KR101963329B1 - 컴파운드 k가 다량 함유된 홍삼 가수분해 농축액의 제조방법 및 이로부터 수득된 홍삼 가수분해 농축액을 함유하는 조성물 - Google Patents
컴파운드 k가 다량 함유된 홍삼 가수분해 농축액의 제조방법 및 이로부터 수득된 홍삼 가수분해 농축액을 함유하는 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 컴파운드 K(Compound K)가 다량 함유된 홍삼 가수분해 농축액의 제조방법 및 이로부터 수득된 홍삼 가수분해 농축액을 함유하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 의해 제조된 홍삼 가수분해 농축액은 컴파운드 K를 다량 함유하고 있어, 이를 유효성분으로 함유하는 조성물은 우수한 인지 능력 개선 효과, 신경 세포 보호 효과를 발휘한다.
Description
본 발명은 컴파운드 K(compound K)가 다량 함유된 홍삼 가수분해 농축액의 제조방법 및 이로부터 수득된 홍삼 가수분해 농축액을 함유하는 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 홍삼 농축액을 가수분해하여 컴파운드 K가 다량 함유된 홍삼 가수분해 농축액을 수득하고, 이를 유효성분으로 함유하는 인지 능력 개선용, 신경 세포 보호용 조성물에 관한 것이다.
인삼(Panax ginseng)은 오갈피나무과(Araliaceae)에 속하는 다년생 초본류로서, 한방에서는 그 뿌리를 인삼(Ginseng Radix)이라 하며 강장(强壯), 강정(强精), 조혈(造血), 보온(保溫), 건위(健胃), 피로회복, 정신안정, 진정작용 등의 효능이 있는 것으로 알려져 있다.
최근에는 많은 효능을 나타내는 인삼의 성분에 대한 많은 연구가 진행되어 그 유효성이 밝혀지고 있는데, 주요 약리성분은 인삼 조사포닌이 4~10% 수준으로 가장 많으며, 산성 다당체, 폴리아세틸렌, 알칼로이드, 리그닌, 페놀성 화합물 등이 보고되고 있다. 인삼에 포함되어 있는 많은 약리성분 중 특히 인삼 사포닌(ginsenoside)은 인삼의 가장 중요한 약리 성분으로 알려지고 있다. 인삼 사포닌(ginsenoside)은 크게 PPD(protopananxadiol)계 진세노사이드 (Rb1, Rb2, Rb3, Rc, Rd)와 PPT(protopanaxatriol)계 진세노사이드(Re, Rf, Rg1, Rg2)로 나눌 수 있다. PPD계에 속하는 진세노사이드는 중추신경 진정효과, 진정작용, 항염 및 진통 등에 효과가 있고, PPT계 진세노사이드는 피로회복, 운동 근력 증진 및 콜레스테롤 감소 효과 등의 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 그러나 진세노사이드는 그 자체가 활성을 나타낸다고 하기 보다는 섭취 후 장내 세균에 의해 사포닌이 대사되고 그 대사체가 흡수되어 약리적 효능을 발휘한다. 이렇게 사포닌의 우수한 약리 활성이 연구에 의해 검증됨에 따라 사포닌 생성을 위한 연구가 활발히 진행되고 있다.
한편, 홍삼은 수삼을 박피를 하지 않은 상태에서 증기로 찌고 건조시키는 증숙의 과정을 반복하여 만든 가공된 인삼을 말한다. 홍삼은 담황갈색 혹은 담적갈색을 띠는 시각적인 차이뿐만 아니라 건조 과정이 수분이 증발되어 단위 g당 생리활성물질의 함량이 매우 높은 특징이 있다.
한편, 홍삼으로부터 특정 진세노사이드의 함량을 증가시키는 기술로, 대한민국 등록특허 제10-1523490호 (특정 진세노사이드 함량이 증가된 홍삼 초미세 분말의 제조방법), 대한민국 등록특허 제10-1093680호 (특정 진세노이드 함량이 증진된 홍삼 추출물의 제조방법), 대한민국 등록특허 제10-1198266호 (양성자 빔 조사를 통해 진세노사이드 Rb 1 및 Rc의 함량을 증진시킨 홍삼), 대한민국 등록특허 제10-1171038호 (사포닌 함량이 증진된 홍삼환의 제조방법)가 있다.
본 발명은 컴파운드 K(compound K)가 다량 함유된 홍삼 가수분해 농축액의 제조방법 및 이로부터 수득된 홍삼 가수분해 농축액을 함유하는 인지 기능 개선용, 신경 세포 보호용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 홍삼 농축액과 펙티나아제(Pectinase)를 7 : 2의 중량비로 물에 희석하는 단계 (A); 상기 단계 (A) 후, 55~60℃에서 10~72시간 반응시키는 단계 (B); 및 상기 단계 (B) 후, 고형분 함량이 60% 이상이 되도록 농축하여 홍삼 가수분해 농축액을 제조하는 단계 (C);를 포함하는 것을 특징으로 하는 컴파운드 K(compound K)가 다량 함유된 홍삼 가수분해 농축액의 제조방법을 제공한다. 본 발명에 의해 제조된 홍삼 가수분해 농축액은 일반 홍삼 농축액에 거의 없는 진세노사이드 F2, 컴파운드 K가 다량 증진되어, 본 발명에 따르면 홍삼으로부터 컴파운드 K를 다량 함유하고 있는 홍삼 가수분해 농축액을 제조할 수 있다.
