KR101965708B1

KR101965708B1 - 스폰지 유사 구조를 갖는 고분자 미립자 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR101965708B1
Application number: KR1020160110709A
Authority: KR
Inventors: 사홍기
Original assignee: 이화여자대학교 산학협력단
Priority date: 2016-08-30
Filing date: 2016-08-30
Publication date: 2019-04-04
Also published as: KR20180024459A

Abstract

본 발명은 고분자 미립자의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로는 메틸아민, 디메틸아민 또는 에틸아민과 같은 화학적 유발인자를 사용하여 비할로겐화 용매인 메틸프로피오네이트, 에틸아세테이트 또는 이소프로필포르메이트를 사용하면서 스폰지와 같은 구조의 다공성을 갖는 미립자의 제조방법 및 상기 제조된 스폰지와 같은 구조의 미립자를 포함하는 약물전달용 조성물에 관한 것이다.

Description

스폰지 유사 구조를 갖는 고분자 미립자 및 이의 제조방법{Sponge-like porous microspheres and method for preparing the same}

본 발명은 고분자 미립자의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로는 화학적 유발인자를 사용하여 스폰지와 같은 구조의 다공성을 갖는 미립자의 제조방법 및 상기 제조된 스폰지와 같은 구조의 미립자를 포함하는 생리활성물질 전달용 조성물에 관한 것이다.

시중에 시판 중인 PLGA 미립자 제품들은 다양한 약물을 1주일에서 6개월동안 서서히 방출하는 장기 지속형 데포(long-acting depot) 기능성을 지니고 있다. 이러한 PLGA 미립자 제품들의 예로서 바이듀리언(Bydureon®), 리스페달 콘스타(Risperdal Consta®), 비비트롤(Vivitrol®), 산도스타틴(Sandostatin LAR®), 및 루프론 데포(Lupron Depot®) 등을 들 수 있다. 이들 미립자 제품들은 모두 비다공성 매트릭스(non-porous matrix)를 지니고 있다. 일반적으로 비다공성 PLGA 미립자의 경우, PLGA의 분해속도(degradation rate)가 약물방출속도를 결정짓는 중대한 요인으로 작용한다. 이 때문에 비다공성 매트릭스를 가지는 미립자의 약물 방출 속도는 느리고 정밀하게 조절하기 어렵다는 단점을 갖는다. 이러한 단점 등을 해소하기 위해 최근 들어서는 기존의 비다공성 고분자 미립자 대신에 새로운 형상을 지닌 미립자 제조 연구가 활발히 진행되고 있다. 이러한 새로운 형상을 갖는 미립자의 대표적인 예로서 다공성 구조(porous structure), 해도형(island-sea), 코어-쉘형(core-shell), 도토리형(acorn), 다공성 층-꽉찬 코어형(porous layer-dense core), 골프공형(golf ball) 그리고 야누스형(Janus) 등을 들 수 있다 (Y. Cai, Y. Chen, X. Hong, Z. Liu and W. Yuan, Int . J. Nanomedicine, 2013, 8, 1111-11120; C. Takai, T. Hotta, S. Shiozaki, Y. Boonsongrit and H. Abe, Chem . Commun., 2009, 37, 5533-5535; D. Cheng, X. Cao, H. Gao, X. Ye, W. Li and Y. Wang, RSC Adv., 2014, 4, 9031-9038; S. W. Kim, K. H. Hwangbo, J. H. Lee and K. Y. Cho, RSC Adv ., 2014, 4, 46536-46540; M.R. Kim, S. Lee, J. K. Park and K. Y. Cho, Chem. Commun., 2010, 46, 7433-7435 및 C. Huang and X. Shen, Chem . Commun., 2014, 50, 2646-2649 등). 이러한 특별한 형태(peculiar morphology) 중에서 특히 다공성 PLGA 미립자는 조직 보수 및 재생 분야에서 생분해성 스캐폴드, 세포 전달, 흡수제, 나노입자-미립자 복합체, 폐 약물 전달 및 장기 지속형 데포로서 각광받고 있다 (W. Xu, L. Wang, Y. Ling, K. Wei and S. Zhong, RSC Adv., 2014, 4, 13495-13501). 다공성 고분자 미립자는 또한 기능성 금속-중합체 하이브리드 복합체를 만들기 위한 템플릿으로서도 활용되고 있다 (H. Y. Son, D. J. Lee, J. B. Lee, C. H. Park, M. Seo, J. Jang, S. J. Kim, M. S. Yoon and Y. S. Nam, RSC Adv., 2014, 4, 55604-55609).

다공성 고분자 미립자의 중요 품질성상으로는 공극 크기 분포, 공극 위치 및 내부 연결, 및 부피 밀도(bulk density) 등을 들 수 있다. 많은 연구자들이 다공성 PLGA 미립자 제조를 위한 전략을 제시하였으며, 그중에서 가장 대표적인 방법은 포로겐(porogens)을 활용한 이중 유제, 구체적으로 W1/O/W2(water-in-oil-in-water) 유제를 기반으로 하는 제조공정이며, 이는 W1/O/W2 유제의 W1과 W2 사이에 큰 삼투압 차에 의해, W1에 존재하는 포로겐이 W2로 확산됨과 동시에 W2의 물이 W1으로 침투하여 최종적으로 다공성 고분자 미립자가 만들어지는 것을 이용한 방법이다. 이러한 이중 유제를 이용하여 미립자를 제조하는 상기와 같은 방법이 다수 보고되어 있다(Int J Pharm 2007;333:103, J Controlled Release 133(2009)37, Angew Chem Int Ed 51(2012)10800, ACS Macro Lett 1(2012)697 및 Ch Chem Lett 24(2013)710 등).

주로 W1에 첨가되는 포로겐으로서 소듐 바이카보네이트, 칼슘 카보네이트 또는 암모늄 바이카보네이트와 같은 가스 형성 물질, W1과 W2 사이의 삼투현상을 극대화하기 위한 염 또는 중합체와 같은 삼투질(osmolytes), 그리고 오일상에 형상된 매우 작은 W1 액적의 안정화를 위한 단백질이나 계면활성제 등을 들 수 있다. 그리고 유상(oil phase)에 첨가하는 포로겐의 경우 미립자 제조공정 도중 또는 제조 후 침출(leaching)됨에 따라 미립자의 다공성을 증가시켜주는 역할을 해준다. 이러한 미립자 제조공정은 일반적으로 PLGA를 녹이기 위한 분산용매로서 할로겐화된 용매인 메틸렌 클로라이드를 사용하며 W1/O 일차 유제(primary 유제)을 만들기 위해 고-전단 또는 고-에너지 믹서가 필요하다. 또한 용매 제거 기법은 용매 증발 및/또는 추출 원리를 활용한 물리적인 접근법에 바탕을 두고 있다.

그러나, 분산용매로 사용되는 유기 용매로서의 메틸렌 클로라이드는 강한 휘발성을 지니고 물과 잘 섞이지 않으며 물 보다 훨씬 낮은 비점을 갖는 등 유제를 만들기 위한 최적의 유기용매이나, ICH Class 2의 용매에 속하는 독성이 강한 물질로 발암물질에 해당하며 환경독성을 야기한다는 큰 문제점을 가지고 있어, 이러한 용매 독성 문제 때문에 약품 제조에 사용하지 않는 것을 권장하고 있다. 현재 메틸렌 클로라이드의 의약품 잔류 허용 한계는 600ppm (0.06%)이다. 따라서, 메틸렌 클로라이드를 용매로서 사용하는 경우 유제로부터 이를 제거하기 위해 밤새 유제를 교반해야 하고(미국 특허 제6,884,435호), 다량의 수상을 사용하여야 함에 따라 큰 용적을 갖는 대규모의 반응기가 필요하며, 미립자 제조시간을 단축하기 위해 반응조(reactor)의 온도를 상승시키거나 또는 감압조건을 도입하기도 하는 번거로운 공정을 필요로 한다(미국 특허 제3,691,090호, 제3,891,570호, 제6,270,700호 및 제6,572,894호 참조). 나아가, 이러한 공정상의 번거로움뿐만 아니라, 상기와 같은 공정을 거치면서 미립자에 봉입된 약물이 변성되는 문제점을 가지고 있다. 또한, 다공성을 확보하기 위해서는 W1에 높은 농도의 포로겐을 첨가해야 하는데, 이때 발생하는 삼투압 증가로 인해 W1에 녹아있는 약물이 외상인 W2로 빠져나가는 문제점이 있으며, 또한 포로겐 제거 단계에서 약물 역시 제거되어 약물 봉입률이 저하되는 문제점을 가지고 있다. 나아가, 앞서 언급한 바와 같이 W1/O 유제를 제조하기 위해 사용되는 고-전단 믹서(예를 들어, 호모게나이저), 또는 고-에너지 믹서(예를 들어, 소니케이터 또는 마이크로플루다이저)와 같은 혼합 장치를 사용하는 공정의 스케일-업은 여러 가지 어려움이 수반된다는 단점 또한 가지고 있어, 제약 산업에서 요구되는 대량생산이 어렵게 된다. 더욱이 포로겐을 사용하였다 하더라도 PLGA 미립자의 다공도가 기대에 부응하지 못하는 낮은 다공도를 보여주는 경우도 많다. 때로는 미립자 표면은 큰 다공성 공극이 많이 존재하지만 미립자의 내부는 여전히 비다공성 매트릭스 형태를 지니고 있다

