KR101960928B1 - 백신으로부터 항원을 단리하고 정량하기 위한 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 가용한 항원 표준의 부재에서 백신 조성물에서 항원을 정량하기 위한 향상된 방법의 개발에 관계한다. 더욱 구체적으로, 본 발명에서는 백신 조성물로부터 항원을 분리하는 신속하고 견고한 방법을 제시하고, 이들 방법은 세정제 없이 및 알킬화 없이 항원을 용해화하는 단계, 산성화를 이용하여 항원 아류형이 다시 결합하는 것을 예방하는 단계, 항원 아류형을 크로마토그래피로 단리하는 단계, 그리고 용리된 항원을 아미노산 분석으로 정량하는 단계를 포함한다. 본 발명의 방법은 다양한 항원과 함께 이용에 적용가능하고, 따라서 현재의 백신 제조의 분야에서 향상된 방법을 제공한다.

Description

백신으로부터 항원을 단리하고 정량하기 위한 방법{METHODS FOR ISOLATING AND QUANTIFYING ANTIGEN FROM VACCINES}

관련된 출원

본 출원은 2011년 4월 21일자 제출된 U.S. 특허가출원 일련 번호 61/477,835에 우선권을 주장하고, 이것은 본원에 전체로서 참고문헌으로 포함된다.

기술 분야

전반적으로, 본 발명은 백신, 그리고 공지된 표준 없이 백신에서 항원을 단리하고 항원 함량을 측정하기 위한 방법의 분야에 관계한다.

배경

일반적으로, 인플루엔자 바이러스는 그들의 핵단백질 항원과 매트릭스 단백질 항원 사이에 항원성 차이에 기초하여, 3가지 유형으로 나눠진다: A, B, 그리고 C. 인플루엔자 바이러스는 2가지 주요 바이러스 표면 당단백질, 혈구응집소 (HA) 및 뉴라미니다아제 (NA)의 항원성 성질에 따라, 아류형으로 더욱 나눠진다. HA와 NA 둘 모두 항원성 에피토프를 보유한다. HA와 NA에 대하여 생성되는 항체는 인간과 동물에서 감염 및/또는 질환에 대한 내성과 연관된다. 인플루엔자에 대한 백신접종의 효능은 백신 내에 면역원성 HA의 양에 의해 거의 결정된다. 따라서 인플루엔자 A와 B 바이러스의 주요 항원성 결정인자는 HA이고, 그리고 인플루엔자에 대한 백신접종의 효능은 백신 내에 면역원성 HA의 양, 다시 말하면, 항원 함량에 의해 거의 결정된다.

현재까지, 항원 함량은 항원 값, 예를 들면, 백신의 HA 함량의 결정에 이용되는, World Health Organization 협력 센터 (이하, "WHO")에 의해 제공된 국제 표준으로 측정된다. 하지만, 종종, 백신은 표준이 가용하지 않을 때, 예를 들면, 바이러스 항원의 상이한 계절적 균주 사이에 항원성 차이 (즉, 상대적으로 낮은 상동성)가 존재할 때, 또는 표준이 아직 가용하지 않은 바이러스의 범유행성 발생이 존재할 때, 백신 제조업체에 의해 제조된다.

이런 범유행성 발생은 2009년 4월에 발생하였는데, 이때 초기에 "돼지 독감"으로 불렸던, 인간, 돼지, 그리고 조류 독감으로부터 유전자를 합동하는 진화된 신규한 독감 균주인 범유행성 인플루엔자 A/California/07/2009 H1N1이 멕시코, 미합중국, 그리고 여러 다른 국가에서 발생하였다. 이러한 특정 사례에서, WHO가 H1 항원에 대한 가용한 표준을 확보하기 이전에, 백신이 필요하였다. 2009년 9월에, US Food and Drug Administration는 2009 H1N1 인플루엔자 바이러스에 대한 4가지 백신을 승인하였다. 하지만, 이들 백신의 개발의 시점에서, 새로운 백신에서 HA를 정량하는데 가용한 WHO 표준이 여전히 없었다.

수십년 동안, 인플루엔자 백신의 HA 함량은 World Health Organization (WHO) 협력 센터에 의해 제공된 국제 표준으로, 단일 원 면역확산법 (SRID 또는 SRD)을 이용하여 검정되었다. 이들 국제 표준은 백신의 항원 값, 예를 들면, HA 함량의 결정에 이용된다. SRID에서, 인플루엔자 비리온은 세정제에 의해 파괴되고, 그리고 실온에서 3일 동안 항체-적하된 아가로즈 겔에서 면역확산이 수행된다. 겔 염색 직후에, 항원-항체 복합체의 침전 지대 직경이 측정되고, 그리고 일정한 아류형의 바이러스 제조물의 항원 함량은 공지된 HA 함량을 갖는 이러한 아류형의 완전한 바이러스 참고 배치로 획득된 보정 곡선을 이용함으로써 계산된다. 하지만, SRID는 힘들고 처리량이 적은 검정법이다. 게다가, 특히 비-정제된 (공정중) 인플루엔자 바이러스에 대한 민감도, 정확도, 그리고 정밀도가 상대적으로 낮다.

Kapteyn 등 (Vaccine 24:3137-44, 2006; "Kapteyn")은 인플루엔자 바이러스 배양액에서 HA의 정량뿐만 아니라 삼가 백신에서 개별 인플루엔자 균주로부터 HA의 확인을 위한 RP-HPLC 검정법을 발표하였다. 하지만, Kapteyn의 방법은 표준 없이, HA를 정량하지 못하였다. 부가적으로, Kapteyn은 항원을 용해화하기 위한 세정제, 그리고 반응성 설피드릴 기를 갖는 단백질이 재-결합하고 복합체를 형성하는 것을 예방하기 위한 알킬화를 이용하였다. 실제로, Kapteyn의 방법에서, HA는 강한 세정제의 이용을 통해 막을 용해함으로써 완전하게 단리되었다. 또한, Kapteyn의 방법은 포르말린-비활성화된 인플루엔자 균주로부터 HA를 정량하는데 적합하지 않은 것으로 설명된다.

따라서 현재까지 당분야는 가공되지 않은 또는 정제된 HA 샘플에서, 특히 세정제 또는 알킬화제로 가공 처리되지 않은 샘플에서, 그리고 WHO 협력 센터에 의해 제공되는 바와 같은 HA 단백질 표준의 부재에서, HA 항원 농도를 정확하고 효율적으로 결정하기 위한 방법을 개시하지 않는다. 명백히, WHO 협력 센터로부터 항원 표준이 가용하기 이전에, 백신 제조 동안 HA와 같은 바이러스 항원을 비롯한 항원의 신뢰성 있는 단리와 정량을 위한 견고하고 정확하고 신속한 방법이 당분야에서 강하게 요구된다. 하기 개시는 이런 방법의 세부 사항을 기술한다.

요약

본원에서 기술된 방법은 가용한 항원 표준의 부재에서 백신 내에 항원 함량을 측정하는 수단을 제공하기 위해 개발되었다. 이런 이유로, 본 발명은 국제 표준의 필요 없이 백신 개발과 제조 공정 동안 백신 내에 항원 농도의 신속하고 정확한 정량에 관련된 당분야의 하나 또는 그 이상의 요구를 해결한다. 따라서 본원에서 제공된 방법은 백신 제조업체가 WHO가 표준을 개발하고 제공하기를 기다리지 않으면서, 공중에게 전달될 수 있는 백신을 더욱 빠르게 생산할 수 있도록 한다.

더욱 구체적으로, 본 발명은 표준의 이용 없이, 백신 항원을 단리하고 정확하게 정량하는 신속하고 견고한 방법을 제시하고, 이들은 정확하고 재현가능하다. 본 발명은 다양한 항원과 함께 이용에 적용가능하고, 따라서 현재의 백신 제조의 분야에서 향상된 방법을 제공한다.

본 발명은 백신 조성물로부터 항원을 단리하기 위한 방법을 제시하고, 이들 방법은 (a) 백신 조성물에서 항원을 세정제 없이 및 알킬화제 없이 용해화하고; 그리고 (b) 항원 또는 항원 아류형을 분별에 의해 단리하는 단계를 포함한다.

일부 양상에서, 용해화 단계는 환원에 의해 수행된다. 일부 양상에서, 환원은 백신 조성물을 디티오트레이톨로 처리하는 것을 포함한다. 일부 양상에서, 환원은 약 5분 내지 약 20시간의 배양 시간을 포함한다. 다른 양상에서, 환원은 약 30분 내지 약 2시간의 배양 시간을 포함한다. 더욱 특정한 양상에서, 환원은 약 1시간의 배양 시간을 포함한다. 추가의 양상에서, 환원은 약 20℃ 내지 약 100℃의 배양 온도를 포함한다. 다양한 양상에서, 환원은 약 50℃ 내지 약 90℃의 배양 온도를 포함한다. 일정한 양상에서, 환원은 약 85℃에서 배양 온도를 포함한다. 추가의 양상에서, 환원 단계는 pH-제어된다. 다양한 양상에서, 환원은 약 pH 6 내지 약 pH 11의 pH에서 수행된다. 특정한 양상에서, 환원은 약 pH 7 내지 약 pH 10의 pH에서 수행된다. 추가의 양상에서, 용해화 단계는 무질서유발제로 변성을 더욱 포함한다. 다양한 양상에서, 무질서유발제는 구아니딘 염산염, 요소, 티오요소, 리튬, 과염소산염, 또는 티오시아네이트이다. 추가의 양상에서, 환원은 분리된 항원 아류형 간에 이황화 결합 형성을 예방하기 위한 항원 또는 항원 아류형의 산성화에 의해 더욱 수행된다. 다양한 양상에서, 산성화는 인산, 염산, 황산, 트리플루오르아세트산, 펜타플루오르프로피온산, 헵타플루오르부티르산, 또는 포름산으로 수행된다.

