KR101964883B1 - 한국 유아 분변 유래의 베타-갈락토시데이즈 활성이 우수한 신규 균주 비피도박테리움 애니멀리스 ldtm8101 - Google Patents

한국 유아 분변 유래의 베타-갈락토시데이즈 활성이 우수한 신규 균주 비피도박테리움 애니멀리스 ldtm8101 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유전자 재조합 효소를 식품 산업에 이용하는 타 발명들과는 다르게 베타-갈락토시데이즈(β-galactosidase) 활성이 높은 균주를 한국인 유아의 배설물로부터 분리하여 선발하고, 이를 통해 단백질 정제과정에서 다른 대장균을 이용한 재조합 단백질 정제과정보다 비용 및 시간을 더욱 줄인 것이다. 또한 이를 통해 유당불내증을 개선할 수 있는 유제품을 제조할 수 있도록 지원할 수 있다. 상기와 같은 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 한국생명공학연구원에 기탁번호 KCTC18613P로 기탁된 비피도박테리움 애니멀리스 신균주(LDTM 8101)를 제공함으로써 달성할 수 있으며, 특히, 배양액을 포함하는 유제품 조성물을 통해 달성할 수 있다.

Description

한국 유아 분변 유래의 베타-갈락토시데이즈 활성이 우수한 신규 균주 비피도박테리움 애니멀리스 LDTM8101{A novel strain Bifidobacterium animalis subsp. lactis LDTM8101 with high β-galactosidase activity derived from Korean infant feces}
본 발명은 한국 유아 분변 유래의 베타-갈락토시데이즈 활성이 우수한 신규 균주 비피도박테리움 애니멀리스 LDTM8101 (Bifidobacterium animalis subsp.lactis LDTM8101)에 관한 것으로, 지금까지 개발된 것들과 다른 특별한 생물활성 효과가 있는데, 특히 한국인 유아의 분변으로부터 분리해냄으로써 한국인의 장내 생존성 및 특정 생물활성 효과가 좋아 유산균 이용 가공식품 및 약품 개발에 크게 활용될 것으로 예상되며, 생물활성 중 베타-갈락토시데이즈 활성이 우수하여 면서도 내산성과 내담즙성이 뛰어난 점에 특징이 있고, 이 때문에 발효유 발균주 또는 프로바이오틱스 균주로 활용될 수 있다.
한국인의 80%는 유당불내증으로 고통받고 있다고 알려져 있다. 그런데, 유당불내증이란 소장의 유당분해효소 결핍 때문에 유당의 분해와 흡수가 충분히 이루어지지 않아 대장 내에서 유당은 수분을 흡인함과 동시에 대장의 세균성 유당분해에 의해 포도당 그리고 유산이 되며 이 때문에 대장의 연동운동이 자극되어 설사, 가스에 의한 장부만시에 복통 등의 증상을 일으키는 원인이 된다고 알려져있다. 이러한 유당불내증을 개선하기 위하여 지금까지는 유제품 속 유당(lactose)의 함량을 낮춰 주는 것이 가장 주된 해결방법으로 알려져있었고, 유당의 함량이 높을 경우 가당연유나 아이스크림 제조과정에서 모래알 씹는 식감을 일으키는 유당결정화의 원인이 되기도 한다. 베타-갈락토시데이즈(beta-galactosidase)는 식품산업 중에서 특히 유가공 관련하여 매우 중요한 효소로서, 유당 분해 뿐만 아니라 갈락토올리고당(galacto oligosaccharide)의 합성에 필요한 효소가 되기도 한다. 갈락토올리고당은 많은 기능성 뿐만 아니라 장내 비피더스균의 증식에 이용되는 프리바이오틱스로서 많이 알려져 있다.
