KR101983741B1 - Bio-ink and manufacturing method thereof - Google Patents

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Abstract

본 발명은 천연 단백질 섬유 중 하나인 실크 피브로인을 사용하여 제조된 바이오 잉크로서, 3D 프린터를 사용하여 향상된 세포적합성 및 우수한 기계적 물성을 가진 생체 조직을 제조할 수 있는 바이오 잉크 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 3D 프린팅을 통해 수분 흡수력, 부피 팽창률, 압축강도, 인장강도 등 기계적 물성을 가진 생체 조직을 제조할 수 있다. 또한, 실크 피브로인을 기본 골격으로 하여 바이오 잉크를 제조함으로써, 체내에서 면역반응이 거의 일어나지 않아 생체적합성이 뛰어난 바이오 구조체를 제조할 수 있다.The present invention relates to a bio ink manufactured using silk fibroin, which is one of natural protein fibers, and to a bio ink capable of producing a biological tissue having improved cellular compatibility and excellent mechanical properties using a 3D printer, and a method of manufacturing the same. Through 3D printing, biological tissues with mechanical properties such as moisture absorption, volume expansion rate, compressive strength, and tensile strength can be manufactured. In addition, by producing a bio ink based on silk fibroin as a basic skeleton, a biostructure having excellent biocompatibility can be produced because an immune reaction hardly occurs in the body.

Description

바이오 잉크 및 이의 제조방법{Bio-ink and manufacturing method thereof}Bio ink and manufacturing method thereof

본 발명은 천연 단백질 섬유 중 하나인 실크 피브로인을 사용하여 제조된 바이오 잉크로서, 3D 프린터를 사용하여 향상된 세포적합성 및 우수한 기계적 물성을 가진 생체 조직을 제조할 수 있는 바이오 잉크 및 이의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a bio ink manufactured by using silk fibroin, which is one of natural protein fibers, and a bio ink capable of producing a biological tissue having improved cellular compatibility and excellent mechanical properties using a 3D printer, and a method of manufacturing the same. .

삼차원 프린팅(3D Printing) 기술은, 3차원 도면을 바탕으로 실물의 입체 모양 즉, 3차원 형상을 구현하는 기술로서, 프린팅에 사용되는 잉크 소재, 경화방식, 3D 프린터의 구동원리에 따라 여러 가지로 분류되고 있으며, 그 중에서도 세계적으로 널리 통용되는 미국 ASTM (American Society for Testing and Materials) F2792-12a의 분류에 따라 구별될 수 있다.3D printing technology is a technology that realizes a three-dimensional shape, that is, a three-dimensional shape, based on a three-dimensional drawing, and can be used in various ways depending on the ink material used for printing, a curing method, and the driving principle of a 3D printer. Are classified according to the classification of the American Society for Testing and Materials (ASTM) F2792-12a, which is widely used throughout the world.

먼저, 빛에 반응하여 경화되는 광경화성 폴리머를 기반 소재로 이용하여 한층 한층 빛을 조사하며 경화시켜 3차원 형상을 만드는 광중합 방식인 SLA(stereo lithography) 방식와 DLP (digital light processing)방식, 고온 가열한 소재를 노즐을 통해 압력으로 연속적으로 밀어내어 3차원 형상을 제작하는 재료압출방식인 FDM (fused deposition modeling) 방식, 가루형태의 모재 위에 액체 형태의 접착제를 토출시켜 모재를 결합, 3차원 형상을 제작하는 접착제 분사방식, 용액형태의 소재를 제팅 (jetting)으로 토출시키고 자외선 등으로 경화시키는 재료분사방식, 레이저나 전자빔 등의 고에너지원으로 원료 소재를 녹여 3차원 형상을 제작하는 고에너지 직접조사방식, 분말형태의 모재 위에 고에너지빔을 주사하여 조사해 선택적으로 결합, 3차원 형상을 제작하는 분말적층용융방식, 얇은 필름형태의 재료를 열이나 접착제 등으로 붙여가며 3차원 형상으로 적층하는 시트 라미네이션 방식이 있다.First, SLA (stereo lithography), DLP (digital light processing), high-temperature heating, which is a photopolymerization method that uses a photocurable polymer cured in response to light as a base material, further irradiates and cures light to form a three-dimensional shape. FDM (fused deposition modeling), a material extrusion method that pushes the material continuously through pressure through a nozzle to produce a three-dimensional shape. Adhesive injection method, material injection method for discharging solution-type material by jetting and curing with ultraviolet light, and high energy direct irradiation method for melting 3D shape by melting raw material with high energy source such as laser or electron beam. Powder lamination melt melting by irradiating and irradiating high energy beam on powder base material , A sheet lamination method of gamyeo paste a thin film material in the form of heat, adhesive or the like stacked in the three-dimensional shape.

특히, 3D 프린팅 기술이 점차 발전함에 따라 좀 더 정밀하고 세밀한 3D 형상을 제조할 수 있게 되면서, 이를 의료·바이오 분야에 접목시켜 의료기기 부품이나 실제 인간의 조직을 거의 그대로 모방한 미세 및 거대 조직 구조체인 인체모형, 피부조직 및 신체 장기 재생을 제조하는데 활용되고 있다.In particular, as 3D printing technology gradually develops, it is possible to manufacture more precise and detailed 3D shapes, and it is applied to the medical and bio fields, and fine and large tissue structures that almost mimic medical device parts or actual human tissues. It is used to manufacture human body model, skin tissue and body organ regeneration.

초반에는 고체 필라멘트를 녹여서 한층 한층 적층시키면서 3D 프린팅하는 방식인 FDM 기술에 열가소성 생체적합 고분자를 적용하여 조직공학용 인공지지체를 제조하였으나, 최근에는 조직공학용 지지체 이외에도 수술시뮬레이션 및 수술 임플란트 제작, 개인별 맞춤형 보형물 제작, 인공 혈관, 인공 장기 등 의학·바이오 분야에서 다양하게 적용될 수 있도록 연구개발이 진행되고 있다.In the early stages, artificial supports for tissue engineering were manufactured by applying thermoplastic biocompatible polymers to FDM technology, which melted solid filaments and laminated them further, to 3D printing.In recent years, however, in addition to tissue engineering supports, surgical simulations, surgical implants, and personalized implants are manufactured. Research and development is underway so that it can be applied to various fields in medicine and biotechnology such as artificial blood vessels and artificial organs.

특히, 조직공학용 지지체는 구성재료의 선택과 구조제어 기술이 매우 중요하다. 즉, 지지체는 자가복구기능을 통해 손실된 조직을 재생시키기 위하여 조직과 조직을 이어주는 다리와 같은 역할을 하며, 이를 위하여 조직재생이 원활이 이루어지도록 세포친화성이 뛰어나야 한다. 또한, 세포가 3차원적으로 성장할 수 있도록 영양분 및 배설물 등의 교환이 잘 이루어질 수 있도록 일정한 크기 영역에서 3차원적으로 연결되어 있는 기공구조를 가져야 하며, 조직의 재생속도에 맞추어 분해되어 없어지는 생분해성과 조직이 재생되는 동안 형태를 유지시켜줄 수 있는 기계적 강도를 가져야하며, 생체안정성 또한 뛰어나야 한다. 특히, 뼈와 치아와 같은 경조직 재생에 있어서는 재생부위에 따른 기계적 물성확보가 중요하다.In particular, the support for tissue engineering is very important for the selection of constituent materials and structural control technology. In other words, the supporter plays a role as a bridge connecting the tissues to regenerate the tissue lost through the self-recovery function, and for this purpose, the support should be excellent in cell affinity to facilitate tissue regeneration. In addition, the cells must have a three-dimensional pore structure connected in a certain size area to facilitate the exchange of nutrients and excretion so that cells can grow in three dimensions, and biodegradation that is broken down according to the tissue regeneration rate Sexual tissue should have mechanical strength to maintain shape during regeneration, and biostability should be excellent. In particular, in regenerating hard tissues such as bones and teeth, it is important to secure mechanical properties according to regeneration sites.

구체적으로 조직공학용 지지체는 첫째, 임플란트 부위에서 물리적으로 안정해야 하고, 둘째, 재생 효능을 조절할 수 있는 생리 활성을 나타내어야 하며, 셋째, 새로운 조직을 형성한 후에는 생체 내에서 분해되어야 하고 넷째, 분해산물이 독성을 갖지 않아야 한다.Specifically, the scaffold for tissue engineering must first be physically stable at the implant site, secondly, exhibit physiological activity that can control regenerative efficacy, and thirdly, form new tissue and then degrade in vivo. Seafood should not be toxic.

따라서, 이러한 조직공학용 지지체 뿐만 아니라 나아가서는 수술시뮬레이션 및 수술 임플란트 제작, 개인별 맞춤형 보형물 제작, 인공 혈관, 인공 장기 등의 바이오 구조체를 제조할 수 있는 재료인 바이오 잉크는 앞서 언급한 조건을 만족하기에는 아직까지 많은 한계점을 나타내고 있다. Therefore, bioinks, which are not only the support for tissue engineering but also the preparation of bio-structures such as surgical simulation and surgical implant production, personalized implant production, artificial blood vessels, artificial organs, etc., have not yet satisfied the aforementioned conditions. There are many limitations.

3D 바이오 프린팅에 사용되기 위해 요구되는 바이오 잉크의 특성으로는 먼저, 우수한 생체적합성이 요구되고, 노즐을 통하여 프린팅되는 3D 프린터를 사용시 미세구경의 디스펜싱 노즐(dispensing nozzle)을 원활히 통과하여 원하는 패턴으로 프린팅 될 수 있는 물리적 성질을 가져야 한다. 또한, 3D 프린팅 후 세포-특이적 신호를 제공하면서 기계적인 지지체 역할을 유지할 수 있어야 한다. The characteristics of the bio ink required to be used for 3D bioprinting are, first, excellent biocompatibility, and when a 3D printer printed through the nozzle is used, it smoothly passes through a small diameter dispensing nozzle in a desired pattern. It must have physical properties that can be printed. In addition, it should be possible to maintain a mechanical support role while providing cell-specific signals after 3D printing.

최근들어 3D 바이오 프린팅 분야에서 천연 유래 또는 합성 하이드로겔 바이오 잉크가 개발되어 사용되고 있지만, 이러한 기존 하이드로겔을 바탕으로 한 바이오 잉크는 생체적합성, 프린팅 적합성, 기하학적 정밀성, 정밀도와 같은 물리적 및 생물학적 측면에서 상당한 한계점을 보이고 있다.Recently, natural or synthetic hydrogel bio inks have been developed and used in the field of 3D bio printing, but bio-based inks based on these existing hydrogels have considerable physical and biological aspects such as biocompatibility, printing suitability, geometric precision and precision. There is a limit.

공개특허 제10-2017-0001444호(2017.01.04 공개)Publication No. 10-2017-0001444 (published Jan. 4, 2017)

본 발명은, 천연 단백질 고분자인 실크 피브로인을 주요 골격으로 한 바이오 잉크를 제조함으로써, 실크 피브로인의 우수한 기계적 강도와 세포 적합성이 동등 이상으로 유지되면서 3D 프린터에 적용할 수 있는 바이오 잉크 및 이의 제조방법을 제공하고자 한다.The present invention provides a bio-ink which can be applied to a 3D printer while producing a bio-ink based on silk fibroin, a natural protein polymer as a main skeleton, while maintaining excellent mechanical strength and cellular suitability of silk fibroin. To provide.

상술한 바와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 실시 형태는, 3D 프린팅에 사용될 수 있는 바이오 잉크에 관한 것으로, 바람직하게는 실크 피브로인(Silk Fibroin)과 메타크릴레이트(Methacrylate)계 화합물이 중합된 고분자 중합체; 및 광개시제;를 포함할 수 있다.One embodiment of the present invention for achieving the object as described above relates to a bio ink that can be used for 3D printing, and preferably a silk fibroin and a methacrylate-based compound are polymerized High polymers; And a photoinitiator.

상기 고분자 중합체는, 실크 피브로인의 아미노산 잔기에 하나 이상의 메타크릴레이트계 화합물이 공중합되어 형성된 것을 사용하는 것이 바람직하다.It is preferable to use the high molecular polymer formed by copolymerizing one or more methacrylate-based compounds with amino acid residues of silk fibroin.

상기 광개시제는, 리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트(lithium phenyl-(2,4,6-trimethyl benzoyl) phosphinate, LAP), 벤질디메틸케탈(benzyl dimethyl ketal), 아세토페논(acetophenone), 벤조인메틸에테르(benzoin methyl ether), 디에톡시아세토페논(diethoxyacetophenone), 벤조일 포스핀 옥사이드(benzoyl phosphine oxide) 및 1-하이드록시사이클로헥실 페닐 케톤(1-hydroxycyclohexyl phenyl ketone)으로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 하나 이상을 포함할 수 있다.The photoinitiator is lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (lithium phenyl- (2,4,6-trimethyl benzoyl) phosphinate, LAP), benzyl dimethyl ketal, acetophenone ), Benzoin methyl ether, diethoxyacetophenone, benzoyl phosphine oxide, and 1-hydroxycyclohexyl phenyl ketone It may include at least one.