일부 양상에서, 분별은 크로마토그래피에 의해 수행된다. 다양한 양상에서, 크로마토그래피는 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 역상 HPLC (RP-HPLC), 이온 교환-HPLC (IEX-HPLC), 친화성 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC), 또는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)이다. 예시적인 양상에서, 크로마토그래피는 역상 (RP)-HPLC이다.

더 나아가, 본 발명은 백신 조성물에서 항원 또는 항원 아류형 함량을 정량하기 위한 방법을 제시한다. 이런 방법은 항원 또는 항원 아류형을 정량하는 추가의 단계를 갖는, 백신 조성물로부터 항원을 단리하기 위한 앞서 기술된 모든 방법을 포함한다. 예시적인 양상에서, 정량 단계는 항원 표준을 이용하지 않으면서 수행된다. 다양한 양상에서, 정량 단계는 아미노산 분석에 의해 항원을 정량하는 것을 포함한다. 일부 양상에서, 항원은 바이러스 또는 박테리아이다. 일정한 양상에서, 항원은 혈구응집소 (HA)이다. 특정한 양상에서, HA는 인플루엔자 바이러스 백신 조성물, 홍역 바이러스 백신 조성물, 파라인플루엔자 바이러스 백신 조성물, 또는 볼거리 바이러스 백신 조성물로부터 유래된다. 일부 양상에서, 백신 조성물은 인플루엔자 바이러스 백신 조성물이다. 추가의 양상에서, 인플루엔자 바이러스 백신 조성물은 인플루엔자 A와 인플루엔자 B로 구성된 군에서 선택되는 인플루엔자 바이러스로부터 보호를 제공한다. 다양한 양상에서, 항원 아류형은 인플루엔자 A HA1, HA2, HA3, HA4, HA5, HA6, HA7, HA8, HA9, HA10, HA11, HA12, HA13, HA14, HA15 및 HA16, 그리고 인플루엔자 B HA 중에서 임의의 한 가지이다. 일정한 양상에서, 항원 아류형은 인플루엔자 A HA 아류형 HA1, HA2, HA3, HA5, HA7, HA9, HA10, 또는 인플루엔자 B HA이다. 예시적인 양상에서, 인플루엔자 A HA 아류형은 HA1이다. 추가의 양상에서, 인플루엔자 백신 조성물은 인플루엔자 A H1N1, H1N2, H2N2, H3N2, H5N1, H7N1, H7N2, H7N3, H7N7, H9N2, H10N7, 그리고 인플루엔자 B로 구성된 군에서 선택되는 인플루엔자 유형으로부터 보호를 제공한다. 다양한 양상에서, 상기 방법은 약 2.5% 이하의 상대 표준 편차 (RSD)로 항원 함량을 정량한다. 더욱 특정한 양상에서, RSD는 약 2.2%이다. 이보다 더욱 특정한 양상에서, RSD는 약 1.3%이다.

전술한 요약은 본 발명의 모든 양상을 정의하는 것으로 의도되지 않고, 그리고 추가의 양상이 다른 섹션, 예를 들면, 하기의 상세한 설명에서 기술된다. 전체 문서는 통합된 개시로서 관련되는 것으로 의도되고, 그리고 본원에서 기술된 특질의 모든 조합은 비록 특질의 조합이 이러한 문서의 동일한 문장, 또는 단락, 또는 섹션 내에서 함께 발견되지 않을지라도, 예기되는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명의 다른 특질과 이점은 하기의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 하지만, 상세한 설명 및 특정 실시예는 본 발명의 특정 구체예를 지시하긴 하지만, 단지 예시로서 제공되는 것으로 이해되어야 하는데, 그 이유는 본 발명의 기술적 사상과 범위 내에서 다양한 개변이 이러한 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이기 때문이다.

상세한 설명

본 발명은 정의된 생물학적 활성을 갖는 생물학적 참고 제조물인 국제 표준, 예를 들면, World Health Organization (WHO) 국제 표준의 부재에서 백신 개발과 제조에서, 항원을 단리하고 제조하고 항원 농도를 결정하기 위한 신규한 방법을 제시한다. 상기 방법은 세정제의 이용 없이 및 알킬화의 이용 없이, 백신 조성물에서 바이러스로부터 항원을 용해화함으로써 선행 기술에 비하여 향상을 포함한다. 용해화된 항원은 이후, 분별에 의해 분리되고 정량적 아미노산 분석에 의해 정량된다.

WHO 국제 표준의 적시 이용가능성은 전세계의 백신 제조에서 생물학적 척도의 비교를 위한 기초로서 역할한다. 하지만, 이들 WHO 국제 표준은 새로운 바이러스가 발생하고 표준이 제조되어야 할 때, 즉시 가용하지 않다. 현재까지의 문제점은 백신 제조업체가 그들의 새로운 백신 내에 항원을 정량하기 위한 WHO 국제 표준의 전달을 기다리면서, 새로운 바이러스의 발생에 응하여 새로운 백신을 신속하게 개발하고 생산하도록 강제된다는 것이다. 본 발명의 방법은 WHO 국제 표준에 대한 요구 없이, 항원을 정량하기 위한 새로운 방법을 제공함으로써 이러한 문제점에 대한 해법을 제공한다.

병원체로부터 유래된 항원의 분리와 회수를 위한 방법에서 현재까지의 다른 문제점은 다른 단백질로부터 항원의 분리가 최적이 아니라는 것이다. 당분야에서, 관심되는 항원 단백질 피크(들)의 분해능이 불량하고, 회수가 낮고 정량적이지 않으며, 그리고 샘플 제조 시간이 더욱 길었다. 본 발명은 세정제의 이용 없이, 그리고 예시적인 양상에서, 항원 상에서 설피드릴 기를 보호하기 위한 알킬화 없이, 변성되고 환원된 샘플에서 항원을 단리하기 위해 크로마토그래피를 이용함으로써 이들 문제점 중에서 상당수를 해결한다. 따라서 샘플 제조 시간이 훨씬 감소하고 부반응이 더욱 적다. 크로마토그래피를 이용한 항원의 단리 후, 항원 농도가 국제 표준의 이용 없이 정량된다. 더욱 특정한 양상에서, 정량적 아미노산 분석이 항원 정량의 대안적 방법으로서 수행된다.

선행기술로부터 해결되어야 하는 문제점은 항원의 고-처리량 분리, 정제, 그리고 정량에 적용가능한 정확하고 신속하고 견고한 방법을 제공하는 것이었다. 더욱 특정한 양상에서, 해결되어야 하는 문제점은 세정제의 이용 없이, 알킬화에 대한 요구 없이, 그리고 항원 표준에 대한 요구 없이 이런 방법을 제공하는 것이었다. 본원에서 기술된 방법은 혈구응집소 (HA) 항원, 그리고 특히, 주요 결정인자 HA1이 제조물 내에 존재하는 다른 단백질로부터 극히 만족스럽게 및 높은 순도로 분리되고, 그리고 당업자가 제조물 내에 존재하는 항원의 양을 다른 (공지된) 값에 비교함으로써, 내부 표준에 비교함으로써, 또는 정량적 아미노산 분석에 의해 결정할 수 있도록 한다는 것을 보여준다.

더욱 구체적으로, 본 발명은 HA 항원을 분리하기 위한 신규한 방법에 관계하고, 상기 방법은 세정제 없이 용해화된 항원 제조물을 적용하는 단계, 그리고 한 양상에서, 항원을 크로마토그래피 칼럼에서 분별하는 단계를 포함한다. 본 발명은 일정한 양상에서, 칼럼으로부터 HA 항원의 용리를 더욱 포함하고, 그리고 추가의 양상에서, AAA에 의한 항원의 정량을 더욱 포함한다.

하지만, 본 발명의 임의의 구체예가 상세하게 설명되기 이전에, 본 발명은 하기 설명에서 진술되거나, 또는 도면과 실시예에서 예시된 성분의 구성과 배열의 상세에 대한 이의 적용에서 한정되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 본원에서 이용된 섹션 표제는 단지 조직화를 목적으로 하고, 그리고 기술된 요부 (subject matter)를 한정하는 것으로 해석되지 않는다. 본 출원에서 인용된 모든 참고문헌은 본원에 명백히 참고문헌으로 편입된다.

본 발명은 다른 구체예를 포괄하고 다양한 방식으로 실시되거나 수행된다. 또한, 본원에서 이용된 어구와 용어는 설명을 목적으로 하고 한정으로서 간주되지 않는 것으로 이해된다. 용어 "내포하는", "포함하는", 또는 "갖는" 및 이들의 변형은 그 뒤에 열거된 항목 및 이들의 등가물뿐만 아니라 추가의 항목을 포함하는 것으로 의도된다.

정의

달리 정의되지 않으면, 본원에서 이용된 모든 기술 용어와 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 평균적 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.

하기 약어가 전체에 걸쳐 이용된다.

AA 아미노산

AAA 아미노산 분석

DNA 데옥시리보핵산

EDTA 에틸렌디아민테트라아세트산

HA 혈구응집소

HA1-16 혈구응집소 아류형1-16

HPLC 고성능 액체 크로마토그래피

HIC 소수성 상호작용 크로마토그래피

IEX-HPLC 이온 교환-HPLC

kDa 킬로달톤

LC-MS/MS 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석법

MALDI/TOF 매트릭스-지원 레이저 탈착 이온화/비행시간 질량 분광법

MVB 일가 벌크

RSD 상대 표준 편차

RP-HPLC 역상 HPLC

SDS 황산도데실나트륨

SDS-PAGE 황산도데실나트륨 폴리아크릴아미드 겔 전기영동

SEC 크기 배제 크로마토그래피

SRD 단일 원 면역확산법

UV 자외선

본 명세서 및 첨부된 청구항에서 이용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥에서 명확하게 달리 지시되지 않으면 복수 참고물을 포함한다.

본원에서 이용된 바와 같이, 하기 용어는 달리 명시되지 않으면, 그들에 부여된 의미를 갖는다.