한편, 인간에 대해 낮은 독성을 나타내는 용매들은 제약 산업에서 ICH Class 3 용매로 분류되며, 이들은 세계적인 규제기관에 의해 의약품 내에 0.5% 미만으로 존재하는 것을 허용하고 있다. 에틸아세테이트는 ICH Class 3 용매에 속하므로 현재 미립자 제조공정 개발에 선호되는 유기용매이다. 하지만, 에틸아세테이트를 사용하는 일반적인 제조방법을 따랐을 때 미립자 잔류 아세테이트양이 2%를 넘는 경우가 많다(미국 특허 제6,884,372호). 그러므로 규제기관의 허용 기준을 충족하는 미립자 잔류 유기용매 함량 (0.5%)을 달성하기 위해 다양한 시도들이 진행되고 있다. 예를 들면 미립자에 존재하는 잔류 유기용매를 에탄올 등을 사용한 비-수성 세척 시스템으로 감소시키기도 한다(미국특허 제8,187,672호). 에틸 아세테이트와 동일한 분자량을 지니고 있으며 유사한 구조식을 지니고 있는 메틸프로피오네이트는 현재 미국 FDA 및 유럽 의약청과 같은 세계적인 규제 당국에서 사람이 먹는 식품 중에 첨가제로 사용할 수 있도록 허가받은 안전한 유기용매이다.

이와 관련하여, 본 발명자들은 최근 가암모니아 분해 반응-기반의 O/W 유제 기법을 사용하여 약물의 봉입률 및 약물 변성의 문제를 갖지 않으면서도 적절한 약물 방출 속도를 나타내는 미립자를 간이한 공정으로 친환경적으로 매우 다공성의 PLGA 미립자를 제조한 바 있다(한국특허출원 제10-2015-0129183호). 이는 수중유형(O/W) 유제를 제조한 후 상기 유제에 암모니아 용액을 첨가하는 것을 특징으로 하며, 이때 암모니아는 유제 액적으로 확산되어 분산상 용매(the dispersed solvent)를 분해시켜 친수성의 분해 부산물을 형성하며, 수상으로 침출되면서 다공성이 확보된 미립자를 제조할 수 있다는 장점을 갖는다. 하지만 이 방법에서는 분산 용매로서 이소프로필포르메이트, 메틸포르메이트, 에틸포르메이트, 프로필포르메이트 등을 사용하여야 하고, 제약산업계에서 PLGA 미립자 제조를 위해 선호하는 비할로겐 용매인 에틸 아세테이트나 메틸프로피오네이트를 분산용매로 사용하였을 때에는 적용할 수 없다는 한계를 지니고 있다. 또한 고분자 PLGA를 미립자 형성 소재로 사용하였을 때 그 다공성이 현저히 감소되거나 또는 비다공성의 미립자가 형성되는 단점을 보여주었다.

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 비할로겐성 용매 중에서도 제약 산업에서 널리 선호되어 사용되는 메틸프로피오네이트와 에틸아세테이트를 분산용매로서 사용할 수 있고, 고분자량을 지닌 PLGA를 사용하더라도 포로겐의 도움이 없이도 간단한 수중유형 유제 기반 방법에 따라 스폰지와 같고, 다공성인 PLGA 미립자를 제조하는 공정을 개발하고자 하고자 예의 연구를 거듭하였다. 그 결과, PLGA와 분산용매를 수용성 용매로 분해할 수 있는 화학반응 유발인자(chemical trigger)로서 메틸아민, 에틸아민, 디메틸아민을 사용하는 경우 상기 선호되는 분산용매 및 고분자량의 PLGA를 사용하면서도 간단한 방법으로 스폰지 형상의 다공성을 지닌 PLGA 미립자를 제조할 수 있다는 점을 최초로 확인하여 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명의 하나의 목적은 스폰지와 같은 구조를 갖는 다공성 고분자 미립자의 제조방법 및 이에 따라 제조된 스폰지와 같은 구조를 갖는 고분자 미립자를 제공하는 것이다.

나아가, 또 다른 본 발명의 목적은 상기 다공성 고분자 미립자를 유효성분으로 포함하는 생리활성물질 전달용 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 해결하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 스폰지와 같은 구조를 갖는 다공성 고분자 미립자의 제조방법에 관한 것이다.

구체적으로, 본 발명에 따른 제조방법은 스폰지와 같은 구조를 갖도록 다음과 같은 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다:

(a) 소수성 고분자를 분산용매로서 메틸프로피오네이트, 에틸아세테이트, 프로필아세테이트, 이소프로필아세테이트, 프로필포르메이트 및 이소프로필포르메이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유기용매에 녹여 분산상을 제조하는 단계;

(b) 상기 단계 (a)에서 제조된 분산상을 수성 용매를 첨가하여 수중유(oil-in-water; O/W)형 유제를 제조하는 유제 제조 단계; 및

(c) 상기 단계 (b)에서 제조한 수중유형 유제에 메틸아민, 에틸아민 및 디메틸아민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화학적 유발인자를 첨가하여 상기 분산상 중의 고분자 및 분산용매와 반응시켜 수용성 분해 산물을 발생시키는 단계.

이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다

본 발명의 단계 (a) 에서는 소수성 고분자를 사용할 수 있으며, 이러한 소수성 고분자는 다공성 고분자 미립자의 형성 소재로 활용할 수 있는 소수성 고분자라면 제한없이 사용할 수 있다. 구체적으로, 폴리(부타디엔)과 같은 폴리(디엔)류 및 이의 유도체; 폴리에틸렌과 같은 폴리(알켄)류, 폴리(아크릴산)과 같은 폴리(아크릴)류, 폴리(메틸렌 메타크릴레이트)와 같은 폴리(메타크릴)류, 폴리(비닐아세테이트)와 같은 폴리(비닐 에스터)류, 폴리(스티렌)류, 폴리(카보네이트)류, 폴리(락타이드-코-글리콜라이드)와 같은 폴리(에스터)류, 폴리(오르토에스터)류, 폴리(에르테라마이드)류, 폴리(안하이드라이드)류, 폴리(우레탄)류, 폴리(아마이드)류, 에틸셀룰로오스와 같은 셀룰로오스 에스터류 및 셀룰로오스 아세테이트와 같은 셀룰로오스 에스터류와 같은 소수성 고분자를 단독 또는 혼합물로 사용할 수 있으며, 바람직하게는 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA) 및 에틸셀룰로오스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 고분자를 사용할 수 있다. 상기 고분자는 미립자의 물성 등에 따라 적절한 분자량을 갖는 고분자를 선택할 수 있다. 종래 한국특허출원 제10-2015-0129183호에서는 가암모니아 반응의 부산물, 즉 물에 녹는 성분들이 효과적으로 수상으로 확산되고 비다공성 고분자 미립자의 제조를 방지하기 위해 비교적 낮은 분자량의 고분자를 사용하였으나, 본 발명에 따른 제조방법에서는 상대적으로 높은 분자량의 고분자를 사용하여도 화학적 유발인자에 의해 효과적으로 분산용매의 분해 반응이 일어나고 동시에 상기 분해 반응의 부산물, 즉 물에 녹는 성분들이 효과적으로 수상으로 확산될 수 있어, 효과적으로 스폰지와 같은 구조의 다공성 고분자 미립자의 제조가 가능하다는 장점을 갖는다.

