KR101986602B1

KR101986602B1 - 하이드록시아파타이트에 특이적으로 결합하는 펩티드 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101986602B1
Application number: KR1020170124122A
Authority: KR
Inventors: 김성현; 방진호
Original assignee: 한국세라믹기술원
Priority date: 2017-09-26
Filing date: 2017-09-26
Publication date: 2019-06-07
Also published as: KR20190035185A

Abstract

본 발명은 하이드록시아파타이트에 특이적으로 결합하는 펩티드 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 하이드록시아파타이트에 특이적으로 결합하는 펩티드, 상기 펩티드가 하이드록시아파타이트 표면에 고정된 골이식재 또는 골재생용 생체 재료, 및 상기 펩티드를 유효성분으로 포함하는 뼈 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물, 또는 치주 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

Description

하이드록시아파타이트에 특이적으로 결합하는 펩티드 및 이의 용도{PEPTIDES SPECIFIC TO HYDROXYAPATITE AND USE THEREOF}

뼈나 치아는 인체 내 경조직이라고 불리며 뼈는 약 45%의 골무기물질과 35%의 유기물질 그리고 20%의 수분으로구성되어 있고 치아에서의 골무기물 함유율은 에나멜질 약 97%, 상아질 70%, 시멘트질 50% 정도의 함유율을 보이며, 이와 같이 무기물질의 조성은 동물의 종류, 부위, 연령 등에 따라 다소 차이가 있다. 구성 물질 중 유기물질은 대부분 콜라겐(collagen)으로 뼈의 생성과 인성 및 탄성을 유지하는데 관여할 뿐 아니라 골세포를 선택적으로 부착을 유도하여 골무기물입자를 배향시키는 matrix로서 존재한다. 자연 상태의 뼈, 즉 척추동물의 골무기물의 주성분은 인회석(Apatite) 광물이며 하이드록시아파타이트 (Hydroxyapatite, (Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂), 수산화인회석 (Hydroxylapatite), 수산화탄산아파타이트(carbonated hydroxy apatite, CHAp, A-type: Ca₁₀(PO₄)₆[(OH)_2-2x(CO₃)x], B-type: Ca₁₀ _-x[(PO₄)_6-2x(CO₃)_2x](OH)2)로 알려져 있으며 Ca² ⁺ 대신에 Mg² ⁺과 Na⁺가 미량 함유되며 OH^- 대신에 Cl^-, F^-가 미량 함유되는 것으로 알려져 있다. 따라서 골결손부를 치유하기 위한 치과재료 및 골이식재에는 아파타이트 무기질로 제조되거나 표면을 코팅하는 연구가 계속되었다.

골이식의 목적은 골의 생역학적 역할을 유지하게 하는 골의 형태학적, 생리학적 기능을 복원시키는데 있으므로, 이 때 사용되는 아파타이트 골이식 재료는 즉시 사용이 가능하고, 면역반응을 일으키지 않으며, 빠른 골생성 및 재혈관화를 촉진하고 골의 지지와 연속성을 유지하는 등의 기본적인 조건을 만족시킬 수 있어야 한다. 그러나 아파타이트는 자체가 골전도성을 가지는 매개체로서의 역할은 할 수 있어도 치료기간의 단축을 위해 필수적인 초기 골형성을 위한 골유도력은 지니고 있지 않다. 이러한 단점을 보완하기 위해 아파타이트에 세포외 기질 단백질, 조직성장인자나 골형성 단백질과 같은 화학 주성을 지니는 생리활성 물질을 아파타이트와 함께 사용된 연구들이 진행되었고, INFUSE (BMP-2 함유), GEM21S (PDGF 함유) 등의 제품이 개발되었다. 그러나 이들 단백질이 아파타이트 표면에서 안정하게 고정되어 있지 않고, 아파타이트로부터 방출되며, 이어서 전신혈에 노출되어 분해되게 되므로, 골재생 효과를 위한 아파타이트 표면에서의 활성을 유지하기 어렵다. 따라서 아파타이트 표면에서 안정하게 고정되어, 장기간 동안 유효한 활성을 유지하는 것이 골재생 효과를 증가시키기 위해 필요하다.