일반적으로 비피도박테리아(Bifidobacterium spp.)는 장내에서 유래하는 세균으로서 식품으로서 안전한 것으로 인정되어 가공식품 산업에 많이 이용되고 있ㅇ으며, 비피도박테리아는 대표적인 프로바이오틱스 균주로써 대장증후군(IBS) 개선 효과, 염증성 장질환이나 궤양성 대장염, 건선, 피부염에 효과가 있다고 알려져 있고, 비만억제, 콜레스테롤 수치 감소 효과 등도 속속 발표되고 있으나 아직까지는 새로운 기능성을 가진 균주가 충분히 선발되어 활용되지 못하고 있는 실정이다.
공개특허공보 제10-2015-0095717호는 프랑스에서 개발된 비피도박테리움 애니멀리스 신균주 CNCM　I-4602에 관한 것으로서, 꼴렉씨옹 나씨오날 드 뀔뛰르 드 미크로오르가니즘에 기탁된 것으로, 소화관 이동성 및 장벽 무결성 기능을 촉진하기 위해 장 신경계를 조절할 수 있고, 특히 WO 2011/148219에 개시된 균주보다 VIP 수준을 더욱 증가된 새로운 박테리아 균주라고 하나, 베타-갈락토시데이즈에 관한 기능을 밝히지는 않고 있다.
하기의 연세대학교 대학원에서 1999년 12월 발표한 박테리오 파아지 λ Q vector를 지닌 재조합 균주의 β-galactosidase 최적 발현 조건에 관한 연구에서도 대장균 재조합균주를 이용하여 β-galactosidase 최적발현 조건을 연구한 것일뿐 유당불내증 예방 등에 직접 사용할 수 있는 천연 균주를 연구하지는 않았었다. 이처럼 종래에는 비피도박테리움 애니멀리스 신종 선발 또는 베타-갈락토시데이즈 발현에 대한 연구가 있었으나, 베타-갈락토시데이즈 활성이 뛰어나 산업에 적용할 만한 새로운 균주를 선발하는 일이 어려운 일이었다.
1. 공개특허공보 제10-2015-0095717호
1. 박사논문(박테리오 파아지 λ Q vector를 지닌 재조합 균주의 β-galactosidase 최적 발현 조건에 관한 연구, 1999.12. 연세대학교 대학원)
본 발명은 유전자 재조합 효소를 식품 산업에 이용하는 타 발명들과는 다르게 베타-갈락토시데이즈(β-galactosidase) 활성이 높은 균주를 한국인 유아의 분변으로부터 분리하여 선발하고자 한다. 이를 통해 단백질 정제과정에서 다른 대장균을 이용한 재조합 단백질 정제과정보다 비용 및 시간을 더욱 줄이고자 한다. 또한 이를 통해 유당불내증을 개선할 수 있는 유제품을 제조할 수 있도록 지원하고자 한다.
따라서 상기와 같은 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 한국생명공학연구원에 기탁번호 KCTC18613P로 기탁된 하기의 특징을 나타내는 비피도박테리움 애니멀리스 신균주 LDTM8101를 제공함으로써 달성할 수 있다.
(a) 서열번호 1의 염기서열을 가짐.
(b) 앰피실린, 카나마이신, 스트렙토마이신, 에리스로마이신, 테트라사이클린 및 클로람페니콜 항생제 내성이 없음.
(c) 용혈성 능력이 없음.
(d) pH 2에서 2시간 생존율이 92% 이상임.
(e) 베타-갈락토시데이즈 관련 유전자인 LacZ의 mRNA 발현량이 디에스엠 10140(DSM 10140)균주에 비해 높음.
(f) 베타-갈락토시데이즈 활성 최적 조건은 pH 6.0 및 온도 섭씨 37도시(℃)임.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 상기 비피도박테리움 애니멀리스 신균주 LDTM8101 배양액을 포함하는 조성물을 제공함으로써 달성할 수 있다.