한편, 본 발명에 있어서, 상기 홍삼 농축액은, 바람직하게 물, 주정 또는 물과 주정의 혼합물을 추출 용매로 하여 추출된 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 물, 주정 또는 물과 주정의 혼합물을 추출 용매로 하여 추출된 것을 고형분 함량이 60% 이상이 되도록 농축하여 제조된 것이다.
또한, 상기 주정은, 바람직하게 알코올 농도가 20~80% (v/v)인 것이 좋다.
또한, 상기 홍삼은, 바람직하게 홍미삼이 3중량% 이상인 것이 좋다.
한편, 본 발명은 홍삼 농축액과 펙티나아제(Pectinase)를 7 : 2의 중량비로 물에 희석한 것을 55~60℃에서 10~72시간 반응시킨 후, 고형분 함량이 60% 이상이 되도록 농축하여 제조된 컴파운드 K가 다량 함유된 홍삼 가수분해 농축액을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 인지 능력 개선용 식품 또는 건강기능식품 조성물을 제공한다. 본 발명의 홍삼 가수분해 농축액은 일반 홍삼 농축액에 거의 없는 진세노사이드 F2, 컴파운드 K가 다량 증진되어, 더욱 우수한 인지 능력 개선 효과를 발휘한다.
한편, 본 발명은 홍삼 농축액과 펙티나아제(Pectinase)를 7 : 2의 중량비로 물에 희석한 것을 55~60℃에서 10~72시간 반응시킨 후, 고형분 함량이 60% 이상이 되도록 농축하여 제조된 컴파운드 K가 다량 함유된 홍삼 가수분해 농축액을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 인지 능력 개선용 약학 조성물을 제공한다. 본 발명의 홍삼 가수분해 농축액은 일반 홍삼 농축액에 거의 없는 F2, 컴파운드 K가 다량 증진되어, 더욱 우수한 인지 능력 개선 효과를 발휘한다.
한편, 본 발명은 홍삼 농축액과 펙티나아제(Pectinase)를 7 : 2의 중량비로 물에 희석한 것을 55~60℃에서 10~72시간 반응시킨 후, 고형분 함량이 60% 이상이 되도록 농축하여 제조된 컴파운드 K가 다량 함유된 홍삼 가수분해 농축액을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 신경 세포 보호용 식품 또는 건강기능식품 조성물을 제공한다. 본 발명의 홍삼 가수분해 농축액은 일반 홍삼 농축액에 거의 없는 F2, 컴파운드 K가 다량 증진되어, 더욱 우수한 신경 세포 보호 효과를 발휘한다.
한편, 본 발명은 홍삼 농축액과 펙티나아제(Pectinase)를 7 : 2의 중량비로 물에 희석한 것을 55~60℃에서 10~72시간 반응시킨 후, 고형분 함량이 60% 이상이 되도록 농축하여 제조된 컴파운드 K가 다량 함유된 홍삼 가수분해 농축액을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 알츠하이머 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 본 발명의 홍삼 가수분해 농축액은 일반 홍삼 농축액에 거의 없는 진세노사이드 F2, 컴파운드 K가 다량 증진되어, 더욱 우수한 알츠하이머 예방 또는 치료 효과를 발휘한다.
한편, 본 발명의 식품 또는 건강기능식품 조성물은, 바람직하게 육류, 곡류, 카페인 음료, 일반음료, 초콜렛, 빵류, 스넥류, 과자류, 피자, 젤리, 면류, 껌류, 아이스크림류, 비타민 복합제 및 그 밖의 건강보조식품류 중 선택되는 어느 하나인 것인 것이 좋으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 식품 또는 건강기능식품 조성물은, 바람직하게 식품 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 담체, 부형제 및 희석제는 예를 들면, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케니트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 톨리돈, 물, 꿀, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유일 수 있다. 제제화할 경우 보통 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 식품 또는 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제(치즈, 초콜렛 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에도 천연 과일 쥬스 및 과일 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
한편, 본 발명의 약학 조성물은 본 발명의 컴파운드 K가 다량 함유된 홍삼 가수분해 농축액 이외에 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 더욱 포함할 수 있다. 사용가능한 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유가 있으며, 이들은 1종 이상 사용될 수 있다. 또한, 예방 및 치료제가 약제인 경우 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제 등이 추가적으로 포함될 수 있다.
한편, 본 발명의 약학 조성물의 제형은 사용방법에 따라 바람직한 형태일 수 있으며, 특히 사용한 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 채택하여 제형화 하는 것이 좋다. 구체적인 제형의 예로는 경고제(PLASTERS), 과립제(GRANULES), 리니멘트제(LINIMENTS), 리모나데제(LEMONADES), 산제(POWDERS), 시럽제(SYRUPS), 액제(LIQUIDS AND SOLUTIONS), 에어로솔제(AEROSOLS), 엑스제(EXTRACTS), 엘릭실제(ELIXIRS), 유동엑스제(FLUIDEXTRACTS), 유제(EMULSIONS), 현탁제(SUSPESIONS), 전제(DECOCTIONS), 침제(INFUSIONS), 정제(TABLETS), 좌제(SUPPOSITIORIES), 주사제(INJECTIONS), 주정제(SPIRITS), 카타플라스마제(CATAPLSMA), 캅셀제(CAPSULES), 트로키제(TROCHES), 틴크제(TINCTURES), 파스타제(PASTES), 환제(PILLS), 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀 중 선택되는 어느 하나일 수 있다.