이에, 본 발명자들은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하고자 예의 노력한 결과, 하이드록시아파타이트 표면에 결합하여 안정한 상태로 존재할 수 있는 신규한 아미노산 서열을 개발하고, 하이드록시아파타이트에 대한 높은 결합능을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 하이드록시아파타이트에 특이적으로 결합하는 펩티드를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 또한 하이드록시아파타이트에 특이적으로 결합하는 펩티드가 하이드록시아파타이트 표면에 고정된 골이식재를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 또한 하이드록시아파타이트에 특이적으로 결합하는 펩티드가 하이드록시아파타이트 표면에 고정된 골재생용 생체 재료를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 또한 하이드록시아파타이트에 특이적으로 결합하는 펩티드를 유효성분으로 포함하는 뼈 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 또한 하이드록시아파타이트에 특이적으로 결합하는 펩티드를 유효성분으로 포함하는 치주 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

제1구현예에 따르면,

본 발명은 하이드록시아파타이트에 특이적으로 결합하는 펩티드를 제공하고자 한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "특이적으로 결합(specifically binding)"은 상기 펩티드가 하이드록시아파타이트 이외의 다른 물질에는 실질적으로 결합하지 않거나 친화도에서 큰 차이를 보여 하이드록시아파타이트와 다른 물질의 구별을 가능하게 하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어 “아미노산은”은 20개의 천연에서 발견되는 아미노산 및 비천연 아미노산, 생체 내에서 번역 후에 변형되는 아미노산 예를 들면 포스포세린 및 포스포쓰레오닌; 및 2-아미노아디프산, 하이드록시라이신, 노르-발린, 노르-루이신과 같은 기타 희귀 아미노산; 세포 투과 또는 생체내 안정성 향상을 위해 변형된 것을 포함하며, 거울상 이성질체인 D- 및 L-형태를 모두 포함하는 것이다. 본원에서 양하전 아미노산, 음하전된 아미노산, 극성의 비하전된 아미노산 및 비극성의 지방족 아미노산은 당업계에 공지되어 있으며, 당업자라면 적절한 것을 선택할 수 있을 것이다.

본 명세서에서 사용된 용어 “펩티드” 또는 “폴리펩티드”는 서로 교환적으로 사용되며, 아미노산의 단위체가 공유결합으로 연결된 분자를 일컫는 것이다. 이는 원(native) 아미노산 또는 그 분해 산물, 합성 펩티드, 재조합 방식으로 제조된 펩티드, 펩티드 모방체 (전형적으로 합성 펩티드), 및 펩토이드 및 세미펩토이드와 같은 펩티드 유사체와 세포 투과 또는 생체내 안정성 향상을 위해 변형된 것을 포함한다. 이러한 변형은 이로 제한하는 것은 아니나, N-말단 변형, C-말단 변형, CH2-NH, CH2-S, CH2-S=O, CH2-CH2와 같은 펩티드 결합 변형, 백본 변형, 측쇄 변형을 포함한다. 펩티드 모방체 화합물을 제조하는 방법은 기술분야에 공지된 것으로, 예를 들면 Quantitative Drug Design, C.A. Ramsden Gd., Choplin Pergamon Press (1992)에 기재된 내용을 참조할 수 있다.

본 발명에 따른 펩티드에 있어서, 상기 펩티드는 KRQQGQRG(서열번호 1), KRRTPVRE(서열번호 2), KNFQSRSH(서열번호 3), KTNRAQSQ(서열번호 4), KVKKRKLQ(서열번호 5), KQYAPCEV(서열번호 6), KTYASMQW(서열번호 7), KSQGMDLQ(서열번호 8), KSAKRQRV(서열번호 9) 및 KTFQCQVS(서열번호 10)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 한다. 바람직하기는, 상기 펩티드는 KRRTPVRE(서열번호 2), KNFQSRSH(서열번호 3) 또는 KTYASMQW(서열번호 7)로부터 선택되는 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 펩티드에 있어서, 상기 펩티드는 하이드로시아파타이트의 부피를 기준으로(ml) 0.1ug 내지 10ug의 양으로 함유되는 것을 특징으로 한다.

