KR101791503B1 - Antibody for nervous necrosis virus and its use - Google Patents
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Abstract
본 발명은 신경괴사바이러스(NNV)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편, 및 신경괴사바이러스의 검출을 위한 그의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to antibodies or antigen-binding fragments that specifically bind to neurotoxic virus (NNV), and uses thereof for the detection of neurodegenerative virus.
Description
본 발명은 신경괴사바이러스(Nervous necrosis virus, NNV)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편, 및 신경괴사바이러스의 검출을 위한 그의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to antibodies or antigen-binding fragments that specifically bind to Nervous necrosis virus (NNV), and uses thereof for the detection of neuronal necrosis virus.
바이러스성 신경괴사(viral nervous necrosis, VNN)는 노다바이러스과 내의 베타노다바이러스(betanodavirus) 속에 속해 있는 어류 노다바이러스에 의해 유발된다. 이 질병은 유럽농어(Dicentrarchus labrax) 뿐만 아니라 줄무늬잭(Pseudocaranx dentex), 대서양 넙치(Hippoglossus hippoglossus), 가자미(Scophthalmus maximus) 및 그루퍼 등 경제적으로 중요한 해양어류에 영향을 미친다. VNN 관련 질병을 유발하는 신경괴사 바이러스(NNV)는 크기가 약 30 nm이며, 비외피성 정 20면체 RNA 바이러스이다. 어류 노다바이러스는 바이러스 외피단백질 유전자 가변부(T4)의 염기서열에 따라 줄무늬잭 NNV (SJNNV), 자주복 NNV (TPNNV), 노랑가자미 NNV (BFNNV) 및 붉바리 NNV (RGNNV) 등 4종류의 유전형으로 구분된다.Viral nervous necrosis (VNN) is caused by fish nodavirus, which belongs to the Betanodavirus in the Nodavirus. The disease affects economically important marine fish, such as the European seabass ( Dicentrarchus labrax ), as well as the Pseudocaranx dentex , the Atlantic flounder ( Hippoglossus hippoglossus ), the flounder ( Scophthalmus maximus ) and grouper. Neuroinvasive virus (NNV), which causes VNN-related diseases, is about 30 nm in size and is a non-epithelial, icosahedral RNA virus. The fish NODA virus has four types of genotypes, namely, the strains Jack NNV (SJNNV), NNV (TPNNV), NNV (BFNNV) and RBNNV (RGNNV) according to the nucleotide sequence of the viral coat protein gene variable region .
다양한 숙주범위와 경제적인 피해로 인하여 NNV를 동정하고 검출하기 위한 다양한 보고가 이루어지고 있다. 특히 혈청학적 방법은 특이성, 신속함 및 단순함 때문에 자주 사용되고 있다. 혈청학적 방법은 항체의 질에 크게 의존하는데, 고도로 정제되고 정확한 항원을 사용하는 것은 더 특이한 항체를 얻는데 있어서 가장 중요한 요소 중의 하나이다. 그러나, 항체를 생산하기 위해서는 동물의 희생을 필요로 하거나 동물세포 배양을 위해 고비용이 요구되며, 많은 시간이 소요된다. 또한 바이러스 진단을 위한 항체를 생산하기 위해서는 바이러스 항원을 확보해야 하는데, 국내에서 얻기 어려운 바이러스의 경우 항원확보에 어려움이 생겨 새로운 바이러스에 대한 대응속도가 떨어지는 문제가 있다. 또한, 대상 단백질의 발현이 일어나지 않거나 정제가 거의 불가능한 경우 대상 항원을 얻는 것이 어렵기 때문에, 전통적인 혈청학적 방법은 사용하기 어려운 경우가 많다. 따라서 virus-like particles (VLPs)을 어류에 주사하는 직접 면역법을 사용하거나, 곤충세포 및 대장균 발현시스템을 사용하여 VLPs를 생산하는 방법이 사용되어 왔다. 최근에는 RGNNV 외피단백질 유전자가 형질전환된 효모(Saccharomyces cerevisiae) 분쇄물로부터 VLPs를 분리하고, 크로마토그래피를 이용하여 정제하는 방법이 보고되기도 하였다 (Choi Y. R. , Kim H. J. , Lee J. Y. , Kang H. A. , Kim H. , Kim J. 2013 Chromatographically-purified capsid proteins of red-spotted grouper nervous necrosis virus expressed in Saccharomyces cerevisiae form virus-like particles Protein Expr Purif 89 162 - 168).Various reports have been made to identify and detect NNV due to various host ranges and economic damages. Serologic methods in particular are frequently used because of their specificity, speed and simplicity. Serological methods are highly dependent on the quality of the antibody, and the use of highly purified and accurate antigens is one of the most important factors in obtaining more specific antibodies. However, in order to produce antibodies, high cost is required for animal sacrifice or animal cell culture, and it takes a lot of time. In order