본 발명에 의한 신균주는 한국인 유아의 분변으로부터 분리한 베타-갈락토시데이즈 활성이 우수한 비피도박테리움 애니멀리스 신균주(LDTM 8101)을 제공함으로써 유당 분해능이 우수한 유제품 가공에 사용할 수 있다. 또한, 상기 제공하는 신균주는 안정성과 장내생존율이 우수하여 프로바이오틱스의 특징을 가지고 있기 때문에 분말이나 테블렛형의 프로바이오틱스 제품으로 사용할 수 있고, 이 때문에 관련 의약품 개발, 사료 등 생물체 또는 그를 포함한 조성물로 다양한 용도에 활용될 수 있다.
도 1에서는 intracellular matrix의 효소활성 시험에서 베타-갈락토시데이즈 활성은 다른 균주들에 비해 LDTM8101 균주가 가장 높은 것을 확인할 수 있다.
도 2에서는 비피도박테리움 애니멀리스의 경우에는 Leucine arylamidase, α-Galactosidase, β-Galactosidase, α-Glucosidase 등의 효소활성이 높았고, 특히 LDTM 8101균주가 가장 좋은 특성을 가진 것으로 확인되었다
도 3은 Illumina, hiseq4000을 이용한 전체지놈시퀀스를 분석하는 방법을 도시한 것이다
도 4는 LDTM 8101 균주가 DSM 10140 균주와 공통적으로 총 4가지의 베타-갈락토시데이즈(β-galactosidase) 발현유전자 (bgaA, ebgA, lacZ, bgalIII)를 보유하고 있으며, 활성 또한 종래의 DSM 10140 균주에 비해 뛰어남을 확인할 수 있다.
도 5는 Quantitative real time PCR (qRT-PCR)을 이용하여 DSM 10140 과 LDTM 8101가 가지고 있는 베타-갈락토시데이즈(β-galactosidase) 관련 유전자와의 발현량을 도 5에서 비교하였다. 실험 결과, LDTM 8101 균주가 보유한 LacZ 유전자에서의 mRNA 발현량이 DSM 10140균주보다 높은 것을 확인하였다.
도 6은 DEAE-Sepharose Fast flow ion exchange chromatography와 NaCl (0.1-1 M) 용액으로 정제한 단백질 획분을 1ml씩 샘플링하였고 그 획분별 단백질 농도와 베타-갈락토시데이즈(β-galactosidase) 활성을 도 6에서 확인하였다. 그 결과, 15-18 획분에서 가장 베타-갈락토시데이즈(β-galactosidase) 활성이 높게 정제 되었음을 확인하였다.
도 7은 폴리아크릴아미드 겔전기영동(Polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)을 이용해 단백질 크기를 확인한 결과, 약 119 kDa로 단일 밴드가 뜨는 것을 확인한 것이다.
도 8은 효소활성의 최적 pH, 최적 배양온도 및 열안정성을 확인하기 위한 것으로 pH는 6에서, 온도는 37℃에서 활성이 높았다.
도 9는 금속이온이 효소활성에 미치는 영향을 확인하기 위해 시험한 것이다.
본 발명에서는 Bifidobacterium animalis subsp.lactis LDTM 8101 의 프로바이오틱스균주 기능성을 평가하기 위해 선발 이후에 항생제내성, 용혈성 등을 평가 하였고 내산성, 내담즙성 등 소화기관에서의 생존율을 평가하여 프로바이오틱스로 이용성을 검증하였다. 유전체분석을 통해서는 베타-갈락토시데이즈(β-galactosidase) 발현 유전자의 존재를 확인함으로써 상업적으로 활용할 수 있는 근거를 마련하고 확인하였다.
1. 한국인 유아 분변으로부터 유산균 분리
본 발명에서는 장내 유산균을 분리하기 위해 100일미만 한국인 영유아의 분변을 제공받아 이용하였다(IRB No.1605/003-006). 상기 유아의 분변으로부터 락토바실러스 속(lactobacillus spp .)과 비피도박테리움속(Bifidobacterium spp .) 균주를 선택 배지를 활용하여 분리하였다.