제2구현예에 따르면,

본 발명은 하이드록시아파타이트에 특이적으로 결합하는 펩티드가 하이드록시아파타이트 표면에 고정된 골이식재를 제공하고자 한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "골이식재(bone graft substitute)"는 골조직 내의 공간을 충진하기 위한 물질이며, 골이식재는 압착, 압축, 가압접촉, 패킹, 압박, 굳힘 등의 방법을 사용하여, 퍼티, 페이스트, 주형가능한 스트립, 블록, 칩 등의 형태로 성형하여 사용할 수 있고, 화학적 첨가물을 이용하여 겔, 과립, 페이스트, 정제, 펠렛 등의 형태로 제형화하여 사용할 수 있으며, 분말 형태 그대로 사용하는 것도 가능하다.

본 발명에 따른 골이식재에 있어서, 상기 펩티드는 KRQQGQRG(서열번호 1), KRRTPVRE(서열번호 2), KNFQSRSH(서열번호 3), KTNRAQSQ(서열번호 4), KVKKRKLQ(서열번호 5), KQYAPCEV(서열번호 6), KTYASMQW(서열번호 7), KSQGMDLQ(서열번호 8), KSAKRQRV(서열번호 9) 및 KTFQCQVS(서열번호 10)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 한다. 바람직하기는, 상기 펩티드는 KRRTPVRE(서열번호 2), KNFQSRSH(서열번호 3) 또는 KTYASMQW(서열번호 7)로부터 선택되는 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 골이식재에 있어서, 상기 펩티드는 하이드로시아파타이트의 부피를 기준으로(ml) 0.1ug 내지 10ug의 양으로 함유되는 것을 특징으로 한다.

제3구현예에 따르면,

본 발명은 하이드록시아파타이트에 특이적으로 결합하는 펩티드가 하이드록시아파타이트 표면에 고정된 골재생용 생체 재료를 제공하고자 한다.

본 발명에 따른 골재생용 생체 재료에 있어서, 상기 펩티드는 KRQQGQRG(서열번호 1), KRRTPVRE(서열번호 2), KNFQSRSH(서열번호 3), KTNRAQSQ(서열번호 4), KVKKRKLQ(서열번호 5), KQYAPCEV(서열번호 6), KTYASMQW(서열번호 7), KSQGMDLQ(서열번호 8), KSAKRQRV(서열번호 9) 및 KTFQCQVS(서열번호 10)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 한다. 바람직하기는, 상기 펩티드는 KRRTPVRE(서열번호 2), KNFQSRSH(서열번호 3) 또는 KTYASMQW(서열번호 7)로부터 선택되는 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 골재생용 생체 재료에 있어서, 상기 펩티드는 하이드로시아파타이트의 부피를 기준으로(ml) 0.1ug 내지 10ug의 양으로 함유되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 골재생용 생체 재료에 있어서, 상기 골재생용 생체 재료는 금속, 천연고분자 및 합성고분자로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.