용어 "폴리펩티드," "펩티드" 및 "단백질"은 본원에서 교체가능하게 이용되고 펩티드 결합을 거쳐 연결된 아미노산 잔기의 중합체를 지칭한다. "단백질"은 전형적으로, 큰 폴리펩티드를 지칭한다. "펩티드"는 전형적으로, 짧은 폴리펩티드를 지칭한다.

또한, 본원에서 언급된 임의의 수치 값은 하한 값에서부터 상한 값까지 모든 값을 포함하는 것으로 명확하게 이해된다, 다시 말하면, 열거된 최저값과 최고값 사이에 수치 값의 모든 가능한 조합은 본 출원에서 명백히 규정된 것으로 간주된다. 가령, 농도 범위가 약 1% 내지 50%로서 규정되면, 2% 내지 40%, 10% 내지 30%, 또는 1% 내지 3% 등과 같은 값은 본 명세서에서 명백히 열거되는 것으로 의도된다. 앞서 열거된 값은 구체적으로 의도되는 것의 단지 실례이다.

다양한 양상에서, 범위는 본원에서 "약" 또는 "대략" 특정 값에서부터 및/또는 "약" 또는 "대략" 다른 특정 값까지 표시된다. 용어 "거의" 역시 용어 "대략"과 교체가능하게 이용된다. 값이 선행사 "약"의 이용에 의해 근사치로서 표시될 때, 적은 양의 변이가 범위 내에 포함되고, 그리고 개시되거나 언급된 값의 +/- 10%, +/- 5%, 그리고 +/- 1.0% 값을 포함하는 것으로 이해될 것이다.

"인플루엔자"는 오르토믹소비리대 (Orthmyxoviridae)의 과에서 3가지 유형의 인플루엔자 바이러스, A, B, 그리고 C 중에서 임의의 한 가지를 지칭한다. 인플루엔자 A와 B만 계절적 발생을 유발한다. 인플루엔자 바이러스는 전형적으로 포유동물의 코, 목과 폐 내에, 그리고 조류의 장 내에 상피 세포의 표면 상에서 시알산 당 위에 혈구응집소 (HA)를 통해 결합함으로써 그들의 숙주를 감염시킨다.

인플루엔자 A 속은 한 가지 종류, 인플루엔자 A 바이러스를 갖는다. 인플루엔자 A는 HA 단백질 (H1-16) 및 뉴라미니다아제 단백질 (N1-9)의 혈청학적 특성에 기초하여, 아류형 또는 혈청형으로 나눠진다. 인플루엔자 아류형은 혈구응집소와 뉴라미니다아제의 조합, 예를 들면, HxNy에 따라 명명된다. 공지된 인간 범유행성 사망자의 숫자에 의해 정렬된, 인간에서 확증된 아류형에는 H1N1, H2N2, H3N2, H5N1, H7N7, H1N2, H9N2, H7N2, H7N3, 그리고 H10N7이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 인플루엔자 B 속은 한 가지 종류, 인플루엔자 B 바이러스를 갖는다. 인플루엔자 B는 유형 A보다 2-3배 느린 속도로 돌연변이하고, 결과적으로 유전적으로 덜 다양하고 단지 하나의 인플루엔자 B 혈청형을 갖는다. 인플루엔자 C 속은 한 가지 종류, 인플루엔자 C 바이러스를 갖고, 이것은 인간, 개와 돼지를 감염시키고, 때때로 심각한 질환 및 국지적 전염병을 유발한다. 하지만, 인플루엔자 C는 다른 유형보다 빈도가 덜하다.

용어 "항원" 또는 "항원 아류형"은 선별성 결합 작용제, 예를 들면, 항체에 의해 결합될 수 있고, 그리고 추가적으로, 각 항원의 에피토프에 결합할 수 있는 항체를 생산하기 위해 개체에서 이용될 수 있는 분자 또는 분자의 일부분을 지칭한다. 다양한 양상에서, 항원은 하나 또는 그 이상의 에피토프를 갖는다. 예시적인 양상에서, HA는 항원이다. HA는 바이러스를 감염되는 세포에 결합시키는 것을 담당하는 항원성 당단백질이다. 적어도 17개의 상이한 HA 항원, 인플루엔자 A의 경우에 분류된 HA1-HA16 또는, 대안으로 H1-H16, 그리고 인플루엔자 B의 경우에 적어도 하나의 공지된 HA 항원이 확인되었다. H1, H2, 그리고 H3은 인간 인플루엔자 A에서 통상적으로 관찰되고, 그리고 인플루엔자 B HA 항원은 인간 인플루엔자 B에서 통상적으로 관찰된다. 본 발명은 HA1, HA2, HA3, HA4, HA5, HA6, HA7, HA8, HA9, HA10, HA11, HA12, HA13, HA14, HA15, HA16 및 인플루엔자 B HA 중에서 임의의 한 가지가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 모든 알려진 및 아직 알려지지 않은 HA 바이러스 단백질을 단리하고 정량하는 방법을 포함한다.

용어 "항원 함량" 또는 "항원 농도"는 백신의 샘플 내에서, 항원의 양, 다시 말하면, 항원의 농도를 지칭한다.

용어 "백신" 또는 "백신 조성물"은 특정 질환 (가령, 인플루엔자)에 대한 면역원성을 향상시키는 생물학적 제조물을 지칭한다. 용어 "백신" 또는 "백신 조성물"은 본원에서 교체가능하게 이용되고 백신 개발과 제조에 관련된 인스트림 (instream)-, 상류-, 그리고 하류-공정 제조물을 비롯한 모든 백신 제제를 지칭한다.

용어 "표준" 또는 "국제 표준" 또는 "내부 참고 표준" 또는 "항원 표준"은 규제 당국, 예를 들면, World Health Organization (WHO) 또는 WHO 협력 센터에 의해 제공된 바와 같은 정의된 생물학적 활성을 갖는 생물학적 참고 제조물을 지칭한다.

"상대 표준 편차," "RSD," 또는 "%RSD"는 변동 계수의 절대 값이다. 이것은 종종, 백분율로서 표시된다. 때때로 이용되는 유사한 용어는 변동 계수의 제곱인 상대 분산이다. 또한, 상대 표준 오차는 표준 오차를 산정값으로 나눗셈하고; 이후 백분율로 표시되도록 100을 곱셈함으로써 획득된 통계학적 산정값의 신뢰성의 적도이다. RSD는 검정법의 정밀도와 반복성을 표현하기 위해 분석 화학에서 폭넓게 이용된다. RSD = (어레이 X의 표준 편차) x 100 / (어레이 X의 평균).

본원에서 이용된 섹션 표제는 단지 조직화를 목적으로 하고, 그리고 기술된 요부 (subject matter)를 한정하는 것으로 해석되지 않는다.

백신으로부터 항원의 단리

본 발명은 백신 조성물로부터 HA 항원이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 항원을 단리하기 위한 방법을 포함한다. 예시적인 구체예에서, 인플루엔자 바이러스 백신은 난-유래된 물질 또는 세포 배양액으로부터 바이러스 물질의 -상류, 인스트림, 또는 하류 공정으로부터 획득된다. 항원은 이후, 세정제 없이 백신 조성물로부터 용해화된다.

바이러스 붕괴로 알려져 있는 항원 용해화는 추가의 단리와 정량을 위해 항원 또는 항원들을 단리하기 위한 화학적 또는 물리적 방법을 이용한 바이러스의 파괴를 수반한다. 예시적인 양상에서, 용해화 단계는 세정제의 이용 없이 환원에 의해 수행된다. 세정제는 본원에서 기술된 방법에서 이용되지 않는데, 그 이유는 이들이 단백질에 결합하고 이들의 특성을 변화시키기 때문이다, 다시 말하면, 세정제가 단리된 항원을 오염시키고, 그리고 항원 농도의 정확한 결정을 위해 필요한 크로마토그래피 분리를 간섭하기 때문이다.

따라서 항원 용해화는 단백질의 이황화 결합을 감소시키는 세정제가 아닌 임의의 환원 작용제에 의해 수행된다. 적절한 환원 작용제에는 디티오트레이톨 (DTT), 트리스 [2-카르복시에틸] 포스핀 염산염 (TCEP), Protein-S-S-Reductant™ (G Biosciences^®, Maryland Heights, MO), β-메르캅토에탄올, β-메르캅토에틸아민, 티오프로필-아가로즈, 나트륨 보로하이드리드, 나트륨 시아노보로하이드리드, 나트륨 포스포로티오에이트, 아황산염과 아황산염 발생제, 디티오에리트리톨, 트리부틸 포스핀, 글루타티온, 티오글리콜레이트, 2,3-디메르캅토프로판올, 또는 과산화포름산이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 다양한 양상에서, 구아니딘 염산염 또는 기타 무질서유발제, 예를 들면, 요소, 티오요소, 리튬, 과염소산염, 그리고 티오시아네이트 역시 용해화 반응 완충액에 이용된다. 무질서유발제는 단백질을 변성하지만, 단백질을 침전시키지 않는다. 단백질의 환원을 수행하기 위한 화합물과 방법은 당업자에게 널리 알려져 있다. 특정한 환원 용액과 조건은 본원의 실시예에서 더욱 상세하게 기술된다.

예시적인 양상에서, 환원 완충액 또는 환원 작용제는 HA 분자 간에 이황화 결합을 개별 아단위, 예를 들면, HA1과 HA2로 환원시키고, 그리고 예로써, HA1을 바이러스로부터 방출한다. 일정한 양상에서, DTT는 약 1mM, 2mM, 3mM, 4mM, 5mM, 6mM, 7mM, 8mM, 9mM, 10mM, 11mM, 12mM, 13mM, 14mM, 15mM, 16mM, 17mM, 18mM, 19mM, 20mM, 21mM, 22mM, 23mM, 24mM, 25mM, 26mM, 27mM, 28mM, 29mM, 30mM, 35mM, 40mM, 45mM, 50mM, 55mM, 60mM, 65mM, 70mM, 80mM, 85mM, 90mM, 95mM, 100mM, 150mM, 200mM, 250mM, 300mM, 350mM, 400mM, 450mM, 또는 500mM의 농도에서 이용된다. 더욱 특정한 양상에서, DTT는 예로써, 약 20mM 내지 약 100mM 범위의 농도에서 이용된다.