수집된 분변 시료는 0.85％ NaCl에 10배 단계 희석하여 0.02% sodium azide를 첨가한 De Man Rogosa, Sharpe agar (MRS broth; Difco, USA)와 50mg/L lithium mupirocin을 첨가한 TOS-propionate agar(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)에 도말하고 37℃의 온도에서 48시간 동안 혐기 배양하였다. 이후 배양에 따라 형성되는 콜로니(colony) 형태가 서로 다른 것으로부터 균주를 선발하였다. 상기 선발된 균주에 대해서는 MRS broth 와 BL broth에서 계대배양한 뒤 20% 글리세롤이 함유된 MRS broth와 BL broth에서 - 80℃의 온도로 동결하여 보관하였다.
정확한 동정을 위해 염기서열 분석회사인 (주)Macrogen에 16s rRNA sequencing을 의뢰한 결과, 표 1과 같이 락토바실러스 루테리 3종, 비피도박테리움 롱검 1종, 비피도박테리움 애니멀리스 3종 및, 비피도박테리움 비피덤 2종으로 확인되었고, 7번 항목의 LDTM 8101균주는 붙임 서열번호 1의 염기서열을 가진 것으로 분석되었다.
Figure 112017106139305-pat00001
2. 베타- 갈락토시데이즈 (β- galactosidase ) 활성이 우수한 균주 선발
상기 분리된 균주를 대상으로 베타-갈락토시데이즈(β-galactosidase)활성을 측정하였다. 측정은 colorimetric assay를 이용하여 선별하였다. β-galactosidase 활성 측정을 위한 colorimetric assay를 하기 위해 상기 선별한 균주를 broth에서 계대배양한 후, 상기 배양액 17,000g을 5분 동안 원심분리하여 상등액과 균체를 파쇄하여 효소액으로 사용하였다. 5 mM로 제조한 4-Nitrophenyl β-D- galactopyranoside (Sigma, USA)에 준비한 효소액을 넣고 20분 동안 37℃에서 반응시켰다. 차가운 0.5 M Na2CO3를 넣어서 반응을 중단한 뒤에 1분 동안 원심분리하여 405nm에서 흡광도를 측정하여 활성을 측정하였다. 그 결과, 도 1과 같이 베타-갈락토시데이즈(β-galactosidase)활성은 intracellular matrix의 효소활성에서 다른 균주들에 비해 LDTM 8101 균주의 활성이 가장 높은 것으로 나타났다.
3. 효소적 특성 평가 및 동정
API-ZYM kit (BioMetrieux Co. France)를 사용하여 생화학적 특성을 검토하였으며, 상기 동정한 비피도박테리움(Bifidobacterium spp.) 6종에 대하여 β-Galactosidase 등 19종의 효소 활성을 조사한 결과, 도 2와 같이 특히 비피도박테리움 애니멀리스의 경우에는 Leucine arylamidase, α-Galactosidase, β-Galactosidase, α-Glucosidase 등의 효소활성이 높았고, 특히 LDTM 8101균주가 가장 좋은 특성을 가진 것으로 확인되었다. 이를 기반으로 베타-갈락토시데이즈를 중심으로 심화 연구하였다.
4. 안전성 평가
가. 항생제 내성 시험
상기의 분리된 비피도박테리움속(Bifidobacterium spp.) 9종 균주에 대하여 항생제에 대한 내성 여부를 판단하기 위해서 microdilution method(CLSI, M07-A9)를 이용하였다. 이를 위해 계대배양한 균주를 2번 세척하여 준비한 뒤, 균체를 Mcfarland 1, O.D600에서 0.3이 되도록 2×LSM broth에 희석한 뒤, 다시 2×LSM broth에 300배 희석하여 준비하였다. 상기 준비한 희석액을 microplate에 100 ㎕씩 담고, 2배 단계 희석을 실시한 2×항생제 희석액을 100 ㎕씩 담는다. 이때 항생제는 Ampicillin, Kanamycin, Streptomycin, Erythromycin을 1 mg/L에서 128 mg/L까지 단계적으로 희석하여 준비하였다. 48시간 동안 혐기 배양한 뒤 Minimal inhibitory concentration을 확인하였다.