제4구현예에 따르면,

본 발명은 하이드록시아파타이트에 특이적으로 결합하는 펩티드를 유효성분으로 포함하는 뼈 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물, 및 치주 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물에 있어서, 상기 펩티드는 KRQQGQRG(서열번호 1), KRRTPVRE(서열번호 2), KNFQSRSH(서열번호 3), KTNRAQSQ(서열번호 4), KVKKRKLQ(서열번호 5), KQYAPCEV(서열번호 6), KTYASMQW(서열번호 7), KSQGMDLQ(서열번호 8), KSAKRQRV(서열번호 9) 및 KTFQCQVS(서열번호 10)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 한다. 바람직하기는, 상기 펩티드는 KRRTPVRE(서열번호 2), KNFQSRSH(서열번호 3) 또는 KTYASMQW(서열번호 7)로부터 선택되는 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물에 있어서, 상기 뼈 질환은 뼈의 손상, 골다공증, 골연화증, 구루병, 섬유성 골염, 무형성 골질환, 대사성 골질환, 골용해, 백혈구 감소증, 뼈의 기형, 고칼슘혈증 또는 신경압박 증후군인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물에 있어서, 상기 치주질환은 치은염(gingivitis), 치주염(periodontitis), 치주낭(periodontal pocket) 또는 치주농양(periodontal abscess)인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물에 있어서, 상기 펩티드는 하이드로시아파타이트의 부피를 기준으로(ml) 0.1ug 내지 10ug의 양으로 함유되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 상기 펩티드 이외에 추가로 약학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 주사액제, 환약, 캡슐, 과립, 산제 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당해 분야의 적정한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science(최근판) 또는 Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 해당 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 명세서에서 사용된 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양, 즉 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양인 치료상 유효량으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 대한 치료상 유효 투여량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 약학적 조성물은 0.05~0.1㎎/㎏/day, 바람직하게는 0.01~0.1㎎/㎏/day 내지 의 양으로 투여할 수 있으며, 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수 회에 나누어 투여할 수도 있다.

도 １은 본 발명의 실시예 3에서 output 파아지/input 파아지 비율을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 실시예 4에서 Hydroxyapatite에 결합하는 10개 sequence의 colony 수의 3회 평균값을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 실험예 5에서 Hydroxyapatite와 결합하는 펩티드의 결합능을 나타낸다.
도 4는 본 발명의 실험예 6에서 펩티드의 농도에 따른 Hydroxyapatite와 펩티드의 결합능을 나타낸다.

이하에서는 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명이 이하의 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 >

실시예 1. 8mer 랜덤 펩티드 파지라이브러리 제조

1-1. 8mer 랜덤 펩티드 제작 및 벡터에의 삽입

8mer 랜덤 펩티드 라이브러리(XXXXXXXX, X=random amino acids)을 제조하기위하여, DNA 라이브러리 (TTCTATGCGGCCCAGCTGGCC NNKNNKNNKNNKNKKNNKGCGGCCGCAGAAACTGTT)를 합성하였다(Bioneer, Daejeon, Korea). 두 개의 single strand 프라이머(TTCTATGCGGCCCAG, AACAGTTTCTGCGGC)로 PCR을 이용하여 Double strand insert를 증폭하였다. 이를 파아지미드 벡터(Phagemid Vector)(pIGT)에 삽입하기 위해서, 파아지미드 벡터와 PCR을 이용하여 증폭한 인서트 DNA를 제한효소로 처리하였다. 약 10 ㎍의 인서트 DNA를 SfiI(New England Biolabs(NEB), Ipswich) 및 NotI(NEB, Ipswich)으로 8시간 반응시킨 후 PCR 정제 키트를 이용하여 정제 DNA를 얻었다. 또한, 약 10 μg의 파아지미드 벡터를 SfiI 및 NotI으로 8시간 처리하고, CIAP(Calf Intestinal Alkaline Phosphatase)(NEB, Ipswich)를 넣고 1 시간 동안 반응시킨 후, PCR 정제 키트를 이용하여 정제하였다. T4 DNA 리가아제(Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 인서트 DNA(3 ㎍)를 파아지미드 벡터(10 ㎍)와 18 ℃에서 15 시간 동안 연결한 후, 에탄올로 침전시켜 TE 버퍼 100 ㎕로 DNA를 용해시켜다.

