KR101955906B1

KR101955906B1 - Antibody for red sea bream iridovirus and its use

Info

Publication number: KR101955906B1
Application number: KR1020160134630A
Authority: KR
Inventors: 이택견; 이석찬; 박소윤; 황진익; 박미례; 길의준; 조상호; 서하늘; 박동훈
Original assignee: 한국해양과학기술원
Priority date: 2016-10-17
Filing date: 2016-10-17
Publication date: 2019-03-11
Also published as: KR20180042046A

Abstract

본 발명은 적색 도미 이리도바이러스(RSIV)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편, 및 적색 도미 이리도바이러스의 검출을 위한 그의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to an antibody or an antigen-binding fragment that specifically binds to red sea bream virus (RSIV), and a use thereof for the detection of red bombyovirus.

Description

ANTIBODY FOR RED SEA BREAM IRIDOVIRUS AND ITS USE BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention < RTI ID = 0.0 >

우리나라의 대표적인 어류질병으로는 이리도바이러스병을 포함해서 에드와드병, 연쇄구균병, 비브리오병, 활주세균병 등이 있다. 이들 바이러스는 수산동물 질병으로 국내 총 피해규모가 연간 약 2,500억원으로 추정된다. 특히, 이리도바이러스(iridovirus)는 1990년 일본에서 처음으로 발병한 이후, 한국 중국 동남아시아 국가들 에서 발병한 어류전염병으로 수평감염과 20~30℃의 고수온기에 발병한다. 감염된 어류는 무기력하게 유영하며 채색흑화/회색, 출혈, 안구돌출 등의 증상이 있으며, 해부 시 지장 종대/흑화, 위심강내 출혈 등이 특징적으로 나타난다.Representative fish diseases in Korea include Irido virus disease, Edwad disease, Streptococcal disease, Vibrio disease, and Slide bacterial disease. These viruses are estimated to total about 250 billion won in total damage due to animal diseases in Korea. In particular, iridovirus is a fish infectious disease that occurred in Korea, China, Southeast Asia since its first outbreak in Japan in 1990, and it is caused by horizontal infection and high temperature of 20 ~ 30 ℃. The infected fish swim helplessly and have symptoms such as color blackening / graying, bleeding, and protrusion of the eyeball. The anatomical features of the anatomic tendon / blackening and intracranial hemorrhage are characteristic features.

이러한 바이러스 진단법으로는 전자현미경 또는 혈청학적 방법 등이 사용되고 있으며, 가장 널리 사용되는 것은 ELISA 법을 이용한 혈청학적 방법이다. 혈청학적 분석 방법은 항체를 이용하는 분석 방법이다. 특히 혈청학적 방법은 특이성, 신속함 및 단순함 때문에 자주 사용되고 있다. 혈청학적 방법은 항체의 질에 크게 의존하는데, 고도로 정제되고 정확한 항원을 사용하는 것은 더 특이한 항체를 얻는데 있어서 가장 중요한 요소 중의 하나이다. 그러나, 항체를 생산하기 위해서는 동물의 희생을 필요로 하거나 동물세포 배양을 위해 고비용이 요구되며, 많은 시간이 소요된다. 또한 바이러스 진단을 위한 항체를 생산하기 위해서는 바이러스 항원을 확보해야 하는데, 국내에서 얻기 어려운 바이러스의 경우 항원확보에 어려움이 생겨 새로운 바이러스에 대한 대응속도가 떨어지는 문제가 있다. 또한, 대상 단백질의 발현이 일어나지 않거나 정제가 거의 불가능한 경우 대상 항원을 얻는 것이 어렵기 때문에, 전통적인 혈청학적 방법은 사용하기 어려운 경우가 많다. 따라서 virus-like particles (VLPs)을 어류에 주사하는 직접 면역법을 사용하거나, 곤충세포 및 대장균 발현시스템을 사용하여 VLPs를 생산하는 방법이 사용되어 왔다. 최근에는 RGNNV 외피단백질 유전자가 형질전환된 효모(Saccharomyces cerevisiae) 분쇄물로부터 VLPs를 분리하고, 크로마토그래피를 이용하여 정제하는 방법이 보고되기도 하였다 (Choi Y. R. , Kim H. J. , Lee J. Y. , Kang H. A. , Kim H. , Kim J. 2013 Chromatographically-purified capsid proteins of red-spotted grouper nervous necrosis virus expressed in Saccharomyces cerevisiae form virus-like particles Protein Expr Purif 89 162 - 168).Electron microscopy or serologic methods are used for these virus diagnosis methods. Serologic methods using ELISA are most widely used. Serological analysis is an analytical method using antibodies. Serologic methods in particular are frequently used because of their specificity, speed and simplicity. Serological methods are highly dependent on the quality of the antibody, and the use of highly purified and accurate antigens is one of the most important factors in obtaining more specific antibodies. However, in order to produce antibodies, high cost is required for animal sacrifice or animal cell culture, and it takes a lot of time. In order to produce antibodies for the diagnosis of viruses, virus antigens must be secured. In the case of viruses which are difficult to obtain in Korea, it is difficult to secure antigens, and thus there is a problem that the speed of response to new viruses is low. In addition, traditional serological methods are often difficult to use because it is difficult to obtain the target antigen if expression of the protein of interest does not occur or purification is nearly impossible. Thus, methods have been used that either use direct immunization to inject virus-like particles (VLPs) into fish, or produce VLPs using insect cells and an E. coli expression system. Recently, a method has been reported for isolating VLPs from Saccharomyces cerevisiae pulverized yeast transformed with the RGNNV coat protein gene and purifying them using chromatography (Choi, YJ, Lee, JH, Kang, HA ., Kim J. 2013 Chromatographically-purified capsid proteins of red-spotted grouper nervous necrosis virus expressed in Saccharomyces cerevisiae form virus-like particles Protein Expr Purif 89 162-168.

적색 도미 이리도바이러스(RSIV)는 수산생물에 감염되었을 시 수확량의 현저한 감소를 가져오는 것으로 보고되어 있고, 해수를 통해 수평 전염 되어 집단폐사를 야기할 수 있으므로, 이에 대한 정확하고 신속하며 경제적인 진단법의 개발이 필요한 실정이다.Red Bombyx mori virus (RSIV) has been reported to result in a significant reduction in yields when infected with aquatic organisms, and it can cause horizontal transmission through seawater, resulting in collective mortality. Therefore, accurate, fast and economical diagnostic methods Development is necessary.

본원은, 돔류 뿐만 아니라 넙치, 방어, 농어 등 국내의 여러 수산생물에 전염력이 있으며 감염 시 대량 폐사를 일으키는 등 심각한 피해를 주는 것으로 알려져 있는 적색 도미 이리도바이러스(RSIV) 항원단백질을 대량 생산하고 이를 검출하는 scFv(single-chain variable fragment)을 선발함으로써 RSIV에 감염된 어류를 조기 진단할 수 있는 항체 또는 항원 결합 단편 및 이를 이용한 RSIV 검출과 관련된 용도를 제공하고자 한다.The present invention relates to a method for mass production of red sea bream virus (RSIV) antigen protein which is known to infect not only domestic fish but also various fish species such as flounder, defense, and perch, Antibody fragment or antigen-binding fragment thereof capable of early diagnosis of RSIV-infected fish by selecting a single-chain variable fragment (scFv) to be used for detection of RSIV.

그러나, 본원이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the problems to be solved by the present invention are not limited to the above-mentioned problems, and other problems not mentioned can be clearly understood by those skilled in the art from the following description.

본원의 제 1 측면은, 서열번호 1로 표시되는 중쇄 가변영역(VH)을 포함하는, 적색 도미 이리도바이러스(RSIV)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편에 관한 것이다.The first aspect of the present invention relates to an antibody or antigen-binding fragment that specifically binds to red rain iridovirus (RSIV), comprising the heavy chain variable region (VH) of SEQ ID NO: 1.

본원의 제 2 측면은, 서열번호 1로 표시되는 중쇄 가변영역(VH)을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는, 적색 도미 이리도바이러스(RSIV) 검출용 조성물에 관한 것이다.The second aspect of the present invention relates to a composition for detecting red rain iriidovirus (RSIV) comprising an antibody or antigen-binding fragment comprising the heavy chain variable region (VH) of SEQ ID NO: 1.

본원의 제 3 측면은, 본원의 제 1 측면에 따른 항체 또는 항원 결합 단편 또는 본원의 제 2 측면에 따른 조성물을 포함하는, 적색 도미 이리도바이러스(RSIV) 검출용 키트에 관한 것이다.A third aspect of the invention relates to a kit for detecting red rain iriidovirus (RSIV) comprising an antibody or antigen-binding fragment according to the first aspect of the invention or a composition according to the second aspect of the invention.

본원의 제 4 측면은, 서열번호 1로 표시되는 중쇄 가변영역(VH)을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다.A fourth aspect of the invention relates to a nucleic acid molecule encoding a heavy chain variable region (VH) as set forth in SEQ ID NO: 1.

본원의 제 5 측면은, 본원의 제 4 측면에 따른 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.A fifth aspect of the invention relates to a recombinant vector comprising a nucleic acid molecule according to the fourth aspect of the invention.

본원의 제 6 측면은, 본원의 제 5 측면에 따른 재조합 벡터를 포함하는 숙주세포에 관한 것이다.A sixth aspect of the invention relates to a host cell comprising a recombinant vector according to the fifth aspect of the invention.

본원의 제 7 측면은, 본원의 제 6 측면에 따른 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는, 서열번호 1로 표시되는 중쇄 가변영역(VH)을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편의 제조방법에 관한 것이다.A seventh aspect of the invention relates to a method for producing an antibody or antigen-binding fragment comprising the heavy chain variable region (VH) of SEQ ID NO: 1, comprising culturing a host cell according to the sixth aspect of the invention .

본원의 제 8 측면은, 본원의 제 1 측면에 따른 항체 또는 항원 결합 단편과 시료를 접촉시키는 단계; 및 상기 항체 또는 항원 결합 단편과 적색 도미 이리도바이러스(RSIV) 외피 단백질의 결합을 탐지하는 단계를 포함하는, 적색 도미 이리도바이러스(RSIV) 검출 방법에 관한 것이다.According to an eighth aspect of the present application, there is provided a method for detecting an antibody, comprising: contacting a sample with an antibody or antigen-binding fragment according to the first aspect of the present invention; And detecting the binding of the antibody or antigen binding fragment to a red bliiridovirus (RSIV) coat protein.

본원에 따르면, 수산생물에 감염되었을 시 수확량의 현저한 감소를 가져올 수 있고, 해수를 통해 수평 전염 되어 집단폐사를 야기할 수 있는 적색 도미 이리도바이러스(RSIV) 항원단백질을 정확하고 효율적으로 검출할 수 있는 항체 또는 항원 결합 단백질, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 적색 도미 이리도바이러스의 검출 방법을 제공할 수 있다.According to the present invention, it is possible to accurately and efficiently detect a red blood redriver virus (RSIV) antigen protein, which can lead to a significant reduction in yield when infected with aquatic organisms and horizontally transmitted through sea water, Antibody or antigen binding protein, a method for producing the same, and a method for detecting red bombyovirus using the same.

