolidone, cellulose based substrate, polyethylene glycol, sodium carboxymethylcellulose, polyarylate, wax, polyethylene glycol or wool.

또한, 본 발명의 약물전달체는 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 유화제, 현탁제, 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.In addition, the drug delivery vehicle of the present invention may further comprise a lubricant, a wetting agent, an emulsifying agent, a suspending agent, or a preservative in addition to the above components.

한 양태로서, 본 발명에 따른 약물전달체는 비경구 투여를 위한 수용성 용액으로 제조할 수 있으며, 바람직하게는 한스 용액(Hank's solution), 링거 용액(Ringer's solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 완충 용액을 사용할 수 있다. 수용성 주입(injection) 현탁액은 소디움 카르복시메틸셀룰로즈, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다.In one embodiment, the drug delivery vehicle according to the present invention may be prepared as an aqueous solution for parenteral administration, preferably a buffer solution such as Hank's solution, Ringer's solution or physically buffered saline solution Can be used. Aqueous injection suspensions may contain a substrate capable of increasing the viscosity of the suspension, such as sodium carboxymethyl cellulose, sorbitol or dextran.

본 발명의 약물전달체의 다른 바람직한 양태는 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액의 멸균 주사용 제제의 형태일 수 있다. 이러한 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제(예를 들면 트윈 80) 및 현탁화제를 사용하여 본 분야에 공지된 기술에 따라 제형화할 수 있다.Another preferred embodiment of the drug delivery system of the present invention may be in the form of a sterile injectable preparation of a sterile injectable aqueous or oily suspension. Such suspensions may be formulated according to techniques known in the art using suitable dispersing or wetting agents (e. G., Tween 80) and suspending agents.

또한, 상기 멸균 주사용 제제는 무독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사 용액 또는 현탁액(예를 들면 1,3-부탄디올 중의 용액)일 수 있다. 사용될 수 있는 비히클 및 용매로는 만니톨, 물, 링거 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균 비휘발성 오일이 통상적으로 용매 또는 현탁화 매질로서 사용된다. 이러한 목적을 위해 합성 모노 또는 디글리세라이드를 포함하여 자극성이 적은 비휘발성 오일은 그 어느 것도 사용할 수 있다.The sterile injectable preparation may also be a sterile injectable solution or suspension in a non-toxic parenterally acceptable diluent or solvent (for example, a solution in 1,3-butanediol). Vehicles and solvents that may be used include mannitol, water, Ringer's solution and isotonic sodium chloride solution. In addition, sterile, nonvolatile oils are conventionally used as a solvent or suspending medium. For this purpose, any non-volatile oil including synthetic mono or diglycerides and less irritant may be used.

본 발명의 약물전달체의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
A suitable dose of the drug delivery vehicle of the present invention may be variously prescribed by such factors as the formulation method, administration method, age, body weight, sex, pathological condition, food, administration time, administration route, excretion rate and responsiveness of the patient .

본 발명은 또한 상기 실리카 복합체; 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조영제 조성물에 관한 것이다. The present invention also relates to the aforementioned silica complex; And a pharmaceutically acceptable carrier.

본 발명의 실리카 복합체는 녹색형광단백질의 형광 특성으로 인해 자기공명 및 광학 영상 장치 등을 통해 표적 부위의 이미징이 가능한 조영제로 사용할 수 있다.The silica complex of the present invention can be used as a contrast agent capable of imaging a target site through magnetic resonance and an optical imaging device due to the fluorescence property of a green fluorescent protein.

본 발명의 조영제 조성물은 진단 대상에서 분리한 조직 또는 세포에 투여하여 형광 실리카 복합체가 발산하는 신호를 감지하여 영상을 수득하는데 이용될 수 있다.The contrast agent composition of the present invention can be used to obtain an image by sensing the signal emitted from the fluorescent silica complex by administration to a tissue or cell isolated from a subject to be diagnosed.

상기 형광 실리카 복합체에 의해 발산되는 신호를 감지하기 위해서는 자기공명영상장치(MRI)와 광학 이미징의 이용이 바람직하다. It is preferable to use magnetic resonance imaging (MRI) and optical imaging to sense the signal emitted by the fluorescent silica composite.

자기공명영상장치는 강력한 자기장 속에 생체를 넣고 특정 주파수의 전파를 조사하여 생체조직에 있는 수소 등의 원자핵에 에너지를 흡수시켜 에너지가 높은 상태로 만든 후, 상기 전파를 중단하여 상기 수소 등의 원자핵 에너지가 방출되게 하고 이 에너지를 신호로 변환하여 컴퓨터로 처리하여 영상화한 장치이다. 자기 또는 전파는 골에 방해를 받지 않기 때문에 단단한 골 주위 또는 뇌나 골수의 종양에 대하여 종단, 횡단, 임의의 각도에서 선명한 입체적인 단층상을 얻을 수 있다. 특히 상기 자기공명영상장치는 T2 스핀-스핀 이완 자기공명영상장치인 것이 바람직하다.
A magnetic resonance imaging apparatus puts a living body in a strong magnetic field and irradiates a radio wave of a specific frequency to absorb energy into an atomic nucleus such as hydrogen in a biological tissue to make the state high in energy, And the energy is converted into a signal, processed by a computer, and imaged. Since the magnetic or radio waves are not disturbed by the bone, a sharp three-dimensional tomographic image can be obtained at the end, transverse, or any angle with respect to the hard bone around or the brain or the bone marrow. In particular, the magnetic resonance imaging apparatus is preferably a T2 spin-spin relaxation magnetic resonance imaging apparatus.

본 발명은 또한 상기 실리카 복합체; 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 표적 지향형 조영제 조성물에 관한 것이다.The present invention also relates to the aforementioned silica complex; ≪ / RTI > and a pharmaceutically acceptable carrier.

본 발명의 실리카 복합체는 녹색형광단백질에 의한 형광성을 가짐과 동시에 조직 특이적 결합성분이 연결되어 있어 표적지향이 가능하여 자기공명 및 광학 영상 장치 등을 통해 표적 부위의 이미징이 가능한 조영제로 사용할 수 있다.
The silica complex of the present invention can be used as a contrast agent capable of imaging a target site through magnetic resonance and an optical imaging device since it has fluorescence due to a green fluorescent protein and is linked to a tissue-specific binding component, .