1.2 전기천공

상기 실시예 1.1에서 제조된 각 8mer 랜덤 인서트 DNA를 포함하고 있는 파아지미드 벡터 100 ㎕를 4 ㎕씩 25개로 분주하여 전기천공을 수행하였다. 컴피턴트 세포(competent cell)를 얼음 위에서 녹이고, 200 ㎕의 컴피턴트 세포를 인서트 DNA를 포함하고 있는 각각의 파아지미드 벡터 용액 4 ㎕와 혼합한 후, 냉각하여 준비된 0.2 cm의 큐벳에 넣은 뒤, 1분 동안 얼음 위에 두었다. 전기천공기(BioRAD, Hercules, CA)를 200 Ω에서 25 ㎌ 및 2.5 kV의 조건으로 프로그램하고 준비된 큐벳의 물기를 제거하고 전기천공기에 위치시킨 후, 펄스를 가하였다(시간상수는 4.5 내지 5 msec). 이후, 즉시 37 ℃로 준비한 20 mM의 글루코오스가 포함된 1 ㎖의 LB(Luria Bertani) 액체배지에 넣은 후, 얻어진 총 25 ㎖의 세포를 100 ㎖의 시험관에 옮겼다. 한 시간 동안 37 ℃에서 200 rpm의 속도로 혼합하며 배양한 후 라이브러리의 개수를 측정하기 위해, 10 ㎕를 분주한 후 희석하여 암피실린 아가 배지에 도말하였다. 분주한 후 잔류하는 세포를 1 L의 LB에 20 mM 글루코오스 및 50 ㎍/㎖의 암피실린을 넣고, 30 ℃에서 하루 동안 배양하였다. 4 ℃에서 4,000 xg로 20분 동안 원심분리하여 침전된 세포들을 제외한 상층액을 모두 제거하고, 40 ㎖의 LB로 재현탁시킨 후 글리세롤을 최종 농도 20 % 이상 넣고 80 ℃에 보관하였다.

실시예 2: 8mer 램덤 펩티드 라이브러리에서 재조합 파아지 생산

-80℃에 저장된 8mer 램덤 펩티드 라이브러리에서 재조합 파아지를 생산하였다. 30㎖ SB 액체배지에 -80℃에 보관된 라이브러리 1㎖을 추가하여 20분 동안 37℃에서 200rpm의 속도로 혼합하여 배양하였다. 여기에 Helper phage(5 x 10

pfu)과 암피실린(최종 농도 50μg/㎖)을 넣고 다시 한 시간 동안 같은 조건으로 배양하였다. 그 다음, 암피실린(50μg/㎖) 및 카나마이신(10μg/㎖)이 포함된 SB 액체배지 30㎖에 옮겨 같은 조건으로 16시간 이상 배양하여 재조합 파아지를 생산하였다. 배양액을 4℃에서 5,000rpm의 속도로 10분 동안 원심 분리하여 얻은 상층액에 PEG/NaCl을 5:1 비율로 혼합하여 얼음에 1시간 동안 방치시킨 후, 4℃에서 20분 동안 13,000rpm의 속도로 원심 분리하여 상층액은 조심스럽게 제거하고 1㎖의 PBS로 펠렛을 재현탁시켰다.

실시예 3: 8mer 램덤 펩티드로 Hydroxyapatite의 바이오패닝

E-tube에 Hydroxyapatite 40mg을 넣고 2% BSA 1㎖를 넣어 상온에서 2시간 동안 Rotator-mixer로 블록킹한 후, 용액을 모두 버리고 PBST 0.05% 800㎕로 1회 세척하였다. 여기에 상기 실시예 1에서 제조된 8mer 램덤 펩티드 재조합 파아지 포함용액 400㎕ 및 2% BSA 400㎕을 혼합하여 E-tube에 800㎕를 넣고 상온에서 1시간 동안 Rotator-mixer에 방치하였다. E-tube의 용액을 모두 제거하고 0.05% PBST(tween-20)로 5회 세척한 뒤 0.2M 글리신(pH 2.2)을 E-tube에 800㎕씩 넣어 10분간 Rotator-mixer로 파아지를 용리시키고 800㎕를 E-tube에 모아 여기에 1M Tris(pH 9.0) 200㎕를 넣어 중화시켰다.