한편, 본 발명이 다른 실시 형태는, 용매에 실크 피브로인(Silk Fibroin)을 용해시키는 용해단계; 실크 피브로인이 용해된 용액에 메타크릴레이트계 화합물을 투입한 후, 이를 교반시켜 고분자 중합체를 제조하는 중합단계; 상기 중합단계를 통해 제조된 고분자 중합체가 포함된 용액을 건조하여 분말화시키는 건조단계; 및 물에 고분자 중합체가 포함된 분말과 광개시제를 혼합하는 혼합단계;를 포함하여 바이오 잉크를 제조하는 방법에 관한 것이다.On the other hand, another embodiment of the present invention, the dissolution step of dissolving silk fibroin (Silk Fibroin) in a solvent; Adding a methacrylate compound to a solution in which silk fibroin is dissolved, followed by stirring to prepare a polymer; A drying step of drying and powdering the solution containing the polymer prepared through the polymerization step; And a mixing step of mixing a powder and a photoinitiator with water containing a polymer polymer in water.

상기 중합단계 후에, 제조된 고분자 중합체가 포함된 용액을 투석 튜브에 넣고, 물에 침지시켜 불순물을 제거하는 투석단계;를 더 포함할 수 있으며, 상기 투석단계는, 제조된 고분자 중합체가 포함된 용액을 12 ~ 14 kDa cutoff 투석튜브에 넣은 후, 물에 3 ~ 5일간 침지시켜 불순물을 제거하는 것이 바람직하다.After the polymerization step, the solution containing the prepared polymer polymer in the dialysis tube, the dialysis step to remove impurities by immersing in water; the dialysis step, the dialysis step, the solution containing the prepared polymer polymer It is preferable to remove the impurities by putting in a 12 ~ 14 kDa cutoff dialysis tube, soaked in water for 3-5 days.

상기 용해단계는, 용매에 실크 피브로인을 0.05 ~ 0.35 g/ml 농도로 용해시킨 후, 40 ~ 80 분간 50 ~ 70 ℃ 온도로 가열할 수 있다.In the dissolving step, the silk fibroin is dissolved in a solvent at a concentration of 0.05 to 0.35 g / ml, and then heated to a temperature of 50 to 70 ° C. for 40 to 80 minutes.

상기 중합단계는, 실크 피브로인이 용해된 용액에 141 ~ 705 mM 농도로 메타크릴레이트계 화합물을 투입하며, 실크 피브로인이 용해된 용액에 메타크릴레이트계 화합물을 투입한 후, 50 ~ 70 ℃ 온도에서 2 ~ 4 시간 동안 200 ~ 400 rpm 회전속도로 교반하는 것이 바람직하다.In the polymerization step, methacrylate compound is added to the solution in which the silk fibroin is dissolved at a concentration of 141 to 705 mM, and the methacrylate compound is added to the solution in which the silk fibroin is dissolved. It is preferable to stir at a speed of 200 to 400 rpm for 2 to 4 hours.

상기 혼합단계는, 물에 고분자 중합체가 포함된 분말 20 ~ 30 wt% 및 광개시제 0.1 ~ 0.3 wt%를 혼합하되, 상기 물, 고분자 중합체 및 광개시제의 합이 100 wt%를 넘지 않는 것이 바람직하다.In the mixing step, 20-30 wt% of the powder containing the polymer polymer and 0.1-0.3 wt% of the photoinitiator are mixed with water, but the sum of the water, the polymer and the photoinitiator is preferably not more than 100 wt%.

상기 혼합단계에서 사용하는 광개시제는, 리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트(lithium phenyl-(2,4,6-trimethyl benzoyl) phosphinate, LAP), 벤질디메틸케탈(benzyl dimethyl ketal), 아세토페논(acetophenone), 벤조인메틸에테르(benzoin methyl ether), 디에톡시아세토페논(diethoxyacetophenone), 벤조일 포스핀 옥사이드(benzoyl phosphine oxide) 및 1-하이드록시사이클로헥실 페닐 케톤(1-hydroxycyclohexyl phenyl ketone)으로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 하나 이상을 포함하는 것을 사용할 수 있다.The photoinitiator used in the mixing step, lithium phenyl-2 (4,6-trimethyl benzoyl) phosphinate (LAP), benzyl dimethyl ketal Acetophenone, benzoin methyl ether, diethoxyacetophenone, benzoyl phosphine oxide and 1-hydroxycyclohexyl phenyl ketone It may be used to include at least one selected from the group consisting of.

상기 건조단계는, 상기 고분자 중합체가 포함된 용액을 -90 ~ -70 ℃ 온도로 10 ~ 14시간 동안 동결한 다음, 동결온도와 동일 온도하에서 40 ~ 60 시간 동안 동결건조하는 것이 바람직하다.In the drying step, the solution containing the polymer polymer is frozen at -90 to -70 ° C for 10 to 14 hours, and then lyophilized for 40 to 60 hours at the same temperature as the freezing temperature.

한편, 본 발명의 또 다른 실시 형태는 앞서 언급한 바이오 잉크; 또는 앞서 언급한 제조방법으로 제조된 바이오 잉크;를 사용하여 3D 프린팅으로 제조된 바이오 구조체이다.On the other hand, another embodiment of the present invention is the aforementioned bio ink; Or a bio structure manufactured by 3D printing using the bio ink prepared by the aforementioned manufacturing method.

본 발명은, 천연 단백질 섬유 중 하나인 실크 피브로인을 베이스로 중합반응을 통해 광 노출시 겔화 또는 경화 반응을 일으킬 수 있는 액체상태의 바이오 잉크 조성물을 제조함으로써, 수분 흡수력, 부피 팽창률, 압축강도, 인장강도 등 기계적 물성을 가진 생체 조직을 제조할 수 있다.The present invention, by producing a liquid bio-ink composition that can cause a gelation or curing reaction upon exposure to light based on the polymerization of silk fibroin, one of the natural protein fibers, moisture absorption, volume expansion ratio, compressive strength, tensile A biological tissue having mechanical properties such as strength can be prepared.

또한, 실크 피브로인을 기본 골격으로 하여 바이오 잉크를 제조함으로써, 체내에서 면역반응이 거의 일어나지 않아 3D 프린팅을 통해 생체적합성이 뛰어난 바이오 구조체를 제조할 수 있다.In addition, by producing a bio ink based on silk fibroin as a basic skeleton, an immune reaction hardly occurs in the body, and thus a biostructure having excellent biocompatibility can be manufactured through 3D printing.

도 1은 본 발명의 일 실시 형태인 바이오잉크의 하이드로겔 형태를 개략적으로 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명의 바이오 잉크의 제조과정을 개략적으로 나타낸 모식도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시 형태로, 실크 피브로인과 GMA의 중합반응을 개략적으로 나타낸 화학구조식이다.
도 4는 본 발명의 일 실시 형태로, 실크 피브로인과 GMA가 중합된 중합체(SGMA)가 겔화된 상태를 개략적으로 나타낸 모식도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시 형태로, 실크 피브로인에 투입된 GMA의 농도에 따른 SGMA의 FT-IR 스펙트럼이다.
도 6은 본 발명의 일 실시 형태로, 실크 피브로인에 투입된 GMA의 농도에 따른 SGMA의 1H-NMR 스펙트럼이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예로 제조된 바이오 잉크를 사용하여 DLP 방식으로 3D 프린팅 과정을 개략적으로 나타낸 모식도이다.
도 8은 본 발명의 다른 실시예로 제조된 바이오 잉크를 사용하여 3D 프린팅으로 인쇄된 하이드로겔의 수분흡수율을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명의 다른 실시예로 제조된 바이오 잉크를 사용하여 3D 프린팅으로 인쇄된 하이드로겔의 체적팽창율을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10 내지 도 16은 본 발명의 다른 실시예로 제조된 바이오 잉크를 사용하여 3D 프린팅으로 인쇄된 하이드로겔의 기계적 강도를 측정한 실험과정 또는 실험결과를 나타낸 사진 또는 그래프이다.
도 17은 본 발명의 다른 실시예로 제조된 바이오 잉크를 사용하여 3D 프린팅으로 인쇄된 하이드로겔의 전단변형율에 따른 저장 탄성율(G')와 손실탄성율(G'')을 나타낸 그래프이다.
도 18은 본 발명의 다른 실시예로 제조된 바이오 잉크를 사용하여 3D 프린팅으로 인쇄된 하이드로겔의 주파수 변화에 따른 저장 탄성율(G')와 손실탄성율(G'')을 나타낸 그래프이다.
도 19은 본 발명의 또 다른 실시예로 제조된 각각 다른 광개시제 함량이 포함된 바이오 잉크를 사용하여 3D 프린팅으로 인쇄된 하이드로겔의 뻣뻣한 정도를 나타낸 그래프이다.
도 20은 본 발명의 또 다른 실시예로 제조된 각기 다른 SGMA-3 함량이 다른 바이오 잉크를 사용하여 3D 프린팅을 하되, UV에 따라 노출된 경화시간에 따른 하이드로겔의 뻣뻣한 정도를 나타낸 그래프이다.
도 21은 본 발명의 다른 실시예로 제조된 바이오 잉크의 세포독성실험 결과를 나타낸 형광 현미경 사진이다.
도 22는 본 발명의 다른 실시예로 제조된 바이오 잉크의 세포증식실험 결과를 나타낸 그래프이다.1 is a schematic diagram schematically showing the hydrogel form of a bioink which is an embodiment of the present invention.
Figure 2 is a schematic diagram showing the manufacturing process of the bio ink of the present invention.
Figure 3 is an embodiment of the present invention, a schematic chemical formula showing the polymerization of silk fibroin and GMA.
FIG. 4 is a schematic diagram showing one embodiment of the present invention, in which a silk fibroin and a GMA polymerized polymer (SGMA) are gelled.
5 is an embodiment of the present invention, FT-IR spectrum of the SGMA according to the concentration of GMA injected into silk fibroin.
FIG. 6 is a 1 H-NMR spectrum of SGMA according to the concentration of GMA injected into silk fibroin in one embodiment of the present invention. FIG.
Figure 7 is a schematic diagram showing a 3D printing process in a DLP method using a bio ink prepared according to an embodiment of the present invention.
Figure 8 is a graph showing the results of measuring the water absorption of the hydrogel printed by 3D printing using a bio ink prepared in another embodiment of the present invention.
9 is a graph showing the results of measuring the volume expansion rate of the hydrogel printed by 3D printing using a bio ink prepared according to another embodiment of the present invention.
10 to 16 are photographs or graphs showing an experimental procedure or test results of measuring the mechanical strength of a hydrogel printed by 3D printing using a bio ink prepared according to another embodiment of the present invention.
FIG. 17 is a graph showing storage modulus (G ′) and loss modulus (G ″) according to shear strain of a hydrogel printed by 3D printing using a bio ink prepared according to another embodiment of the present invention.
FIG. 18 is a graph showing storage modulus (G ′) and loss modulus (G ″) according to a frequency change of a hydrogel printed by 3D printing using a bio ink prepared according to another embodiment of the present invention.
FIG. 19 is a graph showing the stiffness of hydrogels printed by 3D printing using bio inks containing different photoinitiator contents according to another embodiment of the present invention.
20 is a graph showing the stiffness of the hydrogel according to the curing time exposed to UV while 3D printing using different SGMA-3 content of different bio inks prepared by another embodiment of the present invention.
21 is a fluorescence micrograph showing the results of cytotoxicity test of the bio ink prepared according to another embodiment of the present invention.
22 is a graph showing the results of cell proliferation test of the bio ink prepared by another embodiment of the present invention.

이하 본 발명의 바람직한 실시 예를 통해 상세히 설명하기에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정하여 해석되어서는 아니 되며, 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야 함을 밝혀둔다.Before describing in detail through the preferred embodiments of the present invention, the terms or words used in the present specification and claims should not be construed as being limited to the conventional or dictionary meanings, meanings corresponding to the technical spirit of the present invention To be interpreted as

본 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.Throughout this specification, when a part is said to "include" a certain component, it means that it can further include other components, without excluding other components unless otherwise stated.

각 단계들에 있어 식별부호는 설명의 편의를 위하여 사용되는 것으로 식별부호는 각 단계들의 순서를 설명하는 것이 아니며, 각 단계들은 문맥상 명백하게 특정 순서를 기재하지 않는 이상 명기된 순서와 다르게 실시될 수 있다. 즉, 각 단계들은 명기된 순서와 동일하게 실시될 수도 있고 실질적으로 동시에 실시될 수도 있으며 반대의 순서대로 실시될 수도 있다.In each step, the identification code is used for convenience of explanation, and the identification code does not describe the order of each step, and each step may be performed differently from the stated order unless the context clearly indicates a specific order. have. That is, each step may be performed in the same order as specified, may be performed substantially simultaneously, or may be performed in the reverse order.

이하에서는 본 발명의 바이오 잉크 및 이의 제조방법에 관하여 보다 상세히 설명하고자 한다.Hereinafter will be described in more detail with respect to the bio ink of the present invention and its preparation method.

먼저, 본 발명의 바이오 잉크는 3D 프린터를 통해 조직공학용 지지체, 수술 임플란트, 개인별 맞춤형 보형물, 인공 혈관, 인공 장기 등 의학·바이오 분야에 활용될 수 있는 바이오 구조체를 프린팅할 수 있는 생체재료로서, 천연 단백질 고분자인 실크 피브로인에 화합물이 중합된 중합체를 광개시제와 함께 물에 용해시킨 액체상태의 바이오 잉크를 광(예를 들어, UV)에 노출시켜 도 1과 같이 형성된 하이드로 겔을 형성할 수 있다.First, the bio ink of the present invention is a biomaterial capable of printing biostructures that can be used in the fields of medicine and biotechnology such as tissue engineering scaffolds, surgical implants, personalized implants, artificial blood vessels, artificial organs, etc., through a 3D printer. The hydrogel formed by dissolving a polymer polymerized on a silk fibroin, which is a protein polymer, in water together with a photoinitiator may be exposed to light (for example, UV) to form a hydrogel formed as shown in FIG. 1.