본 발명은 또한 상기 실리카 복합체; 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 동시 진단 또는 치료용 조영제 조성물에 관한 것이다.The present invention also relates to the aforementioned silica complex; ≪ / RTI > and a pharmaceutically acceptable carrier.

본 발명의 실리카 복합체는 약제학적 활성성분과 물리 화학적으로 결합하여 실리카 복합체의 형광성을 동시에 포함하고 있어 자기공명 및 광학 영상 장치 등을 통해 생체 분자의 분리, 진단 또는 치료 등의 나노 프로브 및 약물 또는 유전자 전달체(delivery vehicle) 등에 이용할 수 있다. The silica complex of the present invention physically chemically bonds with a pharmaceutically active ingredient and simultaneously contains the fluorescence of the silica complex. Therefore, it is possible to obtain nanoprobes, drugs or genes such as separation, diagnosis or treatment of biomolecules through magnetic resonance and optical imaging devices A delivery vehicle or the like.

상기 실리카 복합체를 이용한 생체 진단의 한 대표적인 예로서 분자 자기공명영상 진단 또는 자기 이완 센서(magnetic relaxation sensor)를 들 수 있다. 실리카 복합체는 그 크기가 커짐에 따라 더 큰 T2 조영효과를 나타내는데, 이러한 성질을 이용하면 생체 분자를 검출하는 센서로 사용될 수 있다. 즉, 특정한 생체 분자가 변형 녹색형광단백질의 엉김을 유도하게 되면 이에 의해 T2 자기 공명 영상 효과가 증대된다. 이러한 차이를 이용하여 생체 분자를 검출한다. Magnetic resonance imaging or a magnetic relaxation sensor may be used as a representative example of the biomedical diagnosis using the silica complex. The silica composite shows a larger T2 contrast effect as its size increases. Using this property, it can be used as a sensor for detecting biomolecules. That is, when a specific biomolecule induces aggregation of modified green fluorescent protein, the T2 magnetic resonance imaging effect is enhanced. Biomolecules are detected using these differences.

또한, 본 발명의 실리카 복합체는 종양과 관련된 다양한 질병, 예를 들어 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 결장암 및 자궁경부암을 진단 및/또는 치료하는데 이용될 수 있다.　The silica complex of the present invention can also be used for diagnosing and / or treating various diseases related to tumors such as gastric cancer, lung cancer, breast cancer, ovarian cancer, liver cancer, bronchial cancer, nasopharyngeal cancer, laryngeal cancer, pancreatic cancer, bladder cancer, colon cancer and cervical cancer . ≪ / RTI >

보다 구체적으로 설명하면, 종양 세포는 정상 세포에서는 거의 또는 전혀 생산되지 않는 특정 물질을 발현 및/또는 분비하는데 이들을 일반적으로 "종양 마커(tumor marker)"라 명명한다. 그러한 종양 마커와 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 상기 실리카 복합체에 결합시켜 종양 진단에 유용하게 이용될 수 있다.　당업계에는 다양한 종양 마커뿐만 아니라 이들과 특이적으로 결합할 수 있는 물질이 공지되어 있다. More specifically, tumor cells express and / or secrete certain substances that are produced in normal cells with little or no production, and these are generally referred to as "tumor markers ". A substance capable of specifically binding to such a tumor marker can be bound to the silica complex and used for diagnosis of a tumor. There are a variety of tumor markers in the art as well as materials that are capable of specifically binding to them.

또한 상기 종양 마커는 작용 기작에 따라 리간드, 항원, 수용체, 및 이들을 코딩하는 핵산으로 분류할 수 있다. The tumor markers can be classified into ligands, antigens, receptors, and nucleic acids encoding them depending on the action mechanism.

종양 마커가 "리간드"인 경우에는 상기 리간드와 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 본 발명에 따른 실리카 복합체에 도입할 수 있는데 상기 리간드와 특이적으로 결합할 수 있는 수용체 또는 항체가 적합할 것이다. 본 발명에서 이용 가능한 리간드 및 이와 특이적으로 결합할 수 있는 수용체의 예로는 시냅토타그민의 C2(synaptotagmin의 C2)와 포스파티딜세린, 아넥신 V(annexin V)와 포스파티딜세린, 인테그린(integrin)과 이의 수용체, VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor)와 이의 수용체, 안지오포이에틴(angiopoietin)과 Tie2 수용체, 소마토스타틴(somatostatin)과 이의 수용체, 바소인테스티날 펩타이드(vasointestinal peptide)와 이의 수용체 등이 있지만 이에 제한되는 것은 아니다. When the tumor marker is a "ligand ", a substance capable of specifically binding to the ligand can be introduced into the silica complex according to the present invention. A receptor capable of specifically binding to the ligand Or an antibody will be suitable. Examples of the ligands usable in the present invention and receptors capable of specifically binding thereto include C2 of synaptotagmin (C2 of synaptotagmin) and phosphatidylserine, annexin V and phosphatidylserine, integrin, Receptor, VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) and its receptors, angiopoietin and Tie2 receptors, somatostatin and its receptors, vasointestinal peptides and receptors thereof. It is not.

종양 마커가 "수용체"인 대표적인 예는 난소암 세포에서 발현되는 폴산 수용체가 있다. 상기 수용체와 특이적으로 결합할 수 있는 물질(폴산 수용체의 경우에는 폴산)이 본 발명에 따른 실리카 복합체에 도입될 수 있는데 상기 수용체와 특이적으로 결합할 수 있는 리간드 또는 항체가 적합할 것이다. A representative example where the tumor marker is a "receptor " is a folate receptor that is expressed in ovarian cancer cells. A substance capable of specifically binding to the receptor (folic acid in the case of a folic acid acceptor) can be introduced into the silica complex according to the present invention, and a ligand or antibody capable of specifically binding to the receptor will be suitable.