또한, 본원에 기재된 방법에 따르면 RSIV 뿐만 아니라 다른 종류의 바이러스에 대해서도 항원을 쉽게 확보할 수 있고 이에 대한 scFv 항체를 신속하게 개발할 수 있을 것으로 기대되며, 이로부터 다양한 바이러스에 신속한 대응이 가능하며 항체유전자를 확보하여 항체공학을 통한 혈청학적 분석 키트를 개발할 수 있다.In addition, according to the method described in the present application, it is expected that antigens can be easily obtained for RSIV as well as other kinds of viruses, and scFv antibodies against the viruses can be rapidly developed, thereby enabling rapid response to various viruses, To develop a serological analysis kit through antibody engineering.

도 1은 적색 도미 이리도바이러스 외피 단백질(sea bream iridovirus coat protein, RSIV CP)의 유전자 서열을 나타낸 이미지이다.
도 2는 본원의 일 실시예에 따라 제조된 효모표면발현벡터의 개략도이다.
도 3은 본원의 일 실시예에 따른 효모표면발현의 결과를 나타낸 유세포분석 이미지이다.
도 4는 본원의 일 실시예에서 선발된 파지 scFv 클론들을 증폭시키기 위해 사용된 프라이머 세트의 서열을 나타낸 이미지이다.
도 5a는 본원의 일 실시예에서 선발된 scFv 클론을 전기영동하여 확인한 이미지이며, 도 5b는 선발된 scFv 클론의 아미노산 서열로부터 추정되는 CDR 영역을 나타낸 이미지이다.
도 6은 본원의 일 실시예에 따라 scFv 유전자 중 VH 및 VL 부분을 증폭하기 위해 사용된 프라이머 세트의 서열을 나타낸 이미지이다.
도 7은 본원의 일 실시예에서 선발된 scFv 클론인 D2의 VH 및 VL 유전자가 증폭된 것을 전기영동으로 확인한 이미지이다.
도 8은 본원의 일 실시예에 따라 플라스미드에 삽입된 scFv 절편의 개략도이다.
도 9는 본원의 일 실시예에 따라 수득된 항체 단백질의 정제 후 웨스턴 블롯을 수행한 결과를 나타낸 이미지이다.
도 10은 본원의 일 실시예에 따라 수득된 중쇄 가변영역의 RSIV CP에 대한 특이적 결합 여부를 확인하기 위해 수행한 ELISA 분석 결과를 나타낸 이미지이다.FIG. 1 is an image showing a gene sequence of a red bream iridovirus coat protein (RSIV CP).
Figure 2 is a schematic representation of a yeast surface expression vector prepared in accordance with one embodiment of the present invention.
3 is a flow cytometry image showing the results of yeast surface expression according to one embodiment of the present invention.
Figure 4 is an image showing the sequence of the primer set used to amplify the phage scFv clones selected in one embodiment of the invention.
FIG. 5A is an image obtained by electrophoresis of a scFv clone selected in one embodiment of the present invention, and FIG. 5B is an image showing a CDR region deduced from the amino acid sequence of the selected scFv clone.
Figure 6 is an image showing the sequence of the primer set used to amplify the VH and VL portions of the scFv gene according to one embodiment of the present application.
FIG. 7 is an image obtained by electrophoresis showing amplification of the VH and VL genes of D2, which is a scFv clone selected in one embodiment of the present invention.
Figure 8 is a schematic view of an scFv fragment inserted into a plasmid according to one embodiment of the invention.
FIG. 9 is an image showing the result of performing Western blotting after purification of the antibody protein obtained according to one embodiment of the present invention. FIG.
10 is an image showing the result of an ELISA analysis performed to confirm the specific binding of the heavy chain variable region obtained according to one embodiment of the present invention to RSIV CP.

이하, 첨부한 도면을 참조하여 본원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 구현예 및 실시예를 상세히 설명한다.Hereinafter, embodiments and examples of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings, so that those skilled in the art can easily carry out the present invention.

그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 구현예 및 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본원을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였다.It should be understood, however, that the present invention may be embodied in many different forms and is not limited to the embodiments and examples described herein. In order to clearly explain the present invention in the drawings, portions not related to the description are omitted.

본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.Throughout this specification, when an element is referred to as " including " an element, it is understood that the element may include other elements as well, without departing from the other elements unless specifically stated otherwise.

본 명세서에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 예를 들어, 용어 "약"이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.As used herein, the terms " about, " " substantially, " and the like are used herein to refer to or approximate the numerical value of manufacturing and material tolerances inherent in the stated sense, Accurate or absolute numbers are used to prevent unauthorized exploitation by unauthorized intruders of the mentioned disclosure. For example, the term " about " is used to refer to a reference quantity, level, value, number, frequency, percentage, dimension, size, quantity, weight, or length of 30, 25, 20, 25, 10, 9, Level, value, number, frequency, percentage, dimension, size, quantity, weight or length of a form, level, value varying from 1 to 6, 5, 4, 3,

또한, 본원 명세서 전체에서, "~ 하는 단계" 또는 "~의 단계"는 "~를 위한 단계"를 의미하지 않는다.Also, throughout the present specification, the phrase " step " or " step " does not mean " step for.

본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 "이들의 조합"의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.Throughout this specification, the term " combination thereof " included in the expression of the machine form means one or more combinations or combinations selected from the group consisting of the constituents described in the expression of the machine form, And the like.

본원 명세서 전체에서, "A 및/또는 B"의 기재는, "A 또는 B, 또는, A 및 B"를 의미한다. Throughout this specification, the description of "A and / or B" means "A or B, or A and B".

본원 명세서 전체에서, "프라이머(primer)" 란 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 본원발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.Throughout this specification, a "primer" is a nucleic acid sequence having a short free 3 'hydroxyl group that can form base pairs with a complementary template and is a starting point for template strand copying Quot; means a short nucleic acid sequence which functions. The primers of the present invention can be chemically synthesized using the phosphoramidite solid support method, or other well-known methods.

본원 명세서 전체에서, 용어 "중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction: PCR)" 은 특정 DNA 영역을 시험관 내에서 효소를 이용하여 원하는 부분을 증폭하는, 대표적인 핵산증폭기술(NAT) 중의 하나이다.PCR은 기본적으로 변성, 결합, 연장의 세 단계로 구성되어 있고, 이 과정이 반복되면서 DNA가 증폭된다. PCR의 제1단계는 주형 DNA를 단일쇄로 변성시킨다(변성단계). 제2단계는 목적하는 영역을 사이에 두는 두 종류의 단일쇄 DNA에 결합시킨다(결합단계). 제3단계는 프라이머로부터 고열에 내성인 DNA 중합효소에 의해 DNA를 합성하고 이상의 사이클을 적절한 횟수(예컨대, 25 내지 40회)로 반복한다.Throughout the specification, the term " polymerase chain reaction " (PCR) is one of the representative nucleic acid amplification techniques (NAT) that amplify a desired DNA region by using an enzyme in a specific DNA region. , Which consists of three steps: denaturation, binding, and extension. This process is repeated to amplify the DNA. The first step of the PCR is to denature the template DNA into a single strand (denaturation step). The second step is to bind the two types of single-stranded DNA between the target regions (the binding step). The third step is to synthesize DNA from the primer by a high temperature resistant DNA polymerase and repeat the above cycle with an appropriate number of times (for example, 25 to 40 times).

이하, 본 발명에 대하여 구현예 및 실시예와 도면을 참조하여 구체적으로 설명하도록 한다. 그러나, 본 발명이 이러한 구현예 및 실시예와 도면에 제한되는 것은 아니다. Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to embodiments, examples and drawings. However, the present invention is not limited to these embodiments and examples and drawings.

본원의 제 1 측면은, 서열번호 1로 표시되는 중쇄 가변영역(VH)을 포함하는, 적색 도미 이리도바이러스(RSIV)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 제공한다. 서열번호 1은 중쇄 가변영역의 아미노산 서열을, 서열번호 2는 중쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 서열을 나타낸다.A first aspect of the invention provides an antibody or antigen-binding fragment that specifically binds to a red rain iridovirus (RSIV), comprising the heavy chain variable region (VH) of SEQ ID NO: 1. SEQ ID NO: 1 shows the amino acid sequence of the heavy chain variable region and SEQ ID NO: 2 shows the nucleic acid sequence encoding the heavy chain variable region.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 적색 도미 이리도바이러스의 외피 단백질(coat protein, CP)에 특이적으로 결합하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.In one embodiment of the invention, the antibody or antigen-binding fragment may specifically bind to coat protein (CP) of red bream virus, but may not be limited thereto.

일반적으로, 완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.In general, a complete antibody is a structure having two full-length light chains and two full-length heavy chains, each light chain being linked by a disulfide bond with a heavy chain. The heavy chain constant region has gamma (gamma), mu (mu), alpha (alpha), delta (delta) and epsilon (epsilon) types and subclasses gamma 1 (gamma 1), gamma 2 ), Gamma 4 (gamma 4), alpha 1 (alpha 1) and alpha 2 (alpha 2). The constant region of the light chain has kappa (kappa) and lambda (lambda) types.

본 명세서에서 용어항원 결합 단편은 전체 항체 분자 내에서 항원-항체 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv, 및 이들의 단편 등을 포함한다. Fv는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 PCT 국제 공개특허출원 WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086 및 WO 88/09344에 개시되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 단쇄의 가변영역이 공유결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. As used herein, the term antigen-binding fragment means a fragment having an antigen-antibody binding function in the whole antibody molecule, and includes Fab, F (ab '), F (ab') 2 and Fv, . Recombinant techniques for producing Fv fragments with minimal antibody fragments having only a heavy chain variable region and a light chain variable region are described in PCT International Publication Nos. WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086, WO 88/09344. The double-chain Fv is a non-covalent linkage between a heavy chain variable region and a light chain variable region. A single-chain Fv generally shares a variable region of a heavy chain and a variable region of a short chain via a peptide linker Or directly connected at the C-terminus to form a dimer-like structure like the double-stranded Fv.

본 명세서에서 용어중쇄는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VH 및 3 개의 불변영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 또한, 본 명세서에서 용어경쇄는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VL 및 불변영역 도메인 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.As used herein, the term heavy chain refers to a full-length heavy chain comprising a variable region domain VH comprising an amino acid sequence with sufficient variable region sequence to confer specificity to the antigen and three constant region domains CH1, CH2 and CH3, it means. Also, as used herein, the term light chain refers to both the full-length light chain and fragments thereof, including the variable region domain VL and the constant region domain CL comprising an amino acid sequence having sufficient variable region sequence to confer specificity to the antigen.