to produce antibodies for the diagnosis of viruses, virus antigens must be secured. In the case of viruses which are difficult to obtain in Korea, it is difficult to secure antigens, and thus there is a problem that the speed of response to new viruses is low. In addition, traditional serological methods are often difficult to use because it is difficult to obtain the target antigen if expression of the protein of interest does not occur or purification is nearly impossible. Thus, methods have been used that either use direct immunization to inject virus-like particles (VLPs) into fish, or produce VLPs using insect cells and an E. coli expression system. Recently, yeast transformed with the RGNNV coat protein gene ( Saccharomyces there has been reported a method of separating VLPs from a cerevisiae pulverized product and purifying it using chromatography (Choi, YH, Lee, JY, Kang, HA, Kim, J., 2013) Chromatographically-purified capsid proteins of red -spotted grouper nervous necrosis virus expressed in Saccharomyces cerevisiae form virus-like particles Protein Expr Purif 89 162 - 168).
신경괴사바이러스(NNV)는 주로 유생과 치어 단계의 어류에 영향을 미친다. 감염된 어류는 중추신경계 및 망막 손상으로 인하여 비정상적인 행동 및 시각기능 이상이 나타나며, 뇌와 척수에서의 액포형성과 괴사가 나타나 수확량의 현저한 감소를 가져올 수 있으므로, 이에 대한 정확하고 신속하며 경제적인 진단법의 개발이 필요한 실정이다.Nerve necrosis virus (NNV) affects predominantly larval and fish stages. Infected fish have abnormal behavior and visual dysfunction due to central nervous system and retinal injuries. Liquid vacuolization and necrosis in the brain and spinal cord may lead to a significant decrease in yield, so development of accurate, fast and economical diagnostic methods .
본원은, 돔류 및 넙치 등에 감염력이 강하며 감염 시 높은 폐사율을 나타내는 것으로 알려진 신경괴사바이러스(NNV) 항원단백질을 대량 생산하고 이를 검출하는 scFv(single-chain variable fragment)를 선발함으로써 NNV에 감염된 어류를 조기 진단할 수 있는 항체 또는 항원 결합 단편 및 이를 이용한 NNV 검출과 관련된 용도를 제공하고자 한다.In this study, we screened single-chain variable fragments (scFv) for mass production and detection of NNV antigen protein, which is infectious to domestics and flounder, An antibody or an antigen-binding fragment capable of early diagnosis and a use related to NNV detection using the same.
그러나, 본원이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the problems to be solved by the present invention are not limited to the above-mentioned problems, and other problems not mentioned can be clearly understood by those skilled in the art from the following description.
본원의 제 1 측면은, 서열번호 1로 표시되는 경쇄 가변영역(VL)을 포함하는, 신경괴사바이러스(NNV)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편에 관한 것이다.A first aspect of the invention relates to an antibody or antigen-binding fragment that specifically binds to neurodegenerative virus (NNV), comprising the light chain variable region (VL) of SEQ ID NO:
본원의 제 2 측면은, 서열번호 1로 표시되는 경쇄 가변영역(VL)을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는, 신경괴사바이러스(NNV) 검출용 조성물에 관한 것이다.The second aspect of the present invention relates to a composition for detecting neuronal necrosis virus (NNV) comprising an antibody or an antigen-binding fragment comprising a light chain variable region (VL) represented by SEQ ID NO: 1.
본원의 제 3 측면은, 본원의 제 1 측면에 따른 항체 또는 항원 결합 단편, 또는 본원의 제 2 측면에 따른 조성물을 포함하는, 신경괴사바이러스(NNV) 검출용 키트에 관한 것이다.A third aspect of the invention relates to a kit for detecting neuronal necrosis virus (NNV), comprising an antibody or antigen-binding fragment according to the first aspect of the invention, or a composition according to the second aspect of the invention.