종양 마커가 "항원"인 경우 상기 항원과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 본 발명에 따른 실리카 복합체에 도입할 수 있는데 상기 항원과 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 적합할 것이다. 본 발명에서 이용 가능한 항원 및 이와 특이적으로 결합하는 항체의 예로는 암성 태아성 항원(carcinoembryonic antigen - 대장암 표지 항원)과 허셉틴(Genentech, USA), HER2/neu 항원(HER2/neu antigen - 유방암 표지 항원)과 허셉틴, 전립선 특이 항원(prostate-specific membrane antigen - 전립선암 표지 항원)과 리툭산(IDCE/Genentech, USA) 등이 있다. 이러한 항체는 상업적으로 입수하거나 당업계에 공지된 방법에 따라 제조할 수 있다. 일반적으로 포유동물(예, 마우스, 랫트, 염소, 토끼, 말 또는 양)을 적절한 양의 항원으로 1회 이상 면역화시킨다.　 일정 시간 후 역가가 적정 수준에 이르렀을 때, 포유동물의 혈청으로부터 회수한다. 회수한 항체는 원하는 경우 공지된 공정을 이용하여 정제하고 사용 시까지 냉동 완충된 용액에 저장할 수 있다. 이러한 방법의 상세한 사항은 당업계에 잘 알려져 있다. When the tumor marker is an " antigen ", a substance capable of specifically binding to the antigen can be introduced into the silica complex according to the present invention, and an antibody capable of specifically binding to the antigen is suitable. Examples of the antibody that specifically binds to the antigen that can be used in the present invention include carcinoembryonic antigen (colon cancer marker antigen), Herceptin (Genentech, USA), HER2 / neu antigen (HER2 / neu antigen - (Prostate-specific membrane antigen) and Rituxan (IDCE / Genentech, USA). Such antibodies can be obtained commercially or can be prepared according to methods known in the art. Generally, mammals (e.g., mice, rats, goats, rabbits, horses or sheep) are immunized once or more with an appropriate amount of antigen. After a period of time, when the titer has reached a suitable level, it is recovered from the serum of the mammal. The recovered antibody can be purified using a known process, if desired, and stored in the freeze buffered solution until use. Details of such methods are well known in the art.

한편, 상기 "핵산"은 전술한 리간드, 항원, 수용체 또는 이의 일부분을 코딩하는 RNA 및 DNA를 포함한다. 핵산은 당업계에 알려진 바와 같이 상보적인 서열 간에 염기쌍(base pair)을 형성하는 특징을 갖고 있기 때문에 특정 염기서열을 갖는 핵산은 상기 염기서열에 상보적인 염기서열을 갖는 핵산을 이용하여 검출할 수 있다. 상기 효소, 리간드, 항원, 수용체를 코딩하는 핵산과 상보적인 염기서열을 갖는 핵산을 본 발명에 따른 실리카 복합체에 도입할 수 있다. On the other hand, the "nucleic acid" includes RNA and DNA encoding the aforementioned ligand, antigen, receptor or a part thereof. Since the nucleic acid has a characteristic of forming a base pair between complementary sequences as known in the art, a nucleic acid having a specific base sequence can be detected using a nucleic acid having a base sequence complementary to the base sequence . A nucleic acid having a base sequence complementary to the nucleic acid encoding the enzyme, ligand, antigen, or receptor can be introduced into the silica complex according to the present invention.

또한, 핵산은 5' 및 3' 말단에 -NH2, -SH, -COOH 등의 작용기가 있어 실리카 복합체와 결합하는데 유용하게 이용될 수 있다. In addition, the nucleic acid has functional groups such as -NH 2 , -SH, and -COOH at the 5 'and 3' ends, and can be usefully used for bonding with the silica complex.

이러한 핵산은 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예를 들면 자동 DNA 합성기(예, 바이오써치, 어플라이드 바이오시스템스 등으로부터 구입할 수 있는 것)를 사용하여 합성할 수 있다. 예로서, 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오타이드는 문헌(Stein et al . Nucl . Acids Res. 1988, vol.16, p.3209)에 기술된 방법에 의해 합성할 수 있다. 메틸포스포네이트 올리고뉴클레오타이드는 조절된 유리 중합체 지지체를 사용하여 제조할 수 있다(Sarin et al . Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 1988, vol.85, p.7448).
Such nucleic acids can be synthesized by standard methods known in the art, for example, using automated DNA synthesizers (such as those available from Biosearch, Applied Biosystems, etc.). As an example, phosphorothioate oligonucleotides have been described in Stein et < RTI ID = 0.0 > al . Nucl . Acids Res . 1988, vol. 16, p. 3209). Methylphosphonate oligonucleotides can be prepared using controlled glass polymer scaffolds (Sarin et < RTI ID = 0.0 > al . Proc . Natl . Acad . Sci . USA 1988, vol. 85, p. 7448).

본 발명은 또한 상기 실리카 복합체; 및 진단 프로브를 포함하는 다중 진단 프로브에 관한 것이다. The present invention also relates to the aforementioned silica complex; And multiple diagnostic probes including diagnostic probes.

상기 진단 프로브는 T1 자기공명 영상 진단 프로브, 광학 진단 프로브, CT 진단 프로브, 또는 방사선 동위원소 등을 사용할 수 있다. The diagnostic probe may be a T1 magnetic resonance imaging probe, an optical diagnostic probe, a CT diagnostic probe, or a radioactive isotope.

상기 다중 진단 프로브는 예를 들면, 형광 실리카 복합체에 T1 자기공명 영상 진단 프로브를 결합시키면 T2 자기공명영상 및 T1자기공명영상 진단을 동시에 진행할 수 있고, 광학 진단 프로브를 결합시키면 자기공명 영상과 광학 이미징을 동시에 할 수 있으며, CT 진단 프로브를 결합시키면 자기공명영상과 CT 진단을 동시에 할 수 있다. 또한 방사선 동위원소와 결합시키면 자기공명영상과 PET, SPECT 진단을 동시에 할 수 있다. The multiple diagnostic probes can, for example, combine a T1 magnetic resonance imaging probe with a fluorescent silica composite to simultaneously perform T2 magnetic resonance imaging and T1 magnetic resonance imaging, and when combined with an optical diagnostic probe, Can be performed simultaneously. Combining the CT diagnostic probe can simultaneously perform magnetic resonance imaging and CT diagnosis. In addition, when combined with radioisotope, MRI, PET, and SPECT can be performed simultaneously.