예시적인 양상에서, 환원은 약 5분 내지 약 20시간, 약 10분 내지 약 10시간, 또는 약 30분 내지 약 2시간의 배양 시간을 포함한다. 양상에서, 배양 시간은 약 1시간이다. 따라서 배양 시간은 약 5분, 약 10분, 약 20분, 약 30분, 약 40분, 약 50분, 약 1시간, 약 1.5시간, 약 2시간, 약 2.5시간, 약 3시간, 약 3.5시간, 약 4시간, 약 4.5시간, 약 5시간, 약 5.5시간, 약 6시간, 약 6.5시간, 약 7시간, 약 7.5시간, 약 8시간, 약 8.5시간, 약 9시간, 약 9.5시간, 약 10시간, 약 11시간, 약 12시간, 약 13시간, 약 14시간, 약 15시간, 약 16시간, 약 17시간, 약 18시간, 약 19시간, 또는 약 20시간이다. 특정한 환원 시간은 본원의 실시예에서 더욱 상세하게 기술된다.

다른 양상에서, 환원은 약 20℃ 내지 약 100℃의 배양 온도를 포함한다. 특정한 양상에서, 환원은 약 50℃ 내지 약 90℃의 배양 온도를 포함한다. 더욱 특정한 양상에서, 환원은 약 85℃에서 배양 온도를 포함한다. 따라서 배양 온도는 약 20℃, 약 25℃, 약 30℃, 약 35℃, 약 40℃, 약 45℃, 약 50℃, 약 55℃, 약 60℃, 약 65℃, 약 70℃, 약 75℃, 약 80℃, 약 85℃, 약 90℃, 약 95℃, 또는 약 100℃이다. 특정한 환원 온도는 본원의 실시예에서 더욱 상세하게 기술된다.

추가의 양상에서, 항원의 환원은 pH-제어된다. 다양한 양상에서, 환원 반응은 약 pH 6 내지 약 pH 11의 pH에서 수행된다. 특정한 양상에서, pH는 약 pH 7 내지 약 pH 10이다. 더욱 특정한 양상에서, pH는 약 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 그리고 10.0이다.

예시적인 양상에서, 환원은 알킬화 없이 수행된다. 알킬화는 환원 후 단백질의 설피드릴 기를 보호하고 유리 시스테인의 뒷반응을 예방한다. 따라서 알킬화는 전형적으로, 분리된 HA 항원, 예를 들면, HA1과 HA2, 그리고 다른 단백질의 재결합 및/또는 복합체 형성을 예방하는데 이용된다. 하지만, 4-비닐피리딘과 같은 알킬화제의 이용은 본원의 실시예에서 더욱 상세하게 기술된 바와 같이, 단백질 순도를 감소시킨다. 따라서 분리된 항원, 예를 들면, HA1과 HA2, 그리고 다른 단백질의 재결합 및/또는 복합체 형성을 예방하기 위해, 모든 단백질의 설피드릴 기는 알킬화제의 이용 없이 보호된다.

예시적인 양상에서, 알킬화제의 추가적인 이용 없이 분리된 항원 및 다른 단백질의 재결합 및/또는 복합체 형성을 예방하기 위해, 환원된 단백질 설피드릴 기는 산성화에 의한 양성자 첨가에 의해 보호된다. 산성화는 이황화 결합 형성을 예방하는데, 그 이유는 이황화 결합이 형성되기 위하여, 설피드릴 기가 적어도 부분적으로 이온 형태에 있어야 하기 때문이다. 산성화는 간단하고 효과적인 처리법인데, 여기서 pH는 항원의 침전을 예방하기 위해 모니터링되고 조정된다. 다양한 양상에서, 산성화는 인산, 염산, 황산, 트리플루오르아세트산, 펜타플루오르프로피온산, 헵타플루오르부티르산, 또는 포름산으로 수행된다. 예시적인 양상에서, 산성화는 인산으로 수행된다; 하지만, 인산의 이용은 한정적이지 않은데, 그 이유는 당분야의 모든 다른 산성화 방법이 이용되기 때문이다. 산성화를 위한 방법은 당분야에 널리 알려져 있고 본원에서 추가로 설명되지 않는다. 특정한 산성화 용액과 조건은 본원의 실시예에서 더욱 상세하게 기술된다.

항원 분별

환원과 산성화 후, 항원은 분별에 의해 단리된다. 예시적인 양상에서, 분별은 크로마토그래피에 의해 수행된다. 당분야에 공지된 임의의 적절한 유형의 크로마토그래피가 이용된다. 가령, 이런 적절한 유형의 크로마토그래피에는 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 역상 HPLC (RP-HPLC), 이온 교환-HPLC (IEX-HPLC), 친화성 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC), 또는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

일부 양상에서, 항원 분별은 RP-HPLC에 의해 수행된다. 이런 이유로, 적절한 유형의 역상 칼럼에는 C2 내지 C18 범위에서 변하는 다양한 변형을 갖는 다공성, 비-다공성 또는 모놀리식 실리카 칼럼 또는 중합체-기초된 칼럼이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 분석 목적에 적합한 칼럼 직경은 약 0.1μl/분 내지 약 5ml/분의 범위에서 다양하게 변할 수 있는 유속에 따라, 전형적으로 약 75μm 내지 약 5mm의 범위이지만 이에 국한되지 않는다. 충분한 양의 항원의 단리를 위하여, 약 1mm 내지 약 10mm의 직경을 갖는 칼럼이 전형적으로 이용된다. 단백질은 아세토니트릴, 메탄올, 에탄올, 부탄올, 프로판올, 이소프로판올, 그리고 테트라히드로푸란이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 수성 용매와 유기 용매의 혼합물을 갖고, 그리고 염산, 황산, 트리플루오르아세트산, 펜타플루오르프로피온산, 헵타플루오르부티르산, 포름산, 인산, 그리고 인산염 완충액이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 변형제를 종종 내포하는 역상 칼럼으로부터 분리되고 용리된다. 단백질의 역상 HPLC를 위한 방법은 당분야에 널리 알려져 있고 본원에서 추가로 설명되지 않는데, 그 이유는 이들이 당업자에 의해 수행될 수 있기 때문이다. 특정한 역상 HPLC 방법과 조건은 본원의 실시예에서 더욱 상세하게 기술된다.

본원의 실시예에서 기술된 바와 같이, 크로마토그래피에 의한 항원 분별은 낮은 상대 표준 편차 (RSD)에서 우수한 선형성과 정밀도를 제공하였다. 샘플 내에서 분석물의 농도 (양)에 직접적으로 비례하는 검사 결과를 획득하는 능력 (일정한 범위 내에서)인 선형성은 임의의 분석 절차에서 중요하다. 분석 절차의 정밀도는 지정된 조건 하에 동질성 샘플의 다중 샘플링 (multiple sampling)으로부터 획득된 일련의 치수 간에 합치의 엄밀함 (closeness of agreement) (산포도)을 나타낸다. 다양한 양상에서, 정밀도는 3가지 수준에서 고려된다: 반복성, 중간 정밀도 및 재현성.

항원 정량

국제 표준의 이용 없이 분별에 의한 단리 후, 항원 또는 항원 아류형을 정량하기 위한 방법이 본 발명에 포함된다. 분별된 항원을 정량하기 적절한 방법에는 아미노산 분석 (AAA), 질소 결정 (Kjeldahl), 질량 분석법, 그리고 동위원소 희석 질량 분석법이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

예시적인 양상에서, 항원 농도는 AAA를 이용하여 결정된다. AAA는 항원과 아미노산의 분자량에 기초하여 아미노산 조성을 결정하고 및/또는 조성물 내에서 항원의 농도를 정량하는데 이용되는 방법을 지칭한다. AAA는 당업자에게 공지된 전통적인 기술을 이용하여 수행된다. AAA는 단백질 양의 정확한 결정을 위한 적절한 도구일 뿐만 아니라, 상대적인 아미노산 조성과 유리 아미노산에 관한 상세한 정보를 제공한다. Amino Acid Analysis Protocols: Methods in Molecular Biology, Volume 159 (Cooper et al., ⓒ 2001 Humana Press Inc., Totawa, NJ에 의해 편집됨)를 참조한다. 상대적인 아미노산 조성물은 단백질에 대한 특징적인 프로필을 제공하고, 이것은 종종, 단백질의 확인에 충분하다. 이것은 종종, 단백질 단편화를 위한 프로테아제의 선택을 위한 결정 보조 (decision support)로서 이용된다.

전형적으로, AAA는 가수분해, 그리고 이후 분리, 검출과 정량을 포함한다. 가수분해 또는 "산 가수분해"는 전형적으로, 산성 조건에 의해 달성된다. 가령, 표준 절차는 6 M 염산으로 가수분해 (24시간, 110℃)이다. 이러한 표준 절차는 시간 요건과 온도 사이에 절충물이고 당업자에 의해 변경될 수 있다. 예시적인 양상에서, HA를 위한 최적 가수분해 시간을 결정하기 위해 가수분해 시간 연구가 수행된다. 하지만, 가수분해 시간은 본 발명의 방법에 따라 정량되는 각 개별 항원에 대해 최적화될 수 있다. AAA를 위한 절차는 당분야에 널리 알려져 있고, 그리고 AAA를 위한 산물은 상업적으로 가용하다 (AccQ Tag 키트 (Waters, No WAT052880) 및 Sigma-Aldrich). 일부 구체예에서, Zorbax Eclipse AAA HPLC 칼럼이 이용된다. 당업자는 AAA를 수행하기 위한 다양한 방법을 인식한다. 특정한 AAA 절차는 본원의 실시예에서 더욱 상세하게 기술된다.