특히, 본 발명의 바이오 잉크는 다양한 방식의 3D 프린터에 적용하여 사용할 수 있으나, 바람직하게는 DLP(digital light processing) 방식의 3D 프린터를 적용하여 사용할 수 있다.In particular, the bio ink of the present invention may be applied to various types of 3D printers, but may be preferably applied to DLP (digital light processing) type 3D printers.

일반적으로 DLP(digital light processing) 방식의 3D 프린터의 경우 마스크 투영 이미지 경화 방식으로 구조체를 제조하는 장치로 일반적으로 액체 상태의 광경화성 수지가 담긴 수조에 빔 프로젝터를 사용하여 조형하고자 하는 형상으로 빛을 투사하고, 투사한 형상대로 수지를 경화시켜 적층하는 방식으로 구조체를 제조하는 3D 프린팅 방식이다. 이와 같은 DLP 방식의 3D 프린팅 기술은 빔 프로젝터에서 나오는 이미지를 마스크 단위(2D)로 투사하기 때문에 지지대와 같은 별도의 부재료 없이도 출력이 가능할 뿐만 아니라 표면 조도가 우수하고 프린팅 과정 중 소음이 발생되지 않는 장점이 있다. In general, a DLP (digital light processing) type 3D printer is a device for manufacturing a structure by mask projection image hardening. Generally, a beam projector is used to form light in a tank containing a liquid photocurable resin. It is a 3D printing method which manufactures a structure by the method of projecting and hardening resin and laminating | stacking to the projected shape. Since DLP-type 3D printing technology projects the image from the beam projector in the unit of mask (2D), it can output without additional materials such as support, and has excellent surface roughness and no noise during printing process. There is this.

특히 DLP 방식의 3D 프린팅의 경우 액체 상태의 수지를 잉크로 사용하여 면 단위 조형방식을 통해 구조체가 성형됨으로서 작업 속도가 균일하고 빠른 속도로 조형할 수 있어 세포의 손상률을 저하시켜 세포 적합성이 우수할 뿐만 아니라, 매우 세밀한 표면 조도 및 정밀한 구조체를 프린팅할 수 있어, 3D 바이오 프린팅 방식으로 적용시 착용감이 우수한 개인별 맞춤 보형물을 제조할 수 있다.Especially in the case of DLP type 3D printing, the structure is molded through the surface unit molding method using the liquid resin as ink, so the work speed is uniform and can be molded at a high speed. In addition, it is possible to print very fine surface roughness and precise structure, it is possible to produce a personalized implant with excellent fit when applied by the 3D bio printing method.

구체적으로, 본 발명의 바이오 잉크는, 생체재료로 사용할 수 있는 생체적합성이 있는 물질(일 예로, 아가로즈(agarose), 피브리노겐(fibrinogen), 피브로인(fibroin), 메타아크릴레이티드 히알루론산(HAMA), 사이올레이티드 히알루론산, 젤라틴, 젤라틴 메타아크릴레이티드(GelMA), 사이올레이티드 젤라틴, 콜라겐, 알기네이트, 메틸 셀룰로오스, 키토산, 키틴, 합성펩타이드, 폴리에틸렌 글리콜 기초의 하이드로겔, PGA(Polyglycolic acid), PLGA(poly-lactic-co-glycolic acid), PLA(Polylactic acid), PLLA( poly(L-lactic acid)), PCL(Polycaprolactone), PHB(Polyhydroxybutyrate), PHV(Polyhydroxyvalerate), PDO(Polydioxanone), PTMC(Polytrimethylenecarbonate) 등) 중에서도 뛰어난 생체적합성과 앞서 언급한 물질 보다 상대적으로 물리적 성질이 뛰어난 피브로인(fibroin)를 베이스(base)로 사용할 수 있다.Specifically, the bio ink of the present invention is a biocompatible material (eg, agarose, fibrinogen, fibroin, methacrylated hyaluronic acid (HAMA)) that can be used as a biomaterial. , Thiolated hyaluronic acid, gelatin, gelatin methacrylate (GelMA), thiolated gelatin, collagen, alginate, methyl cellulose, chitosan, chitin, synthetic peptides, polyethylene glycol-based hydrogels, polyglycolic acid (PGA) , Poly-lactic-co-glycolic acid (PLGA), polylactic acid (PLA), poly (L-lactic acid) (PLLA), polycaprolactone (PCL), polyhydroxybutyrate (PHB), polyhydroxyvalerate (PHV), polydioxanone (PDO), Among the PTMC (Polytrimethylenecarbonate), fibroin, which has superior biocompatibility and physical properties superior to those mentioned above, can be used as a base.

상기 피브로인은, 빠른 가교 결합의 형성 및 기계적 강성을 유지할 수 있고, 하이드로 겔로 형성시 안정성 측면에서 우수한 기계적 특성을 가질 뿐만 아니라 세포가 프린팅된 이후에 세포의 부착 및 분화에 적합한 미세환경을 조성할 수 있다는 장점이 있다. The fibroin can maintain the formation of rapid crosslinks and mechanical stiffness, have excellent mechanical properties in terms of stability when formed into a hydrogel, and can also create a microenvironment suitable for cell attachment and differentiation after the cells are printed. There is an advantage.

따라서 본 발명의 바이오 잉크는 피브로인(fibroin). 그 중에서도 누에고치에서 수득할 수 있는 실크 피브로인(Silk Fibroin)을 베이스(base)하여 제조된 고분자 중합체를 포함함으로써, 우수한 세포적합성, 프린팅 후 뛰어난 압축 강도, 인장강도 및 저장 탄성률의 물리적 특성을 나타낼 뿐만 아니라, DLP 방식의 3D 프린터에도 적용할 수 있다.Therefore, the bio ink of the present invention is fibroin. Among them, the polymer polymer prepared based on silk fibroin obtained from silkworm cocoon is included, thereby exhibiting excellent cell compatibility, excellent compressive strength after printing, tensile strength and storage modulus of physical properties. In addition, it can be applied to a 3D printer of the DLP method.

상세하게는 본 발명의 바이오 잉크는 실크 피브로인(Silk Fibroin)와 메타크릴레이트(Methacrylate)계 화합물이 중합된 고분자 중합체; 및 광개시제;를 포함할 수 있으며, 상기 고분자 중합체 및 광개시제를 물에 용해시켜 액체 상태인 바이오 잉크를 3D 프린터에 충진하고, 상기 바이오 잉크를 광, 바람직하게는 UV(Ultraviolet Ray) 자외선에 노출시켜 하이드로겔(hydrogel)시켜 구조체를 성형할 수 있다.Specifically, the bio ink of the present invention includes a polymer polymer in which silk fibroin and a methacrylate compound are polymerized; And a photoinitiator, wherein the high molecular polymer and the photoinitiator are dissolved in water to fill a liquid bio ink in a 3D printer, and the bio ink is exposed to light, preferably ultraviolet (Ultraviolet Ray) ultraviolet light, The structure may be formed by hydrogel.

본 발명의 바이오 잉크의 주요 골격을 형성하는 실크 피브로인은 누에고치에서 세리신을 제거한 천연 단백질 고분자로서, 상기 실크 피브로인 내 아미노산 잔기 중 하나와 메타크릴레이트계 화합물을 중합반응을 통해 고분자 중합체를 제조할 수 있으며, 바람직하게는 실크 피브로인 내 아미노산기 중 라이신 잔기에 하나 이상의 메타크릴레이트계 화합물이 공중합되어 상기 실크 피브로인의 아민기에 메타크릴레이트 비닐기가 형성된 고분자 중합체를 제조할 수 있다.Silk fibroin, which forms the main skeleton of the bio ink of the present invention, is a natural protein polymer from which sericin has been removed from silkworm cocoon. The polymer may be prepared by polymerizing one of the amino acid residues and a methacrylate compound in the silk fibroin. Preferably, at least one methacrylate compound is copolymerized to the lysine residue in the amino acid group in the silk fibroin to prepare a polymer polymer in which a methacrylate vinyl group is formed in the amine group of the silk fibroin.

일 예로, 상기 고분자 중합체는 도 3과 같이 메타크릴레이트계 화합물로, 글리시딜 메타크릴레이트(glycidyl methacrylate, GMA)를 사용하여 상기 실크 피브로인과 중합 반응시켜 실크 피브로인 분자 내 아민(amine)에 메타아크릴레이트기(metacrylate group)가 중합된 고분자 중합체(이하, SGMA)일 수 있다. For example, the polymer is a methacrylate-based compound as shown in FIG. 3, and is polymerized with the silk fibroin using glycidyl methacrylate (GMA) to meta to amines in the silk fibroin molecule. The acrylate group may be a polymerized polymer (hereinafter, referred to as SGMA).

상기 광개시제는 광에 노출시 상기 고분자 중합체를 공격하여 라디칼 반응을 일으킬 수 있되, 화학적으로 안정하고 인체에 독성이 없는 화합물이면 특별히 한정되지 않고 사용 가능하다.The photoinitiator may cause a radical reaction by attacking the polymer when exposed to light, but may be used without particular limitation as long as it is a chemically stable compound that is not toxic to the human body.

일 예로, 본 발명의 바이오 잉크 내 포함된 광개시제로는 프리 라디컬계 광개시제로, 리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트(lithium phenyl-(2,4,6-trimethyl benzoyl) phosphinate, LAP), 벤질디메틸케탈(benzyl dimethyl ketal), 아세토페논(acetophenone), 벤조인메틸에테르(benzoin methyl ether), 디에톡시아세토페논(diethoxyacetophenone), 벤조일 포스핀 옥사이드(benzoyl phosphine oxide) 및 1-하이드록시사이클로헥실 페닐 케톤(1-hydroxycyclohexyl phenyl ketone)으로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 하나 이상을 포함된 것을 사용할 수 있으나, 바람직하게는 세포 독성이 낮은 리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트(lithium phenyl-(2,4,6-trimethyl benzoyl) phosphinate, LAP)를 사용할 수 있다.For example, the photoinitiator included in the bio ink of the present invention is a free radical type photoinitiator, and includes lithium phenyl-2 (4,6-trimethyl benzoyl) phosphinate, LAP), benzyl dimethyl ketal, acetophenone, benzoin methyl ether, diethoxyacetophenone, benzoyl phosphine oxide and 1-hydroxy Cyclohexyl phenyl ketone (1-hydroxycyclohexyl phenyl ketone) It may be used to include at least one selected from the group consisting of, but preferably low cytotoxic lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (lithium phenyl- (2,4,6-trimethyl benzoyl) phosphinate, LAP).

구체적으로 상기 바이오 잉크에 광 조사시, 광개시제가 상기 고분자 중합체의 비닐 모노머를 공격하여 라디칼 반응이 발생되며, 이로 인하여 생성된 자유 라디칼에 의하여 중합반응을 통해 경화되어 구조체를 형성할 수 있다.Specifically, when the bio ink is irradiated with light, a photoinitiator attacks the vinyl monomer of the polymer polymer to generate a radical reaction, and the free radicals may be cured through a polymerization reaction to form a structure.

바람직하게는 본 발명의 바이오 잉크는 앞서 언급한 실크 피브로인과 메타크릴레이트계 화합물이 중합된 고분자 중합체 및 광개시제 외에도 3D 바이오 프린팅을 통해 제조하고자 하는 바이오 구조체의 사용양태 또는 특성에 따라 세포, 성장인자, 생분해성 고분자 등 유효한 양으로 적절히 더 포함될 수 있다.Preferably, the bio ink according to the present invention may be a cell, a growth factor, or a cell according to the use or characteristic of the biostructure to be prepared through 3D bioprinting in addition to the polymer and photoinitiator polymerized with the silk fibroin and methacrylate-based compounds mentioned above. Biodegradable polymers and the like may be further included as appropriate.

상기 바이오 잉크에 관한 구체적인 성분의 함량 및 구조는 하기 바이오 잉크의 제조방법을 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다.The content and structure of the specific components related to the bio ink will be described in more detail through the preparation method of the bio ink.

한편, 본 발명의 다른 실시 형태는 바이오 잉크의 제조방법에 관한 것으로서, 도 2와 같이 용매에 실크 피브로인(Silk Fibroin)을 용해시키는 용해단계(도 2의 (a)); 실크 피브로인이 용해된 용액에 메타크릴레이트 투입한 후, 이를 교반시켜 고분자 중합체를 제조하는 중합단계(도 2의 (b)); 상기 중합단계를 통해 제조된 고분자 중합체가 포함된 용액을 건조하여 분말화시키는 건조단계(도 2의 (d)및(e); 및 물에 고분자 중합체가 포함된 분말과 광개시제를 혼합하는 혼합단계;(도 2의 (f))를 포함하여 바이오 잉크를 제조할 수 있다.On the other hand, another embodiment of the present invention relates to a method for producing a bio ink, a dissolution step of dissolving silk fibroin (Silk Fibroin) in a solvent as shown in Figure 2 ((a) of FIG. 2); Methacrylate was added to the solution in which the silk fibroin was dissolved, followed by stirring to prepare a polymerized polymer (FIG. 2B); Drying step of drying and powdering the solution containing the polymer prepared by the polymerization step ((d) and (e) of Figure 2; and mixing step of mixing the powder and photoinitiator containing the polymer in water; ( Bio ink may be manufactured including FIG. 2 (f)).