예를 들어, 본 발명의 항체는 단일클론 항체일 수 있다. 용어 "단일클론 항체"는 실질적으로 동일한 항체 집단에서 수득한 단일 분자 조성의 항체분자를 의미하며, 단일클론 항체는 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다. 단일의 하이브리도마 세포주로부터 분리된 항체는 단일클론 항체라 할 수 있다.For example, the antibody of the present invention may be a monoclonal antibody. The term " monoclonal antibody " refers to a single molecule composition of an antibody molecule obtained in a substantially identical population of antibodies, wherein the monoclonal antibody exhibits a single binding specificity and affinity for a particular epitope. An antibody isolated from a single hybridoma cell line can be a monoclonal antibody.

본원의 제 2 측면은, 서열번호 1로 표시되는 중쇄 가변영역(VH)을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는, 적색 도미 이리도바이러스(RSIV) 검출용 조성물을 제공한다.The second aspect of the present invention provides a composition for detecting red rain iriidovirus (RSIV) comprising an antibody or antigen-binding fragment comprising the heavy chain variable region (VH) of SEQ ID NO: 1.

본원의 제 3 측면은, 본원의 제 1 측면의 항체 또는 항원 결합 단편, 또는 본원의 제 2 측면의 조성물을 포함하는, 적색 도미 이리도바이러스(RSIV) 검출용 키트를 제공한다.A third aspect of the invention provides a kit for detecting red blemish virus (RSIV) comprising an antibody or antigen-binding fragment of the first aspect of the invention, or a composition of the second aspect of the invention.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 키트는 면역분석(immunoassay)용 키트일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.In one embodiment of the invention, the kit may be, but not limited to, a kit for immunoassay.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 면역분석용 키트는 단백질 마이크로어레이 또는 ELISA 분석 키트일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.In one embodiment of the invention, the immunoassay kit may be a protein microarray or an ELISA assay kit, but is not limited thereto.

ELISA 분석은 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 이차항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함할 수 있다. 본 발명의 항체는 검출 표지를 가질 수 있으며, 검출표지를 가지지 않을 경우는 본 발명의 항체를 포획할 수 있고 검출 표지를 가지는 또 다른 항체를 처리하여 확인할 수 있다.ELISA assays include direct ELISA using a labeled antibody that recognizes an antigen attached to a solid support, indirect ELISA using a labeled secondary antibody that recognizes the capture antibody in a complex of antibodies recognizing an antigen attached to a solid support, A direct sandwich ELISA using another labeled antibody that recognizes the antigen in the complex of the attached antibody and the antigen, an antibody that recognizes the antibody after reacting with another antibody recognizing the antigen in the complex of the antibody and the antigen attached to the solid support Indirect sandwich ELISA using labeled secondary antibodies, and the like. The antibody of the present invention can have a detection label, and when it does not have a detection label, it can be identified by treating another antibody capable of capturing the antibody of the present invention and having a detection label.

본 발명의 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 추가적으로 포함할 수 있다. ELISA 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한, ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트 됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.The kit of the present invention may further include essential elements necessary for performing ELISA. ELISA kits contain antibodies specific for the marker protein. An antibody is a monoclonal antibody, polyclonal antibody or recombinant antibody, which has high specificity and affinity for the marker protein and little cross-reactivity to other proteins. In addition, ELISA kits can contain antibodies specific for the control protein. Other ELISA kits can be used to detect antibodies that can bind a reagent capable of detecting the bound antibody, such as a labeled secondary antibody, chromophores, an enzyme (e. G., Conjugated to an antibody) Other materials, and the like.

본 발명의 키트는 여러 가지 시료를 동시에 분석하기 위하여 단백질 마이크로어레이를 수행하기 위해 필요한 필수요소를 추가적으로 포함할 수 있다. 마이크로어레이 키트는 고체상에 결합된 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 단백질 마이크로어레이 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단, 효소(예: 항체와 융합됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 단백질 마이크로어레이를 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하는 것을 포함할 수 있다.The kit of the present invention may further include essential elements necessary for performing a protein microarray to simultaneously analyze various samples. Microarray kits contain antibodies specific for the marker protein bound to the solid phase. Protein microarray kits may comprise reagents capable of detecting bound antibodies, such as a labeled secondary antibody, a chromophore, an enzyme (e.g., fused with an antibody) and other substrates capable of binding to the substrate or antibody, . A method of analyzing a sample using a protein microarray is a method of separating a protein from a sample, hybridizing the separated protein with a protein chip to form an antigen-antibody complex, reading the resultant protein, &Lt; / RTI >

본원의 제 4 측면은, 서열번호 1로 표시되는 중쇄 가변영역(VH)을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.A fourth aspect of the invention provides a nucleic acid molecule encoding a heavy chain variable region (VH) as set forth in SEQ ID NO: 1.

본원의 제 5 측면은, 본원의 제 4 측면의 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.A fifth aspect of the invention provides a recombinant vector comprising a nucleic acid molecule of the fourth aspect of the invention.

본 명세서에서 용어벡터는 숙주세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터; 코즈미드 벡터; 그리고 박테리오파지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.As used herein, the term vector refers to a plasmid vector as a means for expressing a gene of interest in a host cell; Cosmeptide vector; And viral vectors such as bacteriophage vectors, adenovirus vectors, retroviral vectors, and adeno-associated viral vectors, and the like.

본 발명의 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001) 등에 개시되어 있다.The recombinant vector of the present invention can be constructed through various methods known in the art, and specific methods for this are disclosed in Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001).

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ프로모터, pRλ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, gal 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주세포로서 E. coli(예컨대, HB101, BL21, DH5α 등)가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위(Yanofsky, C. J. Bacteriol. 158:1018-1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터(pLλ프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D. Ann. Rev. Genet. 14:399-445(1980))가 조절부위로서 이용될 수 있다. 숙주세포로서 바실러스 균이 이용되는 경우, 바실러스 츄린겐시스의 독소단백질 유전자의 프로모터(Appl. Environ. Microbiol. 64:3932-3938(1998); Mol. Gen. Genet. 250:734-741(1996)) 또는 바실러스균에서 발현 가능한 어떠한 프로모터라도 조절부위로 이용될 수 있다.The vector of the present invention can typically be constructed as a vector for cloning or as a vector for expression. In addition, the vector of the present invention can be constructed by using prokaryotic cells or eukaryotic cells as hosts. For example, when the vector of the present invention is an expression vector and a prokaryotic cell is used as a host, a strong promoter capable of promoting transcription (such as a tac promoter, lac promoter, lacUV5 promoter, lpp promoter, pL 貫 promoter, pR 貫 promoter , the rac5 promoter, the amp promoter, the gal promoter, the recA promoter, the SP6 promoter, the trp promoter and the T7 promoter), a ribosome binding site for initiation of detoxification, and a transcription / As the host cell E. coli (e.g., HB101, BL21, DH5α, etc.), if used, E. coli promoter of the tryptophan biosynthetic pathway and the operator site (Yanofsky, CJ Bacteriol 158:. 1018-1024 (1984)) , and phage λ (PL? Promoter, Herskowitz, I. and Hagen, D. Ann. Rev. Genet. 14: 399-445 (1980)) can be used as a regulatory region. When the Bacillus bacterium is used as a host cell, the promoter of the toxin protein gene of Bacillus thuringiensis (Appl. Environ. Microbiol. 64: 3932-3938 (1998); Mol. Gen. Genet. 250: 734-741 (1996) ) Or any promoter capable of expressing in Bacillus may be used as a regulatory region.

한편, 본 발명의 재조합 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예: pCL, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지(예: λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.Meanwhile, the recombinant vector of the present invention can be prepared by using a plasmid (for example, pCL, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8 / 9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pGEX series, pET series, pUC19, etc.), phage (e.g., λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 and M13) or viruses (eg SV40 and the like).

한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터, β-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터 엡스타인바 바이러스(EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 가질 수 있다.On the other hand, when the vector of the present invention is an expression vector and a eukaryotic cell is used as a host, a promoter derived from a genome of a mammalian cell such as a metallothionein promoter, a beta -actin promoter, a human heterologous promoter, A promoter derived from mammalian viruses such as adenovirus late promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, cytomegalovirus (CMV) promoter, HSV tk promoter, mouse breast tumor virus (MMTV) promoter , The LTR promoter of HIV, the promoter of Moloney virus promoter Epstein Barr virus (EBV) and the promoter of Roussacomavirus (RSV)) can be used, and as a transcription termination sequence, a polyadenylation sequence have.

본 발명의 재조합 벡터는 그로부터 발현되는 항체의 정제를 용이하게 하기 위하여 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은, 예컨대 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA); 말토스 결합 단백질(NEB, USA); FLAG(IBI, USA); 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA), Pre-S1, c-Myc와 같은 태그 서열; OmpA, PelB와 같은 선도서열 등이 있다. 또한, 본 발명의 벡터에 의해 발현되는 단백질이 항체이기 때문에 정제를 위한 추가적인서열 없이도, 발현된 항체는 단백질 A 컬럼 등을 통하여 용이하게 정제할 수 있다.The recombinant vectors of the present invention may be fused with other sequences to facilitate purification of antibodies expressed therefrom. Fused sequences include, for example, glutathione S-transferase (Pharmacia, USA); Maltose binding protein (NEB, USA); FLAG (IBI, USA); Tag sequences such as 6x His (hexahistidine; Quiagen, USA), Pre-S1, and c-Myc; OmpA, and PelB. In addition, since the protein expressed by the vector of the present invention is an antibody, the expressed antibody can be easily purified through a protein A column or the like, without any additional sequence for purification.

한편, 본 발명의 재조합 벡터는 선택표지로서 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.Meanwhile, the recombinant vector of the present invention may include an antibiotic resistance gene commonly used in the art as a selection marker. For example, the recombinant vector may include an ampicillin, gentamycin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin, kanamycin, Neomycin, and tetracycline resistance genes, but the present invention is not limited thereto.

본 발명의 항체를 발현하는 벡터는, 경쇄와 중쇄가 하나의 벡터에서 동시에 발현되는 벡터 시스템이거나 또는 경쇄와 중쇄를 각각 별도의 벡터에서 발현시키는 시스템 모두 가능하다. 후자의 경우, 두 벡터는 동시 형질전환(co-transfomation) 및 표적 형질전환(targeted transformation)을 통하여 숙주세포로 도입될 수 있다. The vector expressing the antibody of the present invention can be a vector system in which a light chain and a heavy chain are expressed simultaneously in one vector or a system in which a light chain and a heavy chain are separately expressed in separate vectors. In the latter case, both vectors can be introduced into host cells via co-transfomation and targeted transformation.

본 명세서에서 용어형질전환은 본 발명의 재조합 벡터를 이용하여 숙주 세포에 목적하는 유전자를 도입하는 것을 말하며, 형질감염과 동일한 의미로 사용된다. 따라서, 숙주세포로의형질전환및/또는형질감염은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산칼슘(CaPO₄) 침전, 염화칼슘(CaCl₂) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로 박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환방법 등이 포함되나, 이에 제한되지 않을 수 있다.In this specification, the term transformation refers to introduction of a desired gene into a host cell using the recombinant vector of the present invention, and is used in the same sense as transfection. Thus, transformation and / or transfection into a host cell includes any method of introducing the nucleic acid into an organism, cell, tissue or organ, and is carried out by selecting a suitable standard technique depending on the host cell, as is known in the art . Such methods include electroporation, protoplast fusion, calcium phosphate (CaPO ₄ ) precipitation, calcium chloride (CaCl ₂ ) precipitation, agitation with silicon carbide fibers, Agrobacterium mediated transformation, PEG, dextran sulfate, Pectamine, and dry / depressant-mediated transformation methods, and the like.