한편, 본 발명의 약학 조성물의 투여량은 그 제제 형태, 투여 방법, 사용 목적 및 이것에 적용되는 환자의 연령, 체중, 증상에 따라서 적절히 설정되고, 일정하지 않지만 일반적으로 제제 중에 함유되는 유효성분의 양은 성인 1일당 예컨대 10 mg~2000 mg/kg이다. 물론 복용량은, 각종 조건에 의해서 변동하기 때문에, 상기 투여량보다 적은 양으로 충분한 경우도 있고, 또는 범위를 초과하여 필요한 경우도 있다.
본 발명에 따르면, 컴파운드 K가 다량 함유된 홍삼 가수분해 농축액을 제조할 수 있고, 이를 유효성분으로 함유하는 조성물은 우수한 인지 능력 개선 효과, 신경 세포 보호 효과를 발휘한다.
도 1은 홍삼 가수분해 농축액(HRGE)과 홍삼 농축액(RGE)의 항산화 활성을 확인한 결과이다. 'A'는 홍삼 농축액의 DPPH 라디칼 소거 활성, 'B'는 홍삼 가수분해 농축액의 DPPH 라디칼 소거 활성, 'C'는 홍삼 농축액의 ABTS 라디칼 소거 활성, 'D'는 홍삼 가수분해 농축액의 ABTS+ 라디칼 소거 활성 측정 결과이다.
도 2는 컴파운드 K의 항산화 활성을 확인한 결과이다. 'A'는 DPPH 라디칼 소거 활성, 'B'는 ABTS+ 라디칼 소거 활성, 'C'는 철이온 환원능 실험 결과이다.
도 3은 컴파운드 K가 과산화지질(MDA) 함량에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
도 4는 홍삼 가수분해 농축액(HRGE), 홍삼 농축액(RGE)의 신경 세포 보호 활성능을 확인한 결과이다.
도 5는 컴파운드 K의 신경세포 보호 활성능을 확인한 결과이다.
도 6은 컴파운드 K의 미토콘드리아 막 손상 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 7은 컴파운드 K의 활성산소종 소거능을 확인한 결과이다.
도 8은 컴파운드 K의 활성산소종 소거능을 'Immunocytochemical analysis'를 통해 확인한 결과이다.
도 9는 컴파운드 K가 Nrf2 발현 양에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
도 10은 컴파운드 K가 ARE 활성에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
도 11은 컴파운드 K가 항산화 효소계인 NQO1, HO-1, GR 발현량에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
도 12는 컴파운드 K가 NQO1의 발현에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
도 13은 SnPP 처리에 따른 컴파운드 K의 세포 보호 활성 정도를 확인한 결과이다.
도 14는 Y-미로 실험을 통하여 본 발명의 홍삼 가수분해 농축액(HRGE)의 인지능력 개선 효과를 확인한 결과이다. 'RGE'는 홍삼 농축액, 'HRGE'는 홍삼 가수분해 농축액, 'CK'는 컴파운드 K를 의미한다.
도 15는 모리스 수조 미로 실험을 통하여 본 발명의 홍삼 가수분해 농축액(HRGE)의 인지능력 개선 효과를 확인한 결과이다. 'RGE'는 홍삼 농축액, 'HRGE'는 홍삼 가수분해 농축액, 'CK'는 컴파운드 K를 의미한다.
도 16은 수동회피능력 실험을 통하여 본 발명의 홍삼 가수분해 농축액(HRGE)의 인지능력 개선 효과를 확인한 결과이다. 'RGE'는 홍삼 농축액, 'HRGE'는 홍삼 가수분해 농축액, 'CK'는 컴파운드 K를 의미한다.
도 17은 Nrf2 유전자가 결여된 쥐 (Nrf2 knockout mice)에서 본 발명의 홍삼 가수분해 농축액(HRGE), 컴파운드 K의 인지 개선 효과를 확인한 결과이다. 'A'는 Y-미로 실험, 'B'는 모리스 수조 미로 실험, 'C'는 수동회피능력 실험에 대한 결과이다. 또한, 'HRGE'는 홍삼 가수분해 농축액, 'CK'는 컴파운드 K를 의미한다.
도 18은 본 발명의 홍삼 가수분해 농축액(HRGE)이 뇌조직에 미치는 영향을 확인한 결과이다. 'Control'은 대조군, 'RGE'는 홍삼 농축액 300 mg/kg BW 투여군, 'HRGE-low'는 홍삼 가수분해 농축액 50 mg/kg BW 투여군, 'HRGE-med'는 홍삼 가수분해 농축액 100 mg/kg BW 투여군의 광학현미경 사진이다. 또한, 점선 박스는 스코폴라민 투여에 영향을 받는 CA1 부위이다.
도 2는 컴파운드 K의 항산화 활성을 확인한 결과이다. 'A'는 DPPH 라디칼 소거 활성, 'B'는 ABTS+ 라디칼 소거 활성, 'C'는 철이온 환원능 실험 결과이다.