이러한 고분자 화합물은 분산 용매와 접촉 또는 혼합되어 분산상으로 제조된다. 이때 사용되는 분산용매는 할로겐을 분자 중에 포함하지 않는 비할로겐 유기용매로서, 메틸프로피오네이트, 에틸아세테이트, 프로필아세테이트, 이소프로필아세테이트, 프로필포르메이트, 이소프로필포르메이트나 이들 유기용매의 혼합물, 바람직하게는 메틸프로피오네이트, 에틸아세테이트 및 이소프로필포르메이트에서 선택되는 단독 또는 혼합용매인 것을 특징으로 한다. 종래 한국등록특허 제910892호 및 미국특허 제8,202,525호 등에서 가암모니아 반응을 위하여 사용되던 유기용매는 모두 할로겐화된 유기용매(halogenated organic solvent)로서 용매 자체의 독성 때문에 제약산업에서는 실제적으로 사용하기 힘든 용매이고, 이에 의해서는 단지 비다공성 고분자 미립자만이 제조될 뿐이며, 한국특허출원 제10-2015-0129183호에서는 비록 비할로겐화된 유기용매를 사용하고는 있으나, 제약 산업에서 널리 선호되어 사용하는 메틸프로피오네이트, 에틸아세테이트를 사용하는 경우 가암모니아 반응이 효과적으로 진행되지 않아 이들이 아닌 에틸포르메이트, 메틸포르메이트, 에틸포르메이트, 프로필포르메이트만을 사용하여야만 하였으나, 본 발명에서는 메틸프로피오네이트, 에틸아세테이트, 프로필아세테이트, 이소프로필아세테이트, 프로필포르메이트, 이소프로필포르메이트 및 이들의 혼합용매가 사용 가능하여, 상대적으로 독성이 적을 뿐만 아니라 극강의 다공성을 지닌 미립자를 제조할 수 있으며, 제약산업에서 널리 사용되는 비할로겐화된 유기용매로서 제약산업에 직접적으로 응용이 가능하다는 특징을 갖는다.

나아가, 상기 고분자 화합물과 분산용매를 사용하여 제조된 분산상은 단계 (b)에서 수성용매와 혼합되면서 수중유형(O/W)의 단일 유제를 생성하게 된다. 이때 사용되는 수성용매로는 친수성 유화제, 예컨대 폴리비닐알콜 또는 트윈(Tween) 계열과 같은 유화제를 함유하는 수용액 또는 이의 공용매를 사용할 수 있다. 상기 분산용매에 함유되어 있는 유화제의 농도는 0.1에서 4%(w/w), 바람직하게는 0.2 내지 2.0%(w/v)를 사용할 수 있다.

상기 단계 (a)에서, 분산상을 제조하기 위한 고분자 화합물과 분산용매의 비율은, 제조된 분산상 내의 고분자 화합물의 농도가 3(w/v)% 내지 30(w/v)%, 바람직하게는 3.75(w/v)% 내지 20(w/v)%가 되도록 조절될 수 있다. 이와 관련하여, 고분자의 농도가 30(w/v)%를 초과하는 경우, 분산상의 점도가 상승하여, 후속 단계인 단계 (c)에서 화학적 유발인자에 의한 분산용매의 분해 반응이 억제되고, 이 분해 반응 부산물의 확산이 억제되어 다공성 형성 정도가 감소하고, 3(w/v)% 미만인 경우 미립자의 기계적 강도가 약해 실용성이 떨어지는 문제점이 발생한다. 구체적인 일 실시예에서는, 0.25 g의 PLGA를 4 ml의 메틸프로피오네이트에 녹여 분산상을 제조하였다.

나아가, 상기 단계 (a)에서 제조된 분산상을 단계 (b)에서 수성용매와 혼합시, 그 혼합부피비는 1:1 내지 1:100, 바람직하게는 1:4 내지 1:10이다. 이와 관련하여 수성용매의 양이 너무 많아지면 용매추출이 일어나 다공성 형성 화학반응이 억제됨에 따라 미립자의 다공성이 현저히 떨어질 수 있다는 문제점이 발생한다. 또한, 상기 단계 (c)에서는 단계 (b)에서 제조된 수중유형 단일 유제에 화학적 유발인자를 첨가하여 분산용매의 분해 반응을 수행하게 된다. 본 발명에서는 이러한 화학적 유발인자로서 메틸아민, 에틸아민 및 디메틸아민으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 사용하는 것을 특징으로 하며, 이러한 화학적 유발인자의 사용으로 인해, 고분자량의 고분자 화합물을 사용하고, 종래 가암모니아 반응을 이용하는 미립자의 제조방법에서 사용할 수 없던, 메틸프로피오네이트나 에틸아세테이트를 사용할 수 있다. 이때, 화학적 유발인자의 사용량은 상기 단계 (a)에서 사용되는 분산 용매의 부피를 기준으로 결정하며, 분산용매 : 화학적 유발인자의 몰비율이 1:0.25 내지 1:5가 되도록 사용하는 것이 바람직하다. 이와 관련하여, 상기 범위를 벗어나도록 소량의 화학적 유발인자를 사용하는 경우 공극이 형성되지 않거나, 상기 범위를 벗어난 과량의 화학적 유발인자를 사용하는 경우 매우 공극은 많이 형성되기는 하나, 고분자의 분해가 증가할 수 있고, 약물과 화학적 유발인자 사이 반응이 발생할 수 있으며, 또한 미립자의 기계적 강도가 약해지는 문제가 발생할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 미립자 제조방법에 의하면, 기존의 다공성 고분자 미립자 제조공정들과는 달리, 고분자 화합물을 제약 산업에서 주로 선호하여 사용되는 메틸프로피오네이트, 에틸아세테이트 또는 이소프로필포르메이트와 같은 비할로겐 유기용매에 녹인 분산상을 수용액에 유화시켜 O/W 형의 유제를 형성하고, 그후에 화학적 유발인자를 상기 O/W 유제에 첨가하고, 그 결과 유제 방울을 구성하고 있는 상기 분산용매를 수용성의 분해산물로 분해되게 된다(예를 들어, 메틸아민을 첨가하는 경우 메틸 프로피오네이트가 메탄올과 N-메틸 프로피온아마이드로 분해됨). 이들 수용성 분해산물은 고분자 화합물에 대한 반용매(anti-solvent)로 작용하기 ?문에 고분자 화합물이 용해되지 않으므로 유제방울 내에서 고분자 화합물이 풍부한 도메인과 고분자 화합물이 없는 도메인으로 구분되어지고, 상기 수용성 분해산물은 고분자 화합물에 대한 반용매(anti-solvent)로 작용하고, 이후 자발적으로 수상으로 확산됨에 따라 결국 스폰지와 같은 구조를 갖는 매우 다공성을 갖는 고분자 화합물의 미립자가 형성되게 된다. 상기 과정은 매우 신속하게 일어나는 것으로, 그 결과, 대량의 quenching liquid를 사용한 용매추출이나 또는 용매증발 단계가 전혀 필요하지 않게 되고, 낮은 에너지의 유화기로서 쉽게 O/W형의 유제를 제조할 수 있기 때문에, 특별한 기계장치나 고-에너지 또는 고-전단 혼합 장치가 필요하지 않게 된다. 특히, 바이오 거대분자(biomacromolecules)의 경우 분산상을 이루는 유기용매에 노출되거나 유기용매/물 계면에 노출되는 공정 또는 유제 형성을 위해 사용하는 고에너지 혼합 기기(high-energy mixing device)에 의한 전단으로 인한 바이오 거대분자 자체의 변성, 응집 또는 분해가 될 위험이 있다. 하지만 본 다공성 고분자 미립자를 활용하면 100% 수성 조건에서 안전하게 바이오 거대분자와 같은 생리활성물질을 봉입할 수 있다는 장점을 갖는다. 나아가, 본 발명에 따른 제조방법에 의해 미립자를 제조하는 경우 기존의 다공정 미립자 제조 기법에서 필수적으로 요구되는 포로겐(porogens)을 사용하지 않고, 종래 가암모니아 반응을 사용하는 제조방법과 달리 제약 산업에서 선호하는 메틸프로피오네이트 또는 에틸아세테이트를 사용하면서도 현저한 다공성 구조를 확보할 수 있다는 장점을 갖는다.

나아가, 또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 방법에 따라 제조된, 스펀지 형태의 미립자에 관한 것이다.

구체적으로, 본 발명에 따른 미립자는, 기존의 다공성 PLGA 미립자들와 달리 수많은 공극이 미립자 내부 및 외부에 골고루 분포해 있는 극도의 다공도를 나타내는 스폰지와 같은 형상의 공극 또는 기공들이 존재하며, 이들이 서로 유기적으로 연결되어 네트워크를 형성하는 특유의 성상을 갖는다.

본 발명에 있어서, 상기 고분자 미립자는 평균 직경이 20 내지 1,000um, 바람직하게는 50 내지 350um인 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, 소망하고자 하는 용도에 따라서 자유롭게 변형가능하다. 이때, 미립자의 평균 직경은 유제의 점성도, 분산상의 고분자 화합물의 농도, 고분자 화합물의 분자량, 분산상과 분산용매의 용적비, 유화제의 농도 등에 의해 결정될 수 있다.

이와 같이, 본 발명에 따른 미립자는 스펀지 형태의 다공성을 가져 약물 전달체로 사용시 장기간 지속적인 약물의 방출이 가능하고, 우수한 약물의 봉입률을 나타낸다는 장점을 갖는다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 스폰지와 같은 구조를 갖는 다공성 고분자 미립자 및 생리활성물질을 포함하는 생리활성물질 전달용 조성물에 관한 것이다.