상기 T1 자기공명 영상 진단 프로브로는 Gd 화합물, 또는 Mn 화합물 등을 포함하며, 광학 진단 프로브로는 유기 형광 염료(dye), 양자점, 또는 염료 표지(dye labelled) 무기 지지체(예 SiO2, Al2O3))를 포함하며, CT 진단 프로브로는 I(요오드) 화합물, 또는 금 나노 입자를 포함하고, 방사선 동위원소로는 In, Tc, 또는 F 등을 포함한다.
The T1 magnetic resonance imaging probe includes a Gd compound or a Mn compound and the optical diagnostic probe includes an organic fluorescent dye, a quantum dot, or a dye-labeled inorganic support such as SiO 2 , Al 2 O 3 )). CT diagnostic probes include I (iodine) compounds or gold nanoparticles, and the radioisotopes include In, Tc, or F, and the like.

본 발명은 또한 상기 실리카 복합체가 전기방사된 섬유 또는 필터에 관한 것이다.The present invention also relates to a fiber or filter in which said silica composite is electrospun.

본 발명의 실리카 복합체는 전기방사법을 이용하여 섬유상 바이오 실리카와 같은 구조체를 형성할 경우, 다양한 필터 및 기능성 섬유 제조에 사용될 수 있다. The silica composite of the present invention can be used in the production of various filters and functional fibers when a structure such as fibrous biosilica is formed by electrospinning.

또는, 유전공학적 방법으로 실리카 복합체에 기능성 단백질을 융합하여 전기방사할 경우 기능성이 부여된 섬유 제조가 가능하다.
Alternatively, when the functional protein is fused to the silica complex by a genetic engineering method, electrospinning can produce a functional fiber.

본 발명은 또한 상기 실리카 복합체를 포함하는 골대체제, 치아대체제, 골세포분화배지의 세포배양코팅제 또는 3차원 스캐폴드 소재로서의 용도에 관한 것이다.The present invention also relates to a bone matrix system comprising the silica complex, a tooth replacement agent, a cell culture coating agent for osteocyte differentiation medium or a use thereof as a three-dimensional scaffold material.

본 발명의 실리카 복합체는 하이드록시아파타이트를 포함할 경우, 실리카 기반 복합체 형성을 통해 골대체제, 치아대체제, 골세포분화배지의 세포배양코팅제, 3차원 스캐폴드 등에 사용할 수 있다.
The silica complex of the present invention can be used as a bone matrix system, a tooth replacement agent, a cell culture coating agent of osteoclast differentiation medium, a three-dimensional scaffold or the like through silica-based complex formation when hydroxyapatite is included.

본 발명은 또한 상기 실리카 복합체를 포함하는 포토닉스 소자에 관한 것이다.The present invention also relates to a photonic device comprising the silica composite.

본 발명의 실리카 복합체는 반도체 기판 표면에 흡착되어 나노 스케일의 바이오 실리카를 형성할 수 있어 포토닉스 소자에 사용될 수 있다.
The silica composite of the present invention can be adsorbed on the surface of a semiconductor substrate to form nanoscale biosilica, and thus can be used in a photonics device.

본 발명은 또한 상기 실리카 복합체를 포함하는 바이오분자 검출용 바이오센서에 관한 것이다.The present invention also relates to a biosensor for detecting biomolecules comprising the silica complex.

본 발명의 실리카 복합체에 효소 또는 결합 펩타이드가 고정되는 것이 가능하여 핵산, 단백질, 다당류, 또는 병원균 등의 바이오분자 검출을 위한 바이오센서로 사용할 수 있다.
The enzyme or binding peptide can be immobilized on the silica complex of the present invention and can be used as a biosensor for detecting biomolecules such as nucleic acids, proteins, polysaccharides, and pathogens.

이하, 본 발명에 따르는 실시예 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples of the present invention, but the scope of the present invention is not limited by the following Examples.

<실시예 1> 변형 녹색형광단백질의 제조Example 1: Preparation of modified green fluorescent protein

도 1에 도시한 DNA 서열로 pQE80 벡터를 이용하여 BamHI 사이트와 HindIII 사이트에 삽입하였다. pETDuet 벡터를 이용할 경우에는 BamHI과 XhoI 사이트에 삽입하였다. pQE80 벡터를 이용할 경우 발현 균주는 Escherichia coli (E. coli) XL1-Blu를, pETDuet 벡터의 경우는 E. coli BL21 (DE3)를 사용하였다. GFP는 pET30b+ 벡터에 삽입되어 있으며 BL21(DE3)에서 발현시켜 정제하였다 (미도시됨). The DNA sequence shown in Fig. 1 was inserted into Bam HI site and Hind III site using pQE80 vector. When pETDuet vector was used, it was inserted into BamH I and XhoI sites. When the pQE80 vector was used, the expression strain was Escherichia coli For the (E. coli) XL1-Blu, pETDuet vector was used as the E. coli BL21 (DE3). GFP was inserted into the pET30b + vector and purified by expression in BL21 (DE3) (not shown).

GFP와 mGFP의 서열을 비교하였을 때 도 2의 GFP의 아미노산 서열 중 31번째 세린, 81번째 글루타민, 195번째 류신 잔기가 표면에 이온결합력을 높이는 아르기닌 잔기로, 151번째 아스파라진이 라이신 잔기로 치환되고, 65번째 및 100번째 페닐알라닌은 각각 시스테인과 세린으로 치환되었다. 그밖에 125번째 글루탐산이 라이신으로 반대로 210번째 라이신이 글루탐산으로 치환되었다. 222번째 류신이 히스티딘으로 치환되었고 벡터차이로 인해 2번째 아미노산인 글루타민은 삭제되었다. When the sequences of GFP and mGFP are compared, the 31st serine, the 81st glutamine and the 195th leucine residue in the amino acid sequence of GFP in FIG. 2 are arginine residues that increase the ion binding force on the surface, and the 151st asparagine is substituted with lysine residues , 65th and 100th phenylalanine were substituted with cysteine and serine, respectively. In addition, the 125th glutamic acid was replaced by lysine, and the 210th lysine was replaced by glutamic acid. The 222th leucine was replaced by histidine and due to vector differences, the second amino acid, glutamine, was deleted.