도 3은 컴파운드 K가 과산화지질(MDA) 함량에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
도 4는 홍삼 가수분해 농축액(HRGE), 홍삼 농축액(RGE)의 신경 세포 보호 활성능을 확인한 결과이다.
도 5는 컴파운드 K의 신경세포 보호 활성능을 확인한 결과이다.
도 6은 컴파운드 K의 미토콘드리아 막 손상 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 7은 컴파운드 K의 활성산소종 소거능을 확인한 결과이다.
도 8은 컴파운드 K의 활성산소종 소거능을 'Immunocytochemical analysis'를 통해 확인한 결과이다.
도 9는 컴파운드 K가 Nrf2 발현 양에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
도 10은 컴파운드 K가 ARE 활성에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
도 11은 컴파운드 K가 항산화 효소계인 NQO1, HO-1, GR 발현량에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
도 12는 컴파운드 K가 NQO1의 발현에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
도 13은 SnPP 처리에 따른 컴파운드 K의 세포 보호 활성 정도를 확인한 결과이다.
도 14는 Y-미로 실험을 통하여 본 발명의 홍삼 가수분해 농축액(HRGE)의 인지능력 개선 효과를 확인한 결과이다. 'RGE'는 홍삼 농축액, 'HRGE'는 홍삼 가수분해 농축액, 'CK'는 컴파운드 K를 의미한다.
도 15는 모리스 수조 미로 실험을 통하여 본 발명의 홍삼 가수분해 농축액(HRGE)의 인지능력 개선 효과를 확인한 결과이다. 'RGE'는 홍삼 농축액, 'HRGE'는 홍삼 가수분해 농축액, 'CK'는 컴파운드 K를 의미한다.
도 16은 수동회피능력 실험을 통하여 본 발명의 홍삼 가수분해 농축액(HRGE)의 인지능력 개선 효과를 확인한 결과이다. 'RGE'는 홍삼 농축액, 'HRGE'는 홍삼 가수분해 농축액, 'CK'는 컴파운드 K를 의미한다.
도 17은 Nrf2 유전자가 결여된 쥐 (Nrf2 knockout mice)에서 본 발명의 홍삼 가수분해 농축액(HRGE), 컴파운드 K의 인지 개선 효과를 확인한 결과이다. 'A'는 Y-미로 실험, 'B'는 모리스 수조 미로 실험, 'C'는 수동회피능력 실험에 대한 결과이다. 또한, 'HRGE'는 홍삼 가수분해 농축액, 'CK'는 컴파운드 K를 의미한다.
도 18은 본 발명의 홍삼 가수분해 농축액(HRGE)이 뇌조직에 미치는 영향을 확인한 결과이다. 'Control'은 대조군, 'RGE'는 홍삼 농축액 300 mg/kg BW 투여군, 'HRGE-low'는 홍삼 가수분해 농축액 50 mg/kg BW 투여군, 'HRGE-med'는 홍삼 가수분해 농축액 100 mg/kg BW 투여군의 광학현미경 사진이다. 또한, 점선 박스는 스코폴라민 투여에 영향을 받는 CA1 부위이다.
이하, 본 발명의 구성을 하기 실시예를 통해 구체적으로 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
[제조예 1: 홍삼 농축액 제조]
양질의 홍삼 동체 및 홍미삼을 선별한 후, 홍삼 동체와 홍미삼이 50:50의 무게 비율이 되도록 하여 원료를 준비하였다. 추출 용매로는 주정 (알코올 농도 50%)을 사용하였고, 추출 용매를 원료 중량대비 약 8배수로 첨가한 후, 8시간 동안 추출하였다. 추출은 총 4회 수행되었으며, 추출된 액을 10℃ 이하가 되도록 냉각 처리한 다음 원심분리기를 이용하여 수득된 상등액을 고형분 함량이 60% 이상이 되도록 감압농축기로 농축하여 홍삼 농축액을 제조하였다.
[실시예 1: 홍삼 가수분해 농축액의 제조]
상기 제조예 1에서 제조된 홍삼 농축액 7중량%, 펙티나아제(pectinase) 2중량%를 물에 희석한 후, 57℃에서 24시간 동안 반응시켰다. 반응이 종료된 후, 고형분 함량이 65%가 되도록 감압농축하였다.
[실험예 1: 홍삼 가수분해 농축액의 진세노사이드 함량 분석]
본 실험예에서는 상기 실시예 1에서 제조된 홍삼 가수분해 농축액(HRGE)과 상기 제조예 1에서 제조된 홍삼 농축액(RGE)의 진세노사이드의 함량을 분석하고자 하였다.
상기 실시예 1에서 제조된 홍삼 가수분해 농축액, 상기 제조예 1에서 제조된 홍삼 농축액 각 1 g을 물 100 ㎖에 녹이고 수포화 부탄올 60 ㎖로 3회 걸쳐 추출한 후, 부탄올 분획을 농축시켜 수득된 농축물을 메탄올에 용해시켜 고압액체크로마토그래피를 통하여 함량을 분석하고, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
(단위: mg/g dry matter)
실험결과, 홍삼 가수분해 농축액이 가수분해 전 홍삼 농축액에 비하여, F2, Rh2, 컴파운드 K(compound K)의 함량이 크게 증가하였고, Rb1, Rb2, Rc, Rd, Rg3s는 감소함을 확인할 수 있었다.