Microdilution method법 실험 결과, 분리된 9종의 균주 중 LDTM 8101은 항생제의 내성이 없음을 확인할 수 있었다. 이에 따라 비피도박테리움 애니멀리스 아종인 LDTM 8101 균주는 산업적으로 이용시 항생제 내성에 대한 안전성을 확인하였고, 2017년 9월 12일에 한국생명공학연구원 생물자원센터에 특허미생물 기탁하였다(미생물기탁번호 KCTC18613P).
Figure 112017106139305-pat00002
나. 용혈성 시험
용혈성 여부는 용혈성시험 배지를 이용한 클리어존(clear zone)을 확인하여 이루어졌다. Brain heart infusion 배지에 1 % (w/v) glucose, 0.03 % (w/v) L-arginine and 5 % (v/v) sheep blood를 추가하여 충분히 활성이 높은 균주를 스트레킹하고 24시간 배양 후 클리어존을 확인하였다. 확인 결과, 시험에 사용된 모든 균주는 용혈성 능력이 없음을 확인할 수 있었다.
Figure 112017106139305-pat00003
5. 내산성 시험
분리된 비피도박테리움(Bifidobacterium spp .) 6종 균주를 0.05% cysteine을 함유한 MRS broth에서 계대배양하여 내산성을 조사하였다. 배양액의 pH 변화에 따른 균의 생육 여부를 확인하기 위해 pH 2, 2.5, 3, 3.5으로 조절한 0.05% cysteine을 함유한 MRS broth를 준비하고, 세척한 균체를 2×106 CFU/ml이 되도록 접종하였다. 이후 2시간 동안 37℃온도에서 혐기 배양한 후 이를 다시 꺼내 생균수를 확인하는 방식으로 진행하였다. 상기 접종 후 2시간 뒤의 생균수를 조사함으로써 균주의 생존율을 측정, 비교하였다. 실험 결과, 비피도박테리움 애니멀리스 LDTM 8101(KCTC18613P)는 pH 2.0 내지 3.5의 강산환경에서도 매우 높은 생존율을 갖는 것을 확인할 수 있었는데, 이는 인체 내에서 분리한 균주이므로 장내 환경에서의 적응성이 우수한 것으로 판단되므로, 직접적으로 섭취하거나 생물 전환을 통해 간접적으로 상기 유산균을 섭취할 경우에 위와 같은 기능성을 기대할 수 있을 것으로 예상된다.
Figure 112017106139305-pat00004
6. 내담즙성 시험
대조군 2종과 함께 9종의 선발 균주를 0.05% cysteine을 함유한 MRS broth에서 계대배양하여 조사를 준비하였다. 배양액의 담즙산의 농도에 따른 균의 생육 여부를 확인하기 위해 0.2 %, 0.4 %, 0.6 %, 0.8 %, 1.0 %, 1.2 %, 1.4 %, 1.6 %으로 bovine bile을 포함한 0.05% cysteine을 함유한 MRS broth를 준비하였다. 세척한 균체를 2×106 CFU/ml 로 맞춘 후 100㎕씩 microplates에 접종한 뒤 48시간 동안 37℃에서 혐기 배양한 후에 MIC 농도를 측정하였다. 이를 통해 표 5와 같이, 4종의 비피도박테리아 애니멀리스 균주가 모두 0.8 % 이상의 bovine bile acid에서 정상적인 성장을 할 수 있음을 확인하였고, 담즙염분분해효소(bile salty hydrolase (BSH)) 활성도 확인하였다. 이는 십이지장에서 분비되는 비교적 강한 담즙에도 균주들이 내성을 가지고 있음이 확인된 것으로 선발된 LDTM8101(KCTC18613P)은 높은 생존률로 장내로 유입되어 효과적인 생균제로써 그 기능을 발휘 할 수 있음을 확인하였고, 유당불내증 개선 외의 다양한 제품으로 개발될 수 있을 것으로 판단된다.