구체적으로, 상기 생리활성물질은 생물이 생을 영위함에 있어서 생체의 기능을 증진시키거나 혹은 억제시키는 물질로서, 생체 내에서 소망하는 효과를 발휘할 수 있는 약물을 비롯한 모든 물질을 의미한다. 상기 생리활성물질은 바람직하게 바이오 거대분자(biomacromolecules)일 수 있으며, 예를 들어 펩타이드, 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 단백질, 나노입자, DNA, RNA, 단일클론항체 또는 백신일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한 현재 소수성 약물들을 PLGA 미립자에 봉입하는 경우 비공극성을 띄는 미립자가 주로 활용되지만, 본 발명에 따른 다공성 고분자 미립자는 소수성 약물들을 공극성 미립자에 봉입할 수 있는 기반을 마련해준다.

이러한 생리학적 활성물질의 바람직한 예로서, 성장인자, 성장 호르몬, 펩타이드 또는 단백질 의약품, 소염진통제, 항암제, 항바이러스제, 성호르몬, 항생제, 항균제 또는 저분자 화합물을 들 수 있다.

또 다른 바람직한 양태로서, 본 발명에 따른 생리활성물질 전달용 조성물은 상기 다공성 고분자 미립자 및 생리활성물질 외에, 약학적 조성물에 통상적으로 사용되는 담체, 부형제, 첨가제 등을 포함할 수도 있다.

나아가, 또 다른 일 양태로서, 본 발명은 상기 생리활성물질 전달용 조성물의 제조 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 상기 생리활성물질 전달용 조성물의 제조방법은 다음과 같은 단계를 포함한다:

상기 스폰지와 같은 구조를 갖는 다공성의 고분자 미립자를 제조하는 단계; 및

상기 미립자에 생리활성물질을 봉입시키는 단계.

바람직한 일 양태에서, 상기 생리활성물질 봉입 단계는 미립자와 생리활성물질을 접촉시키는 단계 및 승온 단계를 포함할 수 있다. 바람직한 일 양태에서, 상기 승온 단계는 미립자의 유리전이온도 부근까지 승온시키는 것에 의해 수행될 수 있다.

본 발명에 따른 제조방법에 따라 다공성의 고분자 미립자를 제조하는 경우 메틸아민, 디메틸아민, 에틸아민과 같은 화학적 유발인자를 사용하여 비할로겐화된 메틸프로피오네이트 등과 같은 제약 산업에서 선호되는 유기용매들을 다공성 미립자 제조를 위한 소수성 고분자의 가용화 분산용매로 사용하며, 포로겐의 도움없이 간단한 o/w 유제-템플릿된 기술 플랫폼으로 극도의 다공성을 갖는 스폰지와 같은 구조를 지닌 고분자 미립자를 제조할 수 있고, 이는 종래의 다공성 고분자 미립자 제조기법들과 비교시 분산용매로서 비할로겐화된 메틸프로피오네이트나 에틸아세테이트, 프로필아세테이트, 프로필포르메이트, 그리고 이소프로필포르메이트 등을 사용할 수 있다는 점, 용매 제거가 용이하고 완벽하게 이루어질 수 있다는 점, 극도의 다공성을 부여할 수 있다는 점 및 간이상 제조공정의 수립이 가능하다는 점 및 특별한 추가의 장치나 처리 없이 규제당국이 요구하는 미립자 잔류유기용매 한계 기준을 충족시킬 수 있다는 장점을 갖는바, 다양한 분야에서 long-acting drug depots, 흡수제, 및 생분해성 스캐폴드로서 활용이 가능하다.

도 1은 메틸프로피오네이트-물 이층 시스템에서 시간의 경과에 따른 수용성 메틸프로피오네이트 농도를 보여주는 GC 크로마토그램이다. 물에는 어떠한 화학적 유발인자를 넣어주지 않았다. 화살표는 메틸프로피오네이트의 피크를 나타낸다. 6분에 나타나는 상기 피크는 내부 표준인 이소프로판올을 나타낸다.
도 2은 메틸프로피오네이트-물 이층 시스템에서 시간의 경과에 따른 수용성 메틸프로피오네이트와 메탄올 농도를 보여주는 GC 크로마토그램이다. 물에는 암모니아를 첨가하였다. 화살표 1과 2는 각각 메틸프로피오네이트와 메탄올 피크를 나타낸다. 아주 소량의 메탄올만이 형성되며 수용성 메탄올 농도는 시간이 경과함에 따라 증가하는 경향을 보여준다.
도 3는 메틸프로피오네이트-물 2층 시스템에서의 시간의 경과에 따른 메틸프로피오네이트의 물에서의 농도(화살표 1), 메탄올(화살표 2) 및 N-메틸 프로피온아마이드(화살표 3)을 보여주는 GC 크로마토그램에 관한 것이다. 물에는 메틸아민을 첨가하였다. 아주 소량의 메틸프로피오네이트가 관측되며, 이 용매의 분해산물인 메탄올과 N-메틸 프로피온아마이드의 물에서의 농도는 시간이 경과함에 따라 증가하는 양상을 보여준다.
도 4은 (a) 메틸프로피오네이트 및 (b) 메탄올의 물에서의 농도의 경시적 변화를 나타내는 것이다. (○,●)는 메틸프로피오네이트-물 2층 시스템의 수상으로 부가된 것이 아무 것도 없는 경우, (△,▲)는 암모니아를 부가한 경우, (□,■)는 메틸아민을 부가한 경우이다. 상기 결과는 메틸아민이 수상에 용해된 메틸프로피오네이트를 제거하기 위한 탁월한 화학적인 유발인자임을 나타낸다.
도 5는 메틸프로피오네이트-물 2층 시스템에서 관찰되는 N-메틸 프로피온아마이드의 물에서의 농도 변화를 나타낸다. 메틸아민이 수상에 부가된 후, 물에서의 N-메틸프로피온아마이드의 농도를 시간함수로서 분석하였다.
도 6는 시간함수로서 수단-III 함유 수중 유형 유제를 관찰한 것이다. (a)는 유제에 아무것도 부가하지 않은 경우, (b) 암모니아를 부가한 경우, (c) 메틸아민을 부가한 경우를 나타낸다. 메틸아민-처리된 수중유형 유제의 색은 투명하였고, 이는 메틸아민이 메틸프로피오네이트를 완전히 제거할 수 있음을 증명한다.
도 7는 메틸아민으로 처리한 Sudan III-함유 수중유형 유제의 색상의 동적 변화를 확인한 사진이다. 메틸프로피오네이트-메틸아민의 몰비는 1:0.5로 설정하였다.
도 8은 1시간 동안 교반한 다양한 수중유형 유제의 상태를 확인한 도면이다. (a)는 미처리군, (b)는 암모니아, (c) 내지 (f)는 메틸아민을 유제에 처리한 군이다. 메틸프로피오네이트-메틸아민 몰비는 (c) 1:0.75, (d) 1:1, (e) 1:1.25, and (f) 1:1.5로 설정하였다.
도 9는 메틸아민을 사용한 용매 제거 방법에 의해 제조된 PLGA 미립자의 전형적인 스폰지 형상의 내부 구조를 확인한 SEM 현미경 사진이다.
도 10은 비다공성 고분자 미립자 및 스폰지와 같은 구조를 갖는 미립자의 형성 메커니즘을 나타낸 것이다. (a)와 같이 전형적인 증발/추출 공정에서는, 유제 액적 밖의 분산된 용매 분자들의 느린 확산이 그들의 내부로의 수축을 야기하기 때문에 결과적으로 비다공정 매트릭스가 만들어진다. (b) 메틸아민은 메틸프로피오네이트와 반응하기 위해 유제 액적 내로 확산되고, 그 결과 수용성의 메탄올과 N-메틸프로피온아마이드로 메틸프로피오네이트를 분해시키기 위한 PLGA의 반용매로 작용하게 된다. 이러한 화학적 반응은 유제 액적의 미립자로의 전환을 야기함과 동시에 미립자의 다공성을 유도하게 된다.
도 11은 서로 다른 스폰지와 같은 뼈대를 갖는 다공성 PLGA 미립자의 (a) 외부 및 (b), (c) 내부 형태의 SEM 현미경 사진이다. 미립자의 제조를 위해 사용된 메틸프로피오네이트-메틸아민의 몰비는 1:0.5 내지 1:1.25이다. 미립자들은 그들의 내부 형태를 확인하기 위해 두 가지의 방법에 의해 처리되었다. (a) 미립자의 표면을 테이프를 사용하여 벗겨내었고, (b) 횡단 전에 에폭시 수지 내에 함침시켰다.
도 12는 서로 다른 메틸프로피오네이트-메틸아민 몰비율 (a) 1:0.5, (b) 1:0.75, (c) 1:1, 및 (d) 1:1.25을 사용하여 제조한 PLGA 미립자의 열중량 분석 결과를 나타낸다.
도 13은 고분자 화합물로서 에틸셀룰로오스(4cp) 및 화학적 유발인자로서 에틸아민을 사용하여 스폰지와 같은 구조를 갖는 본 발명에 따른 미립자를 제조하고 이의 내부 및 외부 형상을 전자현미경으로 관찰한 사진이다.
도 14는 고분자 화합물로서 에틸셀룰로오스(10cP) 및 화학적 유발인자로서 에틸아민을 사용하여 스폰지와 같은 구조를 갖는 본 발명에 따른 미립자를 제조하고 이의 내부 및 외부 형상을 전자현미경으로 관찰한 사진이다.
도 15는 에틸아세테이트-물 2층 시스템의 여러 가지 조건들에서 취한 수상 샘플들의 가스크로마토그램을 나타낸다. (a)는 대조시험, 즉 수상에 아무런 화학적 유발인자를 넣지 않은 경우. (b)는 화학적 유발인자로서 암모니아를 사용한 경우. (c)는 메틸아민을 사용한 경우. 1과 2는 각각 에틸아세테이트와 에탄올 피크를 나타낸다.
도 16은 시간함수로서 수단-III 함유 유중 수형 유제를 관찰한 사진이다. (a)는 유제에 아무것도 부가하지 않은 경우, (b) 암모니아를 부가한 경우, (c) 메틸아민을 부가한 경우를 나타낸다. 메틸아민-처리된 수중유형 유제는 투명하여, 그 결과 메틸아민은 에틸아세테이트를 완벽하게 제거할 수 있음을 나타낸다.
도 17은 시간함수로서 수단-III 함유 유중 수형 유제를 관찰한 사진이다. (a)는 유제에 아무것도 부가하지 않은 경우, (b) 암모니아를 부가한 경우, (c) 메틸아민, (d) 디메틸아민, 및 (e) 에틸아민을 부가한 경우를 나타낸다. 이와 같이 메틸아민, 디메틸아민 및 에틸아민과 같은 아민류 화합물은 이소프로필 포르메이트를 용매로 사용하는 경우에도 효과적으로 분해할 수 있는 화학적 유발인자임을 확인할 수 있다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 이러한 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 사용되는 물질