[실험예 2: 항산화 활성 확인]
본 실험예에서는 상기 실시예 1에서 제조된 홍삼 가수분해 농축액(HRGE), 상기 제조예 1에서 제조된 홍삼 농축액(RGE), 본 발명의 홍삼 가수분해 농축액에 다량 함유된 컴파운드 K(Compound K)의 항산화 활성을 확인하고자 하였다.
(1) 홍삼 가수분해 농축액, 홍삼 농축액의 항산화 활성 확인
상기 실시예 1에서 제조된 홍삼 가수분해 농축액, 상기 제조예 1에서 제조된 홍삼 농축액의 항산화 활성을 확인하였다 (Kim, H.J., et al., Antioxidant activity of glyceollins derived from soybean elicited with Aspergillus sojae. J Agric Food Chem, 2010. 58(22): p. 11633-8.).
확인 결과, 홍삼 가수분해 농축액 및 홍삼 농축액 모두 1, 3, 5, 7, 10 mg/㎖ 농도에서 농도 의존적으로 DPPH, ABTS+(양이온) 라디칼 소거 활성을 보임을 확인할 수 있었다 (도 1). 도 1은 홍삼 가수분해 농축액(HRGE)과 홍삼 농축액(RGE)의 항산화 활성을 확인한 결과이다. 'A'는 홍삼 농축액의 DPPH 라디칼 소거 활성, 'B'는 홍삼 가수분해 농축액의 DPPH 라디칼 소거 활성, 'C'는 홍삼 농축액의 ABTS 라디칼 소거 활성, 'D'는 홍삼 가수분해 농축액의 ABTS+ 라디칼 소거 활성 측정 결과이다.
(2) 컴파운드 K의 항산화 활성 확인
컴파운드 K의 항산화 활성을 확인하고자, 컴파운드 K 1~5 mM 농도에서 DPPH, ABTS+ 라디칼 소거 활성, 철이온 환원능을 확인하였다 (라디칼 소거 활성 실험 참고 문헌 :Kim, H.J., et al., Antioxidant activities of licorice-derived prenylflavonoids. Nutr Res Pract, 2012. 6(6): p. 491-8., 철이온 환원능 실험 참고 문헌 : Benzie, I.F. and J.J. Strain, The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of "antioxidant power": the FRAP assay. Anal Biochem, 1996. 239(1): p. 70-6.).
확인 결과, 컴파운드 K는 1~5 mM 농도에서 DPPH, ABTS+ 라디칼 소거 활성, 철이온 환원능을 나타냄을 확인할 수 있었다 (도 2). 도 2는 컴파운드 K의 항산화 활성을 확인한 결과이다. 'A'는 DPPH 라디칼 소거 활성, 'B'는 ABTS+ 라디칼 소거 활성, 'C'는 철이온 환원능 실험 결과이다.
(3) 컴파운드 K가 과산화지질 함량에 미치는 영향 확인
쥐의 뇌 균질액을 사용하여 지질과산화의 지표성분인 MDA(malondialdehyde)의 농도를 측정하여, 컴파운드 K가 과산화지질 함량에 미치는 영향을 확인하였다 (Rao, A.R., et al., Antioxidant activity of Botryococcus braunii extract elucidated in vitro models. J Agric Food Chem, 2006. 54(13): p. 4593-9.).
확인 결과, 산화제인 FeCl3 처리에 의해 증가되었던 MDA 농도가 컴파운드 K(compound K) 처리에 의해 유의적으로 감소됨을 확인할 수 있었다 (도 3). 도 3은 컴파운드 K가 과산화지질(MDA) 함량에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
[실험예 3: 신경세포 보호 활성 확인]
본 실험예에서는 상기 실시예 1에서 제조된 홍삼 가수분해 농축액(HRGE), 상기 제조예 1에서 제조된 홍삼 농축액(RGE), 본 발명의 홍삼 가수분해 농축액에 다량 함유된 컴파운드 K(Compound K)의 신경세포 보호 활성을 확인하고자 하였다.
(1) 홍삼 가수분해 농축액, 홍삼 농축액의 세포 보호 활성 확인
마우스 해마 유래의 HT22 세포에 글루타메이트(glutamate)로 세포 사멸을 유도하고, 홍삼 농축액 (0, 10, 50, 100, 250 ㎍/㎖), 홍삼 가수분해 농축액 (0, 10, 50, 100, 250 ㎍/㎖)을 각각 처리한 후, 세포 보호 활성을 확인하였다 (Zakarova, A., et al., Garlic sprouting is associated with increased antioxidant activity and concomitant changes in the metabolite profile. J Agric Food Chem, 2014. 62(8): p. 1875-80.).
확인 결과, 도 4에서 확인되는 바와 같이, 홍삼 농축액은 250 ㎍/㎖ 농도에서, 홍삼 가수분해 농축액은 50, 100, 250 ㎍/㎖ 농도에서 세포 보호 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다 (도 4). 도 4는 홍삼 가수분해 농축액(HRGE), 홍삼 농축액(RGE)의 신경 세포 보호 활성능을 확인한 결과이다.