재조합 mGFP의 생산은 mGFP 유전자를 함유한 pQE80 벡터로 형질전환된 XL1-Blue 콜로니 한 개를 50 mg/L의 암피실린이 들어 있는 LB 액체 배지 3 mL에 접종하여 37 ℃에서 배양시킨 다음, 대수기 증식기 상태의 균 배양액 0.1 mL를 50 mL의 LB (1.0% 트립톤, 0.5% 효모 추출물, 1% NaCl) 배지에 접종하여 37 ℃에서 200 rpm으로 4시간 배양시킨 후 최종 농도가 1mM 이 되도록 IPTG를 첨가하여 단백질의 발현을 유도하였다. Production of recombinant mGFP was carried out by inoculating one XL1-Blue colony transformed with pQE80 vector containing mGFP gene into 3 mL of LB liquid medium containing 50 mg / L of ampicillin, culturing at 37 ° C, (0.1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl) and incubated at 37 ° C for 4 hours at 200 rpm. IPTG was then added to a final concentration of 1 mM To induce protein expression.

상기 IPTG를 첨가한 다음 37 ℃에서 3시간 동안 추가 배양시킨 다음 4 ℃, 4000 rpm에서 20분간 원심 분리하여 균체를 수거한 후 완충용액(0.3M NaCl, 1mM PMSF 포함된 20mM 인산 완충용액(pH 8.0))으로 균체를 현탁한 후 라이소자임 0.5 mg/mL로 처리하여 실온에서 30분간 효소 반응시킨 후 냉동과 해동 (-70 ℃/37 ℃)을 각각 3차례씩 반복하였다.The cells were harvested by centrifugation at 4 ° C and 4000 rpm for 20 minutes at 37 ° C. for 3 hours at 37 ° C. After adding the IPTG, the cells were harvested by adding buffer solution (0.3 M NaCl, 20 mM phosphate buffer (pH 8.0 ), And treated with 0.5 mg / mL of lysozyme. The cells were incubated at room temperature for 30 minutes and then subjected to freezing and thawing (-70 ° C / 37 ° C) three times.

얻어진 균체를 40W 하에서 10초씩 3회(1회마다 10초간 얼음에서 휴지) 반복으로 초음파 처리하여 균체를 파쇄하였고, 12,000 rpm에서 10분간 원심 분리한 후 상등액을 수거하였다. His-tag이 달린 mGFP는 최종 0.3M NaCl이 함유된 50mM 인산 완충용액(pH 8)으로 평형화된 cobalt affinity column 크로마토그래피(Clone tech사의 talone resin 사용)를 수행하여 N-말단 부위에 6개의 히스티딘 잔기가 연결된 재조합 mGFP 단백질을 100mM 이미다졸로 용출시켰다. 균체를 파쇄하고 원심분리하여 얻은 상청액을 이용하여 각 mGFP의 발현 양과 분자량 확인을 위해 SDS-PAGE와 웨스턴 블랏을 실시하였다. The obtained cells were subjected to ultrasonic treatment repeatedly for 10 seconds every 10 seconds for 10 seconds under 40 W, and the cells were disrupted. The cells were centrifuged at 12,000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was collected. His-tagged mGFP was subjected to cobalt affinity column chromatography (using a talone resin from Clone tech) equilibrated with 50 mM phosphate buffer (pH 8) containing final 0.3 M NaCl, and 6 histidine residues Was ligated with 100 mM imidazole. SDS-PAGE and Western blotting were performed to confirm the expression amount and molecular weight of each mGFP using the supernatant obtained by crushing and centrifuging the cells.

도 3에 나타난 바와 같이, 예상 분자량은 약 27 kDa이며 전기영동 결과로도 이를 확인할 수 있었다. mGFP는 가용화 상태로 고 발현되었다. 항-His tag 항체를 이용하여 His-tag 단백질인 mGFP를 다시 확인하고 SDS-PAGE 상에 나타나는 고발현 밴드와 일치함을 확인하였다. Coblat affinity column을 이용하여 정제된 mGFP 용출액은 총 단백질 양의 약 23%에 해당하였으며 Amicon Ultra-0.5mL filter를 이용하여 용출 시 사용한 이미다졸을 제거하기 위해 인산완충용액으로 계속해서 교환하며 5번 이상 농축과정을 반복하였다. GFP도 동일한 방법으로 준비하였다. As shown in Fig. 3, the expected molecular weight was about 27 kDa, which was confirmed by electrophoresis. mGFP was highly expressed in the solubilized state. The His-tag protein, mGFP, was identified again using an anti-His tag antibody and confirmed to be consistent with the high expression band on SDS-PAGE. Purified mGFP eluate by Coblat affinity column corresponds to about 23% of the total protein amount. It is continuously exchanged with phosphoric acid buffer solution to remove imidazole used in elution with Amicon Ultra-0.5mL filter. The concentration process was repeated. GFP was also prepared in the same manner.

이미다졸이 제거된 정제된 GFP와 mGFP의 실리카 합성 활성을 비교하였다. 촉매 단백질이 들어있지 않은 대조구로서 25mM Tris-HCl(pH6.8) 완충 용액과 1M의 TEOS (tetraethoxysilane)만 들어있는 조건 (none), mGFP 와 GFP를 이용하여 같은 조건으로 실리카 합성반응을 실시하였다. 25mM Tris-HCl (pH6.8) 반응 용액에 단백질 농도는 100 ㎍이 되도록 맞춘 후 최종 1M 농도의 TEOS를 넣고 상온에서 각 성분이 잘 섞이도록 교반하면서 10시간 이상 반응시켰다. The activity of silica synthesis of purified GFP and mGFP with imidazole was compared. As a control without the catalytic protein, silica synthesis reaction was carried out under the same conditions using 25 mM Tris-HCl (pH 6.8) buffer solution and 1M TEOS (tetraethoxysilane) alone (none) using mGFP and GFP. After adjusting the protein concentration to 100 μg in 25 mM Tris-HCl (pH 6.8), the final concentration of 1M TEOS was added, and the reaction was continued for 10 hours or more while stirring at room temperature.