특정 항원에 대한 공지된 서열에 기초하여, 항원 분자당 아미노산의 이론적 총수 및 차후에, 주입마다 항원의 몰 양이 계산된다. 항원의 계산되거나 측정된 분자 질량 및 샘플 제조 동안 적용된 희석 계수는 샘플 ml당 μg 항원으로서 표시된, 샘플 내에 항원 농도의 계산을 가능하게 한다.

예시적인 양상에서, HA 농도를 계산하기 위한 공식은 하기에 제공된다.

n_HA1 = n_AA/x_AA

n_HA1 … 혈구응집소 HA1의 몰 양 [μmol]

n_AA … 개별 아미노산의 몰 양 (아미노산 분석으로부터 결과) [μmol]

x_AA … 혈구응집소 HA1의 분자당 개별 아미노산의 총수

n_HA1 = n_HA

n_HA … 혈구응집소의 몰 양 [μmol]

m_HA = n_HA ^*M_HA

n_HA … 혈구응집소의 몰 양 [μmol]

m_HA … HA의 질량 [μg]

M_HA … 혈구응집소의 분자 질량 (계산되거나 측정됨) [μg^*μmol^-1]

c_HA = m_HA ^*DF/V_i

c_HA … 혈구응집소의 농도 [μg/ml]

DF … 희석 계수

V_i … 주입 부피 [ml]

본 발명의 예시적인 구체예에서, HA의 정량은 다른 백신 성분으로부터 잘 분리되는 HA1의 피크 면적에 기초된다. 본 발명의 적용가능성은 H1N1, H3N2, H5N1, H9N2, 그리고 인플루엔자 B가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 상이한 인플루엔자 A 아류형에 대해 증명되었는데, 이것은 본원에서 개시된 방법이 상이한 HA 항원에 대해 폭넓게 적용될 수 있다는 것을 강하게 암시한다. 본 발명은 인플루엔자로부터 HA에 대해 상세하게 기술되긴 했지만, 인플루엔자로부터 HA의 이용에만 한정되지 않는다. 본 발명은 또한, 다른 바이러스로부터 HA 항원에 대해, 그리고 다른 항원 또는 항원 아류형의 분리와 정량에 대해 적용가능하다.

본원에서 기술된 백신 조성물에서 항원 농도를 결정하는 방법은 약 5% 이하, 약 4% 이하, 약 3% 이하, 약 2.9% 이하, 약 2.8% 이하, 약 2.7% 이하, 약 2.6% 이하, 약 2.5% 이하, 약 2.4% 이하, 약 2.3% 이하, 약 2.2% 이하, 약 2.1% 이하, 약 2.0% 이하, 약 1.9% 이하, 약 1.8% 이하, 약 1.7% 이하, 약 1.6% 이하, 약 1.5% 이하, 약 1.4% 이하, 약 1.3% 이하, 약 1.2% 이하, 약 1.1% 이하, 그리고 약 1.0% 이하의 RSD로 항원 농도를 측정한다. 예시적인 양상에서, 본원에서 기술된 방법은 항원 농도에 따라, 약 2.2%와 약 1.3%의 RSD로 항원 농도를 측정한다.

본원에서 인용된 각 간행물, 특허 출원, 특허, 그리고 기타 참고문헌은 본 발명과 모순되지 않는 정도까지 전체로서 참고문헌으로 편입된다.

본원에서 기술된 실시예와 구체예는 단지 예시를 목적으로 하고, 그리고 이에 비추어 다양한 개변은 당업자에게 제안되고 본 출원의 기술적 사상과 이해 범위 및 첨부된 청구항의 범위 내에 포함되는 것으로 이해된다. 본원에서 인용된 모든 간행물, 특허, 그리고 특허 출원은 본원에 전체로서 참고문헌으로 편입된다.

실시예

본 발명의 추가적인 양상과 상세는 하기 실시예로부터 명백할 것이고, 이들 실시예는 한정이 아닌 예시인 것으로 의도된다.

실시예 1: 백신에서 HA의 단리와 정량을 위한 방법의 개발과 최적화

본원에서 기술된 실험의 목적은 표준 시약이 WHO 또는 다른 곳으로부터 가용하지 않을 때, HA (즉, HA1)의 측정에 기초하여 인플루엔자 A/California/07/2009 (H1N1)의 백신 제조물의 전체 HA 함량을 측정하기 위한 새로운 HPLC 방법을 개발하는 것이었다.

인플루엔자 A/California/07/2009 (H1N1)의 새로운 산물의 하기 배치가 평가되었다:

검사와 참고 항목

샘플	주의	단백질 함량 (μg/ml)
1	소규모 배치	149
2	대규모 배치	530
3	대규모 배치	373

역상 HPLC 에 의한 HA 의 정량

샘플 제조 조건은 하기와 같이 최적화되었다. 희석되지 않은 샘플 또는 탈이온수로 희석된 샘플은 동일한 부피의 환원 완충액 (6M 구아니딘 염산염, 266mM Tris/HCl, 1mM EDTA, pH 8.3, 그리고 40mM 디티오트레이톨)와 혼합되었다. 샘플은 85℃에서 1시간 동안 항온처리되고, 그 이후에 반응을 정지시키고 뒷반응, 유리 시스테인으로부터 이황화 결합의 형성을 예방하기 위해 10%(v/v) 8.5% 인산이 첨가되었다. 샘플은 임의의 미립자 물질을 제거하기 위해 18,407g에서 10분 동안 원심분리되었다. 동일한 HPLC 조건이 이용되었다.

4개 용매 펌프와 다이오드 어레이 검출기가 구비된 Agilent HPLC 시스템이 이용되었다. 단백질은 하기 구배를 이용하여, Jupiter 5μ C4 칼럼 (150x2mm)에서 역상-HPLC에 의해 분리되었다:

용리제 A: 물에서 0.1% 트리플루오르아세트산

용리제 B: 아세토니트릴에서 0.085% 트리플루오르아세트산

용리제 C: 메탄올

샘플과 표준은 0.4ml/분의 유속에서 10분 동안 20% 용리제 B에서 등용매 용리로 별개의 방법에 의해 주입되었다. 이것은 단백질의 용리를 위한 방법이 뒤따랐다:

HPLC 분석을 위한 구배

시간	용리제 A	용리제 B	용리제 C	유속
0분	80%	20%	0%	0.4 ml/분
15분	58%	42%	0%
20분	0%	100%	0%
21분	0%	0%	100%
24분	0%	0%	100%
25분	80%	20%	0%
40분	정지

용리된 단백질은 214nm에서 UV 흡수를 이용하여 검출되었다. HA1은 정량되고 샘플 ml당 μg HA로서 표시되었다. 적절한 표준의 부재로 인하여, 초기에 면적만 보고되었다. 이것은 샘플 2에 대한 아미노산 분석에 의한 용리된 HA1의 정량이 뒤따랐다. 일가 벌크 (MVB) 샘플 제조물 (샘플 1)은 HPLC 분석의 추가 보정을 위한 참고 제조물로서 이용되었다.

아미노산 분석

단백질의 산 가수분해는 유리 앰플에서 수행되었다. 2nmol의 2-L-아미노 부티르산은 내부 표준으로서 각 앰플에 첨가되고, 그리고 HPLC 분획물은 앰플 내로 직접적으로 수집되었다. 수집된 분획물은 진공 (SpeedVac, Savant, SVC100H) 하에 건조되었다. 샘플은 300μl 6N 염산 / 0.2% 페놀에 용해되고, 질소가 덮어 씌워지고, 그리고 앰플은 열-밀봉되었다. 산 가수분해는 115℃에서 18시간 동안 수행되었다. 앰플이 개봉되었다. 500μl 탈이온수가 첨가되었다. 용액은 여과되고 (0.2μ), Eppendorf^® 바이알 내로 이전되고, 그리고 진공 (SpeedVac, Savant, SVC100H) 하에 건조되었다. 아미노산 분석은 제조업체의 사용설명서에 따라 AccQ Tag 키트 (Waters, No WAT052880)를 이용하여 수행되었다. 간단히 말하면, 샘플은 0.1N 염산에 용해되고, 그리고 아미노산은 AccQ Fluor 시약을 이용하여 표지화되었다. 내부 표준 (α-아미노 부티르산) 및 아미노산 표준 (Agilent, 번호 5061-3330)은 동일한 방식으로 처리되었다.

4개 용매 펌프 및 형광 검출기 (스펙트럼 Systems FL 2000)가 구비된 Waters HPLC 시스템이 이용되었다. 아미노산은 37℃에서 작동된 Sentry Guard 칼럼 (20 x 3.9mm, Waters, No. WAT044380)과 전치칼럼 (150 x 2mm)이 구비된 AccQ Tag C18 칼럼 (4μ, 150x3.9mm, Waters, No. WAT052885)에서 역상-HPLC에 의해 분리되었다. 5μl의 샘플이 주입되고, 그리고 아미노산 프로필은 하기 구배를 이용하여 분석되었다:

용리제 A: 탈이온수

용리제 B: 아세토니트릴, 구배 등급

용리제 C: 탈이온수에서 1:10 희석된 AccQ-Tag 완충액 농축물 (Waters, No. WAT052890).

아미노산 분석을 위한 구배

시간	용리제 A	용리제 B	용리제 C	유속
0분	0%	0%	100%	1 ml/분
0.5분	0%	1%	99%
18분	0%	5%	95%
19분	0%	9%	91%
29.5분	0%	17%	83%
33분	40%	60%	0%
36분	0%	0%	100%
60분	정지

용리하는 형광-표지화된 아미노산은 250nm에서 여기 및 394nm에서 방출을 갖는 형광 검출을 이용하여 검출되었다. 보정은 외부 표준 (Agilent, No. 5061-3330)을 이용하여 수행되고 내부 표준을 이용하여 정정되었다. 데이터는 류신, 발린, 리신 및 페닐알라닌에 대해 더욱 가공 처리되었는데, 그 이유는 이들이 산 가수분해 조건 하에 가장 안정된 아미노산이기 때문이다.