(2) 컴파운드 K의 세포 보호 활성 확인
마우스 해마 유래의 HT22 세포에 글루타메이트(glutamate)로 세포 사멸을 유도하고, 컴파운드 K (0, 1, 2, 4, 8 μM)를 각각 처리한 후, 세포 보호 활성을 확인하였다.
확인 결과, 컴파운드 K를 8 μM 농도로 처리 시 세포 사멸을 유도하지 않은 대조군과 비슷한 세포 생존능을 나타냄을 확인할 수 있었다 (도 5). 도 5는 홍삼 컴파운드 K의 신경세포 보호 활성능을 확인한 결과이다.
(3) 컴파운드 K의 미토콘드리아 막 손상 억제 효과 확인
세포 사멸시 미토콘드리아 막전위의 탈분극 현상이 일어나므로, JC-1을 HT22 세포에 적재한 후 미토콘드리아의 막전위를 관찰하였다. JC-1은 미토콘드리아에 적재되어 막전위에 탈분극이 일어나면, 모노머(monomer)가 방출되어 붉은색/초록색의 비율이 감소한다 (Zhou, X., et al., Resveratrol regulates mitochondrial reactive oxygen species homeostasis through Sirt3 signaling pathway in human vascular endothelial cells. Cell Death Dis, 2014. 5: p. e1576.).
확인 결과, 글루타메이트(Glutamate) 처리에 의한 세포 독성으로 붉은색/초록색의 비율이 감소하고, 컴파운드 K(compound K) 처리 시 그 비율이 회복됨을 확인할 수 있었다 (도 6). 상기와 같은 결과로부터, 컴파운드 K 처리가 글루타메이트에 의해 유발된 미토콘드리아 막 손상을 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 도 6은 컴파운드 K의 미토콘드리아 막 손상 억제 효과를 확인한 결과이다.
[실험예 4: 컴파운드 K의 신경세포 보호능 확인]
본 실험예에서는 본 발명의 홍삼 가수분해 농축액에 다량 함유된 컴파운드 K(Compound K)의 신경세포 보호능을 확인하고자 하였다.
(1) 활성산소종 소거능 확인
HT22 세포에서 글루타메이트(glutamate)로 ROS (reactive oxygen species, 활성산소종) 생성을 유도한 후, 컴파운드 K(compound K)의 세포 내 소거능을 확인하였다 (Kang, Y., et al., Cellular protection using Flt3 and PI3Kalpha inhibitors demonstrates multiple mechanisms of oxidative glutamate toxicity. Nat Commun, 2014. 5: p. 3672.).
확인결과, 도 7에서 확인되는 바와 같이, 컴파운드 K 처리시 유의적으로 ROS가 감소됨을 확인할 수 있었다 (도 7). 도 7은 컴파운드 K의 활성산소종 소거능을 확인한 결과이다.
또한, 'Immunocytochemical analysis'를 통해 HT22 세포를 관찰한 결과, 컴파운드 K 처리에 의해 활성산소종이 제거됨을 확인할 수 있었다 (도 8). 도 8은 컴파운드 K의 활성산소종 소거능을 'Immunocytochemical analysis'를 통해 확인한 결과이다.
(2) Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) 발현 양 확인
해마-유래 신경세포에 산화적 스트레스를 유발하여 컴파운드 K(compound K)를 (0, 8 μM) 처리한 후, 항산화 효소계 및 해독관련 효소계의 전사인자인 Nrf2의 양을 확인하였다 (Kim, H.J., et al., Neuroprotective effects of dehydroglyasperin C through activation of heme oxygenase-1 in mouse hippocampal cells. J Agric Food Chem, 2012. 60(22): p. 5583-9.).
Nrf2는 다양한 항산화 효소계 및 해독관련 효소계의 전사인자로서 핵 내 농도가 증가하면 세포의 항산화 능력을 증가시키는 것으로 간주된다.
확인 결과, 컴파운드 K를 8 μM 처리하였을 때, Nrf2(Nuclear factor erythroid 2-related factor 2)는 핵 내에 다량 축적되었고, 세포질의 Nrf2 양은 감소하였다. 상기와 같은 결과로부터, 컴파운드 K가 세포 내 유발된 산화적 스트레스를 감소시킴을 확인할 수 있었다 (도 9). 도 9는 컴파운드 K가 Nrf2 발현 양에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
(3) ARE-리포터 어세이(ARE-reporter assay)
루시퍼라제 리포터(Luciferase reporter) 유전자와 함께 ARE(antioxidant response element) 유전자가 도입되어 있는 HT22-ARE 세포에 컴파운드 K(compound K)를 1, 2, 4, 8 μM 처리한 후, ARE 유전자의 전사활성을 확인하였다 (Saw, C.L., et al., Pharmacodynamics of ginsenosides: antioxidant activities, activation of Nrf2, and potential synergistic effects of combinations. Chem Res Toxicol, 2012. 25(8): p. 1574-80.).