락타이드:글리콜라이드 비율이 75:25(inherent viscosity = 0.71 dL/g in CHCl₃)인 폴리(락타이드-코-글리콜라이드)를 Evonik Corporation (Theodore, AL, USA)으로부터 구입하였다. 이 중합체는 달리 언급하지 않는한 PLGA로 약칭한다. 메틸프로피오네이트 및 에틸 아세테이트는 Alfa Aesar (Ward Hill, MA, USA) 및 J.T. Baker (Phillipsburg, PA, USA)으로부터 각각 제공받았다. 28%의 암모니아 용액은 Merck (Darmstadt, Germany)로부터, 40% 메틸아민 용액과 Sudan III는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다.

N-프로피온아마이드는 Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. (Tokyo, Japan)로부터 구하였고, 메탄올은 Burdick & Jackson (Muskegon, MI, USA), 폴리비닐알코올(PVA; 88% hydrolyzed, Mw = 25,000 g/mol)은 Polysciences Inc. (Warrington, PA, USA)로부터 사입하였다.

실시예 2: 메틸프로피오네이트 -물 2층 시스템에서의 수성 용매 농도의 모니터링

30 ml의 0.5% aqueous PVA 용액을 50 ml 크기의 beaker에 넣고 여기에 3.2 ml의 40% 메틸아민 용액을 첨가하였다. 메틸프로피오네이트 4 ml을 조심스럽게 넣은 후 two phases가 섞이지 않도록 110 rpm으로 천천히 교반하였다. 미리 정해진 시간마다 수층에서 0.2 ml의 수용액을 채취하여 200 mg MgSO₄와 10 ml의 부탄올을 넣어 vortexing 하였다. 이후 0.45 mm syringe filter를 사용하여 얻은 filtrate 0.4 ml에 0.2 ml의 내부 표준 용액을 가하여 GC injection sample 용액으로 하였다. 위에서 사용한 내부 표준 용액은 이소프로판올 100 ml를 1.9 ml의 부탄올에 녹인 후 이를 부탄올로 10배 희석하여 제조하였다. 위의 실험을 메틸아민 대신 28% 암모니아 용액 2.5 ml을 가하여 시험하였다. 또한 메틸아민이나 암모니아를 전혀 넣지 않는 control 실험도 진행하였다.

각 샘플의 부분표본(aliquot)은 불꽃이온화검출기(flame ionization detector)를 장착한 model GC-2010 gas chromatograph(Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan)으로 주입하였다. Zebron ZB-624 컬럼(30m × 0.32mm × 1.80 mm; Phenomenex, Torrance, CA, USA)을 고정상으로 사용하였다. 질소 가스의 컬럼 유입속도를 1.1 mL/min으로 설정하였다. 인젝터 및 디텍터의 온도는 각각 200 °C 및 220 °C로 설정하였다. 오븐 온도는 80 °C에서 6.3분 동안 유지하고, 200 °C/min의 속도로 180°C까지 상승시켰다. 메탄올, 메틸프로피오네이트 및 N-메틸프로피온아마이드의 알려진 농도의 표준 용액은 부탄올을 사용하여 준비하였으며, 이소프로판올 내부 표준 용액을 첨가하였다. 이들의 standard calibration curve는 미지의 샘플 농도를 결정하기 위하여 구축되었다.

이와 같이 PLGA-free 메틸프로피오네이트 4 ml을 30 ml의 0.5% 수성 PVA 용액 위에 위치시켜 2종의 상을 형성시킨 후 각 시점에서 수용성 메틸프로피오네이트 농도를 GC를 사용해 관측해본 결과, 도 1에서 보여준 GC 크로마토그램과 같이 수용성 메틸프로피오네이트 농도가 시간이 경과함에 따라 서서히 증가하였다. 이는 곧 유기용매층으로부터 메틸프로피오네이트 일부가 수상으로 천천히 확산됨에 따라 발생한 것이다. 동일한 조건에서 수상(aqueous phase)에 메틸프로피오네이트 대비 1:1 당량의 암모니아를 넣어주었을 때에도 유사한 결과가 관측되었다(도 2). 하지만 메틸프로피오네이트 대비 1:1 당량의 메틸아민을 수상에 넣어준 후 10분 경과하였을 때 수용성 메틸프로피오네이트 농도는 현격히 감소하였다. 시간이 더 지나더라도 여전히 수용성 메틸프로피오네이트 농도는 매우 낮게 관측되어졌다. 대신 메틸아민과 메틸프로피오네이트가 서로 반응하여 생성된 N-메틸프로피온아마이드와 메탄올의 물에 대한 농도는 시간이 경과함에 따라 증가하였다(도 3). 이는 곧 수상에 첨가한 메틸아민이 유기용매층으로 이행하여 메틸프로피오네이트와 반응하고, 생성되는 반응분해산물인 N-메틸프로피온아마이드와 메탄올이 수상으로 확산되어짐을 제시한다.

상기의 GC 실험을 통해 얻은 결과를 바탕으로 다양한 조건에서 관측되는 수상에서의 메틸프로피오네이트 및 메탄올 농도를 정량한 결과, 도 4a에서 보여지듯이, 메틸프로피오네이트-물 이층상에 아무것도 첨가하지 않았을 때 시간이 경과함에 따라 수용성 메틸프로피오네이트 농도는 점차로 증가되면서 포화상태에 도달하였다. 수상에 암모니아를 첨가한 경우 수용성 메틸프로피오네이트 concentration은 상대적으로 약간 감소되는 경향을 보였주었다. 이러한 결과들과는 매우 다르게 메틸아민을 첨가하였을 때에 수용성 메틸프로피오네이트 농도는 매우 미미하였다. 위에서 언급한 3 가지 조건에서 수상에서의 메탄올 농도를 측정한 결과가 도 4b에 나타나 있다. 메틸프로피오네이트-물 이층상의 수상에 첨가한 암모니아는 유기용매 층에 존재하는 메틸프로피오네이트를 효과적으로 제거하지 못하였지만, 메틸아민은 매우 효과적으로 메틸프로피오네이트를 분해시켜 메탄올을 생성함을 보여주고 있다. 동일한 시험조건들에서 수용성 N-메틸프로피온아마이드 농도를 시간별로 측정해보았을 때 도 4b에서 나타난 결과와 동일한 결과가 관측되었다(도 5). 이러한 모든 결과는 암모니아는 메틸프로피오네이트를 효과적으로 제거하지 못하는 반면에, 메틸아민은 매우 효과적으로 메틸프로피오네이트를 제거하는 화학적 유발인자임을 나타내고 있다.