상기 실크 피브로인은, 천연 단백질 고분자로 체내에 거부반응 및 면역반응이 일어나지 않고, 염증반응이 적어 생체적합성이 우수하다는 장점이 있다. 상기 실크 피브로인은 누에고치(Bombyx mori)로부터 빼낸 그대로의 누에고치 생사를 정련과정을 통해 세리신과 불순물을 제거한 것으로서, 일반적으로 누에고치 생사를 정련하는 방법은 열탕으로 10시간 이상 끓이거나, 묽은 알칼리성 용액으로 처리하는 방법 등이 있으며, 누에고치 생사로부터 세리신 및 불순물을 제거하여 정련된 실크 피브로인을 수득하는 기술은 일반적으로 널리 알려진 방법이면 사용 가능하므로 이의 자세한 설명은 생략하기로 한다.The silk fibroin is a natural protein polymer, the rejection reaction and immune reaction does not occur in the body, there is an advantage that the biocompatibility is excellent due to less inflammatory reaction. The silk fibroin is to remove sericin and impurities from the silkworm cocoon raw silk cocoon (Bombyx mori) by refining process, in general, the method of refining silkworm cocoon silk boiled for 10 hours or more in a dilute alkaline solution And a method of obtaining sericin and impurities from silkworm cocoon raw silk to obtain refined silk fibroin, which can be used as long as it is a well-known method, and thus a detailed description thereof will be omitted.

정련공정을 통해 정련된 실크 피브로인은 물, 묽은 산 또는 묽은 염기 등 묽은 수용액에서는 용해되지 않는 성질을 가지고 있어, 상기 용해단계에서 용매에 실크 피브로인을 용해시키기 위해서는 브롬화리튬 용액에 50 ~ 70 ℃ 온도로 40 ~ 80 분 동안 가열하여 용해시킬 수 있다. 이 때 용해단계에서 사용되는 용매로, 묽은 용액에는 상기 실크 피브로인이 충분히 용해되지 못하므로 바람직하게는 8.0 ~ 10.0 M의 브롬화리튬(LiBr)용액 또는 염화칼슘(CaCl2)용액을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 8.7 ~ 9.8 M의 브롬화리튬용액을 사용할 수 있다.Silk fibroin refined through the refining process is insoluble in dilute aqueous solutions such as water, dilute acid, or dilute base, and in order to dissolve silk fibroin in the solvent in the dissolution step, the temperature of 50-70 ℃ in lithium bromide solution It can be dissolved by heating for 40-80 minutes. In this case, as the solvent used in the dissolution step, since the silk fibroin is not sufficiently dissolved in the dilute solution, a lithium bromide (LiBr) solution or a calcium chloride (CaCl 2 ) solution of 8.0 to 10.0 M may be preferably used. Lithium bromide solution of 8.7 ~ 9.8 M can be used.

상기 용해단계를 통해 제조된 실크 피브로인이 용해된 용액에 메타크릴레이트계 화합물을 투입한 후, 이를 교반시켜 고분자 중합체를 제조하는 중합단계는, 실크 피브로인의 아미노산 잔기에 메타크릴레이트기를 중합시켜 고분자 중합체를 제조함으로써, 이를 광에 노출시 압축강도, 인장강도 및 저장 탄성률 등의 기계적 물성이 향상된 하이드로겔로 이루어진 구조체를 성형할 수 있다. After the methacrylate compound is added to a solution in which the silk fibroin prepared through the dissolution step is dissolved, the polymerization step of preparing a polymer by stirring the polymer is performed by polymerizing a methacrylate group to an amino acid residue of the silk fibroin. By manufacturing a, it is possible to form a structure made of a hydrogel improved mechanical properties such as compressive strength, tensile strength and storage modulus when exposed to light.

이 때, 아미노산 잔기는 실크 피브로인에 포함된 각종 아미노산의 분자 구성 중 H, OH가 이탈한 구성 단위를 의미하며, 넓은 의미로는 펩타이드나 단백질을 구성하는 각각의 아미노산을 의미한다.In this case, the amino acid residue refers to a structural unit from which H and OH are separated among the molecular structures of various amino acids included in silk fibroin, and broadly means each amino acid constituting a peptide or a protein.

구체적으로, 상기 중합단계는 실크 피브로인이 용해된 용매에 메타크릴레이트계 화합물을 투입한 다음, 50 ~ 70 ℃ 온도에서 2 ~ 4 시간 동안 200 ~ 400 rpm 속도로 교반하여 중합체를 제조할 수 있다. Specifically, the polymerization step may be prepared by adding a methacrylate compound to a solvent in which silk fibroin is dissolved, and then stirring at a speed of 200 to 400 rpm for 2 to 4 hours at a temperature of 50 to 70 ℃.

본 발명의 바이오 잉크 내 포함되는 고분자 중합체는 실크 피브로인(Slik Fibtoin, SF)과 메타크릴레이트계 화합물이 공중합되어 제조된 고분자 중합체로 3D 프린팅 시 제조되는 바이오 구조체의 기본 골격이 되는 고분자 중합체로, 상기 실크 피브로인 내 포함된 아미노산의 잔기에 하나 이상의 메타크릴레이트계 화합물이 공중합되어, 상기 아미노산의 잔기에 메타크릴레이트기가 결합된 코폴리머(co-polymer)를 형성함으로써 고분자 중합체를 제조할 수 있다. 바람직하게는 상기 실크 피브로인 내 포함된 아미노산의 잔기에 2개의 메타크릴레이트계 화합물이 중합되어 고분자 중합체를 제조할 수 있으며, 이를 광개시제와 함께 광(light)에 노출시 경화반응을 일으켜 하이드로겔을 형성할 수 있다. 이 때 사용되는 광(light)의 파장은 상기 광개시제가 라디칼 반응을 개시할 수 있는 광파장 영역을 조사시켜 바이오 잉크의 겔화, 경화반응을 개시할 수 있다.The polymer included in the bio ink of the present invention is a polymer polymer prepared by copolymerizing silk fibtoin (SF) and a methacrylate-based compound, and is a polymer polymer serving as a basic skeleton of a biostructure manufactured during 3D printing. One or more methacrylate-based compounds are copolymerized to the residues of the amino acids contained in the silk fibroin, thereby forming a polymer by forming a copolymer in which methacrylate groups are bonded to the residues of the amino acids. Preferably, two methacrylate-based compounds may be polymerized to the residues of amino acids included in the silk fibroin to prepare a polymer, which may be cured upon exposure to light with a photoinitiator to form a hydrogel. can do. The wavelength of light used at this time may irradiate a light wavelength region in which the photoinitiator may initiate a radical reaction to initiate gelation and curing of the bio ink.

일 예로, 상기 고분자 공중합체는 도 3에 제시된 바와 같이 실크 피브로인(SF)와 글리시딜 메타크릴레이트(glycidyl methacrylate, GMA)를 중합시켜, 실크 피브로인 분자 내 아민(amine), 바람직하게는 상기 글리시딜 메타크릴레이트의 에폭시 고리가 끓어지면서 실크 피브로인 분자 내 라이신기의 아민에 메타아크릴레이트기(metacrylate group)가 중합된 고분자 중합체(이하, SGMA)를 제조할 수 있다. 구체적으로 실크 피브로인(SF)의 α-나선 또는 β-시트의 라이신기의 아민(-NH2)에 상기 메타아크릴레이트기의 에폭시 고리가 끊어지면서 친핵성 반응을 통해 상기 아민에 메타크릴레이트기가 중합된 고분자 중합체인 SGMA를 제조할 수 있다. For example, the polymer copolymer is polymerized with silk fibroin (SF) and glycidyl methacrylate (GMA), as shown in FIG. 3, to give an amine in the silk fibroin molecule, preferably the glyc As the epoxy ring of cyl methacrylate is boiled, a polymer polymer (hereinafter, referred to as SGMA) in which a methacrylate group is polymerized to an amine of a lysine group in a silk fibroin molecule may be prepared. Specifically, the methacrylate group is polymerized to the amine through a nucleophilic reaction while the epoxy ring of the methacrylate group is broken to the amine (-NH 2 ) of the lysine group of the silk fibroin (SF) or the lysine group of the β-sheet. SGMA, which is a high molecular polymer, can be prepared.

따라서, 바람직한 고분자 중합체를 제조하기 위해서는 상기 중합단계에서 혼합되는 실크 피브로인과 메타크릴레이트계 화합물의 혼합비율이 가장 중요하다.Therefore, the mixing ratio of the silk fibroin and methacrylate-based compound mixed in the polymerization step is the most important in order to prepare a preferred high polymer.

상기 용해단계에서 용매에 실크 피브로인을 0.05 ~ 0.35 g/ml 농도로 용해시킨 용액에 141 ~ 705 mM 농도로 메타크릴레이트계 화합물을 투입하여 중합단계를 진행하는 것이 바람직하며, 상기 실크 피브로인과 메타크릴레이트계 화합물의 비율이 상기 범위를 벗어나게 되는 경우 미반응된 실크 피브로인 또는 메타크릴레이트계 화합물이 잔존량이 증가로 경제성이 저하되거나, 제조된 바이오 잉크로 인쇄된 구조체의 기계적 강도가 저하될 수 있다.In the dissolving step, it is preferable to add a methacrylate compound at a concentration of 141 to 705 mM in a solution in which silk fibroin is dissolved in a solvent at a concentration of 0.05 to 0.35 g / ml. When the ratio of the rate-based compound is out of the above range, the remaining amount of the unreacted silk fibroin or methacrylate-based compound may be reduced in economic efficiency, or the mechanical strength of the structure printed with the manufactured bio ink may be reduced.

상기 중합단계를 통해 제조된 고분자 중합체가 포함된 용액 내 포함된 이온 성분 즉, 용해단계에서 사용된 용매 내 포함된 이온인 불순물을 제거하기 위하여 제조된 고분자 중합체가 포함된 용액을 투석 튜브에 넣고, 물에 침지시키는 투석단계(도 2의 (c))를 더 포함하는 것이 바람직하다.Into the dialysis tube, a solution containing the polymer prepared in order to remove impurities, ie ions contained in the solution containing the polymer prepared by the polymerization step, that is, ions contained in the solvent used in the dissolution step, It is preferable to further include a dialysis step (Fig. 2 (c)) immersed in water.

더욱 바람직하게는 상기 투석단계 전에 고분자 중합체가 포함된 용액을 필터를 사용하여 여과한 다음, 용액 내 포함된 이온성분을 제거하기 위한 투석단계를 수행할 수 있다.More preferably, before the dialysis step, the solution containing the polymer may be filtered using a filter, and then a dialysis step may be performed to remove ions contained in the solution.

상기 투석단계는 이온성분은 통과하되 고분자 중합체는 통과하지 못하는 크기의 투석튜브를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 12 ~ 14 kDa cutoff 투석튜브에 제조된 고분자 중합체가 포함된 용액을 투입한 후 물에 3 ~ 5일간 침지시키는 것이 바람직하다. 상기 투석시간이 3일 미만일 경우 제조된 고분자 중합체가 포함된 용액 내 포함된 이온 성분의 제거가 충분하지 못하여 생체 적합성이 저하되거나 프린팅으로 제조된 구조체의 기계적 강도가 저하되는 문제가 발생될 수 있고, 투석시간이 5일을 초과하게 되는 경우 시간 초과에 따른 이익이 없어 경제성이 저하될 수 있다.The dialysis step may use a dialysis tube that passes the ionic component but does not pass the polymer polymer, preferably in the 12 ~ 14 kDa cutoff dialysis tube into a solution containing the prepared polymer polymer 3 It is preferable to immerse for 5 days. When the dialysis time is less than 3 days, the removal of ionic components contained in the solution containing the prepared polymer may not be sufficient, resulting in a decrease in biocompatibility or a decrease in mechanical strength of the structure manufactured by printing. If the dialysis time exceeds 5 days, there is no benefit over time, which may lower the economic efficiency.

상기 투석단계를 통과한 고분자 중합체가 포함된 용액을 건조하여 분말화시키는 건조단계는, 액체상태의 바이오 잉크의 유통 및 저장성을 향상시키고 바이오 잉크의 화학적 안정성을 부여하기 위하여 상기 고분자 중합체가 포함된 용액을 동결건조하여 분말화시키는 것이 바람직하다.The drying step of drying and powdering the solution containing the polymer polymer passed through the dialysis step, the solution containing the polymer polymer in order to improve the circulation and storage of the liquid bio ink and to impart chemical stability of the bio ink It is preferable to dry by lyophilization.

구체적으로 상기 건조단계는, 투석이 충분히 진행되어 이온성분이 제거된 고분자 중합체가 포함된 용액을 먼저 -90 ~ -70 ℃ 온도로 10 ~ 14시간에 걸쳐 완전히 동결시킨 다음, 40 ~ 60 시간 동안 동결온도와 동일 온도하에서 동결건조하는 것이 바람직하다. 상기 동결건조된 고분자 중합체가 포함된 용액은 파쇄, 분쇄 등의 가공을 거쳐 적절한 크기의 입도를 가지도록 분말화시키는 것이 바람직하다.Specifically, in the drying step, the solution containing the polymer polymer from which the dialysis is sufficiently removed and the ionic component is first completely frozen at -90 to -70 ° C. over 10 to 14 hours, and then frozen for 40 to 60 hours. It is preferable to lyophilize at the same temperature as the temperature. The solution containing the lyophilized polymer is preferably powdered to have an appropriate size particle size through processing such as crushing and grinding.