확인 결과, 컴파운드 K(compound K)를 1, 2, 4, 8 μM 처리하였을 때, ARE 유전자의 전사활성이 증가됨을 확인할 수 있었다 (도 10). 핵 내 Nrf2 농도의 증가와 더불어, ARE-리포터 어세이(ARE-reporter assay)에서 리포터(reporter)의 활성이 증가한 것은 컴파운드 K(compound K) 처리 시 핵 내의 Nrf2가 항산화 효소계 전사를 실제로 촉진함을 의미한다. 도 10은 컴파운드 K가 ARE 활성에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
(4) 항산화 효소계인 NQO1, HO-1, GR 발현량 확인
컴파운드 K가 항산화 효소계인 NQ01, HO-1, GR 발현량에 미치는 영향을 확인하였다 (Kim, H.J., et al., Nrf2-mediated induction of phase 2 detoxifying enzymes by glyceollins derived from soybean exposed to Aspergillus sojae. Biotechnol J, 2011. 6(5): p. 525-36.).
HT22 세포에 컴파운드 K(Compound K)를 1, 2, 4, 8 μM 농도로 처리하였을 때, 대표적인 항산화 효소계인 NQO1 (NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1), HO-1 (heme oxygenase 1), GR (glutathione reductase)의 발현량이 처리 농도에 따라 증가함을 확인할 수 있었다 (도 11). 도 11은 컴파운드 K가 항산화 효소계인 NQO1, HO-1, GR 발현량에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
또한, 컴파운드 K는 NQO1의 발현 증가뿐만 아니라 활성도도 증가시킴을 확인할 수 있었다 (도 12). 도 12는 컴파운드 K가 NQO1의 발현에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
(5) SnPP 처리에 따른 컴파운드 K의 세포 보호 활성 정도 확인
HT22 세포를 HO-1 저해제인 SnPP로 전처리 (10, 20, 40 μM)하고 컴파운드 K(compound K) 및 글루타메이트(glutamate)를 처리하여 SnPP 처리에 따른 컴파운드 K의 세포 보호 활성 정도를 확인하였다 (Kim, H.J., et al., Neuroprotective effects of dehydroglyasperin C through activation of heme oxygenase-1 in mouse hippocampal cells. J Agric Food Chem, 2012. 60(22): p. 5583-9.).
확인 결과, 컴파운드 K의 세포 보호 활성이 SnPP 처리에 의하여 감소됨을 확인할 수 있었다 (도 13). 도 13은 SnPP 처리에 따른 컴파운드 K의 세포 보호 활성 정도를 확인한 결과이다.
[실험예 5: 동물모델계 인지능력 개선 효능 평가]
본 실험예에서는 상기 실시예 1에서 제조된 홍삼 가수분해 농축액(HRGE), 상기 제조예 1에서 제조된 홍삼 농축액(RGE), 본 발명의 홍삼 가수분해 농축액에 다량 함유된 컴파운드 K(Compound K)의 동물모델계 인지능력 개선 효능 평가를 수행하였다.
하기에서 스코폴라민(Scopolamine) (1 mg/kg BW)으로 유도된 단기기억상실 동물 모델 (C57BL/6 mice, male)을 활용하여, 다양한 행동실험을 진행함으로써, 홍삼 가수분해 농축액의 기억력 및 공간지각능력에 미치는 영향을 평가하였다.
(1) Y-미로 실험
Y-미로 실험은 Kim의 문헌을 참고하여 수행되었다 (Kim, M.H., J.Y. Seo, and J.S. Kim, Artemisia annua L. extract ameliorates galactose-induced cognitive impairment in mice. Food Science and Biotechnology, 2015. 24(5): p. 1901-1905.).
스코폴라민(Scopolamine) 투여로 인해 감소된 행동변경 능력이 컴파운드 K (5, 10 mg/kg BW), 홍삼 가수분해 농축액 (100, 300 mg/kg BW), 홍삼 농축액 (300 mg/kg BW) 급여에 의해 향상됨을 확인할 수 있었다 (도 14). 도 14는 Y-미로 실험을 통하여 본 발명의 홍삼 가수분해 농축액의 인지능력 개선 효과를 확인한 결과이다. 'RGE'는 홍삼 농축액, 'HRGE'는 홍삼 가수분해 농축액, 'CK'는 컴파운드 K를 의미한다.
(2) 모리스 수조 미로 실험
모리스 수조 미로 실험은 Lee의 문헌을 참고하여 수행되었다 (Lee, J.S., et al., Hippocampal memory enhancing activity of pine needle extract against scopolamine-induced amnesia in a mouse model. Scientific Reports, 2015. 5.).
스코폴라민(Scopolamine) 투여로 인해 감소된 공간 학습 및 기억 능력이 컴파운드 K (5, 10 mg/kg BW), 홍삼 가수분해 농축액 (50, 100, 300 mg/kg BW), 홍삼 농축액 (300 mg/kg BW)의 급여에 의해 향상됨을 확인될 수 있었다 (도 15). 도 15는 모리스 수조 미로 실험을 통하여 본 발명의 홍삼 가수분해 농축액의 인지능력 개선 효과를 확인한 결과이다. 'RGE'는 홍삼 농축액, 'HRGE'는 홍삼 가수분해 농축액, 'CK'는 컴파운드 K를 의미한다.
(3) 수동회피능력 실험
수동회피능력 실험은 Jiang의 문헌을 참고하여 수행되었다 (Jiang, B., et al., P7C3 Attenuates the Scopolamine-Induced Memory Impairments in C57BL/6J Mice. Neurochem Res, 2015.).