반응 결과 단백질이 없는 대조구와 GFP 대조구에서는 약간 흐릿하나 여전히 투명한 액체 상태를 나타낸 반면 mGFP 조건에서는 탁하고 젤 상태를 나타내었다 (도 4). 14000×g 에서 1분간 원심분리 후 실리카 합성물을 회수 하였다. 알코올로 2번, 증류수로 2번 침전물을 수세한 후 60 ℃ 드라이오븐에서 침전물을 건조시켰다. 건조된 실리카 침전물은 정량 분석을 위해 1M NaOH 용액에 넣어 95 ℃에서 30분간 반응시켜 분해시킨 후 몰리브데이트와 실리카가 반응하여 노란색의 발색 반응물을 형성하는 원리를 이용한 발색반응을 유도하였다. 이 반응에 사용된 용액들은 1M의 염산용액, 0.1N 황산용액에 녹인 2% 암모늄몰리브데이트 (SolA), 5% 옥살산 용액 (SolB), 10% 아세톤에 녹아있는 200mM 아스코브르산 용액과 0.6%의 SDS (sodium dodecyl sulfate) 용액을 1:1로 섞은 SolC 용액이며 각 용액의 기능은 첫째, HCl은 NaOH로 가수분해된 실리카를 중화하기 위해 첨가하고 둘째로 실리카를 발색시킬 몰리브테이트 용액인 SolA를 첨가하여 5분간 반응시킨 후 인산기와 몰리브데이트와의 결합을 막기 위해 옥살산 용액인 SolB를 넣어주었다. 마지막으로 SolC를 첨가하면 아스코브르산이 실리카와 몰리브데이트의 복합체를 환원시켜 노란색에서 푸른 색으로 변화시켜 색의 세기를 더 증폭 시켜주는 역할을 한다. 분석은 1M NaOH에 용해된 실리카 용액 50 ㎕, 1M HCl 50 ㎕, SolA 50 ㎕, SolB 50 ㎕ 그리고 SolC 50 ㎕ 을 차례로 넣어 주어 96-웰 플레이트를 이용하여 microplate reader 기에서 흡광도를 측정하였다. 표준 용액으로는 100 mg/mL Sodium metasilicate nonahydrate (Na2O3Si·9H2O)을 이용하였다. 실리카 농도와 발색 세기가 비례 관계인 것을 이용하여 700 nm에서의 흡광도를 읽어 합성된 실리카의 농도를 계산하였다.As a result, the control and the GFP control without the protein showed slightly cloudy but still transparent liquid state, while the mGFP condition showed a cloudy gel state (FIG. 4). After centrifugation at 14000 x g for 1 min, the silica composite was recovered. The precipitate was washed 2 times with alcohol and 2 times with distilled water, and the precipitate was dried in a dry oven at 60 占 폚. The dried silica precipitate was decomposed by reacting with 1M NaOH solution at 95 ° C for 30 minutes for quantitative analysis, and the color reaction was induced by the reaction of molybdate and silica to form a yellow color reaction product. The solutions used in this reaction were 1% hydrochloric acid solution, 2% ammonium molybdate (SolA), 5% oxalic acid solution (SolB) dissolved in 0.1 N sulfuric acid solution, 200 mM ascorbic acid solution dissolved in 10% (SDS) solution of sodium dodecyl sulfate (SDS) solution. The function of each solution is as follows. First, HCl is added to neutralize the hydrolyzed silica with NaOH, and secondly, a solution of the molybdate solution Was added and reacted for 5 minutes. Then, SolB, which is an oxalic acid solution, was added to prevent the bonding between the phosphoric acid group and the molybdate. Finally, when SolC is added, ascorbic acid reduces the complex of silica and molybdate and changes the color from yellow to blue to further enhance the intensity of the color. For analysis, absorbance was measured in a microplate reader using 50 μl of 1M NaOH-dissolved silica, 50 μl of 1M HCl, 50 μl of SolA, 50 μl of SolB and 50 μl of SolC in a 96-well plate. As a standard solution, 100 mg / mL sodium metasilicate nonahydrate (Na 2 O 3 Si 9H 2 O) was used. The concentration of the synthesized silica was calculated by reading the absorbance at 700 nm using the relationship between the silica concentration and the intensity of the color intensity.

도 5에 나타난 바와 같이, mGFP에서는 mGFP의 실리카 합성 반응에 의한 자기 캡슐화 (autoencapsulation) 반응이 나타났다. 상청액에서는 초기 첨가했던 단백질양의 20% 미만의 단백질만 검출되었는데 이는 80% 이상의 mGFP가 실리카 합성에 참여하고 합성된 실리카에 고정화됨을 나타내었다.As shown in FIG. 5, in mGFP, autoencapsulation reaction of mGFP due to silica synthesis reaction appeared. In the supernatant, only proteins with less than 20% of the initial amount of protein added were detected, indicating that over 80% of mGFP participated in silica synthesis and immobilized on the synthesized silica.

반면, GFP는 완충용액 대조구에 비하면 약하지만 침전물이 존재하였으나 침전물은 단백질은 대부분 상청액에 존재하였고 이들은 실리카 형성반응과는 거의 무관한 것으로 사료되었다. On the other hand, GFP was weaker than the buffer solution but precipitates were present, but the precipitates were mostly present in the supernatant, and they were considered to be almost independent of the silica formation reaction.

mGFP에 의한 실리카 합성체의 형광현미경 사진을 통해 mGFP가 TEOS로부터 실리카를 합성하며 자기 캡슐화 (autoencapsulation) 됨을 확인할 수 있으며 전자현미경 사진을 통해서도 구형의 실리카 구조체를 만들고 있음을 확인할 수 있었다 (도 6).
Fluorescence microscopic photographs of the silica composite by mGFP showed that mGFP synthesized silica from TEOS and autoencapsulated. It was also confirmed by electron micrograph that a spherical silica structure was produced (FIG. 6).