본원의 제 4 측면은, 서열번호 1로 표시되는 경쇄 가변영역(VL)을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다.A fourth aspect of the invention relates to a nucleic acid molecule encoding a light chain variable region (VL) represented by SEQ ID NO: 1.
본원의 제 5 측면은, 본원의 제 4 측면에 따른 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.A fifth aspect of the invention relates to a recombinant vector comprising a nucleic acid molecule according to the fourth aspect of the invention.
본원의 제 6 측면은, 본원의 제 5 측면에 따른 재조합 벡터를 포함하는 숙주세포에 관한 것이다.A sixth aspect of the invention relates to a host cell comprising a recombinant vector according to the fifth aspect of the invention.
본원의 제 7 측면은, 본원의 제 6 측면에 따른 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는, 서열번호 1로 표시되는 경쇄 가변영역(VL)을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편의 제조방법에 관한 것이다.A seventh aspect of the invention relates to a method for producing an antibody or antigen-binding fragment comprising the light chain variable region (VL) of SEQ ID NO: 1, comprising culturing a host cell according to the sixth aspect of the invention .
본원의 제 8 측면은, 본원의 제 1 측면에 따른 항체 또는 항원 결합 단편과 시료를 접촉시키는 단계; 및 상기 항체 또는 항원 결합 단편과 신경괴사바이러스(NNV) 외피 단백질의 결합을 탐지하는 단계를 포함하는, 신경괴사바이러스(NNV) 검출 방법에 관한 것이다.According to an eighth aspect of the present application, there is provided a method for detecting an antibody, comprising: contacting a sample with an antibody or antigen-binding fragment according to the first aspect of the present invention; And detecting the binding of the antibody or antigen binding fragment to a neuronal necrosis virus (NNV) coat protein.
본원에 따르면, 돔류 및 넙치 등의 수산생물에 감염되었을 시 높은 폐사율을 나타내는 신경괴사바이러스(NNV) 항원단백질을 정확하고 효율적으로 검출할 수 있는 항체 또는 항원 결합 단백질, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 신경괴사바이러스의 검출 방법을 제공할 수 있다.According to the present invention, there is provided an antibody or antigen-binding protein capable of accurately and efficiently detecting a nerve necrosis virus (NNV) antigen protein exhibiting a high mortality when infected with aquatic organisms such as dams and flounder, A method of detecting a virus can be provided.
또한, 본원에 기재된 방법에 따르면 NNV 뿐만 아니라 다른 종류의 바이러스에 대해서도 항원을 쉽게 확보할 수 있고 이에 대한 scFv 항체를 신속하게 개발할 수 있을 것으로 기대되며, 이로부터 다양한 바이러스에 신속한 대응이 가능하며 항체유전자를 확보하여 항체공학을 통한 혈청학적 분석 키트를 개발할 수 있다.In addition, according to the method described in the present application, antigens can be easily obtained for not only NNV but also other kinds of viruses, and it is anticipated that it will be possible to rapidly develop scFv antibodies against these viruses. Accordingly, To develop a serological analysis kit through antibody engineering.
도 1은 신경괴사바이러스 외피 단백질(Nervous necrosis virus coat protein, NNV CP)의 유전자 서열을 나타낸 이미지이다.
도 2a 및 도 2b는 본원의 일 실시예에서 사용된 NVV CP 단백질 서열을 야생형 서열과 비교하여 나타낸 이미지이다.
도 3a는 본원의 일 실시예에 따라 수행된 효모표면발현의 개략도이며, 도 3b는 효모표면발현의 결과를 나타낸 유세포분석 이미지이다.
도 4는 본원의 일 실시예에서 선발된 파지 scFv 클론들을 증폭시키기 위해 사용된 프라이머 세트의 서열을 나타낸 이미지이다.
도 5는 본원의 일 실시예에서 선발된 scFv 클론들을 전기영동하여 확인한 이미지이다.
도 6은 본원의 일 실시예에서 선발된 scFv 클론들의 아미노산 서열로부터 추정되는 CDR 영역을 나타낸 이미지이다.
도 7은 본원의 일 실시예에서 선발된 B2VL 유전자의 증폭을 위한 프라이머 서열 및 B2VL 유전자가 증폭된 것을 전기영동으로 확인한 이미지이다.