각 바이오패닝마다 input 파아지 및 output 파아지의 수를 측정하기 위해 OD=0.7인 E. coli 세포에 섞어 주어 암피실린이 포함된 아가 배지에 도말하였다. 패닝을 반복하기 위해 output 파아지 500㎕를 3㎖의 E. coli 세포와 섞어 37℃에서 200rpm의 속도로 30분 동안 혼합하며 배양한 후, 암피실린(50μg/㎖) 및 헬퍼 파아지(5 x 10

pfu) 첨가하여 같은 방법으로 30분 동안 배양하였다. 그 다음 암피실린(50μg/㎖)과 카나마이신(10μg/㎖)이 포함된 50㎖ SB 배지에 옮겨 같은 방법으로 하루 동안 배양하였다. 배양액을 4℃에서 5,000rpm의 속도로 10분동안 원심 분리하여 상층액에 PEG/NaCl [20% PEG(w/v) 및 15% NaCl(w/v)]을 5:1 비율로 첨가한 후 얼음에 1시간 동안 정치시켰다. 4℃에서 13,000rpm의 속도로 20분 동안 원심분리 후 상층액을 완전히 제거하고 1㎖의 PBS 용액으로 파아지 펠렛을 현탁한 다음 2차 바이오패닝에 사용하였다.

각 패닝 단계마다 상기와 동일한 방법을 사용했으며, 처음 세척 과정만 5회, 그 후 단계는 10회로 동일하게 하였다 (표 1). 하기의 표 1 및 도 1로부터 알 수 있듯이, 패닝단계에 따라 output 파아지 / input 파아지 의 비율이 증가하였다.

[표 1]

실시예 4: Hydroxyapatite에 특이적인 파아지 검색

상기 표 1에서 output/input 파아지 비율이 가장 높은 바이오패닝 단계에서 회수한 조건 4의 파아지를 E. coli 세포에 감염시킨 후 플라크가 플레이트당 100-200개 정도가 되도록 도말하였다. 무작위로 20개의 플라크를 선택하여 플라스미드를 정제 후 시퀀싱을 의뢰하였다(Bioneer, Daejeon, Korea). 시퀀싱 프라이머는 GATTACGCCAAGCTTTGGAGC 를 사용하였다. 20개의 sequence를 Multiple Alignment하여 진화적으로 유사한 10개의 클론을 선택하였다. 멸균된 팁을 이용하여 선택 한 10개의 클론을 1㎖의 SB-암피실린(50 μg/㎖) 배양액에 접종한 후 37℃에서 5시간 동안 진탕 배양하여 헬퍼 파아지를 30㎕씩 첨가하여 37℃에서 200rpm의 속도로 하루 동안 배양하였다. 배양액을 12,000rpm의 속도로 2분 동안 원심 분리하여 상층액을 회수한 후 400㎕ 및 2% BSA 400㎕을 혼합하여 Hydroxyapatite 40mg이 든 E-tube에 넣고 rotator로 1시간 동안 방치하였다. E-tube의 용액을 모두 제거하고 0.05% PBST(tween-20)로 3회 세척한 뒤 0.2M 글리신(pH 2.2)을 E-tube에 800㎕씩 넣어 10분간 Rotator-mixer로 파아지를 용리시키고 800㎕를 E-tube에 모아 여기에 1M Tris(pH 9.0) 200㎕를 넣어 중화시켰다. 상기 과정을 3회 반복하여 input 파아지 및 output 파아지의 수를 측정하기 위해 OD=0.7인 E. coli 세포에 섞어 주어 암피실린이 포함된 아가 배지에 도말하였다.

[표 2]

<실험예>

실험예 5. HAp 펩티드 결합능 확인

FITC 형광표지를 붙인 펩티드 FITC-Hydroxyapatite@peptide2, FITC-Hydroxyapatite@peptide3, FITC-Hydroxyapatite@peptide7을 주문 제작하였다(표 3). 각 sample을 1ug/ml로 희석하여 Hydroxyapatite 20mg에 500㎕를 첨가하여 Rotator-mixer에 1시간 incubation하였다. 상층액을 버리고 PBS로 3회 희석 후 ELISA plate에 Hydroxyapatite를 넣고 DW 200㎕를 첨가하였다. 488nm에서 흡광도 수치를 측정하였다.