<110> Korea University Research and Business Foundation <120> Modified green fluorescent protein capable of silica deposition and use thereof <130> P120784 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 238 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified green fluorescent protein <400> 1 Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val 1 5 10 15 Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly Glu 20 25 30 Gly Glu Gly Asp Ala Thr Asn Gly Lys Ile Thr Leu Lys Leu Ile Cys 35 40 45 Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Cys 50 55 60 Gly Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Arg 65 70 75 80 His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg 85 90 95 Thr Ile Ser Phe Lys Asp Asp Gly Thr Phe Lys Thr Arg Ala Glu Val 100 105 110 Lys Phe Glu Gly Asp Thr Ile Val Asn Arg Ile Lys Leu Lys Gly Ile 115 120 125 Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn 130 135 140 Phe Asn Ser His Lys Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly 145 150 155 160 Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Val Glu Asp Gly Ser Val 165 170 175 Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro 180 185 190 Val Arg Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Val Ile Leu 195 200 205 Glu Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu His Glu Phe Val 210 215 220 Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235 <210> 2 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Green fluorescent protein <400> 2 Met Gln Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu 1 5 10 15 Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly 20 25 30 Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile 35 40 45 Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr 50 55 60 Phe Gly Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys 65 70 75 80 Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu 85 90 95 Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu 100 105 110 Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly 115 120 125 Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr 130 135 140 Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn 145 150 155 160 Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser 165 170 175 Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly 180 185 190 Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu 195 200 205 Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe 210 215 220 Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235 <110> Korea University Research and Business Foundation <120> Modified green fluorescent protein capable of silica deposition          and use thereof <130> P120784 <160> 2 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 238 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified green fluorescent protein <400> 1 Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val   1 5 10 15 Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly Glu              20 25 30 Gly Glu Gly Asp Ala Thr Asn Gly Lys Ile Thr Leu Lys Leu Ile Cys          35 40 45 Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Cys      50 55 60 Gly Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Arg  65 70 75 80 His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg                  85 90 95 Thr Ile Ser Phe Lys Asp Asp Gly Thr Phe Lys Thr Arg Ala Glu Val             100 105 110 Lys Phe Glu Gly Asp Thr Ile Val Asn Arg Ile Lys Leu Lys Gly Ile         115 120 125 Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn     130 135 140 Phe Asn Ser His Lys Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly 145 150 155 160 Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Val Glu Asp Gly Ser Val                 165 170 175 Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro             180 185 190 Val Arg Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Val Ile Leu         195 200 205 Glu Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu His Glu Phe Val     210 215 220 Thr Ala Gly Ily Thr Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235 <210> 2 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Green fluorescent protein <400> 2 Met Gln Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu   1 5 10 15 Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly              20 25 30 Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile          35 40 45 Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr      50 55 60 Phe Gly Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys  65 70 75 80 Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu                  85 90 95 Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu             100 105 110 Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly         115 120 125 Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr     130 135 140 Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn 145 150 155 160 Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser                 165 170 175 Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly             180 185 190 Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu         195 200 205 Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe     210 215 220 Val Thr Ala Gly Ily Thr Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235

Claims (29)