본원의 제 6 측면은, 본원의 제 5 측면의 재조합 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공한다.A sixth aspect of the invention provides a host cell comprising the recombinant vector of the fifth aspect of the invention.

본원의 제 7 측면은, 본원의 제 6 측면의 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는, 서열번호 1로 표시되는 중쇄 가변영역(VH)을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편의 제조방법을 제공한다. 숙주세포를 배양함으로써 숙주세포로부터 생성되는 목적 단백질을 수집하고 정제하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 당업계에 알려진 목적 단백질의 수집 및 정제 방법들이 제한 없이 사용될 수 있다.A seventh aspect of the invention provides a method for producing an antibody or antigen-binding fragment comprising the heavy chain variable region (VH) of SEQ ID NO: 1, comprising culturing the host cell of the sixth aspect of the invention. Methods for collecting and purifying target proteins produced from host cells by culturing host cells are well known in the art and methods of collection and purification of target proteins known in the art can be used without limitation.

본원의 제 8 측면은, 본원의 제 1 측면의 항체 또는 항원 결합 단편과 시료를 접촉시키는 단계; 및 상기 항체 또는 항원 결합 단편과 적색 도미 이리도바이러스(RSIV) 외피 단백질의 결합을 탐지하는 단계를 포함하는, 적색 도미 이리도바이러스(RSIV) 검출 방법을 제공한다.The eighth aspect of the present application relates to a method of detecting an antibody or antigen-binding fragment thereof, comprising contacting the sample with the antibody or antigen-binding fragment of the first aspect of the invention; And detecting the binding of the antibody or antigen binding fragment to a red bliiridovirus (RSIV) coat protein.

예를 들어, 상기 시료는 생물학적 시료일 수 있다. 상기 생물학적 시료란 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 조직 부검 시료(뇌, 피부, 림프절, 척수 등), 세포 배양 상등액, 파열된 진핵세포 및 세균 발현계 등을 들 수 있지만 이에 제한되지 않을 수 있다.For example, the sample may be a biological sample. The biological sample includes, but is not limited to, a tissue, a cell, a whole blood, a serum, a plasma, a tissue autopsy sample (brain, skin, lymph node, spinal cord etc.), a cell culture supernatant, a ruptured eukaryotic cell, have.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 시료는 검출 대상 어류의 혈청 또는 어류로부터 추출한 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.In one embodiment of the present invention, the sample may be, but is not limited to, proteins extracted from the serum or fish of the fish to be detected.

본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 더 잘 이해 될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명의 예시 목적을 위한 것이며, 첨부된 특허청구범위에 의하여 한정되는 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.The present invention may be better understood by the following examples, which are for the purpose of illustrating the invention and are not intended to limit the scope of protection defined by the appended claims.

[[ 실시예Example ]]

1. One. RSIVRSIV CP 효모표면발현벡터의 수집 Collection of CP yeast surface expression vector

본 실시예에서는 적색 도미 이리도 바이러스(Red Sea bream Iridovirus, RSIV)의 외피껍질 단백질(Coat Protein, CP)의 DNA를 이용하여 실험을 진행하였다. 이는 미국 국립생물정보센터(National Center for Biotechnology Information: NCBI)에서 제공하는 생물체 핵산 정보 데이터베이스인 진뱅크(Genbank)에 기존에 보고된 RSIV CP(Coat Protein)의 염기서열 정보(진뱅크 접근번호 (GenBank accession number): AY310918.1)를 바탕으로 합성된 것이다. 합성에 있어서 효모 표면에 발현되는 단백질의 당단백질은 항원의 발현 효율을 떨어트릴 뿐만 아니라 패닝(panning)을 통해 바이러스 특이 반응 scFv를 선발할 때 항원결정부위가 될 수 있으므로, 당단백질 (주로 N-glycan)을 코딩하지 않도록 하기 위해 N-glycosylation 아미노산 서열(아스파라긴-X(무작위 아미노산)-세린 또는 트레오닌)의 아스파라긴이 글루타민으로 치환될 수 있도록 하였다. 또한 클로닝을 위해 RSIV CP 서열의 앞, 뒤로는 NheI과 BamHI 제한효소 사이트가 추가되었다. 제공받은 RSIV CP 유전자의 염기서열은 도 1 및 서열번호 3에 나타내었으며 염기서열이 치환된 부분은 빨간색으로, 제한효소 사이트는 파란색으로 표시하였다.In this example, the experiment was performed using DNA of Coat Protein (CP) of Red Sea bream Iridovirus (RSIV). This is based on the nucleotide sequence information of the previously reported RSIV CP (Coat Protein) (GenBank accession number (GenBank accession number accession number: AY310918.1). The glycoprotein expressed on the yeast surface in the synthesis not only lowers the efficiency of expression of the antigen but also can be an antigenic determinant when selecting the virus specific reaction scFv through panning, Asparagine of the N-glycosylation amino acid sequence (asparagine-X (random amino acid) -serine or threonine) can be replaced with glutamine so as not to code glycan. In addition, NheI and BamHI restriction sites were added before and after the RSIV CP sequence for cloning. The nucleotide sequence of the provided RSIV CP gene is shown in FIG. 1 and SEQ ID NO. 3, the nucleotide sequence-substituted portion is shown in red, and the restriction enzyme site is shown in blue.

2. 2. RSIVRSIV CP 효모표면발현벡터의 CP yeast surface expression vector 클로닝Cloning

RSIV CP 항원의 유전자들을 효모 표면에 발현시키기 위해, RSIV CP 유전자를 효모표면발현 플라스미드 벡터인 pCTCON 벡터에 클로닝하는 과정을 수행하였다. 합성한 RSIV CP 유전자와 pCTCON-EGFR 플라스미드 벡터를 각각 NheI과 BamHI 제한효소를 이용하여 DNA를 절단하였다. DNA 절단 과정은 제조사의 지시사항에 따라 진행하였다. DNA 결찰(ligation) 조성물의 제조를 위하여 1 ㎕의 T4 DNA Ligase 10X buffer (300 mM Tris-HCl (pH 7.8), 100 mM MgCl₂, 100 mM Dithiothreitol(DTT) 및 10 mM ATP), 0.5 ㎕의 T4 DNA ligase, 1 ㎕의 절단된 pCTCON-EGFR 벡터, 4 ㎕의 RSIV CP 유전자를 반응튜브에 첨가한 후 혼합하였다. 혼합물은 16℃에서 12 시간동안 결찰(ligation) 반응시켰다. 상기 반응물을 대장균 균주중 하나인 DH5α에 형질전환시켰다. -85℃에 보관된 DH5α competent 세포를 상기 반응물과 4℃에 10 분간 둔 후 반응튜브에 첨가하고 혼합시켜 42℃에 1 분 15 초 동안 열충격(heat shock)을 주었다. 그 후 세포를 4℃에 1 분 동안 둔 후, 200 ㎕의 Luria-Bertani(LB) 브로스(broth) 배지를 넣고 37℃ 교반배양기에서 30 분동안 회복시켜 주었다. 그 후 암피실린(Amp; 50 ㎍/ml)이 포함된 LB 고형 배지(LB agar plate)에 도말하여 37℃ 박테리아배양기에서 16 시간동안 배양시켜 단일 콜로니를 형성시켰다. 단일 콜로니는 3 ml의 Amp LB 브로스에 넣고 37℃ 교반배양기에서 9 시간동안 배양시킨 후, Bioneer사의 AccuPrep Nano-plus Plasmid Mini Extraction Kit를 사용하여 제조사의 지시사항에 따라 RSIV CP 유전자가 삽입된 플라스미드 벡터를 분리하였다. 분리한 플라스미드 벡터는 Macrogen사에 DNA 염기서열 분석서비스를 의뢰하여 RSIV CP 유전자가 pCTCON 플라스미드 벡터에 삽입된 것을 확인하였다. 재조합 플라스미드 벡터의 모식도가 도 2에 나타나 있다. RSIV CP 유전자가 삽입된 플라스미드 벡터는 pCTCON-RSIVCP'이라고 명명하였다.In order to express genes of RSIV CP antigen on the surface of yeast, a process of cloning RSIV CP gene into pCTCON vector which is a plasmid surface expression plasmid vector was performed. DNAs were digested with NheI and BamHI restriction enzymes for the RSIV CP gene and the pCTCON-EGFR plasmid vector, respectively. The DNA cleavage process was performed according to the manufacturer's instructions. 100 mM Tris-HCl (pH 7.8), 100 mM MgCl ₂ , 100 mM Dithiothreitol (DTT) and 10 mM ATP), 0.5 μl of T4 DNA Ligase 10X buffer DNA ligase, 1 μl of digested pCTCON-EGFR vector, and 4 μl of RSIV CP gene were added to the reaction tube and mixed. The mixture was subjected to a ligation reaction at 16 ° C for 12 hours. The reaction product was transformed into DH5 alpha, one of E. coli strains. The DH5α competent cells stored at -85 ° C were incubated with the above reaction mixture at 4 ° C for 10 minutes, added to a reaction tube, mixed, and heat shocked at 42 ° C for 1 minute and 15 seconds. The cells were then placed at 4 ° C for 1 minute, and 200 μl of Luria-Bertani (LB) broth medium was added and allowed to recover for 30 minutes in a 37 ° C agitation incubator. The cells were then plated on LB agar plates containing ampicillin (Amp; 50 μg / ml) and cultured in a 37 ° C. bacterial incubator for 16 hours to form single colonies. Single colonies were placed in 3 ml of Amp LB broth and incubated for 9 hours in a 37 ° C stirred incubator. The plasmid vector containing the RSIV CP gene was isolated using the Nano-plus Plasmid Mini Extraction Kit according to the manufacturer's instructions. The isolated plasmid vector was submitted to Macrogen for DNA sequencing service and the RSIV CP gene was inserted into the pCTCON plasmid vector. A schematic diagram of the recombinant plasmid vector is shown in Fig. The plasmid vector into which the RSIV CP gene was inserted was named pCTCON-RSIVCP '.