Figure 112017106139305-pat00005
7. 전체지놈시퀀스 (Whole genome sequence)를 이용한 베타- 갈락토시데이즈 (β-galactosidase) 발현 유전자 동정 및 발현량 확인
도 3은 Illumina, hiseq4000을 이용한 전체지놈시퀀스를 분석하는 방법을 도시한 것이다. 본 발명에서는 상기 분석방법으로 분석한 선발된 9개의 균주 중 LDTM 8101(KCTC18613P)이 가장 효소 활성이 높았고, 프로바이오틱스로서의 안전성 및 기능성이 우수하였다. LDTM 8101(KCTC18613P) 균주에 관한 whole genome sequence 분석은 gDNA 추출 후 high throughpup sequencing pipelines를 이용해 얻은 raw sequence data를 FastQC를 이용해 확인하였다. 90%이상 base quality를 확인하였다. 총 2개의 contig를 얻었고, SOAPdenovo를 이용한 De novo analysis를 진행하여 최종적으로 1,923,647 bp의 scaffold를 얻었다. 마지막으로 genome annotation을 하여 LDTM 8101(KCTC18613P) 균주가 가지는 유전자를 확인할 수 있었다.
Bifidobacterium animalis subsp. lactis DSM 10140 균주는 잘 알려진 요거트 유래 균주로써 유제품에 함유된 lactose를 분해할 수 있는 베타-갈락토시데이즈(β-galactosidase)활성이 높은 것으로 알려져 있으며, 이미 전체 지놈시퀀싱이 완료되어 유전자 정보를 쉽게 얻을 수 있어 LDTM 8101과 대비하여 유전체분석이 용이하여 신균주 선발시 많이 사용되고 있다. 대비 시험결과, LDTM 8101은 DSM 10140 균주와 공통적으로 총 4가지의 베타-갈락토시데이즈(β-galactosidase) 발현유전자 (bgaA, ebgA, lacZ, bgalIII)를 보유하고 있으며, 활성 또한 종래의 DSM 10140 균주에 비해 뛰어남을 도 4와 같이 확인하였다. Quantitative real time PCR (qRT-PCR)을 이용하여 DSM 10140 과 LDTM 8101가 가지고 있는 베타-갈락토시데이즈(β-galactosidase) 관련 유전자와의 발현량을 도 5에서 비교하였다. 실험 결과, LDTM 8101 균주가 보유한 LacZ 유전자에서의 mRNA 발현량이 DSM 10140균주보다 높은 것을 확인하였다. 이는 LDTM8101균주가 DSM10140균주에 비해 베타-갈락토시데이즈 활성이 훨씬 뛰어남을 보여주는 근거이다.
8.베타 - 갈락토시데이즈 (β- galactosidase ) 정제
베타-갈락토시데이즈(β-galactosidase)를 정제하기 위해서 0.03% L-cysteine을 추가한 2L의 MRS 액체배지에 overnight 배양한 Bifidobacterium animalis subsp.lactis LDTM 8101(KCTC18613P) 배양액 1%를 접종하여 18시간 동안 37℃ 혐기배양하였다. 4000rpm으로 10분 동안 원심분리 후 균체를 회수하였다. 회수한 균체를 50mM sodium phosphate buffer (pH 7.0)로 세척하였다. 위의 조건으로 한번 더 세척을 한 후 셀 파쇄기를 이용해 세포벽을 파쇄하였다. 파쇄액을 다시 15,000rpm 으로 30분 원심분리 후 상층액은 조 추출액으로 이용하였다. 황산암모늄 포화 용액(0-90%)을 이용해 4 ℃에서 조추출액을 침전시킨 결과 40% 항산암모늄 침전 획분에서 가장높은 specific activity (34,786.43 unit/mg)가 관찰되었다.