실시예 3: 서로 다른 화학적 유발인자를 사용한 용매( 메틸프로피오네이트 ) 제거 공정의 비교

실시예 2에 따른 GC 실험을 통하여 메틸아민이 메틸프로피오네이트를 수용성 용매(water-soluble solvents)로 분해시킨다는 사실을 확인하였다. 본 반응을 이용하여 미립자 제조 공정 중 용매제거를 달성할 수 있는지를 알아보기 위하여 다음과 같은 실험을 디자인하였다.

구체적으로, 수용성 붉은 염료인 Sudan III를 메틸프로피오네이트를 사용하여 용해시켜 0.25 mg/ml 농도로 사용하였다. 이 염료 용액의 4ml를 30 ml의 0.5% 수성 PVA 용액에 부가하고 300 rpm으로 교반하였다. 오일상에 Sudan III가 녹아있기 때문에 수중유형 유제는 적색을 나타내었다. 3분이 되었을 ?, 암모니아 또는 메틸아민을 상기 유제로 부가하였다. 상기 화학적 유발인자(암모니아 또는 에틸아민)은 유기용매 대비 1:0.5 또는 1:1 비율로 첨가하였다. 대조군으로는 유제에 아무것도 부가하지 않은 것을 사용하였다. 각 유제의 상태는 시간의 함수로 모니터링하였다.

붉은 색의 소수성 염료인 Sudan III를 메틸프로피오네이트에 녹인 후 물에 교반하여 o/w 유제를 형성하면 적색을 나타내었다. 이러한 결과는 소수성 염료인 Sudan III가 오일상에 녹아있기 때문이었다. 오일상을 구성하고 있는 유기용매가 제거되지 않는 한 유제는 계속 적색을 나타낼 것으로 판단하였다. 실제로, 아무런 화학적 유발인자를 넣어주지 않고 유제를 계속 교반만 시켜주는 대조군 시험 조건에서는 붉은 색의 o/w 유제가 지속적으로 관측되었다(도 6). 메틸프로피오네이트와 암모니아의 사용 몰비가 1:1인 경우에도 유사한 결과가 관측되었다. 하지만 메틸아민을 첨가하였을 때 유제의 색깔은 놀랍게도 5분 지났을 때 맑은 색으로 변하였다. 메틸프로피오네이트가 메틸아민에 의하여 분해 제거됨에 따라 Sudan III가 석출되어 비이커 기벽에 흡착되고 일부는 매우 작은 입자로서 수상에 분산됨에 따라 적색이 소실되면서 맑은 색깔을 띄게 되는 것이다. 만약 이러한 판단이 사실이라면, 유제 색깔의 변화속도는 o/w 유제에 첨가하는 메틸아민 용량에 영향을 받을 것으로 판단하였다. 실제로 사용한 메틸프로피오네이트 대비 0.5 당량의 메틸아민을 첨가해보았을 때, 예상대로 유제의 색깔변화 속도는 1 당량을 사용한 경우보다 낮게 관측되었다(도 7).

실시예 4: 광학현미경에 의한 다양한 유제 액적 /초기 미립자의 관찰

GC와 수단 III 염료 실험을 통해 메틸아민을 메틸프로피오네이트를 제거하는 화학적 유발인자로 사용할 수 있으며 이러한 기법을 활용하여 PLGA microspheres를 효과적으로 제조할 수 있을 것으로 기대하였다. 이에, PLGA를 메틸프로피오네이트에 녹인 분산상을 수상에 유화시켜 제조한 o/w 유제를 여러 조건에서 처리한 후 유제 status를 광학현미경을 사용하여 모니터링하였다.

구체적으로, PLGA (0.25 g)를 4 ml의 메틸프로피오네이트에 용해시키고, 이를 450 rpm 로 교반하면서 0.5% PVA 수성 용액에 부가하였다. 교반 3분이 지난 후 사용한 유기용매 대비 1:1 당량에 해당하는 암모니아 또는 메틸아민을 상기 수중유형 유제에 첨가하였다. 또 다른 대조군 시험에서는 아무런 화학적인 유발인자를 넣어주지 않고 계속 교반시켰다. 교반 1 시간 후, 상기 유제의 물리적인 상태를 model S16C 광학현미경(MiCro Scopes, Inc., St. Louis, MO, USA)을 사용하여 관찰하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 8a의 경우는 실험조건에서 명시한대로 o/w 유제를 만든 후 아무런 화학적 유발인자를 넣지 않고 1시간 지났을 때 유제 일부를 sampling하여 관측한 것이다. 이때 유제 액적은 교반을 멈추자 바로 융합되어 polymeric films/aggregates가 되었다. o/w 유제를 형성한 후 메틸프로피오네이트 대비 1:1 당량의 암모니아를 넣어주고 1시간 지났을 때도 유사한 현상이 관측되었다(도 8b). 이러한 결과들은 유제 droplets로부터 메틸프로피오네이트가 효과적으로 제거되지 않았기에 발생한 것이다. 이러한 결과들과 완전히 상충되게, 유제 제조를 위해 사용한 메틸프로피오네이트 대비 0.75 당량 이상의 메틸아민을 o/w 유제에 넣어주었을 때는 유제 droplets들은 opaque/dark image를 보여주었다(도 8 (c) 내지 (f)). 이러한 결과는 암모니아를 사용하였을 때는 유제방울이 미립자로 잘 경화되지 않음에 반해(도 8), 메틸아민을 사용하였을때는 메틸프로피오네이트가 손쉽게 분해되어 아주 효과적으로 수중유형 유제방울에 있는 메틸프로피오네이트를 제거하여 유제방울을 PLGA 미립자로 경화시켰음을 나타내는 것이다.

실시예 5: 스폰지와 같은 PLGA 미립자의 제조

0.25 g PLGA를 4 ml의 메틸프로피오네이트에 녹인 분산상을 30 ml의 0.5% aqueous PVA 용액에 유화시켰다. 이 때 유화를 위해 digital magnetic plate를 사용하여 수상을 450 rpm으로 교반시켰다. 3분이 지난 후 수중유형 유제에 메틸프로피오네이트 당량 대비 0.5 내지 1.5 당량에 해당하는 용량의 메틸아민을 첨가하였다. 1시간 교반 후 형성된 microsphere suspension을 dialysis bag에 넣어 준 후 1L의 물을 사용하여 8시간 동안 투석시켰다. 여과를 통해 수득한 미립자를 상온에서 밤새 건조하였다.

실시예 6: 미립자 형상의 관찰

Spongy microspheres 외부 및 내부의 형상을 SEM을 사용하여 관찰하였다. 미립자의 내부를 보기 위해서는 2가지 방법을 사용하였다. 미립자 표면쪽으로 치우친 내부 형상을 관찰하기 위하여 미립자를 금속 막대에 부착시킨 double-sided adhesive tape에 분산시켜 흡착 시킨 후 그 위에 새로운 adhesive tape를 눌러 압착시킨 후 떼어내었다. 이때 spongy microspheres의 표면 부분들이 벗겨져 내부 모습이 노출되었다. Spongy microspheres의 심층 내부를 보기 위해서는 미립자 샘플을 우선 에폭시 수지에 분산시켜 경화시킨 후 니퍼를 사용해 잘라주었다. 처리한 모든 미립자 샘플들을 platinum을 사용해 sputter-coating 시킨 후 SEM (model JSM-5200; Jeol Inc., MA, USA)으로 그들의 형상을 관찰하였다.

도 9는 본 연구에서 개발한 미립자 제조공정을 따라 제조한 전형적인 미립자의 내부를 보여주는 SEM 사진이다. 이러한 사진에서 확인할 수 있는 바와 같이 본 발명에 따른 제조방법을 사용하는 경우 극강의 공극성을 지닌 스폰지 PLGA microspheres를 효과적으로 제조할 수 있음을 증명하고 있다. 매우 놀라운 사실은 포로겐의 도움을 받는 w/o/w 유제 microencapsulation 공정을 사용하지 않고 단순한 o/w 유제를 기반으로 하는 제조공정을 사용하였음에도 불구하고 미립자의 다공성은 매우 뛰어나다는 것이다. 도 10에서는 본 발명에 따른 새로운 용매제거 기법에 근거한 스폰지와 같은 구조를 갖는 다공성의 PLGA microspheres 제조 기전을 보여주고 있다. PLGA를 녹인 메틸프로피오네이트 용액을 물에 유화시켜 o/w 유제를 제조한다. 연후에 수상에 첨가한 메틸아민이 유제의 분산상으로 확산되어 메틸프로피오네이트와 반응하여 메탄올과 N-메틸프로피온아마이드가 형성된다. 이들은 친수성 용매로서 PLGA에 대하여 반용매로 작용하여 유제 액적 내부는 수많은 작은 PLGA-rich domains과 PLGA-free anti-solvent domains로 나누어지게 된다. 메틸프로피오네이트가 점점 고갈되어짐에 따라 PLGA 침전으로 인해 미립자의 스폰지와 같은 골격구조가 형성되며, anti-solvents들이 수상으로 확산되어짐에 따라 미립자에는 수많은 공극들이 남게 되는 것이다. 대조적으로 유제방울을 대상으로 유기용매의 확산과 증발을 유도하는 대부분의 용매제거기법들은 비다공성 매트릭스를 지닌 미립자가 형성된다. 그 이유는 유제방울로부터 외상으로의 용매확산이 서서히 발생할 때 PLGA 침전 발생 전까지 유제방울이 지속적으로 수축되기 때문으로 추론할 수 있다.