인플루엔자 A/California/07/2009 (H1N1) (GenBank 수탁 번호 ACQ55359.1)의 HA에 대한 공지된 서열에 기초하여, HA1 분자당 아미노산의 이론적 총수 및 차후에, 주입마다 HA의 몰 양이 계산되었다. HA의 계산되거나 측정된 분자 질량 및 샘플 제조 동안 적용된 희석 계수는 샘플 ml당 μg HA로서 표시된, 샘플 내에 HA 농도의 계산을 가능하게 하였다.

SDS-PAGE

샘플은 황산도데실나트륨-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE), 그 이후에 Coomassie Blue 염색에 의해 분석되었다. 일가 벌크 샘플은 환원과 비-환원 조건 하에 분석되고, 그리고 HPLC에 의해 단리된 환원된 HA1과 비교되었다. 전기영동 후, 겔은 즉석에서 이용가능한 Coomassie 용액 (GelCode® Blue Stain Reagent, Pierce, cat. # 24590)으로 2시간 동안 염색되었다. 겔은 탈이온수의 2-3회 교체로 탈색되고 이미지 스캐닝에 앞서 하룻밤 동안 탈이온수에 유지되었다. SDS-겔은 농도계 Image Scanner III (GE Healthcare)의 제조업체에 의해 제공된 GelData 프로그램으로 스캔되었다. 띠를 확인하고 흡수의 흡광도를 획득하기 위해 Image Quant TL 소프트웨어 (Amersham Bioscience)가 이용되었다. 이들 띠의 한계는 수동으로 설정되었다.

MALDI/TOF

프레임의 매트릭스-지원 레이저 탈착/이온화 시간 (MALDI/TOF) 분석을 위하여, 단백질은 앞서 기술된 방법에 의해 HPLC를 이용하여 정제되었다. 동결건조된 HPLC 분획물은 5μl 50% 아세토니트릴, 물에서 0.5% 포름산에 용해되고 매트릭스 용액 (50% 아세토니트릴에서 10mg/ml 시나핀산, 그리고 물에서 0.5% 포름산)과 혼합되었다. 1μl가 MALDI/TOF 표적 위에 놓이고 실온에서 건조되었다. 스펙트럼은 표준 복수 채널 플레이트 검출기 또는 CovalX HM1 고질량 검출기를 이용하여 Applied Biosystems 4800 MALDI TOF/TOF에서 획득되었다.

스펙트럼은 제공된 소프트웨어 패키지 (Data Explorer 4.9, Applied Biosystems)를 이용하여 분석되었다. 분자 질량은 소 혈청 알부민으로 수행된 외부 보정으로 획득된 적어도 10 스펙트럼의 평균으로서 계산되었다.

LC-MS/MS에 의한 피크의 확인

HPLC 피크는 수동으로 수집되고 SpeedVac에서 동결건조되었다. 동결건조물은 재구성 완충액 (8M 요소, 100mM 중탄산암모늄, pH 8.4)에서 용해되고, 100mM 중탄산암모늄, pH 8.4의 첨가에 의해 0.9M 요소의 최종 농도로 희석되고, 그리고 트립신을 이용하여 효소분해되었다.

인-겔 트립신 효소분해를 위하여, 겔 조각은 SDS-PAGE 겔로부터 절단되고 아세토니트릴, 그 이후에 100mM 중탄산암모늄, pH 8.4, 그리고 다시 한 번 아세토니트릴에 의해 반복적으로 세척되었다. 최종 단계로서, 겔 조각은 아세토니트릴로 처리되고 SpeedVac에서 1시간 동안 동결건조되었다. 겔 조각은 트립신 용액 (12.5ng/μl)을 이용하여 재수화되고 하룻밤 동안 효소분해되었다. 펩티드는 이후, 상층액으로부터 회수되었다.

산출된 펩티드는 Zorbax SB300 C18 5μ 150x0.5mm 칼럼을 이용하여 Agilent 1100 모세관 HPLC에서 분리되고, 그리고 전기분무 공급원 (electrospray source)이 구비된 선형 트랩 사중극 (LTQ 또는 선형 이온 트랩) Orbitrap 질량 분석계에서 펩티드 질량 핑거프린팅 (LC-MS/MS 또는 탠덤 MS)과 함께 액체 크로마토그래피-질량 분석법을 이용하여 온라인 분석되었다. 펩티드는 LTQ Orbitrap 내에 전구물질 스캔에서 정확한 질량 및 60,000의 해상도로 측정되었다. 차후에, 4개의 가장 강력한 이온이 선별되고 LTQ에서 탠덤 질량 분석법 (MS/MS) 양식을 이용하여 분석되었다. MS/MS 스펙트럼은 Bioworks 3.3 소프트웨어를 이용하여 확인을 위해 가공 처리되고, 그리고 H1N1only (인플루엔자 바이러스 자원으로부터 회수된 서열, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/Database/request.cgi, 15.06.2009)로부터 바이러스 단백질을 내포하는 수동으로 만들어진 데이터베이스에 대하여, 또는 Uniprot 데이터베이스 (Release 14.8, 10.02.2009)에 대하여 검색되었다. 상대적 정량은 확인된 펩티드에 대한 재구성된 이온 크로마토그램에서 피크의 높이를 이용하여 수행되었다.

HPLC 방법 최적화

H1N1에서 최초 실험은 다른 인플루엔자 백신에서 HA의 정량을 위한 확립된 HPLC 방법을 이용하여 수행되었다. 간단히 말하면, 샘플 제조는 37℃에서 1시간 동안 바이러스 붕괴 단계, 그 이후에 4-비닐피리딘으로 알킬화를 포함하였다. 이러한 샘플 제조 방법을 이용하여, HA1은 샘플 2로부터 HPLC 피크의 분별에 의해 단리되고 아미노산 분석을 이용하여 정량되었다. 아미노산 분석의 6-배 결정의 평균으로서, 62.2μg/ml HA의 값이 샘플 1에서 획득되었다. 상기 샘플로부터 HA1의 회수를 산정하기 위해 SDS-PAGE가 이용되었다. 겔은 Coomassie 염색되고 농도계측 스캐닝 (densitometric scanning)에 의해 평가되었다. 결과는 53kDa에서 이동하는 단리된 HA1이 샘플 1에서 상응하는 띠의 강도의 약 13%만을 갖는다는 것을 지시하였다. 샘플 1에서 상기 띠의 순도를 결정하기 위해 LC-MS/MS 분석이 이용되었다. 이들 분석은 상기 띠에서 대략 25% (n=6)의 HA1 함량을 제공하는 반면, 주요 내용물은 핵단백질이었다. 종합하면, 이들 결과는 HA1의 회수가 단지 약 50%라는 것을 증명하였다. HA1의 낮은 회수로 인하여, 샘플 제조의 추가 최적화가 수행되었다.

바이러스 붕괴 단계 동안 배양 온도는 변하였고, 그리고 회수의 최대 값은 약 80℃의 온도에서 관찰되었다. 추가의 실험은 37℃와 90℃ 사이에 바이러스 붕괴를 위한 배양 온도의 최적화, 그리고 30분과 4시간 사이에 배양 시간의 최적화를 포함하였다. 이에 더하여, 알킬화 단계에 대한 대안으로서, 8.5% 인산으로 산성화가 조사되었다.

바이러스 붕괴, 다시 말하면, 용해화를 위한 최적 조건은 1시간 동안 약 85℃인 것으로 밝혀졌고, 알킬화 단계 또는 산성화 단계가 뒤따랐다. 이들 최적화된 샘플 제조 조건을 이용하여, HA1 회수는 SDS-PAGE에 의해 다시 한 번 검사되었다. HA1 회수는 샘플 1에서 상응하는 띠에서 25%의 HA1 함량에 기초하여 90 내지 120%인 것으로 결정되었다.

HA1 회수에 더하여, 이들 2가지 최적화된 방법 (알킬화 있음 및 알킬화 없음)에 대한 특이성이 검사되었다. LC-MS/MS 분석에 의해, 4-비닐피리딘으로 알킬화의 방법에 대한 HA1 피크에서 단백질 순도는 87%인 것으로 결정되었다. 대조적으로, 알킬화 대신에 인산으로 산성화가 유리 시스테인의 뒷반응을 예방하는데 이용되면, HA1 피크에서 단백질 순도가 96%까지 향상되었다.

참고 제조물의 확립

서열 정렬

하기 수탁 번호를 갖는 서열은 Genbank로부터 수득되었다: (1) HA, 인플루엔자 A 바이러스 (A/California/07/2009(H1N1)): ACQ55359.1; 그리고 (2) HA, 인플루엔자 A 바이러스 (A/Solomon Islands/03/2006(H1N1)), ABU50586.1. 단백질 서열은 디폴트 설정된 ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)를 이용하여 정렬되었다.

인플루엔자 A 바이러스 (A/California/07/2009(H1N1)) HA와 인플루엔자 A 바이러스 (A/Solomon Islands/03/2006(H1N1)) HA의 서열 정렬 상동성에 따르면, HA 상동성은 이들 두 바이러스 간에 단지 약 79%이다. 다른 대유행기 사이의 균주는 A/California/07/2009(H1N1)에 대한 필적하는 낮은 상동성을 보인다. 이러한 낮은 상동성은 대유행기 사이의 참고 항원으로 보정이 범유행성 H1N1 균주의 경우에 가능하지 않다는 것을 암시하였다.