상기 건조단계를 거쳐 고분자 중합체가 포함된 분말은, 물에 광개시제와 함께 혼합하는 혼합단계를 통해 본 발명의 바이오 잉크를 제조할 수 있다. 바람직하게는 상기 혼합단계는 물에 고분자 중합체가 포함된 분말 20 ~ 30 wt% 및 광개시제 0.1 ~ 0.3 wt%를 혼합하는 것이 바람직하며, 이 때 물, 고분자 중합체 및 광개시제의 합이 100 wt%를 넘지 않도록 하는 것이 바람직하다.Through the drying step, the powder containing the polymer may be prepared in the bio ink of the present invention through a mixing step of mixing the water with a photoinitiator. Preferably, in the mixing step, 20-30 wt% of the powder containing the polymer polymer and 0.1-0.3 wt% of the photoinitiator are mixed with water, and the sum of the water, the polymer polymer and the photoinitiator does not exceed 100 wt%. It is desirable to avoid.

상기 광개시제에 관한 구체적인 설명은 앞서 언급하였으므로 여기서는 생략하기로 한다.Since a detailed description of the photoinitiator has been mentioned above, it will be omitted here.

이와 같은 방법으로 제조된 본 발명의 바이오 잉크는 일 예로, 도 4와 같이 상기 광 개시제가 광중합 반응을 개시할 수 있는 파장의 광에 노출시켜 겔화 또는 경화되어 하이드로겔을 형성할 수 있다.In the bio ink of the present invention prepared in this manner, for example, as shown in FIG. 4, the photoinitiator may be gelled or cured by exposure to light having a wavelength capable of initiating a photopolymerization reaction to form a hydrogel.

상세하게는 실크 피브로인과 글리시딜 메타크릴레이트(glycidyl methacrylate, GMA)이 중합반응되어 형성된 SGMA가 포함된 용액에 광개시제인 LAP를 투입하여 제조된 본 발명의 바이오 잉크를 광(자외선, UV)에 노출시키면 상기 광개시제 LAP가 SGMA의 비닐기를 공격(attack)하여 자유 라디칼(free radical)을 생성시키고, 이로 인하여 SGMA의 메타크릴기의 이중결합 부분의 사슬 내부의 결합, 그 사이의 공유 결합이 유발될 뿐만 아니라, 고분자 중합체의 긴 사슬 간의 물리적 얽힘 등을 통해 하이드로 겔의 구조체를 제조할 수 있다. In detail, the bio ink of the present invention prepared by adding LAP, a photoinitiator, to a solution containing SGMA formed by polymerizing silk fibroin and glycidyl methacrylate (GMA) to light (ultraviolet, UV). When exposed, the photoinitiator LAP attacks the vinyl group of SGMA to generate free radicals, thereby causing bonds in the chain of the double bond portion of the methacryl group of SGMA, and covalent bonds therebetween. In addition, the structure of the hydrogel may be prepared through physical entanglement between long chains of the polymer.

따라서, 앞서 언급한 바이오 잉크 또는 앞서 언급한 제조방법으로 제조된 바이오 잉크를 사용하여 3D 프린팅, 바람직하게는 DLP 방식의 3D 프린팅을 통해 하이드로 겔 상태의 바이오 구조체를 제조할 수 있다.Therefore, the bio-structure in the hydrogel state may be manufactured by 3D printing, preferably 3D printing using the bio-ink prepared by the aforementioned bio ink or the aforementioned manufacturing method.

이하에서는, 본 발명의 실시 예를 살펴본다. 그러나 본 발명의 범주가 이하의 바람직한 실시 예에 한정되는 것은 아니며, 당업자라면 본 발명의 권리범위 내에서 본 명세서에 기재된 내용의 여러 가지 변형된 형태를 실시할 수 있다.Hereinafter, an embodiment of the present invention will be described. However, the scope of the present invention is not limited to the following preferred embodiments, and those skilled in the art can implement various modified forms of the contents described herein within the scope of the present invention.

[제조예 1][Production Example 1]

대한민국 농촌 진흥청에서 가져온 누에고치(B. mori)를 4조각으로 자른 후, 자른 누에고치 40 g을 0.05 M 탄산나트륨 수용액 1L에 침지시켜 100 ℃ 온도로 30 분간 가열한 뒤 이를 증류수로 수회 세정한 다음, 이를 실온에서 건조시켜 세리신이 제거된 누에 고치 즉, 실크 피브로인 31.1 g(약 80 % 수득률)을 수득하였다.After cutting the cocoon ( B. mori ) from the Rural Development Administration of Korea into 4 pieces, 40 g of the cocoon was immersed in 1 L of 0.05 M sodium carbonate aqueous solution, heated at 100 ° C for 30 minutes, and washed several times with distilled water. It was dried at room temperature to give 31.1 g (about 80% yield) of silkworm cocoon, ie silk fibroin, from which sericin was removed.

수득된 실크 피브로인 20 g을 9.3 M 브롬화리튬 수용액 100 ml에 투입시킨 후 이를 60 ℃ 온도로 1시간 동안 가열하여 실크 피브로인을 브롬화리튬 수용액에 완전히 용해시켰다.(도 2의 (a))20 g of the obtained silk fibroin was added to 100 ml of an aqueous 9.3 M lithium bromide solution and then heated to 60 ° C. for 1 hour to completely dissolve the silk fibroin in the aqueous lithium bromide solution (FIG. 2A).

실크 피브로인이 용해된 브롬화리튬 수용액에 GMA(Glycidyl methacrylate)가 141mM, 282 mM, 424 mM, 705mM 농도로 포함될 수 있도록 상기 실크 피브로인이 용해된 브롬화리튬 수용액에 GMA 용액(Sigma-Aldrich, St.Louis, Missouri, USA)을 각각 2, 4, 6, 10 ml씩 투입한 뒤, 상기 실크 피브로인과 GMA가 충분히 중합 반응할 수 있도록 60 ℃ 온도에서 300 rpm 속도로 3시간 동안 교반시켰다.(도 2의 (b))GMA solution (Sigma-Aldrich, St. Louis, Co., Ltd.) in which the silk fibroin-dissolved lithium bromide solution can be contained in the lithium bromide solution in which silk fibroin is dissolved at a concentration of 141 mM, 282 mM, 424 mM, or 705 mM in GMA (Glycidyl methacrylate). Missouri, USA) was added 2, 4, 6, and 10 ml, respectively, and then stirred at 300 rpm at 60 ° C. for 3 hours to sufficiently polymerize the silk fibroin and GMA. b))

미라클로스(miracloth)(Calbiochem, SanDiego, CA) 필터를 사용하여 여과한 다음, 13 kDa cut-off 투석 튜브에 실크 피브로인과 GMA이 중합 반응된 SGMA가 포함된 용액을 담은 후 증류수에 상기 투석튜브가 완전히 침지될 정도로 4일동안 방치하여 용액 내 포함된 이온, 불순물을 투석하여 제거하였다.(도 2의 (c))After filtration using a miracloth (Calbiochem, SanDiego, CA) filter, a solution containing SGMA polymerized with silk fibroin and GMA was placed in a 13 kDa cut-off dialysis tube. It was left for 4 days to be completely immersed to remove ions and impurities contained in the solution by dialysis (Fig. 2 (c)).

투석이 끝난 용액은 평균 -80 ℃ 온도로 12시간 동안 동결한 다음, 48 시간동안 동결건조한 후(도 2의 (d)), 이를 분말화시켜 SGMA 분말(GMA 투입량 순서대로, SGMA-1, SGMA-2, SGMA-3, SGMA-4)을 제조하였다.(도 2의 (e))The dialysis solution was frozen at an average temperature of -80 ° C. for 12 hours, and then lyophilized for 48 hours (FIG. 2D), and then powdered to obtain SGMA powder (in order of GMA dosage, SGMA-1, SGMA). -2, SGMA-3, SGMA-4) was prepared (FIG. 2 (e)).

[실험예 1]Experimental Example 1

상기 제조예 1에서 제조된 SGMA 분말의 화학 구조를 확인하기 위하여 적외선 분광광도기(Frontier, PerkinElmer, Rodau, UK)를 사용하여 FT-IR 스펙트럼을 측정하였으며, SGMA의 메타크릴화 정도를 확인하기 위하여 Buker DPX FT-NMR 장치(Bruker Analytik GmbH, Karlsruhe, Germany)를 사용하여 1H NMR 스펙트럼을 측정하였다.In order to confirm the chemical structure of the SGMA powder prepared in Preparation Example 1, an FT-IR spectrum was measured using an infrared spectrophotometer (Frontier, PerkinElmer, Rodau, UK), and to confirm the degree of methacrylation of SGMA. 1 H NMR spectra were measured using a Buker DPX FT-NMR instrument (Bruker Analytik GmbH, Karlsruhe, Germany).

구체적으로 제조예 1에서 각기 다른 비율의 GMA를 투입하여 제조된 SF, SGMA-1, SGMA-2, SGMA-3, SGMA-4 분말 0.001 g을 KBr(Potassium bromide, FT-IR grade) 0.5 g과 함께 막자사발로 고르게 분쇄하였다. 이를 FT-IR(Froniter, PerkinElmer, Rodgau, UK)를 사용하여 스펙트럼을 측정한 결과를 도 5에 나타내었다.Specifically, 0.001 g of SF, SGMA-1, SGMA-2, SGMA-3, SGMA-4 powder prepared by adding different ratios of GMA in Preparation Example 1, 0.5 g of KBr (Potassium bromide, FT-IR grade) and Together, it was ground in a mortar and pestle. 5 shows the results of spectrum measurement using FT-IR (Froniter, PerkinElmer, Rodgau, UK).

또한, SGMA의 메타크릴화 정도를 확인하기 위하여 상기 제조예 1에서 제조된 SF, SGMA-1, SGMA-2, SGMA-3, SGMA-4 분말 0.5 mg을 700 ㎕ 듀테륨 용매(D2O, Sigma-Aldrich)에 용해시킨 후, 0.45 ㎛ 크기의 필터로 여과한 다음, Buker DPX FT-NMR 장치(Bruker Analytik GmbH, Karlsruhe, Germany)를 사용하여 1H NMR 스펙트럼을 측정한 결과를 도 6 및 표 2에 나타내었다.In addition, 0.5 mg of SF, SGMA-1, SGMA-2, SGMA-3, SGMA-4 powder prepared in Preparation Example 1 to determine the degree of methacrylated SGMA 700 μl of deuterium solvent (D 2 O, Sigma -Aldrich), filtered with a 0.45 μm filter, and then measured by 1 H NMR spectrum using a Buker DPX FT-NMR apparatus (Bruker Analytik GmbH, Karlsruhe, Germany). FIG. 6 and Table 2 Shown in

FT-IR 스펙트럼인 도 5의 결과를 살펴보면, SF, SGMA-1, SGMA-2, SGMA-3, SGMA-4 모두 아미드Ⅰ(1639 cm-1), 아미드Ⅱ(1512 cm-1), 아미드Ⅲ(1234 cm- 1)에서 피크를 확인할 수 있었으며, 이는 실크 피브로인 내 포함된 약 5000 개의 아미노산 중 1105 개의 반응성 아미노산을 나타낸다. 또한, 1238 cm-1에서 약하게 측정되는 CH-OH 피크는 GMA의 에폭시 링이 끊어지면서 생성된 알콜기를 나타내며, 1165 cm-1 및 951 cm-1에서 나타나는 피크는 GMA의 메타크릴레이트 비닐기의 CH2의 공명에 의해 형성된다고 예상되었으며, 이러한 피크는 GMA의 포함량이 증가함에 따라 피크의 세기도 증가함을 확인할 수 있었다.Referring to the result of FIG. 5, which is an FT-IR spectrum, SF, SGMA-1, SGMA-2, SGMA-3, and SGMA-4 all have amide I (1639 cm -1 ), amide II (1512 cm -1 ), and amide III. They were able to identify a peak in - (1234 cm 1), which indicates the reactive amino acid 1105 of about 5000 amino acids contained within the silk fibroin. In addition, the CH-OH peak measured weakly at 1238 cm -1 represents an alcohol group formed by breaking the epoxy ring of GMA, and the peaks appearing at 1165 cm -1 and 951 cm -1 represent the CH of the methacrylate vinyl group of GMA. It was expected that it is formed by the resonance of 2 , and it was confirmed that the peak intensity also increased as the content of GMA increased.

메타크릴레이트의 비닐기Vinyl group of methacrylate 라이신Lysine 메틸 그룹Methyl group 메타크릴레이트화 정도(%)Methacrylation degree (%) SF (Slik Fobroin)SF (Slik Fobroin) 0.10.1 1.431.43 0.260.26 0.00.0 SGMA-1
(SF + GMA 2ml)SGMA-1
(SF + GMA 2ml) 0.230.23 1.111.11 0.550.55 22.422.4 SGMA-2
(SF + GMA 4ml)SGMA-2
(SF + GMA 4ml) 0.350.35 0.970.97 0.590.59 32.232.2 SGMA-3
(SF + GMA 6ml)SGMA-3
(SF + GMA 6ml) 0.750.75 0.830.83 0.870.87 42.042.0 SGMA-4
(SF + GMA 10ml)SGMA-4
(SF + GMA 10ml) 0.510.51 0.870.87 0.770.77 39.239.2

제조예 1에서 제조된 SF, SGMA-1, SGMA-2, SGMA-3, SGMA-4 분말의 NMR을 측정한 1H NMR 스펙트럼인 도 6의 결과를 살펴보면, 먼저 6.2~6δ=5.8~5.6 ppm에서 관찰되는 피크는 메타크릴레이트 비닐기로 인한 것이고, δ=1.8 ppm에서 관찰되는 피크는 GMA 메틸기(-CH3)의 공명에 기인한 것으로 여겨지며, 이는 GMA의 함량이 증가함에 따라 점차 피크의 강도가 증가함을 확인할 수 있었다.Referring to the result of FIG. 6, which is a 1 H NMR spectrum of NMR of SF, SGMA-1, SGMA-2, SGMA-3, and SGMA-4 powders prepared in Preparation Example 1, 6.2 to 6δ = 5.8 to 5.6 ppm The peak observed at is due to the methacrylate vinyl group, and the peak observed at δ = 1.8 ppm is believed to be due to the resonance of the GMA methyl group (-CH 3 ), which gradually increases in intensity as the content of GMA increases. It could be confirmed that the increase.