o/w 유제에 첨가한 메틸아민의 용량이 스폰지 미립자 형상에 어떤 영향을 미치는지를 파악하기로 하였다. 사용한 메틸프로피오네이트 대비 0.5, 0.75, 1, 그리고 1.25 당량의 메틸아민을 사용하여 제조한 PLGA 미립자의 SEM micrographs를 관측하였다(도 11). Double adhesive tape을 사용하여 미립자의 표면을 떼어내었을 때 관측되는 미립자의 성상은 모두 스폰지 형태의 극도의 다공성을 보여주었다. 하지만 니퍼를 사용하여 미립자의 깊숙한 내부를 절단하여 관측하였을 때 미립자 내부는 메틸아민 사용량에 영향을 받음을 알 수 있었다. 즉 1:0.5 당량비의 경우 미립자의 심층 내부는 매트릭스 형상을 유지하였으며 외부쪽으로 치우친 지역에서는 스폰지 형상의 다공성를 보여주었다. 1:0.75 당량 비에서도 심층 내부의 일부는 매트릭스 형태를 보여주었지만 1:0.5 경우보다 그 도메인은 훨씬 감소되었다. 1:1 당량 비 이상에서는 미립자 내부에는 상당한 양의 매트릭스 도메인이 관측되지 않았으며 모든 내부에 공극이 균질하게 분포되어 있음을 알 수 있었다.

실시예 7: 열중량분석 ( TGA )

미립자를 제조한 후 잔류하는 유기용매에 대한 정보를 구하기 위해 열질량분석(TGA)를 실시하였다. 구체적으로, 미립자 샘플의 열적 동태를 조사하기 위해 Thermogravimetric analyzer (model Q50; TA Instruments, DE, USA)를 사용하였다. 미립자 샘플 (5.078 내지 9.483 mg)를 platinum pan 담았다. 30 °C에서 5분 동안 equilibrium 시킨 후 20 °C/min의 속도로 550 °C까지 온도를 올려주었다. 온도의 변화에 따른 시료 질량의 변화를 TA Universal Analysis 2000 software program을 통하여 자동적으로 측정하였다.

메틸프로피오네이트의 비점이 79 °C임을 고려하여 30 °C에서 150 °C 사이에 걸쳐 관측되는 질량변화를 TGA를 사용하여 측정하였고 그 결과를 도 10에 나타내었다. 도 10에서 확인할 수 있는 바와 같이, 1:0.5, 그리고 1:0.75 당량 반응조건을 사용하여 제조한 PLGA 미립자 경우 관측된 질량 감소는 1.32 내지 1.38%이었다. 1:1 이상의 당량 비에서는 잔류하는 유기용매의 양은 모두 0.40% 미만으로 관측되었다. 이러한 결과로부터, 본 발명에 따른 제조방법에서 사용되는 용매제거기법이 효과적이며, 동시에 매우 낮은 미립자 잔류용매 수준을 보여줌을 알 수 있었다.

본 발명에 따른 스폰지와 같은 구조를 갖는 다공성 고분자 미립자가 특별한 잔류유기용매 제거공정을 사용하지 않았음에도 불구하고 왜 상대적으로 매우 낮은 잔류유기용매를 함유하고 있는지에 대해 고찰해볼 필요가 있다. 에틸클로로아세테이트나 에틸플루오로아세테이트를 유기용매로 사용하고 암모니아를 사용한 가암모니아 반응 기반의 미립자 제조 공정을 통해 PLGA 미립자를 제조하였을 때에 미립자는 비다공성의 형상을 보여주었으며, 잔류하는 유기용매는 2.67% 이상이었다(참고문헌, 그리고 HY Im, H Sah, IJP). 이 경우 가암모니아 반응에 의해 생성되는 분해산물인 클로로아세타마이드의 융점 및 aqueous solubility가 각각 120 °C와 9%이어서 효과적으로 수상로 침출되지 않을 뿐만 아니라 또한 미립자의 비다공성 매트릭스가 그들의 침출을 억제할 것이다. 이에 비해 메틸아민과 메틸프로피오네이트의 반응으로 생성되는 N-메틸프로피온아마이드의 융점 및 물에 대한 용해도는 각각 -3 °C 및 19%이기 때문에 수상으로 훨씬 더 잘 침출/확산되어지는 경향을 보여준다. 또한 본 발명에 따른 미립자는 비다공성이고, 치밀한 매트릭스를 가지지 않고 다공성이 매우 높은 스폰지와 같은 구조 형상을 지니므로 손쉬운 잔류유기용매 제거가 가능하게 해주는 것으로 판단된다. 그러므로 이전에 발표한 ammonolysis-based microencapsulation을 통해 형성된 미립자보다 본 연구를 통해 제조한 미립자에 훨씬 적은 량의 잔류용매가 존재하게 되는 것이다.

실시예 8: 에틸셀룰로오스 및 에틸아민를 사용한 스폰지 같은 미립자의 제조(4cP)

0.25 g 에틸 셀룰로오스(toluene/ethanol 80:20 혼합액에 5% 농도로 녹였을 때 점도가 4 cP; 48% ethoxyl)를 4 ml의 메틸프로피오네이트에 녹인 분산상을 30 ml의 0.5% aqueous PVA 용액에 유화시켰다. 이 때 emulsification을 위해 digital magnetic plate를 사용하여 수상을 450 rpm으로 교반시켰다. 3분이 지난 후 o/w 유제에 에틸아민을 첨가하였다. 이때 사용한 메틸프로피오네이트와 에틸아민의 몰 당량비는 1:1이 되도록 해주었다. 1시간 교반 후 형성된 microsphere suspension을 dialysis bag에 넣어 준 후 1 liter water을 사용하여 8시간 동안 투석시켰다. 여과를 통해 수득한 미립자를 상온에서 밤새도록 건조하였다. 건조 후 미립자의 외부 및 내부 형상을 전자현미경을 사용하여 관찰하였다. 도 13에서 확인할 수 있는 바와 같이 에틸아민을 메틸프로피오네이트 분해를 위한 화학적 유발인자로 사용하였을 때 스폰지 형상의 다공성을 지닌 미립자를 제조할 수 있음을 증명하고 있다.

실시예 9: 에틸셀룰로오스 및 에틸아민를 사용한 스폰지 같은 미립자의 제조(10cP)

0.25 g 에틸셀룰로오스(toluene/ethanol 80:20 혼합액에 5% 농도로 녹였을 때 점도가 10 cP; 48% ethoxyl)를 4 ml의 메틸프로피오네이트에 녹인 분산상을 30 ml의 0.5% aqueous PVA 용액에 유화시켰다. 이 때 emulsification을 위해 digital magnetic plate를 사용하여 수상을 450 rpm으로 교반시켰다. 3분이 지난 후 o/w 유제에 에틸아민을 첨가하였다. 이때 사용한 메틸프로피오네이트와 에틸아민의 몰 당량비는 1:1이 되도록 해주었다. 1시간 교반 후 형성된 microsphere suspension을 dialysis bag에 넣어 준 후 1 liter water을 사용하여 8시간 동안 투석시켰다. 여과를 통해 수득한 미립자를 상온에서 밤새도록 건조하였다. 건조 후 미립자의 외부 및 내부 형상을 전자현미경을 사용하여 관찰하고 그 결과를 도 14에 나타내었다. 도 14에서 확인할 수 잇는 바와 같이, 에틸아민을 메틸프로피오네이트 분해를 위한 화학적 유발인자로 사용하였을 때 스폰지 형상의 다공성을 지닌 미립자가 제조되었으며, 실시예 8과 동일하지만 분자량(점도)이 다른 에틸셀룰로오스를 사용하더라도 본 발명에 따른 제조방법에 의해 아민류의 화학적 유발인자를 사용해 다공성 고분자 미립자를 제조할 수 있다.