스코폴라민(Scopolamine) 투여로 인해 감소된 학습 능력이 컴파운드 K (5, 10 mg/kg BW), 홍삼 가수분해 농축액 (50, 100, 300 mg/kg BW), 홍삼 농축액 (300 mg/kg BW) 급여에 의해 향상됨을 확인할 수 있었다 (도 16). 도 16은 수동회피능력 실험을 통하여 본 발명의 홍삼 가수분해 농축액의 인지능력 개선 효과를 확인한 결과이다. 'RGE'는 홍삼 농축액, 'HRGE'는 홍삼 가수분해 농축액, 'CK'는 컴파운드 K를 의미한다.
(4) Nrf2 유전자가 결여된 쥐 (Nrf2 knockout mice)에서의 실험
상기 (1)~(3)와 같이 시료 급여에 의한 학습/기억력 개선 현상은 Nrf2 유전자가 결여된 쥐(Nrf2 knockout mice)에서는 관찰되지 않았다. 즉, 시료의 인지 기능 개선 효과는 항산화 효소계 유도를 통해 진행됨을 확인할 수 있었다 (도 17). 도 17은 Nrf2 유전자가 결여된 쥐 (Nrf2 knockout mice)에서 본 발명의 홍삼 가수분해 농축액 (HRGE), 컴파운드 K의 인지 개선 효과를 확인한 결과이다. 'A'는 Y-미로 실험, 'B'는 모리스 수조 미로 실험, 'C'는 수동회피능력 실험에 대한 결과이다. 또한, 'HRGE'는 홍삼 가수분해 농축액, 'CK'는 컴파운드 K를 의미한다.
[실험예 6: 뇌조직에 미치는 영향 확인]
본 실험예에서는 조직학적 분석을 통해 상기 실시예 1에서 제조된 홍삼 가수분해 농축액(HRGE), 상기 제조예 1에서 제조된 홍삼 농축액(RGE), 본 발명의 홍삼 가수분해 농축액에 다량 증가된 컴파운드 K(compound K)가 뇌조직에 미치는 영향을 확인하고자 하였다.
스코폴라민(Scopolamine)과 홍삼 농축액 (300 mg/kg BW), 홍삼 가수분해 농축액 (50, 100, 300 mg/kg BW), 컴파운드 K (5, 10 mg/kg BW)를 급여한 쥐의 뇌를 적출하여, 고정한 후, 마이크로톰(microtome)으로 5 ㎛ 두께의 절편을 만들어 헤마톡실린&에오신(haematoxylin and eosin)으로 염색 (H&E stain) 후 광학현미경으로 관찰하여 해마 내 세포핵의 배열 및 조직의 형태학적 변형을 관찰하였다.
확인 결과, 스코폴라민(Scopolamine) 투여 후 뚜렷한 해마 조직 변형이 컴파운드 K, 홍삼 가수분해 농축액 급여 후 크게 감소됨을 확인할 수 있었다 (도 18). 즉, 홍삼 가수분해 농축액(compound K 함유) 급여군에서 기억/학습력 및 인지능에 중요한 뇌 부위인 해마의 손상 정도가 매우 낮음을 확인할 수 있었다. 도 18은 본 발명의 홍삼 가수분해 농축액의 뇌조직에 미치는 영향을 확인한 결과이다. 'Control'은 대조군, 'RGE'는 홍삼 농축액 300 mg/kg BW 투여군, 'HRGE-low'는 홍삼 가수분해 농축액 50 mg/kg BW 투여군, 'HRGE-med'는 홍삼 가수분해 농축액 100 mg/kg BW 투여군의 광학현미경 사진이다. 또한, 점선 박스는 스코폴라민 투여에 영향을 받는 CA1 부위이다.
Claims (8)
- 홍삼 동체 및 홍미삼으로 이루어진 홍삼을 알코올 농도 20~80%(v/v)의 주정으로 추출한 후 고형분 함량이 60% 이상이 되도록 농축하여 홍삼 농축액을 제조한 후, 상기 홍삼 농축액과 펙티나아제(Pectinase)를 7 : 2의 중량비로 물에 희석하는 단계 (A);
상기 단계 (A) 후, 55~60℃에서 24시간 반응시키는 단계 (B); 및
상기 단계 (B) 후, 고형분 함량이 60% 이상이 되도록 농축하여 홍삼 가수분해 농축액을 제조하는 단계 (C);로 이루어지며,
상기 홍삼 가수분해 농축액은 진세노사이드 F2, Rh2 및 컴파운드 K(compound K)의 함량이 증대되는 반면, 진세노사이드 Rd의 함량은 감소되며, 인지능력 개선효과 및 신경세포 보호효과가 있는 것을 특징으로 하는 컴파운드 K(compound K)가 다량 함유된, 인지능력개선 및 신경세포보호용 홍삼 가수분해 농축액의 제조방법.
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 홍삼은,
홍미삼이 3중량% 이상인 것을 특징으로 하는 컴파운드 K(compound K)가 다량 함유된, 인지능력개선 및 신경세포보호용 홍삼 가수분해 농축액의 제조방법. - 삭제
- 삭제
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-
2016
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Patent Citations (1)
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