MALDI/TOF에 의한 분자 질량

아미노산 서열 (수탁 번호: HA, 인플루엔자 A 바이러스 (A/California/07/2009(H1N1)): ACQ55359.1)에 기초한 인플루엔자 A 바이러스 (A/California/07/2009(H1N1)) HA의 이론적 분자 질량은 61424 (HA0, 환원된 이황화 결합, 단백분해에 의해 개열되지 않는 HA1과 HA2를 포함한다)이고, 환원된 HA1의 경우에 36312이고, 그리고 환원된 HA2의 경우에 25130이다. 하지만, 이것은 번역후 변형, 예를 들면, 당화, 특히 당단백질 질량에 상당히 기여하는 N-당화 (5개의 잠재적 N-당화 부위가 HA1 도메인 내에서 관찰되었다)를 포함하지 않는다. 환원 후 단리된 HA1의 분자 질량은 MALDI/TOF를 이용하여 측정되었는데, 샘플 2에 대해 측정될 때 45268±119 (n=15)이었다. 샘플 3의 경우에, 45229±101 (n=20)의 HA1 분자 질량이 측정되었다. 상기 방법의 오차 내에서, 이들 두 로트 간에 HA1의 분자 질량에서 차이가 없었다. MALDI/TOF 데이터는 당펩티드가 바이러스 단백질의 트립신 효소분해 후 분석되는 LC-MS 펩티드 맵핑 데이터에 의해 더욱 뒷받침되었다.

HA1에서 LC-MS 펩티드 맵핑에 의해 확인된 당펩티드 (신호 펩티드를 제외한 아미노산의 넘버링)

당화된 아미노산	공통 서열	주요 동종형	분자 질량 (평균)
N10 또는 N11	NNST	복합 유형, 트리안테너리, 코어 푸코실화	2135.0
N23	NVT	복합 유형, 바이안탄테너리, 코어 푸코실화	1769.6
N87	NGT	고 만노오스 유형, Man7	1541.4
N278	NTT	복합 유형, 바이안테너리	1623.5
N287	NTS	복합 유형, 바이안테너리	1623.5

이들 N-당화 결과는 MALDI/TOF에 의해 측정된 분자 질량 및 이론적 분자 질량 간에 차이와 우수한 합치를 증명하였다. 질량 계산을 위하여, MALDI/TOF에 의한 분자 질량이 이용되었는데, 그 이유는 이러한 측정이 상이한 N-당화 동종형의 평균에 기초하기 때문이다.

HA2에서 LC-MS 펩티드 맵핑에 의해 확인된 당펩티드 (신호 펩티드를 제외한 아미노산의 넘버링)

당화된 아미노산	공통 서열	주요 동종형	분자 질량 (평균)
N462	NGT	복합 유형, 바이안테너리, 코어 푸코실화	1769.6

HA2는 단리될 수 없고, 따라서 분자 질량이 MALDI/TOF에 의해 측정될 수 없었다. 하지만, N-당화는 LC-MS 펩티드 맵핑에 의해 확인될 수 있었다 (표 5). 계산을 위하여, HA2의 이론적 분자 질량 (25130)이 이용되고, 그리고 확인된 N-당화의 분자 질량이 추가되어 26900의 질량이 산출되었다. HA1과 HA2에 대한 이들 값에 따르면, 당화된 HA1, 당화된 HA2, 그리고 6개 이황화 결합을 포함하는 HA의 전체 분자 질량은 72156이다.

아미노산 분석

아미노산 분석은 (1) 4-비닐피리딘으로 알킬화 단계를 포함하거나, 또는 (2) 인산으로 산성화 단계를 포함하는 샘플 제조의 2가지 옵션에 대해 병렬로, 샘플 제조의 최적화 후 수행되었다. 샘플 2는 HPLC 분석의 보정을 위한 참고 제조물로서 이용되었다.

샘플 2는 알킬화가 정제에 어떻게 영향을 주는 지를 결정하기 위해, 하기에 기술된 바와 같은 알킬화 단계로 제조되었다. HA 함량을 결정하기 위해, HA1 분별이 85℃에서 1시간 동안 붕괴 단계 및 4-비닐피리딘으로 알킬화로 수행되었다. HA1 HPLC 피크 분획물은 수집되고 아미노산 분석에 이용되었다. 가수분해물은 그들의 류신, 발린, 리신과 페닐알라닌 함량에 대해 분석되었다. HA 농도의 계산은 MALDI/TOF에 의해 결정된 바와 같은 분자 질량을 이용하여 수행되었다. 피크당 평균 HA 함량은 93.7±3.2μg/ml HA에 상응하는 4.64μg (n=8)이었다. HA1 순도가 단지 87%인 것으로 결정되었기 때문에, HA 값은 과대산정되었고, 따라서 알킬화가 추가 분석에 유용한 것으로 간주되지 않았다.

85℃에서 1시간 동안 붕괴 및 4-비닐피리딘으로 알킬화를 이용한 샘플 2의 샘플 제조에 기초된 아미노산 데이터

	85℃ + 4VP_2 (mg/피크)	85℃ + 4VP_3 (mg/피크)	85℃ + 4VP_4 (mg/피크)	85℃ + 4VP_5 (mg/피크)	85℃ + 4VP_6 (mg/피크)	85℃ + 4VP_7 (mg/피크)
L-발린	4.47	4.60	4.52	4.71	4.32	4.60
L-리신 HCl	4.09	4.19	4.23	4.36	3.96	4.17
L-류신	4.61	4.73	4.66	4.88	4.42	4.71
L-페닐알라닌	4.92	5.09	4.98	5.25	4.78	5.04
평균	4.52	4.65	4.60	4.80	4.37	4.63
표준 편차	0.34	0.37	0.31	0.37	0.34	0.36
RSD %	7.62	8.00	6.79	7.70	7.72	7.70
피크는 XXμl MVB와 동등	49.50	49.50	49.50	49.50	49.50	49.50
MVB에서 HA (μg/ml)	91.35	93.94	92.89	96.93	88.27	93.49
MVB에서 HA (μg/ml)	93.7
총수	8
표준 편차	3.2
RSD %	3.4

샘플 2는 또한, 산성화 단계로 제조되었다. 샘플 2의 HA 함량을 결정하기 위해, HA1을 내포하는 분획물이 제조되었는데, 이것은 85℃에서 1시간 동안 붕괴 단계 및 인산으로 산성화 단계를 포함하였다. HA1 HPLC 피크 분획물은 수집되고 아미노산 분석에 이용되었다. 가수분해물은 그들의 류신, 발린, 리신, 그리고 페닐알라닌 함량에 대해 분석되었다. HA 농도의 계산은 MALDI/TOF에 의해 결정된 분자 질량을 이용하여 본원에서 기술된 바와 같이 수행되었다. 피크당 평균 HA 함량은 92.7±9.0μg/ml HA에 상응하는 4.21μg (n=8)이었다. 상기 값은 HA HPLC 결정의 추가 보정에 이용되었다. HA1의 분별은 이후, 아미노산 분석을 위해 수행되었다.

85℃에서 1시간 동안 붕괴 및 인산으로 산성화를 이용한 샘플 제조에 기초된 아미노산 데이터

샘플 명칭	85℃ + 4VP_2 (mg/피크)	85℃ + 4VP_3 (mg/피크)	85℃ + 4VP_4 (mg/피크)	85℃ + 4VP_5 (mg/피크)	85℃ + 4VP_6 (mg/피크)	85℃ + 4VP_7 (mg/피크)
L-발린	4.80	4.33	4.26	4.16	3.90	3.81
L-리신 HCl	4.45	3.94	3.84	3.79	3.56	3.40
L-류신	5.34	4.68	4.46	4.35	4.07	3.93
L-페닐알라닌	5.55	4.91	4.69	4.54	4.22	4.06
평균	5.03	4.47	4.31	4.21	3.94	3.80
표준 편차	0.50	0.42	0.36	0.32	0.28	0.29
RSD %	10.00	9.51	8.40	7.62	7.21	7.54
피크는 XXμl MVB와 동등	45.45	45.45	45.45	45.45	45.45	45.45
MVB에서 HA (μg/ml)	110.75	98.25	94.92	92.63	86.60	83.62
MVB에서 HA (μg/ml)	92.7
총수	8
표준 편차	9.0
RSD %	9.7

최종 방법

표 8에서는 새로운 샘플 제조 방법의 개발을 위해 검사된 주요 파라미터를 요약한다. 어떤 방법을 이용할 지에 관한 최종 결정은 주로, LC-MSMS를 이용한 특이성에 기초하여 이루어졌는데, 여기서 4-비닐 피리딘으로 알킬화를 포함하는 방법은 훨씬 낮은 특이성을 보였다. 이러한 관찰 결과는 아마도 변화된 용리 위치에 기인하였는데, 그 이유는 변형이 친수성을 약간 증가시키기 때문이다. 이러한 변화된 용리 위치는 공동 용리하는 단백질의 차이를 유발하였다. 알킬화가 있거나 없는 샘플 제조물에 대한 HA1 용리 프로필이 수행되었다. 4-비닐피리딘으로 알킬화를 이용하여 제조된 샘플에서 HA 함량은 아마도 오염 단백질의 더욱 높은 농도로 인하여, 약간 더 높은 것으로 결정되었다.

2가지 샘플 제조물에 대한 주요 방법 개발 파라미터의 비교.

	옵션 1	옵션 2
환원	85℃, 1시간	85℃, 1시간
알킬화	4-비닐피리딘	알킬화 없음, 인산을 이용한 산성화
AAA에 의한 샘플 2 HA	93.7 μg/ml	92.7 μg/ml
SDS-PAGE에 의한 특이성	53kDa에서 단일 띠	53kDa에서 단일 띠
LC-MSMS에 의한 특이성	87%	96%
바이러스로부터 HA1의 회수	90-120%

모든 후속 실험의 경우에, 샘플 제조는 상기 최초 실험에서 기술된 최적화된 방법에 따라 수행되었다.