뿐만 아니라, GMA의 함량 증가에 따라 δ=2.9 ppm에서 라이신(Lysin)의 메틸렌 신호가 점차 감소함을 확인할 수 있는데, 이는 실크 피브로인 분자와 GMA가 중합되어 라이신기가 변형되는 것으로 판단된다. 이러한 피크의 정도를 통해 실크 피브로인의 라이신의 메틸렌 기의 변성도는 GMA의 함량 변화에 따라 약 22 ~ 42 %로 예상되었다. In addition, it can be seen that the methylene signal of lysine (Lysin) gradually decreases at δ = 2.9 ppm as the GMA content increases, which is believed to modify the lysine group by polymerizing the silk fibroin molecule and GMA. Through the degree of these peaks, the degree of denaturation of the methylene group of lysine of silk fibroin was estimated to be about 22-42% according to the change of GMA content.

상기 표 1은, 1H NMR 그래프인 도 6에서 관찰된 각각의 피크(메타크릴레이트의 비닐기, 라이신, 메틸그룹)의 넓이를 측정한 값으로, 메타크릴레이트화의 정도는 상기 도 6의 1H NMR 그래프 내 라이신기의 그래프 넓이를 측정한 후, 하기 식(1)로 부터 계산하였다. 이는 실제로 중합 반응시, 메타아크릴레이트화는 실크 피브로인 내 반응성을 갖는 2차 아민기에서는 모두 발생될 수 있으나, 실크 피브로인 내 반응성을 갖는 2차 아민기의 대표적인 아미노산이 라이신기이기 때문에 상기 라이신기를 기준으로 실크 피브로인 내 메타아크릴레이트화의 정도를 확산하였다.Table 1 is a value obtained by measuring the area of each peak (vinyl group, lysine, methyl group of methacrylate) observed in FIG. 6 which is a 1 H NMR graph, and the degree of methacrylateization is shown in FIG. After measuring the graph area of the lysine group in the 1 H NMR graph, it was calculated from the following equation (1). This may actually occur in the polymerization reaction, all of the secondary amine groups having reactivity in silk fibroin, but since the representative amino acid of the secondary amine group having reactivity in silk fibroin is a lysine group, The extent of methacrylation in silk fibroin was diffused as a reference.

1-(SGMA의 라이신기 / 순수 실크피브로의 라이신기)×100 … 식(1)1- (SGMA lysine group / pure silk fibro lysine group) × 100... Formula (1)

따라서, 상기 도 6 및 표 1의 결과를 살펴보면, 앞서 언급한 제조방법을 통해 실크 피브로인과 GMA가 중합되어 SGMA이 생성됨을 확인할 수 있었다.Therefore, looking at the results of FIG. 6 and Table 1, it was confirmed that the silk fibroin and the GMA is polymerized by the above-mentioned manufacturing method to generate the SGMA.

[제조예 2][Production Example 2]

물 1L에 상기 제조예 1에서 제조된 SGMA-3 분말과 리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트 분말(이하, LAP분말; Tokyo chemical industry, Tokyo, Japan)를 각각 하기 표 2과 같이 투입한 후, 상기 SGMA-3 분말과 LAP 분말이 완전히 용해시켜 바이오 잉크를 제조하였다.SGMA-3 powder and lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate powder (hereinafter referred to as LAP powder; Tokyo chemical industry, Tokyo, Japan) prepared in Preparation Example 1 were added to 1 L of water, respectively. After the addition, the SGMA-3 powder and the LAP powder were completely dissolved to prepare a bio ink.

비교예 1Comparative Example 1 실시예 1Example 1 실시예 2Example 2 실시예 3Example 3 실시예 4Example 4 비교예 2Comparative Example 2 비교예 3Comparative Example 3 물(ml)Water (ml) 100100 100100 100100 100100 100100 100100 100100 SGMA(g)SGMA (g) -- 1010 2020 3030 1010 1010 1010 LAP(g)LAP (g) -- 0.20.2 0.20.2 0.20.2 0.10.1 0.050.05 0.40.4 GelMA(g)GelMA (g) 1010 -- -- -- -- -- -- SGMA농도(w/v%)SGMA Concentration (w / v%) -- 1010 2020 3030 1010 1010 1010

[실험예 2]Experimental Example 2

상기 제조예 2에서 제조된 바이오 잉크의 기계적 물성을 확인하기 위하여, DLP(Digital light processing) 프로젝터(365 ㎚, 3.5 ㎽/cm2)를 통해 도 7과 같이 제조예 2에서 제조된 바이오 잉크를 사용하여 3D 구조체(10×10×2 mm3 육면체 시편)를 제조하였다. 시편은 Solid works 2016(Dassault systenmes, Waltham, USA)으로 설계하였으며, 상기 프로젝터로 조각을 투영하여 3D 형태의 구조체(시편)를 제조 하였다. (인쇄 두께; 50 ㎛, 베이스 층 수; 3, 베이스 층 경화시간; 4 sec, 버퍼 층 수; 1, 버퍼 층 경화시간; 3 sec)In order to confirm the mechanical properties of the bio ink prepared in Preparation Example 2, using the bio ink prepared in Preparation Example 2 as shown in Figure 7 through a digital light processing (DLP) projector (365 nm, 3.5 ㎽ / cm 2 ) 3D structures (10 × 10 × 2 mm 3 hexahedral specimens) were prepared. The specimen was designed in Solid works 2016 (Dassault systenmes, Waltham, USA), and the 3D structure (sample) was manufactured by projecting the pieces with the projector. (Print thickness; 50 μm, base layer number; 3, base layer cure time; 4 sec, buffer layer number; 1, buffer layer cure time; 3 sec)

제조된 3D 구조체(시편)의 수분 흡수 능력 및 체적 팽창률 측정하기 위하여, 10×10×2 mm3 육면체로 인쇄된 시편을 37 ℃의 PBS(인산완축식염수, pH7.4)에 각각 0.3, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5 시간 동안 침지한 후 중량을 측정(Wswollen)하였고, 이를 동결건조하여 중량(Wdry)을 측정하였다. 동결건조된 SGMA 파우더의 무게를 측정하여 이를 기준(100%)으로 하여 수분 흡수 상태의 무게를 측정하여 하기 식 (2)를 통해 수분 흡수 능력(Q)를 도출하였으며, 그 결과는 도 8 및 하기 표 3에 나타내었다.In order to measure the water absorption capacity and the volume expansion ratio of the manufactured 3D structure (sample), the specimen printed with 10 × 10 × 2 mm 3 hexahedron was 0.3, 0.5, in PBS (phosphate reduced saline, pH 7.4) at 37 ° C., respectively. After immersion for 1, 2, 3, 4, 5 hours, the weight was measured (W swollen ), it was lyophilized to determine the weight (W dry ). The weight of the lyophilized SGMA powder was measured and the weight of the water absorbed state was measured based on this (100%), and the water absorption capacity (Q) was derived through the following Equation (2). Table 3 shows.

Q = (Wswollen - Wdry)/Wdry × 100 (%) … 식(2)Q = (W swollen -W dry ) / W dry × 100 (%). Formula (2)

또한, 물에 의한 체적 팽창률은, 상기 시편의 인쇄된 직후 10×10×2 mm3 육면체의 X 축과 Y 축의 길이를 측정한 뒤, 상기 X 축과 Y 축의 길이를 기준으로(100%) 침지 후 경과시간에 따라 팽창된 10×10×2 mm3 팽창 육면체의 팽창 X 축과 팽창 Y 축의 길이 변화를 통해 측정하였으며, 그 결과는 도 9 및 하기 표 3에 나타내었다.In addition, the volume expansion rate by water is immersed based on the length of the X and Y axes (100%) after measuring the lengths of the X and Y axes of a 10 × 10 × 2 mm 3 hexahedron immediately after the specimen is printed. After elapsed time was measured through the change in the length of the expansion X axis and expansion Y axis of the expanded 10 × 10 × 2 mm 3 expanded cube, the results are shown in Figure 9 and Table 3 below.

상기 도 8 및 도 9의 결과를 살펴보면, 제조된 시편은 10 % SGMA-3인 실시예 1의 경우 높은 수분흡수율과 높은 체적팽창율을 보였으며, SGMA-3의 함량이 증가함에 따라 수분흡수량과 체적팽창율이 낮아짐을 확인할 수 있었다.Referring to the results of FIGS. 8 and 9, the prepared specimen showed high water absorption rate and high volume expansion rate in Example 1 of 10% SGMA-3, and the water absorption amount and volume were increased as the content of SGMA-3 increased. It was confirmed that the expansion rate is lowered.

추가로, 제조된 3D 구조체의 기계적 강도를 확인하기 위하여 압축응력, 압축변형도, 탄성계수, 인장응력, 연신률 및 영률 측정하였으며, 또한 잉크로서의 물성을 확인하기 위하여 레올리지 특성을 측정하였으며, 그 결과는 하기 표 3 및 표 4, 도 10 내지 도 20과 같다.In addition, compressive stress, compressive strain, elastic modulus, tensile stress, elongation and Young's modulus were measured to confirm the mechanical strength of the manufactured 3D structure, and the rheological properties were measured to confirm the physical properties as ink. Table 3 and Table 4, as shown in Figures 10 to 20.

먼저, 기계적 강도를 측정하기 위하여 상기 실시예 1 내지 3((10% SGMA-3 내지 30 % SGMA-3)의 바이오 잉크를 사용하여 3D 프린팅으로 원통형 시편(지름; 6 mm, 높이; 12 mm)제조하고, 이를 10 kgf 로드쉘이 장착된 universal testing 장치(QM100S, QMESYS, 대한민국)를 사용하여 5 mm/min의 변위 속도로 압력을 가하여(도 10) 압축응력(compressive stress), 탄성계수(elastic modulus)를 측정하였으며, 인장응력(tensile stress) 실온에서 신장 속도 5mm/min으로 설정하여 측정하였으며, 영률(young's modulus)은 50 % strain 변형의 기울기로 계산하였으며 상기 실험의 결과값은 하기 표 3 및 도 10 내지 16과 같다.First, cylindrical specimens (diameter; 6 mm, height; 12 mm) by 3D printing using bio inks of Examples 1 to 3 ((10% SGMA-3 to 30% SGMA-3) to measure mechanical strength It was prepared and pressured at a displacement speed of 5 mm / min using a universal testing device (QM100S, QMESYS, South Korea) equipped with a 10 kgf load shell (FIG. 10), compressive stress, elastic modulus. modulus) was measured, the tensile stress was measured by setting the elongation rate 5mm / min at room temperature, the Young's modulus was calculated as the slope of the 50% strain strain and the results of the experiment are shown in Table 3 and 10 to 16.

실시예 1
(10% SGMA-3)Example 1
(10% SGMA-3) 실시예 2
(20% SGMA-3)Example 2
(20% SGMA-3) 실시예 3
(30% SGMA-3)Example 3
(30% SGMA-3) 수분흡수량(%)Water absorption (%) 4580±4804580 ± 480 2026±2022026 ± 202 1059±1211059 ± 121 팽창률
(%)Expansion
(%) 5시간5 hours 175.2±6.1175.2 ± 6.1 150.0±0.9150.0 ± 0.9 145.4±2.4145.4 ± 2.4 24시간24 hours 183.7±3.9183.7 ± 3.9 142.8±1.7142.8 ± 1.7 165.1±1.9165.1 ± 1.9 재료기여도(%)Material Contribution (%) 100.3±6.7100.3 ± 6.7 83.7±9.583.7 ± 9.5 65.4±7.165.4 ± 7.1 압축응력(kPa)Compressive stress (kPa) 122±45122 ± 45 434±128434 ± 128 910±127910 ± 127 압축변형도(%)Compressive strain (%) 69.5±0.569.5 ± 0.5 77.7±3.377.7 ± 3.3 80.5±5.180.5 ± 5.1 탄성계수(kPa)Modulus of elasticity (kPa) 17.7±1.217.7 ± 1.2 47.8±4.847.8 ± 4.8 125.8±34125.8 ± 34 인장응력((kPa)Tensile Stress ((kPa) ND(not data)ND (not data) 52±4.352 ± 4.3 75±7.575 ± 7.5 연신률(%)Elongation (%) ND(not data)ND (not data) 77.6±3.877.6 ± 3.8 124.2±41124.2 ± 41 영률(kPa)Young's modulus (kPa) ND(not data)ND (not data) 9.7±1.09.7 ± 1.0 14.5±2.914.5 ± 2.9

상기 표 3과 도 10 내지 16의 결과를 살펴보면, 압축응력, 압축변형도, 탄성계수, 인장응력, 연신률, 영률 등 모든 측정 결과에서 SGMA-3의 함량비가 증가함에 따라 측정값도 증가함을 보였으며, 특히 30 % SGMA-3이 포함된 실시예 3의 경우 압축응력이 실시예 2에 비하여 약 2배가량 증가함을 확인할 수 있었다. 비록, 10 % SGMA-3인 실시예 1의 질감이 너무 부드러워 인장응력, 연신률 또는 영률 실험의 결과값은 얻지 못했지만, SGMA-3 함량이 증가함에 따라, 인장응력, 연신률, 영률의 측정값이 증가함을 확인할 수 있었다.Referring to Table 3 and the results of FIGS. 10 to 16, the measured values also increase as the content ratio of SGMA-3 increases in all measurement results such as compressive stress, compressive strain, elastic modulus, tensile stress, elongation, and Young's modulus. In particular, in the case of Example 3 containing 30% SGMA-3, it can be seen that the compressive stress increased by about 2 times compared to Example 2. Although the texture of Example 1, which was 10% SGMA-3, was so soft that no tensile stress, elongation, or Young's modulus results were obtained, the measured values of tensile stress, elongation, and Young's modulus increased as the SGMA-3 content increased. Could confirm.