Figure 112017106139305-pat00006
40% 침전 획분을 4℃에서 하루 투석한 후 DEAE-Sepharose Fast flow ion exchange chromatography의 column에 흡착시킨 후 NaCl (0.1-1 M) 용액을 이용해 도 6과 같이 순수한 베타-갈락토시데이즈(β-galactosidase)로 분리하였다.그 결과 5-10째 추출된 획분에서 단백질량이 높은 것을 확인하였으나 효소활성이 나타나지 않아 본 연구에서 타켓으로 하는 베타-갈락토시데이즈(β-galactosidase)는 없는것으로 확인하였다. 반면 15-18번째 획분에서 가장 높은 베타-갈락토시데이즈(β-galactosidase) 효소 활성이 있음을 알 수 있었다.
또한 정제된 획분을 폴리아크릴아미드 겔전기 영동(Polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)을 이용해 확인한 결과, 도 7과 같이 약 119 kDa인 베타-갈락토시데이즈(β-galactosidase)가 단일 밴드로 검출되는 것을 명확히 확인할 수 있었다. 결과적으로 약 10배의 정제도로 30,473.8 unit/ml의 단백질을 정제할 수 있었다.
한편, 베타 갈락토시데이즈 정제 단계별 실험결과는 다음 표 7과 같이 요약할 수 있다.
Figure 112017106139305-pat00007
9.베타 - 갈락토시데이즈 (β- galactosidase ) 최적활성 조건
효소활성 최적 pH는 50mM sodium phosphate buffer (pH 5.0-7.5)를 이용해 측정하였다. 37℃에서 20분간 배양한 후 효소활성을 측정한 결과, 도 8과 같이 pH 6에서 가장 높은 활성을 보였다. 최적배양 온도를 확립하기 위해 30℃ 내지 60℃ 조건에서 20분간 배양한 결과, 37℃에서 가장 활성이 높았고, 열안정성을 확인한 결과 37℃에서 1시간 동안 프리인큐베이션(preincubation) 시켰을 경우에 효소 활성은 약 80.43%로 확인되었다.
또한, 금속이온이 효소활성에 미치는 영향을 확인하기 위해 다양한 금속이온(KCl, NaCl, Na2SO4, MgSO4, CuSO4, FeSO4, CaCl2, MnSO4, MgCl2)을 1mM 포함한 50mM sodium phosphate buffer에서 효소 활성을 측정한 결과, 도 9와 같이 KCl, NaCl, Na2SO4, CuSO4에서는 활성이 저하되었지만, CaCl2(1.27 fold), MgSO4(2.43 fold), FeSO4(3.00 fold), MnSO4(2.75 fold), MgCl2(2.17 fold)에서는 증가한 것을 확인하였다.
이와 같이 본 연구에서는 한국인 유아 분변유래의 베타-갈락토시데이즈(β-galactosidase) 활성이 우수한 신규한 비피도박테리움 애니멀리스 LDTM8101을 선발하였으며, in vitro 수준에서 베타-갈락토시데이즈(β-galactosidase)의 최적 pH, 온도, 열안전성, 금속이온 등의 활성 조건을 확립하였다. 이를 통해 제품 개발시 scale up 하는 단계의 background data로서도 기술적 의미가 있다.
이상과 같이 비피도박테리움 애니멀리스 신균주(LDTM 8101) 배양액을 포함하는 조성물은 유제품 제조에 활용시 락토스를 분해하기 어려워 발생하는 유당불내증예방에 효과적으로 활용할 수 있을 것이 예상되며, 본 발명의 균주 또는 조성물은 위장불쾌감 또는 과민성대장증후군과 같은 위장 장해의 예방 및 감소에 사용할 수 있을 것이다.