도 8은 본원의 일 실시예에 따라 플라스미드에 삽입된 scFv 절편의 개략도이다.
도 9a는 본원의 일 실시예에 따라 수득된 항체 단백질의 발현을 확인한 결과이고, 도 9b는 상기 항체 단백질의 정제 후 웨스턴 블롯을 수행한 결과를 나타낸 이미지이다.
도 10은 본원의 일 실시예에 따라 수득된 경쇄 가변영역의 NNV CP에 대한 특이적 결합 여부를 확인하기 위해 수행한 ELISA 분석 결과를 나타낸 이미지이다.
도 11은 본원의 일 실시예에 따라 수득된 경쇄 가변영역의 유전자 염기서열을 나타낸 이미지이다.FIG. 1 is an image showing the gene sequence of a nervous necrosis virus coat protein (NNV CP).
2A and 2B are images showing the NVV CP protein sequence used in one embodiment of the present invention in comparison with a wild-type sequence.
Figure 3A is a schematic representation of yeast surface expression performed in accordance with one embodiment of the invention, and Figure 3B is a flow cytometric analysis image showing the results of yeast surface expression.
Figure 4 is an image showing the sequence of the primer set used to amplify the phage scFv clones selected in one embodiment of the invention.
FIG. 5 is an image obtained by electrophoresis of scFv clones selected in one embodiment of the present invention.
Figure 6 is an image showing the CDR regions deduced from the amino acid sequence of the scFv clones selected in one embodiment of the present application.
FIG. 7 is an image obtained by amplifying the primer sequence and the B2VL gene for amplification of the B2VL gene selected in one embodiment of the present invention by electrophoresis.
Figure 8 is a schematic view of an scFv fragment inserted into a plasmid according to one embodiment of the invention.
FIG. 9A is a result of confirming the expression of the antibody protein obtained according to one embodiment of the present invention, and FIG. 9B is an image showing the result of performing Western blotting after purification of the antibody protein.
FIG. 10 is an image showing the result of ELISA analysis performed to confirm the specific binding of the light chain variable region to NNV CP obtained according to one embodiment of the present invention.
11 is an image showing the gene base sequence of the light chain variable region obtained according to one embodiment of the present invention.
이하, 첨부한 도면을 참조하여 본원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 구현예 및 실시예를 상세히 설명한다.Hereinafter, embodiments and examples of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings, so that those skilled in the art can easily carry out the present invention.
그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 구현예 및 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본원을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였다.It should be understood, however, that the present invention may be embodied in many different forms and is not limited to the embodiments and examples described herein. In order to clearly explain the present invention in the drawings, portions not related to the description are omitted.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.Throughout this specification, when an element is referred to as "including " an element, it is understood that the element may include other elements as well, without departing from the other elements unless specifically stated otherwise.
본 명세서에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 예를 들어, 용어 "약"이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.As used herein, the terms "about," " substantially, "and the like are used herein to refer to or approximate the numerical value of manufacturing and material tolerances inherent in the stated sense, Accurate or absolute numbers are used to prevent unauthorized exploitation by unauthorized intruders of the mentioned disclosure. For example, the term "about" is used to refer to a reference quantity, level, value, number, frequency, percentage, dimension, size, quantity, weight, or length of 30, 25, 20, 25, 10, 9, Level, value, number, frequency, percentage, dimension, size, quantity, weight or length of a form, level, value varying from 1 to 6, 5, 4, 3,
또한, 본원 명세서 전체에서, "~ 하는 단계" 또는 "~의 단계"는 "~를 위한 단계"를 의미하지 않는다.Also, throughout the present specification, the phrase " step "or" step "does not mean" step for.
본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 "이들의 조합"의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.Throughout this specification, the term "combination thereof" included in the expression of the machine form means one or more combinations or combinations selected from the group consisting of the constituents described in the expression of the machine form, And the like.
본원 명세서 전체에서, "A 및/또는 B"의 기재는, "A 또는 B, 또는, A 및 B"를 의미한다. Throughout this specification, the description of "A and / or B" means "A or B, or A and B".
본원 명세서 전체에서, "프라이머(primer)" 란 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 본원발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.Throughout this specification, a "primer" is a nucleic acid sequence having a short free 3 'hydroxyl group that can form base pairs with a complementary template and is a starting point for template strand copying Quot; means a short nucleic acid sequence which functions. The primers of the present invention can be chemically synthesized using the phosphoramidite solid support method, or other well-known methods.