특히, 도 16은 하이드로겔의 강도 또는 탄성을 확인하기 위한 것으로, 30% SGMA-3인 실시예 3의 상부에 7 kg의 케틀벨을 얹었을 때, 하이드로겔인 실시예 3이 상기 케들벨의 무게를 지탱할 뿐만 아니라, 일정 시간 경과 후 케틀벨을 제거한 후에는 측정 전과 동일한 모양으로 되돌아 오는 것을 확인할 수 있었다.In particular, Figure 16 is to confirm the strength or elasticity of the hydrogel, when a 7 kg kettle bell on top of Example 3 which is 30% SGMA-3, Example 3 hydrogel weight of the kettle bell Not only was it supported, but after removing the kettle bell after a certain time, it was confirmed that it returned to the same shape as before the measurement.

한편, 실시예 1 내지 3의 광가교 반응을 확인하기 위하여 0.1 % 변형률, 1Hz 주파수 하에서 Anton Paar MCR 302 (Anton Paar, Zofingen, Switzerland)를 사용하여 레올로지 특성을 측정하였으며 그 결과는 하기 표 4 및 도 17, 18과 같다. Meanwhile, in order to confirm the photocrosslinking reactions of Examples 1 to 3, rheological properties were measured using Anton Paar MCR 302 (Anton Paar, Zofingen, Switzerland) under 0.1% strain and 1 Hz frequency. 17 and 18 are the same.

실시예 1
(10% SGMA-3)Example 1
(10% SGMA-3) 실시예 2
(20% SGMA-3)Example 2
(20% SGMA-3) 실시예 3
(30% SGMA-3)Example 3
(30% SGMA-3) 상변화각도(°)
(phase shift angle)Phase change angle (°)
(phase shift angle) 6.386.38 6.516.51 9.079.07 저장 탄성률(G') Storage modulus (G ') 81.181.1 1068.21068.2 3038.33038.3 손실 탄성률(G")Loss modulus (G ") 9.19.1 121.9121.9 485.1485.1

상기 표 4 및 도 17, 18의 결과를 살펴보면, 전단 변형율(shear strain)이 1 % 이하일 경우 저장 탄성율(G')와 손실탄성율(G'')가 거의 일정한 값을 나타내므로 상기 실시예 1 내지 3의 하이드로겔의 탄성 및 점성은 전단응력에 영향을 받지 않음을 알 수 있었다. 상세하게는 SGMA-3의 함량이 증가함에 따라 저장 탄성율, 손실 탄성율의 측정값이 점차 증가하였으며, 30 % SGMA-3이 포함된 실시예 3이 가장 높은 측정값을 보였다.Referring to Table 4 and the results of FIGS. 17 and 18, when the shear strain is 1% or less, the storage modulus (G ′) and the loss modulus (G ″) have almost constant values, thus, the first to the first embodiment. It was found that the elasticity and viscosity of the hydrogel of 3 were not affected by the shear stress. In detail, as the content of SGMA-3 increased, the measured values of storage modulus and loss modulus gradually increased, and Example 3 containing 30% SGMA-3 showed the highest measured value.

특히, 실시예 1 내지 3에서 저장탄성율(G')가 손실탄성율(G'')보다 약 6 배 이상 큰 것으로 보아 실시예 1 내지 3의 하이드로겔이 엘라스토머 형상으로 거동함을 예상할 수 있다.In particular, in Examples 1 to 3, the storage modulus (G ′) is about 6 times greater than the loss modulus (G ″), and thus, the hydrogels of Examples 1 to 3 may be expected to behave in an elastomeric shape.

한편, 상변화 각도는 물질의 상태를 나타내는 것으로 6.4 ~ 9.1°로 (고체와 같은 거동은 '0°', 액체와 같은 거동은 '90°') 실시예 1(10% SGMA-3) 내지 3(30% SGMA-3)의 바이오 잉크를 사용한 3D 프린팅을 통해 제조된 하이드로겔의 경우 고체 상태를 가지고 있음을 확인할 수 있다.On the other hand, the phase change angle represents the state of the material to 6.4 ~ 9.1 ° (behaves like a solid '0 °', a liquid like '90 ° ') Example 1 (10% SGMA-3) to 3 It can be seen that the hydrogel prepared through 3D printing using (30% SGMA-3) bio ink has a solid state.

따라서, 실험예 2의 결과(도 8 내지 도 18 및 표 3 내지 4의 결과)를 종합해보면, 상기 실시예 1(10% SGMA-3) 내지 3(30% SGMA-3)의 바이오 잉크의 물리적 특성을 살펴보면, 바이오 잉크 내 SGMA의 함량이 증가할수록 하이드로겔의 수분 흡수량은 점차 감소함을 확인할 수 있었고, 반면에 팽창률은 함량이 증가할수록 줄어듬을 확인할 수 있었다. 또한, 시편의 중량 변화를 측정한 결과 3D 프린팅에 대한 SGMA의 재료 기여도가 SGMA 함량이 증가할 수록 점차 줄어듬을 확인할 수 있었으며, 이는 용액의 투명도가 증가하고 자외선의 산란도가 증가함을 유추할 수 있었다.Therefore, when combining the results of Experimental Example 2 (results of FIGS. 8 to 18 and Tables 3 to 4), the physical properties of the bio inks of Example 1 (10% SGMA-3) to 3 (30% SGMA-3) were obtained. Looking at the properties, it was confirmed that the water absorption of the hydrogel gradually decreases as the content of SGMA in the bio ink increases, while the expansion rate decreases as the content increases. In addition, as a result of measuring the weight change of the specimen, it was confirmed that the material contribution of SGMA to 3D printing gradually decreased as the SGMA content was increased, which can be inferred from the increase of the transparency of the solution and the scattering of ultraviolet rays. there was.

또한, 바이오 잉크 내 SGMA의 함량 증가에 따른 압축 응력, 압축변형도, 탄성계수, 인장응력, 연신률, 영률 등 모든 물리적 특성을 측정한 결과, SGMA 함량 증가에 따라 측정값이 점차 증가함을 확인할 수 있었으며 이는 실크 피브로인 고분자와 GMA이 광조사를 통해 중합되어 분자 내, 분자끼리 얽힘으로 인하여 물리적으로 우수한 물성을 가짐을 예측할 수 있었다. 이로 인해 바이오 잉크 내 SGMA의 함량 증가에 따른 팽창률의 저감은 분자 내부의 화학적 결합속도 증가, 하이드로겔의 강성 및 탄성이 증가되어 결정화도가 증가되었음을 예상할 수 있었다.In addition, as a result of measuring all physical properties such as compressive stress, compressive strain, elastic modulus, tensile stress, elongation, and Young's modulus according to the increase of SGMA content in the bio ink, the measured value gradually increases with increasing SGMA content. It could be predicted that the silk fibroin polymer and GMA polymerized through light irradiation and had excellent physical properties due to entanglement between molecules in the molecule. As a result, the reduction of the expansion rate according to the increase of the SGMA content in the bio ink could be expected to increase the crystallization degree by increasing the chemical bonding rate in the molecule, the rigidity and elasticity of the hydrogel.

또한, 바이오 잉크 내 SGMA의 함량이 증가함에 따라 레올로지 특성인 상변화각도, 저장 탄성률(G'), 손실 탄성률(G") 또한 현저히 증가함을 확인할 수 있었다. 상기 상변화각도, 저장 탄성률(G'), 손실 탄성률(G")의 결과를 종합해보면, 특히 30 %의 SGMA-3인 실시예 3가 가장 높은 형태 안정성을 가질 것으로 예상할 수 있었다.In addition, as the content of SGMA in the bio ink increases, the rheological properties of phase change angle, storage modulus (G ′) and loss modulus (G ″) also increase significantly. The phase change angle, storage modulus ( G ') and the results of the loss modulus (G "), it can be expected that Example 3, in particular 30% SGMA-3 has the highest form stability.

한편, 0.1 % 변형율(strain) 및 1 Hz 주파수에서 UV 경화 과정 내 SGMA 레올로지 특성을 모니터링 하기 위해 SGMA-3과 광개시제인 LAP의 함량 변화에 따른 저장탄성율을 측정하였으며, 그 결과는 하기 도 19 및 도 20에 나타내었다.On the other hand, storage elastic modulus according to the change of the content of SGMA-3 and photoinitiator LAP was measured in order to monitor the SGMA rheological properties during UV curing at 0.1% strain and 1 Hz frequency, the results are shown in Figure 19 and 20 is shown.

상기 도 19를 통해 광개시제인 LAP의 함량 변화에 따른 하이드로겔의 뻣뻣해지는 경향을 알 수 있으며, 도 20을 통해 각각의 실시예 1 내지 3 및 30 % SGMA-3(4초간 UV 노출)의 경화시간이 증가함에 따라 하이드로겔의 저장탄성율(G')이 증가함을 확인할 수 있었다. 이는 UV 광에 노출된 시간이 증가함에 따라 실크 피브로인(SF)가 GMA에 의해 메타크릴화 되는 소수성 도메인(hydrophobic domain)이 안정화됨을 예측할 수 있었다. 추가로, 도 20의 30 % SGMA-3(4초간 UV 노출)의 경우 4초 후 UV가 차단되면 급격히 저장탄성율(G')이 낮아짐을 확인하였다.19 shows the tendency of stiffness of the hydrogel according to the change of the content of LAP, a photoinitiator, and the curing time of SGMA-3 (UV exposure for 4 seconds) of Examples 1 to 3 and 30, respectively, through FIG. 20. As it increases, it was confirmed that the storage modulus (G ′) of the hydrogel was increased. This predicted that the hydrophobic domain of silk fibroin (SF) methacrylated by GMA was stabilized with increasing exposure to UV light. In addition, in the case of 30% SGMA-3 (UV exposure for 4 seconds) of FIG. 20, when UV was blocked after 4 seconds, the storage modulus (G ′) was rapidly lowered.

다른 한편, 바이오 잉크 내 고분자 중합체인 SGMA과 광개시제인 LAP의 함량 변화에 따른 SGMA의 겔화점은 레올로지 특성 실험의 저장탄성율(G')와 손실 탄성률(G")의 교차점을 겔화점으로 정의하여 측정하였다.On the other hand, the gelation point of SGMA according to the change of the content of SGMA, a polymer polymer in the bio ink, and LAP, a photoinitiator, is defined as a gelation point by defining the intersection point of the storage modulus (G ') and the loss modulus (G ") of the rheological properties experiment. Measured.

실시예 1Example 1 실시예 2Example 2 실시예 3Example 3 실시예 4Example 4 비교예 2Comparative Example 2 비교예 3Comparative Example 3 겔화점(%)Gel point (%) 7474 81.281.2 137.5137.5 8383 101101 4141

(단위 : sec)(Unit: sec)

상기 표 5의 결과를 살펴보면 겔화점은 광개시제인 LAP 함량이 증가함에 따라 101 초에서 41초 시간이 단축되었으며, SGMA의 함량이 증가함에 따라 74 초에서 135초로 증가함을 확인할 수 있었다. 이러한 겔화점은 바이오 잉크 내 광개시제인 LAP 함량, SGMA 함량, UV(광) 노출 시간에 의존함을 확인할 수 있었다.Looking at the results of Table 5, the gel point was shortened from 101 seconds to 41 seconds as the LAP content of the photoinitiator was increased, and increased from 74 seconds to 135 seconds as the SGMA content was increased. This gelation point was confirmed to depend on the photoinitiator LAP content, SGMA content, UV (light) exposure time in the bio ink.

[실험예 3]Experimental Example 3

상기 제조예 2에서 제조된 바이오 잉크의 세포 적합성을 확인하기 위하여, 세포 독성(생존) 및 세포 증식 실험을 진행하였다.In order to confirm the cell suitability of the bio ink prepared in Preparation Example 2, cytotoxicity (survival) and cell proliferation experiments were conducted.

세포 독성 및 세포 증식 실험에 사용된 세포는 HeLa cell 및 NIH/3T3 cell을 사용하였으며, 이는 ATCC(Manassas, Virginia)에서 구입하였다. 세포는 DMEM(dulbecco's modified Eagle medium) 배지에서 10 v/v% FBS(fetal bovine serum), 1 v/v% 페니실린 스트렙토마이신 첨가한 배양액을 사용하여 37℃ 습윤한 CO2(5% CO2) 에서 배양하였고, 배지는 3일마다 교환하였다.Cells used for cytotoxicity and cell proliferation experiments were HeLa cells and NIH / 3T3 cells, which were purchased from ATCC (Manassas, Virginia). Cells were cultured in CO 2 (5% CO 2 ) at 37 ° C. using a culture medium supplemented with 10 v / v% fetal bovine serum (FBS) and 1 v / v% penicillin streptomycin in DMEM (dulbecco's modified Eagle medium) medium. The medium was incubated every three days.