3. 효모 형질전환과 효모의 배양3. Yeast Transformation and Culture of Yeast

효모표면발현 시스템에는 EBY100 균주의 효모를 사용하였다. 효모를 형질전환하기 위해서 먼저 EBY100 competent 세포를 제작하였다. -85℃에 보관된 EBY100 글리세롤 세포 스탁(glycerol cell stock)을 YPDA 플레이트에 스트리킹하여 30℃ 미생물배양기에서 3 일 동안 배양하였다. 단일 콜로니를 5 ml YPD 배지에 넣고 30℃의 교반배양기에서 24 시간동안 배양하였다. 배양 후 세포 500 ㎕를 50 ml의 YPD 배지에 넣고 30℃ 교반배양기에서 흡광도(Optical density; OD) 파장 600 nm값이 1~1.5까지 배양한 후 원심분리기를 이용하여 세포를 수확하였다. 수확한 세포는 50 ml의 증류수를 이용하여 수세 한 후, 다시 원심분리기를 이용해 세포를 가라앉혔다. 그 후 5 ml의 LiAc 버퍼 (0.1M 리튬 아세테이트(LiAc), 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0)와 50 ㎕의 10 mM DTT를 반응튜브에 첨가한 후 세포와 혼합하여 25℃에서 30 분 동안 반응시켰다. 원심분리기를 이용하여 세포를 분리한 후 10 ml의 1 M 소비톨(sorbitol)과 혼합하여 다시 원심분리기를 이용해 세포를 분리하였다. 그후 1.5 ml의 1M 소비톨로 3 번 수세하여 EBY100 competent 세포를 제작하였다. 80 ㎕의 competent 세포와 5 ㎕의 pCTCON-RSIV CP를 반응튜브에 넣어 혼합한 후 얼음에 10 분간 두었다. 미리 차게 해 둔 큐벳에 혼합물을 옮긴 후 전기천공법(electroporation: 1.5 KV, 25 Ω, 20 0mF)을 통해 효모를 형질전환시켰다. 형질전환체는 YPDS 배지로 옮긴 후 30℃ 교반배양기에서 30 분 동안 회복시켰다. 그 후 트립토판 dropout supplement minimal SD plate(-Trp SD plate)에 도말하여 30℃ 박테리아 배양기에서 3 일 동안 배양시켜 단일콜로니를 형성시켰다. 단일콜로니는 5 ml의 SD-CAA 배지를 넣고 30℃ 교반배양기에서 24 시간 동안 배양한 후 원심분리기를 이용하여 세포를 가라앉혔다. 그 후 10 ml의 SG-CAA (2% 갈락토오스)배지를 넣고 30℃ 교반배양기에서 3 일 동안 배양하여 RSIV CP의 효모표면발현을 진행하였다. 효모표면발현된 세포는 OD 600nm 값이 0.4가 되도록 세포의 양을 맞추어 항원의 발현을 확인하였다. 1 차 항체 처리 단계로 항 c-Myc 항체(anti-c-Myc antibody)를 PBS (0.1% BSA) 로 1:200 희석 후 25℃에서 1 시간 동안 반응을 진행하였으며, TBST를 이용하여 수세한 뒤 2 차 항체(anti-mouse IgG TRITC conjugated)를 1:200 으로 희석 후 4℃에서 30 분 동안 반응시켰다. TBST를 이용하여 수세한 뒤 유세포분석기를 이용하여 효모표면발현의 정도를 측정하였으며 그 결과를 도 3에 나타내었다. 분석 결과 RSIV CP가 효모 표면에 정상적으로 발현함을 확인하였다.Yeast strain EBY100 was used for yeast surface expression system. In order to transform yeast, EBY100 competent cells were first prepared. EBY100 glycerol cell stock stored at -85 ° C was streaked on a YPDA plate and cultured in a 30 ° C. microbial incubator for 3 days. Single colonies were placed in 5 ml of YPD medium and cultured in a 30 ° C agitating incubator for 24 hours. After culturing, 500 μl of the cells were put into 50 ml of YPD medium, and the optical density (OD) wavelength of 600 nm was incubated at 1 to 1.5 in a 30 ° C. stirring incubator, and the cells were harvested using a centrifuge. The harvested cells were washed with 50 ml of distilled water, and the cells were further submerged using a centrifuge. Then, 5 ml of LiAc buffer (0.1 M lithium acetate (LiAc), 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0) and 50 μl of 10 mM DTT were added to the reaction tube and mixed with the cells. Lt; / RTI > The cells were separated using a centrifuge and mixed with 10 ml of 1 M sorbitol. Cells were then separated using a centrifuge. Then, EBY100 competent cells were prepared by rinsing 3 times with 1.5 ml of 1 M sorbitol. 80 μl of competent cells and 5 μl of pCTCON-RSIV CP were mixed in a reaction tube and placed on ice for 10 minutes. The mixture was transferred to a pre-chilled cuvette and the yeast was transformed by electroporation (1.5 KV, 25 Ω, 200 mF). The transformants were transferred to YPDS medium and allowed to recover for 30 minutes in a 30 ° C agitation incubator. After that, the cells were plated on tryptophan dropout supplemented minimal SD plate (-Trp SD plate) and cultured in a 30 ° C bacterial incubator for 3 days to form a single colony. Single colonies were incubated in 5 ml of SD-CAA medium for 24 hours in a 30 ° C agitation incubator, and the cells were submerged using a centrifuge. Then, 10 ml of SG-CAA (2% galactose) medium was added and cultured for 3 days in a 30 ° C agitating incubator to conduct yeast surface expression of RSIV CP. The expression of the antigen was confirmed by adjusting the amount of cells so that the OD 600nm value of the yeast surface expressed cells was 0.4. Anti-c-Myc antibody was diluted 1: 200 with PBS (0.1% BSA), and reacted at 25 ° C for 1 hour. After washing with TBST, The secondary antibody (anti-mouse IgG TRITC conjugated) was diluted 1: 200 and reacted at 4 ° C for 30 minutes. After washing with TBST, the degree of yeast surface expression was measured using a flow cytometer. The results are shown in FIG. As a result of analysis, it was confirmed that RSIV CP was expressed normally on the yeast surface.

4. 인간 4. Human scFvscFv 라이브러리로부터 From library RSIVRSIV CP에 결합하는 Coupled to CP scFvscFv 분리 detach

RSIV CP가 표면에 발현된 효모와 scFv 라이브러리를 이용하여 RSIV CP에 결합하는 scFv 분리 실험을 진행하였다. 본 실시예에서 사용된 scFv 라이브러리는 아주대학교 의과대학 미생물학교실의 권명희 교수 연구실로부터 제공받은 pRGA-scFv(A) 인간 scFv 라이브러리를 이용하였다. pRGA-scFv(A) 스탁(stock)으로부터 파지 라이브러리를 준비하는 과정은 Tomlinson I+J 라이브러리 프로토콜을 참고하여 준비하였으며 그 역가는 3.27x10¹³cfu/ml이었다.RSIV CP surface-expressed yeast and scFv library were used to conduct scFv isolation experiments that bind to RSIV CP. The scFv library used in this example was the pRGA-scFv (A) human scFv library provided by Kwon Myung-Hui, professor of microbiology at Ajou University School of Medicine. Preparation of the phage library from pRGA-scFv (A) stock was prepared according to the Tomlinson I + J library protocol and the reverse was 3.27 × ^{10 13} cfu / ml.

RSIV CP를 표면에 발현하는 효모를 PBS 1 ml에 OD 600nm 값이 2가 되도록 희석한 후 96 웰 면역플레이트(immunoplate)의 60 개 웰에 세포를 웰 당 100 ㎕씩 넣어 4℃에서 24 시간 동안 웰을 코팅하였다 (RSIV well). 이와 동시에 RSIV CP를 발현하지 않은 효모를 같은 과정을 통해 코팅하였고 (Negative well), PBS만 넣은 웰도 준비하였다(Blank well). 상층액을 제거한 후 각 웰에 200 ㎕의 3% BSA가 포함된 PBS(PBSB)를 넣어주어 37℃에서 2 시간 동안 블로킹시켰다. 10¹⁰cfu/ml의 라이브러리를 PBSB에 희석시킨 후 블랭크 웰(Blank well)에 있던 블로킹 용액을 버리고 웰 당 100 ㎕씩 첨가한 후 25℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 그 후, 네거티브 웰(Negative well)에 있던 블로킹 용액을 버리고 블랭크 웰에 있던 용액을 100 ㎕씩 네거티브 웰에 옮겨 준 후 25℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 그 다음, RSIV 웰에 있던 블로킹 용액을 버리고 네거티브 웰에 있던 용액을 100 ㎕씩 RSIV 웰에 옮겨 준 후 25℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. RSIV 웰의 상층액을 버린 후 TBS-T (0.5% tween-20이 포함된 TBS) 버퍼로 각 플레이트를 3 회 수세한 후, 웰 당 100 ㎕의 100 mM 트리에틸아민(triethylamine)을 넣어 25℃에서 10 분 동안 용리시켰다. 그 후 각 웰 당 50 ㎕의 1 M tris (pH 7.5)를 넣은 후 새로운 튜브에 상층액을 모두 모았다. 여기까지의 과정을 바이오 패닝(bio-panning)이라고 한다.The yeast expressing RSIV CP on the surface was diluted in 1 ml of PBS to an OD 600nm value of 2, and 100 쨉 l of cells were added to 60 wells of a 96-well immunoplate for 24 hours at 4 째 C (RSIV well). At the same time, yeast not expressing RSIV CP was coated in the same manner (negative well), and a well containing PBS only (blank well). After the supernatant was removed, PBS (PBSB) containing 200 μl of 3% BSA was added to each well, and the mixture was blocked at 37 ° C for 2 hours. 10 ¹⁰ cfu / ml of the library was diluted in PBSB, and the blocking solution in blank wells was discarded. 100 μl of the blocking solution was added to each well, followed by reaction at 25 ° C for 1 hour. After that, the blocking solution in the negative well was discarded, and 100 μl of the blank well solution was transferred to the negative well, followed by reaction at 25 ° C for 1 hour. Then, the blocking solution in the RSIV well was discarded, and 100 μl of the solution in the negative well was transferred to the RSIV well, followed by reaction at 25 ° C for 1 hour. After discarding the supernatant from the RSIV wells, each plate was washed three times with TBS-T (TBS containing 0.5% tween-20) buffer, and then 100 μl of 100 mM triethylamine per well was added thereto. Lt; / RTI > for 10 minutes. Then 50 μl of 1 M tris (pH 7.5) was added per well and the supernatant was collected in a new tube. The process so far is called bio-panning.