서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 변형 녹색형광단백질을 포함하는 실리카 합성용 조성물.
1. A composition for synthesizing silica comprising a modified green fluorescent protein represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
제1항에 있어서,
실리카 전구체를 더 포함하는 실리카 합성용 조성물.
The method according to claim 1,
A silica synthesis composition further comprising a silica precursor.
제2항에 있어서,
실리카 전구체는 테트라에틸 오르토실리케이트, 테트라메틸 오르토실리케이트, 메틸 트리에톡시실란, 페닐 트리에톡시실란, 디메틸 디메톡시 실란, 에틸 트리에톡시실란, 티타니아 테트라이소프로폭사이드 및 테트라에틸 게르마늄으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 실리카 합성용 조성물.
3. The method of claim 2,
The silica precursor may be selected from the group consisting of tetraethylorthosilicate, tetramethylorthosilicate, methyltriethoxysilane, phenyltriethoxysilane, dimethyldimethoxysilane, ethyltriethoxysilane, titania tetraisopropoxide and tetraethylgermanium And at least one selected from the group consisting of silica and silica.
제1항에 있어서,
효소 또는 결합 펩타이드를 더 포함하고, 상기 결합 펩타이드는 항체, DNA 또는 RNA와 특이적으로 결합하는 펩타이드, 또는 수용체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 실리카 합성용 조성물.
The method according to claim 1,
An enzyme or a binding peptide, wherein the binding peptide is at least one selected from the group consisting of a peptide, or a receptor that specifically binds to an antibody, DNA or RNA.
제1항에 있어서,
인지질을 더 포함하는 실리카 합성용 조성물.
The method according to claim 1,
A composition for synthesizing silica further comprising a phospholipid.
제1항에 있어서,
하이드록시아파타이트를 더 포함하는 실리카 합성용 조성물.
The method according to claim 1,
A composition for synthesizing silica further comprising hydroxyapatite.
서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 변형 녹색형광단백질 및 실리카 전구체를 반응시키는 단계를 포함하는 실리카 합성방법.
Reacting a modified green fluorescent protein represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a silica precursor.
제7항에 있어서,
반응은 상온 및 상압의 조건에서 pH 6 에서 8의 수용액 하에서 실시하는 실리카 합성방법.
8. The method of claim 7,
The reaction is carried out in an aqueous solution of pH 6 to 8 at normal temperature and normal pressure.
제7항에 있어서,
반응은 효소 또는 결합 펩타이드를 더 포함하고, 상기 결합 펩타이드는 항체, DNA 또는 RNA와 특이적으로 결합하는 펩타이드, 또는 수용체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 실리카의 합성방법.
8. The method of claim 7,
Wherein the reaction further comprises an enzyme or a binding peptide, wherein the binding peptide specifically binds to an antibody, DNA or RNA, or a receptor.
제7항에 있어서,
반응은 인지질을 더 포함하는 실리카의 합성방법.
8. The method of claim 7,
Wherein the reaction further comprises a phospholipid.
제7항 또는 제10항에 있어서,
반응은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열로 표시되는 변형 녹색형광단백질, 실리카 전구체 및 인지질을 반응시켜 실리카 단일막을 제조하거나, 상기 변형 녹색형광단백질, 실리카 전구체 및 인지질을 반응시켜 유무기 복합체를 제조한 후, 열 또는 유기용매를 처리하여 유기물을 제거하여 다공성 실리카를 합성하는 것인 실리카의 합성방법.
11. The method according to claim 7 or 10,
The reaction is carried out by preparing a silica single membrane by reacting a modified green fluorescent protein, a silica precursor and a phospholipid expressed by the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, or by reacting the modified green fluorescent protein, a silica precursor and a phospholipid , Heat or an organic solvent is treated to remove organic matter to synthesize porous silica.
제7항에 있어서,
반응은 하이드록시아파타이트를 더 포함하는 실리카의 합성방법.
8. The method of claim 7,
Wherein the reaction further comprises hydroxyapatite.
서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 변형 녹색형광단백질의 자기조립 구조체의 표면이 실리카로 코팅되어 있는 실리카 복합체.
Wherein the surface of the self assembled structure of the modified green fluorescent protein represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is coated with silica.
제13항에 있어서,
항원, 항체, RNA, DNA, 합텐(hapten), 아비딘(avidin), 스트렙타비딘(streptavidin), 뉴트라비딘(neutravidin), 프로테인 A, 프로테인 G, 렉틴(lectin), 셀렉틴(selectin), 방사선 동위원소 표지성분 및 종양 마커와 특이적으로 결합할 수 있는 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 조직 특이적 결합성분이 추가로 결합되어 있는 실리카 복합체.
14. The method of claim 13,
(S) selected from the group consisting of antibodies, antigens, antibodies, RNA, DNA, hapten, avidin, streptavidin, neutravidin, protein A, protein G, lectin, selectin, Wherein at least one tissue-specific binding component selected from the group consisting of a marker component and a substance capable of specifically binding to a tumor marker is further bound.
제13항에 있어서,
siRNA, 안티센스, 항암제, 항생제, 호르몬, 호르몬길항제, 인터루킨, 인터페론, 성장 인자, 종양 괴사 인자, 엔도톡신, 림포톡시, 유로키나제, 스트렙토키나제, 조직 플라스미노겐 활성제, 프로테아제 저해제, 알킬포스포콜린, 방사선 동위원소로 표지된 성분, 심혈관계 약물, 위장관계 약물 및 신경계 약물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 약제학적 활성성분이 추가로 결합되어 있는 실리카 복합체.
14. The method of claim 13,
siRNA, antisense, anticancer, antibiotic, hormone, hormone antagonist, interleukin, interferon, growth factor, tumor necrosis factor, endotoxin, lymphotoxin, urokinase, streptokinase, tissue plasminogen activator, protease inhibitor, alkylphosphocholine, Wherein at least one pharmaceutically active ingredient selected from the group consisting of an enzyme-labeled substance, an element-labeled substance, a cardiovascular drug, a gastrointestinal drug, and a nervous system drug is further bound.
제13항에 있어서,
효소 또는 결합 펩타이드가 추가로 결합되어 있고, 상기 결합 펩타이드는 항체, DNA 또는 RNA와 특이적으로 결합하는 펩타이드, 또는 수용체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 실리카 복합체.
14. The method of claim 13,
An enzyme or a binding peptide is further bound, and the binding peptide is at least one selected from the group consisting of a peptide, a receptor that specifically binds to an antibody, DNA or RNA, or a receptor.
제13항에 있어서,
인지질이 추가로 결합되어 있는 실리카 복합체.
14. The method of claim 13,
Lt; RTI ID = 0.0 &gt; phospholipids. &Lt; / RTI &gt;
제13항에 있어서,
하이드록시아파타이트가 추가로 결합되어 있는 실리카 복합체.
14. The method of claim 13,
A silica composite further comprising hydroxyapatite.
제13항의 실리카 복합체; 및
약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약물전달체.
A silica complex of claim 13; And
A medicament carrier comprising a pharmaceutically acceptable carrier.
제13항의 실리카 복합체; 및
약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조영제 조성물.
A silica complex of claim 13; And
A contrast agent composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier.
제13항의 실리카 복합체; 및
약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 표적 지향형 조영제 조성물.
A silica complex of claim 13; And
A composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier.
제13항의 실리카 복합체; 및
약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 동시 진단 또는 치료용 조영제 조성물.
A silica complex of claim 13; And
A contrast agent composition for simultaneous diagnosis or treatment comprising a pharmaceutically acceptable carrier.
제13항의 실리카 복합체; 및
진단 프로브를 포함하는 다중 진단 프로브.
A silica complex of claim 13; And
Multiple diagnostic probes containing diagnostic probes.
제13항의 실리카 복합체가 전기방사된 섬유.
13. The fiber of claim 13 wherein the silica composite is electrospun.
제13항의 실리카 복합체가 전기방사된 섬유를 포함하는 필터.
14. The filter of claim 13, wherein the silica composite comprises electrospun fibers.
제13항의 실리카 복합체를 포함하는 골대체제.
13. The framework according to claim 13, wherein the framework comprises the silica complex.
제13항의 실리카 복합체를 포함하는 포토닉스 소자.
A photonics device comprising the silica complex of claim 13.
제13항의 실리카 복합체를 포함하는 바이오분자 검출용 바이오센서.
A biosensor for detecting a biomolecule comprising the silica complex of claim 13.
제28항에 있어서,
바이오분자는 핵산, 단백질, 다당류 또는 병원균인 바이오분자 검출용 바이오센서.
29. The method of claim 28,
Biomolecules are biosensors for detecting biomolecules that are nucleic acids, proteins, polysaccharides or pathogens.
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