본원 명세서 전체에서, 용어 "중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction: PCR)" 은 특정 DNA 영역을 시험관 내에서 효소를 이용하여 원하는 부분을 증폭하는, 대표적인 핵산증폭기술(NAT) 중의 하나이다.PCR은 기본적으로 변성, 결합, 연장의 세 단계로 구성되어 있고, 이 과정이 반복되면서 DNA가 증폭된다. PCR의 제1단계는 주형 DNA를 단일쇄로 변성시킨다(변성단계). 제2단계는 목적하는 영역을 사이에 두는 두 종류의 단일쇄 DNA에 결합시킨다(결합단계). 제3단계는 프라이머로부터 고열에 내성인 DNA 중합효소에 의해 DNA를 합성하고 이상의 사이클을 적절한 횟수(예컨대, 25 내지 40회)로 반복한다.Throughout the specification, the term "polymerase chain reaction" (PCR) is one of the representative nucleic acid amplification techniques (NAT) that amplify a desired DNA region by using an enzyme in a specific DNA region. , Which consists of three steps: denaturation, binding, and extension. This process is repeated to amplify the DNA. The first step of the PCR is to denature the template DNA into a single strand (denaturation step). The second step is to bind the two types of single-stranded DNA between the target regions (the binding step). The third step is to synthesize DNA from the primer by a high temperature resistant DNA polymerase and repeat the above cycle with an appropriate number of times (for example, 25 to 40 times).
이하, 본 발명에 대하여 구현예 및 실시예와 도면을 참조하여 구체적으로 설명하도록 한다. 그러나, 본 발명이 이러한 구현예 및 실시예와 도면에 제한되는 것은 아니다. Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to embodiments, examples and drawings. However, the present invention is not limited to these embodiments and examples and drawings.
본원의 제 1 측면은, 서열번호 1로 표시되는 경쇄 가변영역(VL)을 포함하는, 신경괴사바이러스(NNV)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 제공한다. 서열번호 1은 경쇄 가변영역의 아미노산 서열을, 서열번호 2는 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 서열을 나타낸다.A first aspect of the invention provides an antibody or antigen-binding fragment that specifically binds to neurodegenerative virus (NNV), comprising the light chain variable region (VL) of SEQ ID NO: SEQ ID NO: 1 represents the amino acid sequence of the light chain variable region, and SEQ ID NO: 2 represents the nucleic acid sequence encoding the light chain variable region.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 신경괴사바이러스의 외피 단백질(coat protein. CP)에 특이적으로 결합하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. In one embodiment of the invention, the antibody or antigen-binding fragment may be, but is not limited to, specifically bind to coat protein (CP) of neuronal necrosis virus.
일반적으로, 완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.In general, a complete antibody is a structure having two full-length light chains and two full-length heavy chains, each light chain being linked by a disulfide bond with a heavy chain. The heavy chain constant region has gamma (gamma), mu (mu), alpha (alpha), delta (delta) and epsilon (epsilon) types and subclasses gamma 1 (gamma 1), gamma 2 ), Gamma 4 (gamma 4), alpha 1 (alpha 1) and alpha 2 (alpha 2). The constant region of the light chain has kappa (kappa) and lambda (lambda) types.
본 명세서에서 용어항원 결합 단편은 전체 항체 분자 내에서 항원-항체 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv, 및 이들의 단편 등을 포함한다. Fv는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 PCT 국제 공개특허출원 WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086 및 WO 88/09344에 개시되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 단쇄의 가변영역이 공유결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. As used herein, the term antigen-binding fragment means a fragment having an antigen-antibody binding function in the whole antibody molecule, and includes Fab, F (ab '), F (ab') 2 and Fv, . Recombinant techniques for producing Fv fragments with minimal antibody fragments having only a heavy chain variable region and a light chain variable region are described in PCT International Publication Nos. WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086, WO 88/09344. The double-chain Fv is a non-covalent linkage between a heavy chain variable region and a light chain variable region. A single-chain Fv generally shares a variable region of a heavy chain and a variable region of a short chain via a peptide linker Or directly connected at the C-terminus to form a dimer-like structure like the double-stranded Fv.