바이오 패닝 이후 수확한 파지를 증폭하는 실험을 수행하였다. 용리를 통해 얻은 파지 scFv를 대장균 균주 중 하나인 5 ml 부피의 XL1-Blue에 감염시켜 37℃에서 교반시키지 않고 1 시간 동안 배양하였다. 배양 후 원심분리기를 이용해서 세포를 침전시킨 후 상층액을 버리고 세포만만 모아서 테트라사이클린(Tet: 10 ㎍/ml)과 암피실린(Amp)이 포함된 2TY 플레이트에 도말하여 박테리아배양기에서 37℃에서 16 시간 동안 배양하였다. 플레이트에 생성된 콜로니 군집을 모두 긁어모아서 50 ml의 1% 글루코오스가 포함된 2TY Amp(100 ㎍/ml) 배지에 넣고 37℃에서 OD 600nm값이 0.4가 될 때까지 배양시켰다. 그 후 2x10¹¹cfu/ml의 VSCM13 헬퍼 파지(helper phage)를 넣고 교반하지 않고 37℃에서 30 분 동안 감염시켰다. 원심분리기를 이용하여 세포를 가라앉힌 후 100 ml의 0.1%의 글루코오스가 포함된 Amp (100 ㎍/ml), 카나마이신 (50 ㎍/ml)이 포함된 2TY 배지를 넣고 30℃ 교반배양기에서 24 시간 동안 배양하였다. 원심분리기를 이용하여 세포를 가라앉힌 후 80 ml의 상층액을 새 반응튜브에 넣고 20 ml의 PEG/NaCl (20% 폴리에틸렌 글리콜 6000, 2.5 M NaCl)을 첨가하여 혼합한 후 얼음 위에 1 시간 동안 방치하였다. 그 후, 원심분리기를 이용하여 침전물을 가라앉힌 후 PEG/NaCl을 깔끔히 제거하였다. 침전물을 4 ml의 PBS 용액과 혼합한 후 원심분리기를 이용하여 남은 박테리아 찌꺼기를 가라앉혔다. 파지 용액을 새 튜브에 넣고 15%의 글리세롤을 첨가하여 -85℃에 보관하였다. 바이오 패닝 두 번째 라운드에서는 scFv 라이브러리 대신 첫 번째 라운드에서 수확하여 증폭한 파지를 이용함으로써 RSIV CP에 대해 결합능력이 높은 파지의 농도를 증가시켰다. Experiments were performed to amplify harvested phage after bio panning. The phage scFv obtained from elution was infected with 5 ml of XL1-Blue, one of the Escherichia coli strains, and cultured at 37 째 C for 1 hour without stirring. After culturing, the cells were precipitated using a centrifuge, the supernatant was discarded, and only the cells were collected and plated on a 2TY plate containing tetracycline (Tet: 10 μg / ml) and ampicillin (Amp) Lt; / RTI > The colonies formed on the plate were all scraped off and placed in 2 TY Amp (100 g / ml) medium containing 50 ml of 1% glucose and incubated at 37 ° C until OD 600nm value reached 0.4. Then, 2x10 ¹¹ cfu / ml VSCM13 helper phage was added and infected for 30 minutes at 37 ° C without stirring. After centrifuging the cells using a centrifuge, 100 ml of 2TY medium containing Amp (100 μg / ml) and kanamycin (50 μg / ml) containing 0.1% glucose was added and incubated in a 30 ° C. agitation incubator for 24 hours Lt; / RTI > After submerging the cells using a centrifuge, 80 ml of the supernatant was placed in a new reaction tube and mixed with 20 ml of PEG / NaCl (20% polyethylene glycol 6000, 2.5 M NaCl) Respectively. Thereafter, the precipitate was settled using a centrifuge, and then PEG / NaCl was removed. The precipitate was mixed with 4 ml of PBS solution, and the residual bacterial debris was submerged using a centrifuge. The phage solution was placed in a new tube and 15% glycerol was added and stored at -85 ° C. In the second round of bio-panning, instead of the scFv library, harvested and amplified phage were used in the first round to increase the phage concentration with high binding capacity to RSIV CP.

5. 5. ScFvScFv 유전자 분리 및 분석 Gene separation and analysis

바이오 패닝은 총 3 라운드를 거쳐 2.4x10¹³cfu/ml의 역가를 갖는 파지를 분리하였고 이중 무작위로 1 개의 파지 scFv를 선발하였으며 선발된 파지 scFv 클론을 증폭시키는 프라이머 세트를 제작하여 도 4에 나타내었다 (pCANTAB5_S1 : 정방향 프라이머, 서열번호 4, pCANTAB5_S6: 역방향 프라이머, 서열번호 5). 파지 scFv가 감염된 XL1-Blue 세포를 Bioneer사의 AccuPrep Nano-plus Plasmid Mini Extraction Kit를 사용하여 제조사의 지시사항에 따라 scFv 유전자가 삽입된 파지미드(phagemid)를 분리하였다. 분리한 파지미드는 PCR을 통해 scFv DNA를 증폭하였다. 상기 프라이머 조성물의 제조를 위하여 10 ㎕의 2X PCR 프리믹스(premix), 1 ㎕의 10 pM 정방향 프라이머, 2 ㎕의 10 pM 역방향 프라이머, 1 ㎕의 파지미드, 및 증류수 7 ㎕를 반응튜브에 첨가한 후 혼합하였다. 제조된 증폭 반응 조성물을 96℃에서 10 분 동안 반응시킨 후 95℃에서 30 초 (DNA 변성), 55℃에서 30 초 (프라이머의 결합), 72℃에서 1 분 (DNA의 합성) 반응시켰다. 이 세 단계 과정을 35 회 반복하여 DNA를 증폭하였다. 총 20 ㎕의 반응물을 EtBr이 포함된 1% 아가로스 겔에서 전기영동하여 유전자가 증폭되었는지 확인하였다. 1 Kb 내외의 scFv 유전자가 증폭된 것을 확인하였으며 그 결과는 도 5a에 나타내었다. 도 5a에 나타난 DNA를 면도칼을 이용하여 자른 후, Intron 사의 MEGAquick-spin Total fragment DNA Purification Kit를 사용하여 제조사의 지시사항에 따라 DNA 증폭 산물을 분리하였다. 분리한 DNA 절편은 Macrogen사에 DNA 염기서열 분석서비스를 의뢰하여 선발 scFv 유전자 염기 서열이 증폭된 것을 확인하였고 염기서열을 아미노산 서열로 번역한 후 IgBLAST를 이용하여 scFv 절편의 상보성 결정영역(complementarity determining region, CDR)위치를 추정하여 도 5b에 나타내었다.Bio-panning was carried out for a total of three rounds to separate the phage having a titer of 2.4 x ¹⁰ < ¹³ > cfu / ml. One phage scFv was randomly selected and a primer set amplifying the selected phage scFv clone was prepared and shown in Fig. (pCANTAB5_S1: forward primer, SEQ ID NO: 4, pCANTAB5_S6: reverse primer, SEQ ID NO: 5). XL1-Blue cells infected with phage scFv were purchased from Bioneer AccuPrep Using the Nano-plus Plasmid Mini Extraction Kit, the phagemid inserted with the scFv gene was isolated according to the manufacturer's instructions. The isolated phagemid amplified the scFv DNA by PCR. To prepare the primer composition, 10 μl of 2 × PCR premix, 1 μl of 10 μM forward primer, 2 μl of 10 μM reverse primer, 1 μl of phagemid, and 7 μl of distilled water were added to the reaction tube . The prepared amplification reaction composition was reacted at 96 ° C for 10 minutes and reacted at 95 ° C for 30 seconds (DNA denaturation), 55 ° C for 30 seconds (primer binding) and 72 ° C for 1 minute (synthesis of DNA). These three steps were repeated 35 times to amplify the DNA. A total of 20 쨉 l of the reaction product was electrophoresed on 1% agarose gel containing EtBr to confirm whether the gene was amplified. It was confirmed that the scFv gene of about 1 Kb was amplified and the result is shown in FIG. 5A. The DNA shown in FIG. 5A was cut using a razor blade, and DNA amplification products were isolated according to the manufacturer's instructions using an Intron MEGAquick-spin Total Fragment DNA Purification Kit. The separated DNA fragment was subjected to DNA sequencing service by Macrogen, and the selected scFv gene sequence was amplified. After translating the nucleotide sequence into amino acid sequence, the complementarity determining region (complementarity determining region) of the scFv fragment was determined using IgBLAST , CDR) are estimated and shown in FIG. 5B.

6. 6. ScFvScFv VHVH , , VLVL 단독발현을 위한 For single expression 클로닝Cloning

아미노산 서열 분석을 완료한 scFv 유전자에서 VH, VL 부분을 대장균에서 발현시키는 플라스미드에 클로닝하기 위해 이들을 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 제작하였고 이들의 서열을 도 6에 나타내었다 (VH 정방향 프라이머: 서열번호 6; VH 역방향 프라이머: 서열번호 7; VL 정방향 프라이머: 서열번호 8; VL 역방향 프라이머: 서열번호 9). 정방향 프라이머와 역방향 프라이머에는 각각 클로닝을 위해 각각 XmaI (G2는 Age1)과 AflⅡ 제한효소 사이트를 추가하였고 정방향 프라이머에는 정제를 위한 His-Tag 서열을 추가하였다. 상기 프라이머 조성물의 제조를 위하여 10 ㎕의 2X PCR 프리믹스, 1 ㎕의 10 pM 정방향 프라이머, 2 ㎕의 10 pM역방향 프라이머, 1 ㎕의 파지미드, 및 증류수 7 ㎕를 반응튜브에 첨가한 후 혼합하였다. 제조된 증폭 반응 조성물을 96℃에서 10 분 동안 반응시킨 후 95℃에서 30 초 (DNA 변성), 55℃에서 30 초 (프라이머의 결합), 72℃에서 1 분 (DNA의 합성) 반응시켰다. 이 세 단계 과정을 35 회 반복하여 DNA를 증폭하였다. 총 20 ㎕의 반응물을 EtBr이 포함된 1% 아가로스 겔에서 전기영동하여 유전자가 증폭되었는지 확인하였다. 그 결과는 도 7에 나타내었다.In order to clone the scFv gene that had undergone the amino acid sequence analysis into a plasmid expressing the VH and VL portions in E. coli, a primer set capable of amplifying the primers was prepared and their sequence is shown in Fig. 6 (VH forward primer: SEQ ID NO: 6 ; VH reverse primer: SEQ ID NO: 7; VL forward primer: SEQ ID NO: 8; VL reverse primer: SEQ ID NO: 9). For forward primer and reverse primer, XmaI (G2 is Age1) and AflII restriction site were added respectively for cloning, respectively, and His-Tag sequence for purification was added to the forward primer. To prepare the primer composition, 10 μl of 2 × PCR premix, 1 μl of 10 μM forward primer, 2 μl of 10 μM reverse primer, 1 μl of phagemid, and 7 μl of distilled water were added to the reaction tube and mixed. The prepared amplification reaction composition was reacted at 96 ° C for 10 minutes and reacted at 95 ° C for 30 seconds (DNA denaturation), 55 ° C for 30 seconds (primer binding) and 72 ° C for 1 minute (synthesis of DNA). These three steps were repeated 35 times to amplify the DNA. A total of 20 쨉 l of the reaction product was electrophoresed on 1% agarose gel containing EtBr to confirm whether the gene was amplified. The results are shown in Fig.