[표 3]

실험예　6. 농도에 따른 HAp 펩티드 결합능 확인

FITC-Hydroxyapatite@peptide2, FITC-Hydroxyapatite@peptide3, FITC-Hydroxyapatite@peptide7을 각각 0.1ug/ml, 0.25ug/ml, 0.5ug/ml, 1ug/ml, 2ug/ml로 희석하여 농도별로 2개씩 Hydroxyapatite 20mg에 500㎕를 첨가하여 Rotator-mixer에 1시간 incubation하였다. 상층액을 버리고 PBS로 3회 희석 후 ELISA plate에 Hydroxyapatite를 넣고 DW 200㎕를 첨가하였다. 488nm에서 흡광도 수치를 측정하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Korea Institute of Ceramic Engineering and Technology <120> PEPTIDES SPECIFIC TO HYDROXYAPATITE AND USE THEREOF <130> DP-2017-0169 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPTIDE <400> 1 Lys Arg Gln Gln Gly Gln Arg Gly 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPTIDE <400> 2 Lys Arg Arg Thr Pro Val Arg Glu 1 5 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPTIDE <400> 3 Lys Asn Phe Gln Ser Arg Ser His 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPTIDE <400> 4 Lys Thr Asn Arg Ala Gln Ser Gln 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPTIDE <400> 5 Lys Val Lys Lys Arg Lys Leu Gln 1 5 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPTIDE <400> 6 Lys Gln Tyr Ala Pro Cys Glu Val 1 5 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPTIDE <400> 7 Lys Thr Tyr Ala Ser Met Gln Trp 1 5 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPTIDE <400> 8 Lys Ser Gln Gly Met Asp Leu Gln 1 5 <210> 9 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPTIDE <400> 9 Lys Ser Ala Lys Arg Gln Arg Val 1 5 <210> 10 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPTIDE <400> 10 Lys Thr Phe Gln Cys Gln Val Ser 1 5

Claims

하이드록시아파타이트에 특이적으로 결합하는 펩티드로서,
상기 펩티드는 KRRTPVRE(서열번호 2), KNFQSRSH(서열번호 3) 또는 KTYASMQW(서열번호 7)로부터 선택되는 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 하는 것인, 펩티드.
삭제
제1항에 있어서,
상기 펩티드는 하이드로시아파타이트의 부피를 기준으로(ml) 0.1ug 내지 10ug의 양으로 함유되는 것을 특징으로 하는 것인, 펩티드.
제1항 또는 제3항에 따른 펩티드가 하이드록시아파타이트 표면에 고정된 골이식재.
제1항 또는 제3항에 따른 펩티드가 하이드록시아파타이트 표면에 고정된 골재생용 생체 재료.
제5항에 있어서,
상기 골재생용 생체 재료는 금속, 천연고분자 및 합성고분자로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 것인, 골재생용 생체 재료.
제1항 또는 제3항에 따른 펩티드를 유효성분으로 포함하는 뼈 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제7항에 있어서,
상기 뼈 질환은 뼈의 손상, 골다공증, 골연화증, 구루병, 섬유성 골염, 무형성 골질환, 대사성 골질환, 골용해, 백혈구 감소증, 뼈의 기형, 고칼슘혈증 또는 신경압박 증후군인 것을 특징으로 하는 것인, 뼈 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제1항 또는 제3항에 따른 펩티드를 유효성분으로 포함하는 치주 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제9항에 있어서,
상기 치주질환은 치은염(gingivitis), 치주염(periodontitis), 치주낭(periodontal pocket) 또는 치주농양(periodontal abscess)인 것을 특징으로 하는 것인, 치주 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.