배양된 각각의 세포 1 × 106 을 상기 제조예 2에서 제조된 바이오 잉크를 혼합하고, 혼합된 세포 현탁액 50 ㎕을 96 well-plate에 분주한 후 UV광(3.5mW/cm2)을 7초간 조사한 후, 14일 동안 세포 생존율을 관찰하였다. 1 × 10 6 of the cultured cells were mixed with the bio ink prepared in Preparation Example 2, 50 μl of the mixed cell suspension was dispensed into 96 well-plates, and UV light (3.5 mW / cm 2 ) was applied for 7 seconds. After irradiation, cell viability was observed for 14 days.

세포 독성 실험은 LIVE/DEAD 분석 키트(Life Technologies, USA)를 사용하여 진행하였으며, 형광현미경으로 관찰하여 녹색 형광(calcein)을 띄는 세포, 즉 살아있는 세포를 확인하였으며 그 결과는 도 21과 같고, 세포 증식실험은 CCK-8 분석(Dojindo molecular technologt, Rockville, USA)을 통해 진행하였으며 그 결과는 도 22와 같다.Cytotoxicity experiments were conducted using a LIVE / DEAD analysis kit (Life Technologies, USA), and confirmed by fluorescence microscopy cells with green fluorescence (calcein), that is, living cells as shown in Figure 21, the cells Proliferation experiments were carried out through CCK-8 analysis (Dojindo molecular technologt, Rockville, USA) and the results are shown in FIG.

도 21에 나타난 바와 같이 HeLa 세포를 가지고 측정한 GelMA(비교예 1), 10% SGMA-3(실시예 1)을 비교해 보면, Day 1에서는 대부분의 세포가 녹색 형광을 나타내었으며 이는 살아있는 세포를 확인할 수 있다. 그러나, 점차 실험기간이 경과 될수록 GelMA(비교예 1)의 녹색 형광 즉, 살아있는 세포의 분포가 점차 저하됨을 확인할 수 있는 반면에, 10% SGMA-3(실시예 1)의 경우에는 7일 까지 어느 정도의 세포 수를 유지하다 14일 경과 후 세포가 증식되었음을 확인할 수 있었다.As compared to GelMA (Comparative Example 1) and 10% SGMA-3 (Example 1) measured with HeLa cells, as shown in FIG. 21, most cells showed green fluorescence on Day 1, confirming living cells. Can be. However, as the experimental period gradually passed, the green fluorescence of GelMA (Comparative Example 1), that is, the distribution of living cells gradually decreased, whereas in the case of 10% SGMA-3 (Example 1), it was found that After 14 days of maintaining the number of cells was confirmed that the cells proliferated.

이는 NIH/3T3 세포를 사용한 실험에서도 유사한 결과를 관찰할 수 있었다.Similar results were observed in experiments using NIH / 3T3 cells.

도 22는 세포 증식 비율을 나타낸 그래프로, 1일의 GelMA(비교예 1) 및 10% SGMA-3(실시예 1)의 세포 수를 기준으로 GelMA(비교예 1)는 점차 시간이 경과함에 따라 세포의 수가 줄어든 반면, 10% SGMA-3(실시예 1)는 7일 정도까지 세포의 수가 미미하게 증가하다가 14일 경과 후 세포의 수가 현저히 증가하여 세포가 증식되었음을 확인할 수 있었으며, 이는 HeLa 세포 및 NIH/3T3 세포 모두에서 확인할 수 있었다.Figure 22 is a graph showing the rate of cell proliferation, GelMA (Comparative Example 1) based on the number of cells of GelMA (Comparative Example 1) and 10% SGMA-3 (Example 1) per day gradually over time While the number of cells decreased, 10% SGMA-3 (Example 1) showed a slight increase in the number of cells by about 7 days, but after 14 days, the number of cells increased significantly, indicating that the cells proliferated. It was found in all NIH / 3T3 cells.

따라서, 상기 실험예 2 및 실험예 3의 결과를 종합해보면 실크 피브로인을 기본 골격으로 중합되어 형성된 고분자 중합체는 광개시제와 함께 광에 노출시 가교반응을 할 수 있으며, 이러한 고분자 중합체를 포함한 본 발명의 바이오 잉크를 사용하여 3D 프린팅을 통해 우수한 물리적 특성뿐만 아니라, 세포 적합성이 우수한 3D 바이오 구조체를 제조할 수 있다.Therefore, summarizing the results of Experimental Example 2 and Experimental Example 3, the polymer polymer formed by polymerizing silk fibroin as a basic skeleton can crosslinking when exposed to light together with a photoinitiator, and the bio of the present invention including such a polymer polymer. Inks can be used to produce 3D biostructures with excellent cell suitability as well as good physical properties through 3D printing.

Claims (13)

실크 피브로인(Silk Fibroin)과 글리시딜 메타크릴레이트(Glycidyl methacrylate)가 중합된 고분자 중합체; 광개시제; 및 물;을 포함하며,
상기 고분자 중합체는 실크 피브로인을 0.05 ~ 0.35 g/ml 농도로 용해시킨 용액에 141 ~ 705 mM 농도로 글리시딜 메타크릴레이트(Glycidyl methacrylate)를 투입하여 중합시킨 것을 특징으로 하는, 바이오 잉크.
Polymer polymers in which silk fibroin and glycidyl methacrylate are polymerized; Photoinitiators; And water;
The polymer is a bio ink, characterized in that polymerized by injecting glycidyl methacrylate (Glycidyl methacrylate) at a concentration of 141 ~ 705 mM in a solution in which silk fibroin was dissolved at a concentration of 0.05 to 0.35 g / ml.
제1항에 있어서,
상기 고분자 중합체는,
실크 피브로인의 아미노산 잔기에 하나 이상의 글리시딜 메타크릴레이트(Glycidyl methacrylate)가 공중합되어 형성된 것을 특징으로 하는, 바이오 잉크.
The method of claim 1,
The high polymer,
At least one glycidyl methacrylate (Glycidyl methacrylate) formed by copolymerizing the amino acid residues of the silk fibroin, the bio ink.
제1항에 있어서,
상기 광개시제는,
리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트(lithium phenyl-(2,4,6-trimethyl benzoyl) phosphinate, LAP), 벤질디메틸케탈(benzyl dimethyl ketal), 아세토페논(acetophenone), 벤조인메틸에테르(benzoin methyl ether), 디에톡시아세토페논(diethoxyacetophenone), 벤조일 포스핀 옥사이드(benzoyl phosphine oxide) 및 1-하이드록시사이클로헥실 페닐 케톤(1-hydroxycyclohexyl phenyl ketone)으로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 바이오 잉크.
The method of claim 1,
The photoinitiator,
Lithium phenyl- (2,4,6-trimethyl benzoyl) phosphinate (LAP), benzyl dimethyl ketal, acetophenone, benzoin At least one selected from the group consisting of benzoin methyl ether, diethoxyacetophenone, benzoyl phosphine oxide, and 1-hydroxycyclohexyl phenyl ketone Bio ink, characterized in that it comprises.
용매에 실크 피브로인(Silk Fibroin)을 용해시키는 용해단계;
실크 피브로인이 용해된 용액에 글리시딜 메타크릴레이트(Glycidyl methacrylate)를 투입한 후, 이를 교반시켜 고분자 중합체를 제조하는 중합단계;
상기 중합단계를 통해 제조된 고분자 중합체가 포함된 용액을 건조하여 분말화시키는 건조단계; 및
물에 고분자 중합체가 포함된 분말과 광개시제를 혼합하는 혼합단계;를 포함하며,
상기 용해단계는,
용매에 실크 피브로인을 0.05 ~ 0.35 g/ml 농도로 용해시킨 후,
40 ~ 80 분간 50 ~ 70 ℃ 온도로 가열하는 것을 특징으로 하고,
상기 중합단계는,
실크 피브로인이 용해된 용액에 141 ~ 705 mM 농도로 글리시딜 메타크릴레이트(glycidyl methacrylate)를 투입하는 것을 특징으로 하는 바이오 잉크의 제조방법.
A dissolution step of dissolving silk fibroin in a solvent;
A polymerization step of preparing a polymer by adding glycidyl methacrylate to a solution in which silk fibroin is dissolved, and then stirring the glycidyl methacrylate;
A drying step of drying and powdering the solution containing the polymer prepared through the polymerization step; And
It includes; mixing step of mixing a powder and a photoinitiator containing a polymer polymer in water,
The dissolution step,
After dissolving silk fibroin in a solvent at a concentration of 0.05 to 0.35 g / ml,
It is characterized by heating to a temperature of 50 to 70 ℃ 40 to 80 minutes,
The polymerization step,
Method for producing a bio-ink, characterized in that the glycidyl methacrylate (glycidyl methacrylate) is added to the solution in which the silk fibroin is dissolved at a concentration of 141 ~ 705 mM.
제4항에 있어서,
상기 중합단계 후에,
제조된 고분자 중합체가 포함된 용액을 투석 튜브에 넣고, 물에 침지시켜 불순물을 제거하는 투석단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 바이오 잉크의 제조방법.
The method of claim 4, wherein
After the polymerization step,
And a dialysis step of removing the impurities by placing the prepared solution containing the polymer in a dialysis tube and immersing in water.
제5항에 있어서,
상기 투석단계는,
제조된 고분자 중합체가 포함된 용액을 12 ~ 14 kDa cutoff 투석튜브에 넣은 후,
물에 3 ~ 5일간 침지시켜 불순물을 제거하는 것을 특징으로 하는, 바이오 잉크의 제조방법.
The method of claim 5,
The dialysis step,
After the solution containing the prepared polymer in a 12 ~ 14 kDa cutoff dialysis tube,
Method of producing a bio-ink, characterized in that impurities are removed by immersing in water for 3-5 days.
삭제delete 삭제delete 제4항에 있어서,
상기 중합단계는,
실크 피브로인이 용해된 용액에 글리시딜 메타크릴레이트(Glycidyl methacrylate)를 투입한 후,
50 ~ 70 ℃ 온도에서 2 ~ 4 시간 동안 200 ~ 400 rpm 회전속도로 교반하는 것을 특징으로 하는, 바이오 잉크의 제조방법.
The method of claim 4, wherein
The polymerization step,
Glycidyl methacrylate was added to a solution in which silk fibroin was dissolved.
Method for producing a bio-ink, characterized in that the stirring at a rotational speed of 200 ~ 400 rpm for 2 to 4 hours at a temperature of 50 ~ 70 ℃.
제4항에 있어서,
상기 혼합단계는,
물에 고분자 중합체가 포함된 분말 20 ~ 30 wt% 및 광개시제 0.1 ~ 0.3 wt%를 혼합하되,
상기 물, 고분자 중합체 및 광개시제의 합이 100 wt%를 넘지 않는 것을 특징으로 하는, 바이오 잉크의 제조방법.
The method of claim 4, wherein
The mixing step,
20 to 30 wt% of a powder containing a polymer in water and 0.1 to 0.3 wt% of a photoinitiator are mixed,
Wherein the sum of the water, the polymer, and the photoinitiator does not exceed 100 wt%.
제4항에 있어서,
상기 광개시제는,
리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트(lithium phenyl-(2,4,6-trimethyl benzoyl) phosphinate, LAP), 벤질디메틸케탈(benzyl dimethyl ketal), 아세토페논(acetophenone), 벤조인메틸에테르(benzoin methyl ether), 디에톡시아세토페논(diethoxyacetophenone), 벤조일 포스핀 옥사이드(benzoyl phosphine oxide) 및 1-하이드록시사이클로헥실 페닐 케톤(1-hydroxycyclohexyl phenyl ketone)으로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 바이오 잉크의 제조방법.
The method of claim 4, wherein
The photoinitiator,
Lithium phenyl- (2,4,6-trimethyl benzoyl) phosphinate (LAP), benzyl dimethyl ketal, acetophenone, benzoin At least one selected from the group consisting of benzoin methyl ether, diethoxyacetophenone, benzoyl phosphine oxide, and 1-hydroxycyclohexyl phenyl ketone Method for producing a bio ink, characterized in that it comprises.
제4항에 있어서,
상기 건조단계는,
상기 고분자 중합체가 포함된 용액을 -90 ~ -70 ℃ 온도로 10 ~ 14시간 동안 동결한 다음,
동결온도와 동일 온도하에서 40 ~ 60 시간 동안 동결건조하는 것을 특징으로 하는, 바이오 잉크의 제조방법.
The method of claim 4, wherein
The drying step,
After freezing the solution containing the polymer polymer for 10 to 14 hours at a temperature of -90 ~ -70 ℃,
A freeze-dried for 40 to 60 hours at the same temperature as the freezing temperature, a method for producing a bio ink.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 바이오 잉크; 또는
제4항 내지 제6항 및 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항의 제조방법으로 제조된 바이오 잉크;를 사용하여 3D 프린팅으로 제조된 바이오 구조체.The bio ink according to any one of claims 1 to 3; or
A biostructure manufactured by 3D printing using a bio ink prepared by the method of any one of claims 4 to 6 and 9 to 12.
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