도 7에 나타난 DNA를 면도칼을 이용하여 자른 후, Intron 사의 MEGAquick-spin Total fragment DNA Purification Kit를 사용하여 제조사의 지시사항에 따라 DNA 증폭산물을 분리하였다. 그 후, 증폭한 선발 scFv의 VH, VL 유전자를 클로닝하기 위해서 TA 클로닝을 수행하였으며, TA 플라스미드를 DH5α에 형질전환시켰다. TA 클로닝과 대장균 형질전환 과정은 실시예 2에 기술한 것과 동일한 과정으로 실시하였다. 형질전환된 대장균으로부터 플라스미드 벡터를 분리한 후 분리한 플라스미드 벡터를 Macrogen사의 DNA 염기서열 분석서비스를 의뢰하여 각각의 VH, VL 유전자가 올바르게 증폭이 된 것을 확인하였다. The DNA shown in FIG. 7 was cut using a razor blade, and DNA amplification products were separated according to the manufacturer's instructions using an Intron MEGAquick-spin Total Fragment DNA Purification Kit. Then TA cloning was performed to clone the VH and VL genes of the selected scFv amplified, and TA plasmid was transformed into DH5α. TA cloning and E. coli transformation were carried out in the same manner as described in Example 2. [ The plasmid vector was isolated from the transformed E. coli, and the isolated plasmid vector was subjected to DNA sequencing service of Macrogen, confirming that the VH and VL genes were correctly amplified.

확보한 TA 플라스미드의 VH/VL 유전자를 대장균에 발현시키기 위해 대장균 발현 플라스미드 벡터인 pIg20 벡터에 클로닝하는 과정을 수행하였다. 상기 실시예에서 제작한 VH/VL TA 플라스미드 벡터와 pIg20 플라스미드 벡터를 각각 XmaI과 AflⅡ 제한효소를 이용하여 DNA를 절단하였다. DNA 절단 과정은 제조사의 지시사항에 따라 진행하였다. 절단한 각각의 scFv VH/VL 유전자와 pIg20 벡터를 4:1로 혼합한 후 실시예 2에 명기된 T4 DNA ligase와 결찰 버퍼(ligation buffer)를 반응튜브에 첨가한 후 혼합하였다. 혼합물은 16℃에서 12 시간 동안 결찰반응 시켰다. 반응물을 DH5α에 형질전환하였으며 대장균 형질전환 과정은 실시예 3에 기술한 것과 동일한 과정으로 실시하였다. 형질전환된 대장균으로부터 플라스미드 벡터를 분리한 후 분리한 플라스미드 벡터를 Macrogen사에 DNA 염기서열 분석서비스를 의뢰하여 각각의 scFv 유전자가 pIg20 플라스미드 벡터에 삽입된 것을 확인하였다. 플라스미드 벡터 pIg20-VH/VL의 모식도는 도 8에 나타내었다. The VH / VL gene of the TA plasmid thus obtained was cloned into an E. coli expression plasmid vector pIg20 vector for expression in E. coli. The VH / VL TA plasmid vector and pIg20 plasmid vector prepared in the above example were digested with XmaI and AflII restriction enzymes, respectively. The DNA cleavage process was performed according to the manufacturer's instructions. The scFv VH / VL gene and the pIg20 vector were mixed at a ratio of 4: 1, and then the T4 DNA ligase and ligation buffer described in Example 2 were added to the reaction tube and mixed. The mixture was ligated for 12 hours at 16 < 0 > C. The reaction product was transformed into DH5α and E. coli transformation was carried out in the same manner as described in Example 3. The plasmid vector was isolated from the transformed E. coli, and then the isolated plasmid vector was subjected to DNA sequencing service by Macrogen, and each scFv gene was inserted into the pIg20 plasmid vector. A schematic diagram of the plasmid vector pIg20-VH / VL is shown in Fig.

7. 7. VHVH // VLVL 단백질의 발현 테스트 및 정제 Protein expression testing and purification

대장균 발현 플라스미드 벡터인 pIg20은 phoA 리더(leader) 서열이 존재하여 발현한 단백질이 주변세포질(periplasm)에 위치하게 한다. 그 결과 발현한 단백질이 배지에 존재하게 된다. His Tag는 정제를 위한 태깅(tagging) 단백질로 이용할 수 있다. 서열이 확인된 pIg-VH/VL 플라스미드 벡터는 단백질 발현 균주인 BL21(DE3)pLysE에 형질전환 하였다. -85℃에 보관된 BL21(DE3)pLysE competent 세포를 상기 플라스미드와 4℃에 10 분간 둔 후 반응튜브에 첨가한 후 혼합시켜 42℃에 1 분 15 초 동안 열충격(heat shock)을 주었다. 그 후 세포를 4℃에 1 분 동안 둔 후, 200 ㎕의 LB 브로스 배지를 넣고 37℃ 교반배양기에서 30 분 동안 회복시켰다. 그 후 암피실린(Amp) 및 클로람페니콜(Cam: 25 ㎍/ml)이 포함된 LB 아가 플레이트에 도말하여 37℃ 박테리아배양기에서 16 시간 동안 배양시켜 단일콜로니를 형성시켰다. 세포들을 500 ml의 Amp Cam LB 브로스에 접종하여 OD 600nm 값이 0.6이 되도록 37℃ 교반배양기에서 배양하였다. 배양한 대장균에 각각 0.5 mM의 IPTG를 넣어 단백질의 발현을 유도하였으며 26℃에서 16 시간 동안 단백질을 발현시켰다.The E. coli expression plasmid vector, pIg20, has a phoA leader sequence so that the expressed protein is located in the periplasm. As a result, the expressed protein is present in the medium. His Tag is available as a tagging protein for purification. The pIg-VH / VL plasmid vector whose sequence was confirmed was transformed into BL21 (DE3) pLysE, a protein expression strain. BL21 (DE3) pLysE competent cells stored at -85 ° C were incubated with the plasmid at 4 ° C for 10 minutes, added to a reaction tube, mixed, and heat shocked at 42 ° C for 1 minute and 15 seconds. Then, the cells were allowed to stand at 4 ° C for 1 minute, and then 200 μl of LB broth medium was added and the cells were allowed to stand for 30 minutes in a 37 ° C agitation incubator. Then, on a LB agar plate containing ampicillin (Amp) and chloramphenicol (Cam: 25 占 퐂 / ml), a single colony was formed by culturing in a 37 占 폚 bacterial incubator for 16 hours. The cells were inoculated into 500 ml Amp Cam LB broth and cultured in an incubator at 37 占 폚 to an OD 600nm value of 0.6. Protein expression was induced by adding 0.5 mM IPTG to the cultured Escherichia coli, and the protein was expressed at 26 ° C for 16 hours.

단백질 정제를 위해 각각의 cell들을 원심분리기를 통해 cell을 가라앉힌 후, 상층액을 0.22 μm stericup (Millipore)을 이용하여 여과하였다. 여과액을 Ni-NTA Agarose를 이용하여 정제하였으며 centricon 10,000 NMWL (Merck)을 이용하여 단백질을 농축하였다. D2 중쇄 가변영역(VH)에 대해 정제를 성공하였고, 정제한 단백질은 웨스턴 블로팅(western blotting)을 수행하였으며 그 결과를 도 9에 나타내었다. For protein purification, each cell was submerged in a centrifuge and the supernatant was filtered using 0.22 μm stericup (Millipore). The filtrate was purified using Ni-NTA agarose and the protein was concentrated using Centricon 10,000 NMWL (Merck). The D2 heavy chain variable region (VH) was successfully purified and the purified protein was subjected to western blotting and the results are shown in FIG.

8. 정제된 VH를 이용한 ELISA8. ELISA using purified VH

정제한 VH의 RSIV CP에 대한 효과를 확인하기 위해 ELISA 분석을 진행하였다. EBY 100과 RSIV CP 발현효모를 카보네이트 코팅 버퍼(carbonate coating buffer)에 1:200으로 희석하여 96 웰 플레이트에 각 웰 당 100 ㎕씩 코팅하였다. 코팅 과정은 25℃에서 4 시간 동안 진행하였다. TBS-T로 수세한 후 탈지유(skim milk) 5% 용액 (블로킹 버퍼)로 블로킹하고 정제한 VH를 PBS에 희석하여 20 ㎍/ml로 농도를 일치시킨 후 블로킹 버퍼에 1:200으로 희석하여 96 웰 플레이트에 각 웰 당 100 ㎕씩 반응시켰다. 토끼로부터 얻은 RSIV 폴리클로날 항체도 같은 농도로 희석하여 반응시켰다. 25℃에서 16 시간 동안 반응시킨 후 TBS-T를 이용하여 수세하였다. VH를 반응시킨 웰에 항-HisX6 항체와 항-마우스 HRP 컨쥬게이트 항체 (Cell signaling technology)를 블로킹 버퍼에 1:200으로 희석하여 100 ㎕씩 넣어주고 25℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. TBS-T를 이용하여 수세한 뒤 각 웰에 100 ㎕의 TMB 용액을 넣어 발색반응을 진행했으며 15 분 뒤 100 ㎕의 1 M H₂SO₄를 넣어 발색반응을 멈추었다. 분광광도계를 통해 반응결과를 정량적으로 측정하였으며 그 결과를 도 10에 나타내었다. 정제한 VH 단백질은 비특이 반응이 낮은 것을 확인하였으며 토끼로부터 유래한 폴리클로날 항체보다 우수한 RSIV CP 특이적 결합능을 보이는 것을 확인하였다. ELISA analysis was performed to confirm the effect of purified VH on RSIV CP. EBY 100 and RSIV CP-expressing yeast were diluted 1: 200 in a carbonate coating buffer and coated in a 96-well plate at a rate of 100 μl per well. The coating process was carried out at 25 DEG C for 4 hours. After washing with TBS-T, the cells were blocked with 5% skim milk solution (blocking buffer), and the purified VH was diluted with PBS to a concentration of 20 μg / ml, diluted 1: 200 in blocking buffer 100 [mu] l / well of each well was reacted. The RSIV polyclonal antibody from rabbits was diluted to the same concentration and reacted. The reaction was carried out at 25 DEG C for 16 hours and then washed with TBS-T. Anti-HisX6 antibody and anti-mouse HRP conjugated antibody were diluted 1: 200 in blocking buffer, and 100 μl of each was added at 25 ° C for 1 hour. After rinsing with TBS-T, 100 μl of TMB solution was added to each well to perform color reaction. After 15 minutes, 100 μl of 1 MH ₂ SO ₄ was added to stop the color reaction. The reaction results were quantitatively measured through a spectrophotometer, and the results are shown in FIG. The purified VH protein showed low specificity and showed superior RSIV CP - specific binding ability than the rabbit - derived polyclonal antibody.

전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.It will be understood by those of ordinary skill in the art that the foregoing description of the embodiments is for illustrative purposes and that those skilled in the art can easily modify the invention without departing from the spirit or essential characteristics thereof. It is therefore to be understood that the above-described embodiments are illustrative in all aspects and not restrictive. For example, each component described as a single entity may be distributed and implemented, and components described as being distributed may also be implemented in a combined form.

본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위, 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다. The scope of the present invention is defined by the appended claims rather than the detailed description, and all changes or modifications derived from the meaning and scope of the claims and their equivalents should be interpreted as being included in the scope of the present invention .