한국생명공학연구원 KCTC18613P 20170912
<110> Seoul National University R&DB Foundation <120> A novel strain Bifidobacterium animalis subsp. lactis LDTM8101 with high beta-galactosidase activity derived from Korean infant feces <130> P17-018 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1366 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Bifidobacterium animalis subsp.lactis LDTM 8101 <400> 1 ccctggcagc ttgctgtcgg ggtgagagtg gcgaacgggt gagtaatgcg tgaccaacct 60 gccctgtgca ccggaatagc tcctggaaac gggtggtaat accggatgct ccgctccatc 120 gcatggtggg gtgggaaatg cttttgcggc atgggatggg gtcgcgtcct atcagcttgt 180 tggcggggtg atggcccacc aaggcgttga cgggtagccg gcctgagagg gtgaccggcc 240 acattgggac tgagatacgg cccagactcc tacgggaggc agcagtgggg aatattgcac 300 aatgggcgca agcctgatgc agcgacgccg cgtgcgggat ggaggccttc gggttgtaaa 360 ccgcttttgt tcaagggcaa ggcacggttt cggccgtgtt gagtggattg ttcgaataag 420 caccggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag ggtgcgagcg ttatccggat 480 ttattgggcg taaagggctc gtaggcggtt cgtcgcgtcc ggtgtgaaag tccatcgcct 540 aacggtggat ctgcgccggg tacgggcggg ctggagtgcg gtaggggaga ctggaattcc 600 cggtgtaacg gtggaatgtg tagatatcgg gaagaacacc aatggcgaag gcaggtctct 660 gggccgtcac tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg aacaggatta gataccctgg 720 tagtccacgc cgtaaacggt ggatgctgga tgtggggccc tttccacggg tcccgtgtcg 780 gagccaacgc gttaagcatc ccgcctgggg agtacggccg caaggctaaa actcaaagaa 840 attgacgggg gcccgcacaa gcggcggagc atgcggatta attcgatgca acgcgaagaa 900 ccttacctgg gcttgacatg tgccggatcg ccgtggagac acggtttccc ttcggggccg 960 gttcacaggt ggtgcatggt cgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg 1020 caacgagcgc aaccctcgcc gcatgttgcc agcgggtgat gccgggaact catgtgggac 1080 cgccggggtc aactcggagg aaggtgggga tgacgtcaga tcatcatgcc ccttacgtcc 1140 agggcttcac gcatgctaca atggccggta caacgcggtg cgacacggtg acgtggggcg 1200 gatcgctgaa aaccggtctc agttcggatc gcagtctgca actcgactgc gtgaaggcgg 1260 agtcgctagt aatcgcggat cagcaacgcc gcggtgaatg cgttcccggg ccttgtacac 1320 accgcccgtc aagtcatgaa agtgggtagc acccgaagcc ggtggc 1366

Claims (3)

  1. 한국생명공학연구원에 기탁번호 KCTC18613P로 기탁된 하기의 특징을 나타내는 비피도박테리움 애니멀리스 신균주 LDTM8101
    (a) 서열번호 1의 염기서열을 가짐.
    (b) 앰피실린, 카나마이신, 스트렙토마이신, 에리스로마이신, 테트라사이클린 및 클로람페니콜 항생제 내성이 없음.
    (c) 용혈성 능력이 없음.
    (d) pH 2에서 2시간 생존율이 92% 이상임.
    (e) 베타-갈락토시데이즈 관련 유전자인 LacZ의 mRNA 발현량이 디에스엠 10140(DSM 10140)균주에 비해 높음.
    (f) 베타-갈락토시데이즈 활성 최적조건은 pH 6.0 및 온도 섭씨 37도시(℃)임.
  2. 청구항 1의 비피도박테리움 애니멀리스 신균주 LDTM8101 배양액을 포함하는 조성물
  3. 삭제
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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1. 박사논문(박테리오 파아지 λ Q vector를 지닌 재조합 균주의 β-galactosidase 최적 발현 조건에 관한 연구, 1999.12. 연세대학교 대학원)
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