정량 방법

선형성

분석 절차의 핵심 범주 중에서 한 가지는 샘플 내에서 분석물의 농도 (양)에 직접적으로 비례하는 검사 결과를 획득하는 능력 (일정한 범위 내에서)인 선형성이다. 농도-의존성 HPLC 반응의 선형성을 증명하기 위해, 샘플 2는 탈이온수로 상이한 농도로 희석되고, 그리고 상이한 농도에서 샘플은 RP-HPLC에 의해 분석되었다. 참고 제조물의 농도는 앞서 기술된 바와 같은 아미노산 분석에 의해 결정되었다.

검사와 참고 항목, 샘플 2

수준	희석	주입 부피(μL)	AAA에 의해 결정된 단백질 농도 (μg/ml)
1	1:4	100	23.175
2	1:3	100	30.9
3	1:2	100	46.35
4	없음	100	92.7
5	없음	150	139.05
6	없음	200	185.4

상기 데이터의 보정 곡선은 23.175 μg/ml와 185.4 μg/ml 사이의 단백질 농도 범위에서 우수한 선형성을 보였다. 표 11에서는 계산된 나머지를 보여준다. 모든 단일 계산된 값은 이론적 값의 ±5% 내에 있다.

특이성

특이성에 대한 중요한 선행 조건은 HA1 HPLC 피크가 충분한 순도를 보인다는 것이다. HA1의 단리된 피크는 SDS-PAGE에 의해 검사되었다. Coomassie 염색과 함께 SDS-PAGE를 이용하여, 단리된 HA1은 단일 띠로서 이동한다. 이러한 HA1 띠는 띠 내에 단백질의 확인을 위한 인-겔 효소분해와 LC-MS/MS 분석에 의해 더욱 분석되었다. 상기 띠는 배타적으로 HA1을 내포하였다. HA1 피크에서 단백질을 분석하기 위한 더욱 민감한 방법은 동결건조 후, 수집된 분획물에 직접적으로 효소분해를 수행하는 것이었다.

모든 확인된 펩티드의 경우에, 내포된 단백질의 순도를 산정하기 위해 재구성된 이온 크로마토그램에서 피크의 높이가 측정되었다. 상이한 펩티드가 상이한 이온화 효력을 갖기 때문에, 이러한 방법은 어떤 단백질이 검출가능한 지의 산정 및 근사한 상대 정량으로서 이용되었다.

HA1 이중 피크로부터 단리된 피크 1과 피크 2의 순도

번호	참고	P (pro) 1	스코어 2	모든 확인된 펩티드의 피크 높이 합계	높이 %
1	HA 인플루엔자 A 바이러스 (A/California/07/2009 (H1N1)	1.09E-09	130.15	55264118	96.39
2	액틴 숙주 세포 관련됨	1.17E-07	56.17	1226697	2.14
3	코필린-1 숙주 세포 관련됨	2.33E-11	50.20	477875	0.83
4	뉴클레오캡시드 단백질 인플루엔자 A 바이러스	9.24E-07	20.14	365744	0.64
합계				57334434	100.00

¹ P (pro)는 단백질 정합에 대한 확률이다 (값이 더욱 낮을수록 정합이 더욱 우수하다)

²는 SEQUEST 검색의 품질에 대한 파라미터이다 (값이 더욱 높을수록 정합이 더욱 우수하다)

표 12에서 확인할 수 있는 바와 같이, HA1 피크는 >96% HA1을 내포한다. 미량 불순물은 핵단백질 및 숙주 세포 단백질 (액틴과 코필린-1)로서 확인되었다.

정밀도

샘플 2에서 HA 함량을 결정하기 위한 방법의 정도를 증명하기 위하여, HA 함량의 총 12회 결정이 2가지 농도, 23.175 μg/ml와 92.7 μg/ml에서 2일 (각 일자에 6회) 동안 수행되었다. 하루중 정밀도는 낮은 농도의 경우에 2.96%와 1.77%이고, 그리고 높은 농도 샘플의 경우에 0.81%와 0.89%이었다. 상대 표준 편차 (RSD)는 낮은 농도 샘플의 경우에 2.19%, 그리고 높은 농도 샘플의 경우에 1.30%이었다.

탈이온수로 1:4 희석된 샘플 2의 HA 정량, 23.175μg/ml에서 정밀도

반복	1일자 [μg/ ml ]	2일자 [μg/ ml ]	모든 데이터 [μg/ml]
1	22.80	22.72
2	22.42	23.41
3	23.74	22.70
평균	22.99	22.94	22.97
RSD	2.96%	1.77%	2.19%

샘플 2의 HA 정량, 92.7μg/ml에서 정밀도

반복	1일자 [μg/ ml ]	2일자 [μg/ ml ]	모든 데이터 [μg/ml]
1	91.32	94.87
2	92.44	93.73
3	92.74	93.24
평균	92.17	93.95	93.06
RSD	0.81%	0.89%	1.30%

본 발명은 본 발명의 실시를 위한 특정한 양식을 포함하는 것으로 확인되거나 제안된 특정 구체예에 관해서 기술되었다. 기술된 발명의 다양한 변형과 변이는 본 발명의 범위와 기술적 사상을 벗어나지 않으면서, 당업자에게 명백할 것이다. 비록 본 발명이 특정한 구체예와 관련하여 기술되긴 했지만, 청구된 발명은 이런 특정한 구체예에 부당하게 한정되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 실제로, 당해 분야에서 평균적 기술자에게 명백한, 본 발명을 실시하기 위한 기술된 양식의 다양한 변형은 하기 청구항의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.

Claims (32)

1. 백신 조성물로부터 혈구응집소 (HA) 항원 또는 항원 아류형을 단리하기 위한 방법에 있어서, 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
   (a) 백신 조성물 내에 항원 또는 항원 아류형을 세정제가 아닌 환원 작용제에 의한 환원에 의해 용해화하는 단계로서, 상기 환원은 70℃, 75℃, 80℃, 85℃ 또는 90℃의 배양 온도를 포함하는 단계;
   (b) 상기 항원 또는 항원 아류형을 산성화하여 이황화 결합 형성을 예방하는 단계; 및
   (c) 항원 또는 항원 아류형을 분별에 의해 단리하는 단계.
2. 삭제
3. 청구항 1에 있어서, 환원은 백신 조성물을 디티오트레이톨로 처리하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 청구항 1에 있어서, 용해화 단계는 무질서유발제로 변성을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 삭제
6. 항원을 포함하는 백신 조성물에서 항원 또는 항원 아류형 함량을 정량하기 위한 방법에 있어서, 항원 또는 항원 아류형을 정량하는 추가 단계와 함께 청구항 1의 방법을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 청구항 6에 있어서, 정량 단계는 항원 표준을 이용하지 않으면서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 청구항 6에 있어서, 정량 단계는 항원 표준을 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 청구항 6에 있어서, 정량 단계는 아미노산 분석에 의해 항원을 정량하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 청구항 6에 있어서, 환원은 5분 내지 20시간의 배양 시간을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 청구항 6에 있어서, 환원은 30분 내지 2시간의 배양 시간을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 청구항 6에 있어서, 환원은 1시간의 배양 시간을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
13. 삭제
14. 삭제
15. 청구항 6에 있어서, 환원은 85℃에서 배양 온도를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
16. 청구항 4에 있어서, 무잘서유발제는 구아니딘 염산염, 요소, 티오요소, 리튬, 과염소산염, 또는 티오시아네이트인 것을 특징으로 하는 방법.
17. 청구항 6에 있어서, 산성화는 인산, 염산, 황산, 트리플루오르아세트산, 펜타플루오르프로피온산, 헵타플루오르부티르산, 또는 포름산으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
18. 청구항 6에 있어서, 분별은 크로마토그래피에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
19. 청구항 18에 있어서, 크로마토그래피는 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 역상 HPLC (RP-HPLC), 이온 교환-HPLC (IEX-HPLC), 친화성 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC), 또는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)인 것을 특징으로 하는 방법.
20. 청구항 19에 있어서, 크로마토그래피는 역상 (RP)-HPLC인 것을 특징으로 하는 방법.
21. 삭제
22. 삭제
23. 청구항 6에 있어서, HA는 인플루엔자 바이러스 백신 조성물, 홍역 바이러스 백신 조성물, 파라인플루엔자 바이러스 백신 조성물, 또는 볼거리 바이러스 백신 조성물로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 방법.
24. 청구항 6에 있어서, 백신 조성물은 인플루엔자 바이러스 백신 조성물인 것을 특징으로 하는 방법.
25. 청구항 23 내지 24중 어느 한 항에 있어서, 인플루엔자 바이러스 백신 조성물은 인플루엔자 A와 인플루엔자 B로 구성된 군에서 선택되는 인플루엔자 바이러스로부터 보호를 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
26. 청구항 6에 있어서, 항원 아류형은 인플루엔자 A HA1, HA2, HA3, HA4, HA5, HA6, HA7, HA8, HA9, HA10, HA11, HA12, HA13, HA14, HA15 및 HA16, 그리고 인플루엔자 B HA 중에서 임의의 한 가지인 것을 특징으로 하는 방법.
27. 청구항 26에 있어서, 항원 아류형은 인플루엔자 A HA 아류형 HA1, HA2, HA3, HA5, HA7, HA9, HA10, 또는 인플루엔자 B HA인 것을 특징으로 하는 방법.
28. 청구항 27에 있어서, 인플루엔자 A HA 아류형은 HA1인 것을 특징으로 하는 방법.
29. 청구항 26 내지 28중 어느 한 항에 있어서, 인플루엔자 백신 조성물은 인플루엔자 A H1N1, H1N2, H2N2, H3N2, H5N1, H7N1, H7N2, H7N3, H7N7, H9N2, H10N7, 그리고 인플루엔자 B로 구성된 군에서 선택되는 인플루엔자 유형으로부터 보호를 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
30. 청구항 6에 있어서, 2.5% 이하의 상대 표준 편차 (RSD)로 항원 함량을 정량하는 것을 특징으로 하는 방법.
31. 청구항 29에 있어서, RSD는 2.2%인 것을 특징으로 하는 방법.
32. 청구항 30에 있어서, RSD는 1.3%인 것을 특징으로 하는 방법.