<110> Korea Institute of Ocean Science and Technology <120> ANTIBODY FOR RED SEA BREAM IRIDOVIRUS AND ITS USE <130> 0 <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D2VH amino acid sequence <400> 1 Arg Asp His His His His His His Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys 1 5 10 15 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 20 25 30 Ser Asn Tyr Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Pro 35 40 45 Glu Trp Ile Ser Tyr Ile Asn Gly Ser Gly Thr Tyr Thr Asp Tyr Ala 50 55 60 Asp Ser Val Met Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Gly Asn Ala Gln Asn 65 70 75 80 Ser Leu Tyr Leu Gln Ile Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Ile 85 90 95 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Val Gly Pro Gly Asn Gly Ala Ser Glu Phe 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Ala Thr Val Thr Val Ser Ser His Met Ala 115 120 125 <210> 2 <211> 384 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D2VH nucleic acid sequence <400> 2 cccgggatca tcatcatcac catcacgagt ctgggggagg cttggtcaag cctggagggt 60 ccctgagact ctcctgtgca gcctcaggat tcaccttcag taactactac atgagctgga 120 tccgtcagac tccagggaag gggccggagt ggatttcata cattaacgga agtggtactt 180 acacagacta cgcagactct gtgatgggcc ggttcaccat ctccagaggc aacgcccaaa 240 attctctgta tctgcagatc aacagcctga gagtcgagga cacggccatc tattactgtg 300 cgagagcggt tgggcccggt aacggtgctt ctgagttctg gggccagggg gccacggtca 360 ccgtctcctc acatatggct taag 384 <210> 3 <211> 1344 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Red Sea bream Iridovirus Coat Protein <400> 3 gctagcatgt ctgcaatctc aggtgcgcag gtaaccagtg ggttcatcga catctccgcg 60 tttgatgcga tggagaccca cttgtatggc ggcgacaatg ccgtgaccta ctttgcccgt 120 gagaccgtgc gtagttcctg gtacagcaag ctgcccgtca ccctatcaaa acagactggc 180 catgctaatt tcggccagga gtttagtgtg actgtggcaa ggggtggcga ctacctcatt 240 aatgtgtggc tgcgtgttaa gatcccctcc atcacgtcca gcaaggagaa cagctacatt 300 cgctggtgtg ataatttgat gcacaatcta gttgaggagg tgtcggtgtc atttaacgac 360 ctggtggcac agaccctgac cagcgagttc cttgactttt ggaacgcctg catgatgcct 420 ggtagcaaac aatctggcta caacaagatg attggcatgc gcagcgacct ggtgggcggt 480 atcaccaacg gtcagactat gcccgccgcc taccttaatt tgcccattcc cctgttcttt 540 acccgtgaca caggccttgc attgcctact gtgtctctgc cgtacaatga ggtgcgcatc 600 cacttcaagc tgcggcgctg ggaggacctg ctcatcagcc agagcaccca ggccgacatg 660 gccatatcga ctgtcaccct ggctaacatt ggcaatgtag cacccgcact gacccaggtg 720 tccgtgatgg gcacctacgc tgtactgaca agtgaggagc gtgaggttgt ggcccagtct 780 agccgtagca tgctcattga gcagtgtcag gtggcgcctc gtgtgcctgt cacacccgta 840 gacaattcct tggtgcatct cgacctgatg ttcagtcacc ctgtgaaggc cttgttcttt 900 gcagtcaagc aggtcactca ccgcaacgtg caaagccagt acaccgcggc cagtcccgtg 960 tatgtcaaca acaaggtgaa tctgcctttg ctggccacca atcccctgtc cgaggtgtcg 1020 ctcatttacg agaacacccc tcggctccac cagatgggag tagactactt cacatctgtc 1080 gacccctact actttgcgcc cagcatgcct gagatggatg gtgttatgac ctactgttat 1140 acgctggaca tgggcaatat caaccctatg ggctcgacca actacggccg cctgtcccag 1200 gtcaccctgt catgtaaggt gtcggacaat gccaagacca ccgcggcggg cggtggaggc 1260 cagggcaccg gctacacggt cgcccaaaag tttgaactgg tcgttattgc agtcaaccac 1320 aacatcatga agattgccgg atcc 1344 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pCANTAB5_S1_primer F <400> 4 caacgtgaaa aaattattat tcgc 24 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pCANTAB5_S6_primer R <400> 5 gtaaatgaat tttctgtatg agg 23 <210> 6 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D2VH_primer F <400> 6 cccgggatca tcatcatcac catcacgagt ctggggga 38 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D2VH_primer R <400> 7 cttaagccat atgtgaggag acggtg 26 <210> 8 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D2VL_primer F <400> 8 cccgggatca tcatcatcac catcaccagt ctgccctg 38 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D2VL_primer R <400> 9 cttaagccat atgggtgacc ttggtccca 29 <110> Korea Institute of Ocean Science and Technology <120> ANTIBODY FOR RED SEA BREAM IRIDOVIRUS AND ITS USE <130> 0 <160> 9 <170> KoPatentin 3.0 <210> 1 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D2VH amino acid sequence <400> 1 Arg Asp His His His His His Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys 1 5 10 15 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ser Ser Gly Phe Thr Phe 20 25 30 Ser Asn Tyr Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Pro 35 40 45 Glu Trp Ile Ser Tyr Ile Asn Gly Ser Gly Thr Tyr Thr Asp Tyr Ala 50 55 60 Asp Ser Val Met Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Gly Asn Ala Gln Asn 65 70 75 80 Ser Leu Tyr Leu Gln Ile Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Ile 85 90 95 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Val Gly Pro Gly Asn Gly Ala Ser Glu Phe 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Ala Thr Val Thr Val Ser Ser His Met Ala 115 120 125 <210> 2 <211> 384 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> &Lt; 223 > D2VH nucleic acid sequence <400> 2 cccgggatca tcatcatcac catcacgagt ctgggggagg cttggtcaag cctggagggt 60 ccctgagact ctcctgtgca gcctcaggat tcaccttcag taactactac atgagctgga 120 tccgtcagac tccagggaag gggccggagt ggatttcata cattaacgga agtggtactt 180 acacagacta cgcagactct gtgatgggcc ggttcaccat ctccagaggc aacgcccaaa 240 attctctgta tctgcagatc aacagcctga gagtcgagga cacggccatc tattactgtg 300 cgagagcggt tgggcccggt aacggtgctt ctgagttctg gggccagggg gccacggtca 360 ccgtctcctc acatatggct taag 384 <210> 3 <211> 1344 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Red Sea bream Iridovirus Coat Protein <400> 3 gctagcatgt ctgcaatctc aggtgcgcag gtaaccagtg ggttcatcga catctccgcg 60 tttgatgcga tggagaccca cttgtatggc ggcgacaatg ccgtgaccta ctttgcccgt 120 gagaccgtgc gtagttcctg gtacagcaag ctgcccgtca ccctatcaaa acagactggc 180 catgctaatt tcggccagga gtttagtgtg actgtggcaa ggggtggcga ctacctcatt 240 aatgtgtggc tgcgtgttaa gatcccctcc atcacgtcca gcaaggagaa cagctacatt 300 cgctggtgtg ataatttgat gcacaatcta gttgaggagg tgtcggtgtc atttaacgac 360 ctggtggcac agaccctgac cagcgagttc cttgactttt ggaacgcctg catgatgcct 420 ggtagcaaac aatctggcta caacaagatg attggcatgc gcagcgacct ggtgggcggt 480 atcaccaacg gtcagactat gcccgccgcc taccttaatt tgcccattcc cctgttcttt 540 acccgtgaca caggccttgc attgcctact gtgtctctgc cgtacaatga ggtgcgcatc 600 cacttcaagc tgcggcgctg ggaggacctg ctcatcagcc agagcaccca ggccgacatg 660 gccatatcga ctgtcaccct ggctaacatt ggcaatgtag cacccgcact gacccaggtg 720 tccgtgatgg gcacctacgc tgtactgaca agtgaggagc gtgaggttgt ggcccagtct 780 agccgtagca tgctcattga gcagtgtcag gtggcgcctc gtgtgcctgt cacacccgta 840 gacaattcct tggtgcatct cgacctgatg ttcagtcacc ctgtgaaggc cttgttcttt 900 gcagtcaagc aggtcactca ccgcaacgtg caaagccagt acaccgcggc cagtcccgtg 960 tatgtcaaca acaaggtgaa tctgcctttg ctggccacca atcccctgtc cgaggtgtcg 1020 ctcatttacg agaacacccc tcggctccac cagatgggag tagactactt cacatctgtc 1080 gacccctact actttgcgcc cagcatgcct gagatggatg gtgttatgac ctactgttat 1140 acgctggaca tgggcaatat caaccctatg ggctcgacca actacggccg cctgtcccag 1200 gtcaccctgt catgtaaggt gtcggacaat gccaagacca ccgcggcggg cggtggaggc 1260 cagggcaccg gctacacggt cgcccaaaag tttgaactgg tcgttattgc agtcaaccac 1320 aacatcatga agattgccgg atcc 1344 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pCANTAB5_S1_primer F <400> 4 caacgtgaaa aaattattat tcgc 24 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pCANTAB5_S6_primer R <400> 5 gtaaatgaat tttctgtatg agg 23 <210> 6 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D2VH_primer F <400> 6 cccgggatca tcatcatcac catcacgagt ctggggga 38 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D2VH_primer R <400> 7 cttaagccat atgtgaggag acggtg 26 <210> 8 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D2VL_primer F <400> 8 cccgggatca tcatcatcac catcaccagt ctgccctg 38 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D2VL_primer R <400> 9 cttaagccat atgggtgacc ttggtccca 29

Claims

A heavy chain variable region (VH) of an antibody that specifically binds to a red blemish idiovirus (RSIV), represented by SEQ ID NO: 1 and comprising HFR1, HCDR1, HFR2, HCDR2, HFR3 and HCDR3.

The heavy chain variable region of claim 1, wherein the heavy chain variable region specifically binds to the coat protein of red bream virus.

A composition for detecting red rain ischemia virus (RSIV) comprising the heavy chain variable region according to claims 1 or 2.

A kit for detecting red blemish virus (RSIV) comprising the heavy chain variable region according to claim 1 or 2.

5. The kit according to claim 4, wherein the kit is an immunoassay kit.

The kit according to claim 5, wherein the immunoassay kit is a protein microarray or an ELISA assay kit.

1. A nucleic acid molecule encoding an amino acid sequence of a heavy chain variable region (VH) comprising SEQ ID NO: 1 and comprising HFR1, HCDR1, HFR2, HCDR2, HFR3 and HCDR3.

8. A recombinant vector comprising a nucleic acid molecule according to claim 7.

9. A host cell comprising the recombinant vector according to claim 8.

11. A method for producing a host cell comprising culturing a host cell according to claim 9,
1. A method for producing a heavy chain variable region (VH) represented by SEQ ID NO: 1 and comprising HFR1, HCDR1, HFR2, HCDR2, HFR3 and HCDR3.

Contacting the sample with the heavy chain variable region according to claim 1; And
Detecting the binding of the heavy chain variable region to the red bliomydidovirus (RSIV) coat protein
(RSIV). &Lt; / RTI >

12. The method of claim 11,
Wherein the sample is a protein extracted from a serum or a fish of a fish to be detected, wherein the red rain is isovirus (RSIV) detection method.