실시예 10: 에틸아세테이트-물 2층 시스템에서의 수성 용매 농도의 모니터링

30 ml의 0.5% aqueous PVA 용액을 50 ml 크기의 beaker에 넣고 여기에 3.2 ml of the 40% 메틸아민 용액을 첨가하였다. 에틸아세테이트 4 ml을 조심스럽게 넣은 후 두 상이 섞이지 않도록 110 rpm으로 천천히 교반하였다. 교반을 50 분간 시킨 후 수층에서 0.2 ml의 수용액을 채취하여 200 mg MgSO₄와 10 ml의 부탄올을 넣어 vortexing 하였다. 이후 0.45 mm syringe filter를 사용하여 얻은 filtrate 0.4 ml에 0.2 ml의 내부표준 용액을 가하여 GC injection sample 용액으로 하였다. 위에서 사용한 내부 표준 용액은 이소프로판올 100 ml를 1.9 ml의 부탄올에 녹인 후 이를 부탄올로 10배 희석하여 제조하였다. 위의 실험을 메틸아민 대신 28% 암모니아 용액 2.5 ml을 가하여 시험하였다. 또한 메틸아민이나 암모니아를 전혀 넣지 않는 대조군 실험도 진행하였다. 이렇게 제조한 샘플들을 gas chromatography로 분석하였다.

도 15에서는 수상에 아무런 화학적 유발인자를 넣지 않는 경우 상당량의 에틸아세테이트가 물에 녹아 존재함을 보여주고 있다. 암모니아를 첨가한 경우에도 수상에는 높은 농도의 에틸아세테이트가 관측되었으며 아주 미미한 양의 에탄올 피크가 관측되었다. 이러한 결과는 에틸아세테이트는 암모니아에 의해 효과적으로 제거되지 않음을 보여준다. 하지만 메틸아민을 사용한 경우 수상에서는 에틸아세테이트가 거의 관측되지 않았으며 대신 높은 농도의 에탄올이 관측되었다. 즉 메틸아민과 에틸아세테이트간의 효과적인 반응에 의해 에탄올 분해산물이 잘 형성되었으며 이에 따라 에틸아세테이트를 손쉽게 제거할 수 있음을 보여준다.

실시예 11: 서로 다른 화학적 유발인자를 사용한 용매(에틸아세테이트) 제거 공정의 비교

소수성 염료인 Sudan III을 에틸아세테이트에 녹여 0.25 mg/ml 농도로 만들었다. 4 ml을 취하여 300 rpm의 속도로 교반되고 있는 0.5% PVA 수용액 30 ml에 넣어주었다. 이때 형성되는 o/w 유제는, 오일상에 Sudan III가 녹아있기 때문에, 적색을 나타내었다. 3분 경과 후, 에틸아세테이트 대비 1몰 당량의 암모니아 또는 메틸아민을 첨가한 후 시간의 경과에 따른 유제 상태를 관측하였다. 대조 시험으로서는 아무런 화학적 유발인자를 사용하지 않았다.

도 16에서는 아무런 화학적 유발인자를 넣어주지 않고 유제를 계속 교반만 시켜주는 대조군 시험 조건에서는 붉은 색의 o/w 유제가 지속적으로 관측되었다. 암모니아를 넣어주었을 때에도 유사한 결과가 관측되어, 붉은 색의 유제가 관측되었다. 하지만 메틸아민을 첨가하였을 때 5분 경과하였을 때 유제는 맑은 색으로 변하였다. 이는 곧 에틸아세테이트가 메틸아민에 의하여 분해 제거됨에 따라 Sudan III가 석출되어 비이커 기벽에 흡착되고 일부는 작은 입자로서 수상에 분산됨에 따라 붉은 색이 소실되면서 맑은 색깔을 띄게 되는 것이다. 즉 메틸아민은 에틸아세테이트를 제거하는 화학적 유발인자로서 아주 유용함을 증명하고 있다.

실시예 12: 서로 다른 화학적 유발인자를 사용한 용매(이소프로필 포르메이트 ) 제거 공정의 비교

소수성 염료인 Sudan III을 이소프로필 포르메이트에 녹여 0.25 mg/ml 농도로 만들었다. 4 ml을 취하여 300 rpm의 속도로 교반되고 있는 0.5% PVA 수용액 30 ml에 넣어주었다. 이때 형성되는 the o/w 유제는, oil phase에 Sudan III가 녹아있기 때문에, 적색을 나타내었다. 3 분 경과 후, 이소프로필 포르메이트 대비 1몰 당량의 암모니아, 메틸아민, 디메틸아민, 또는 에틸아민을 첨가한 후 시간의 경과에 따른 유제 상태를 관측하였다. 대조 시험으로서는 아무런 화학적 유발인자도 사용하지 않았다.

도 17에서 확인할 수 있는 바와 같이 메틸아민 뿐만 아니라 디메틸아민 그리고 에틸아민 역시 훌륭한 화학적 유발인자로서의 역할을 수행함을 보여주고 있다. 즉 유제방울에 있는 유기용매를 제거할 수 있는 능력을 지니고 있으며 이를 활용하여 미립자 경화 및 다공성 고분자 미립자를 제조할 수 있음을 제시하고 있다.

이상과 같이, 본 발명의 제조방법에 따르는 경우 종래의 다공성 고분자 미립자의 제조방법들과는 완전히 다르게, 포로겐의 도움 없이, 그리고 제약 산업에서 선호됨에도 불구하고 가암모니아 반응 등에서는 사용되기 어려운 메틸프로피오네이트, 에틸 아세테이트 등을 분산 용매로 사용하면서 아주 간단한 수중 유형 유제 기술로서 스폰지 유사 PLGA 미립자를 최초로 제조할 수 있었다. 그럼에도 불구하고, 기존의 다공성 PLGA 미립자들와 달리 수많은 공극 미립자 내부 및 외부에 골고루 분포해 있는 극도의 다공도를 나타내는 스폰지와 같은 구조를 갖는 PLGA 미립자를 제조할 수 있다.

Claims

(a) 폴리(디엔)류, 폴리(알켄)류, 폴리(아크릴)류, 폴리(메타크릴)류, 폴리(비닐에스터)류, 폴리(스티렌)류, 폴리(카보네이트)류, 폴리(에스터)류, 폴리(오르토에스터)류, 폴리(에르테라마이드)류, 폴리(안하이드라이드)류, 폴리(우레탄)류, 폴리(아마이드)류, 셀룰로오스 에테르류 및 셀룰로오스 에스터류로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 소수성 고분자를, 분산용매로서 메틸프로피오네이트, 에틸아세테이트, 프로필아세테이트, 이소프로필아세테이트, 프로필포르메이트 및 이소프로필포르메이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유기용매에 녹여 분산상을 제조하는 단계;
(b) 상기 단계 (a)에서 제조된 분산상을 수성 용매를 첨가하여 수중유(oil-in-water; O/W)형 유제를 제조하는 유제 제조 단계; 및
(c) 상기 단계 (b)에서 제조한 수중유형 유제에 메틸아민, 에틸아민 및 디메틸아민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화학적 유발인자를 첨가하여 상기 분산상 중의 고분자 및 분산용매와 반응시켜 수용성 분해 산물을 발생시키는 단계,
를 포함하는 스폰지 형상의 다공성 고분자 미립자의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 단계 (a)에서 제조된 분산상 내의 고분자 화합물의 농도가 3 내지 30 (w/v)%인, 다공성 고분자 미립자의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 단계 (b)에서의 분산상 : 분산용매의 부피비가 1:1 내지 1:100인 것인, 다공성 고분자 미립자의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 단계 (b)에서 사용되는 수성용매는 폴리비닐알코올을 포함하는 수용액인 것인, 다공성 고분자 미립자의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 분산용매 : 화학적 유발인자의 몰 비율이 1:0.25 내지 1:5인, 다공성 고분자 미립자의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 소수성 고분자는 폴리(에스터)류 및 셀룰로오스 에테르류로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인, 다공성 고분자 미립자의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 소수성 고분자는 PLGA 및 에틸셀룰로오스로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 것인, 다공성 고분자 미립자의 제조방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조되고, 공극을 가지며, 상기 공극들이 미립자 내에서 상호 연결된 열린 구조의 스폰지 형상을 가지는 것을 특징으로 하는, 스폰지 형상의 다공성 고분자 미립자.
제8항에 있어서, 상기 미립자의 직경은 20 내지 1000um인 것인, 스폰지 형상의 다공성 고분자 미립자.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 스폰지 형상의 다공성 고분자 미립자 및 생리활성물질을 포함하되, 상기 생리활성물질은 상기 고분자 미립자에 봉입된 것을 특징으로 하는 생리활성물질 전달용 조성물.
제10항에 있어서,
상기 생리활성물질은 바이오 거대분자 또는 소수성 약물인 것인, 생리활성물질 전달용 조성물.
제11항에 있어서,
상기 바이오 거대분자는 펩타이드, 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 단백질, DNA, RNA, 단일클론항체 또는 핵산인 것인, 생리활성물질 전달용 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 스폰지 형상의 다공성 고분자 미립자를 제조하는 단계; 및 상기 미립자에 생리활성물질을 봉입시키는 단계를 포함하는 생리활성물질 전달용 조성물의 제조방법.