본 명세서에서 용어중쇄는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VH 및 3 개의 불변영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 또한, 본 명세서에서 용어경쇄는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VL 및 불변영역 도메인 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.As used herein, the term heavy chain refers to a full-length heavy chain comprising a variable region domain VH comprising an amino acid sequence with sufficient variable region sequence to confer specificity to the antigen and three constant region domains CH1, CH2 and CH3, it means. Also, as used herein, the term light chain refers to both the full-length light chain and fragments thereof, including the variable region domain VL and the constant region domain CL comprising an amino acid sequence having sufficient variable region sequence to confer specificity to the antigen.
예를 들어, 본 발명의 항체는 단일클론 항체일 수 있다. 용어 "단일클론 항체"는 실질적으로 동일한 항체 집단에서 수득한 단일 분자 조성의 항체분자를 의미하며, 단일클론 항체는 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다. 단일의 하이브리도마 세포주로부터 분리된 항체는 단일클론 항체라 할 수 있다.For example, the antibody of the present invention may be a monoclonal antibody. The term "monoclonal antibody" refers to a single molecule composition of an antibody molecule obtained in a substantially identical population of antibodies, wherein the monoclonal antibody exhibits a single binding specificity and affinity for a particular epitope. An antibody isolated from a single hybridoma cell line can be a monoclonal antibody.
본원의 제 2 측면은, 서열번호 1로 표시되는 경쇄 가변영역(VL)을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는, 신경괴사바이러스(NNV) 검출용 조성물을 제공한다.A second aspect of the present invention provides a composition for detecting neuronal necrosis virus (NNV) comprising an antibody or an antigen-binding fragment comprising a light chain variable region (VL) represented by SEQ ID NO: 1.
본원의 제 3 측면은, 본원의 제 1 측면의 항체 또는 항원 결합 단편, 또는 본원의 제 2 측면의 조성물을 포함하는, 신경괴사바이러스(NNV) 검출용 키트를 제공한다.A third aspect of the invention provides a kit for detecting neuronal necrosis virus (NNV) comprising an antibody or antigen-binding fragment of the first aspect of the invention, or a composition of the second aspect of the invention.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 키트는 면역분석(immunoassay)용 키트일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.In one embodiment of the invention, the kit may be, but not limited to, a kit for immunoassay.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 면역분석용 키트는 단백질 마이크로어레이 또는 ELISA 분석 키트일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.In one embodiment of the invention, the immunoassay kit may be a protein microarray or an ELISA assay kit, but is not limited thereto.
ELISA 분석은 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 이차항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함할 수 있다. 본 발명의 항체는 검출 표지를 가질 수 있으며, 검출표지를 가지지 않을 경우는 본 발명의 항체를 포획할 수 있고 검출 표지를 가지는 또 다른 항체를 처리하여 확인할 수 있다.ELISA assays include direct ELISA using a labeled antibody that recognizes an antigen attached to a solid support, indirect ELISA using a labeled secondary antibody that recognizes the capture antibody in a complex of antibodies recognizing an antigen attached to a solid support, A direct sandwich ELISA using another labeled antibody that recognizes the antigen in the complex of the attached antibody and the antigen, an antibody that recognizes the antibody after reacting with another antibody recognizing the antigen in the complex of the antibody and the antigen attached to the solid support Indirect sandwich ELISA using labeled secondary antibodies, and the like. The antibody of the present invention can have a detection label, and when it does not have a detection label, it can be identified by treating another antibody capable of capturing the antibody of the present invention and having a detection label.
본 발명의 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 추가적으로 포함할 수 있다. ELISA 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한, ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트 됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.The kit of the present invention may further include essential elements necessary for performing ELISA. ELISA kits contain antibodies specific for the marker protein. An antibody is a monoclonal antibody, polyclonal antibody or recombinant antibody, which has high specificity and affinity for the marker protein and little cross-reactivity to other proteins. In addition, ELISA kits can contain antibodies specific for the control protein. Other ELISA kits can be used to detect antibodies that can bind a reagent capable of detecting the bound antibody, such as a labeled secondary antibody, chromophores, an enzyme (e. G., Conjugated to an antibody) Other materials, and the like.
본 발명의 키트는 여러 가지 시료를 동시에 분석하기 위하여 단백질 마이크로어레이를 수행하기 위해 필요한 필수요소를 추가적으로 포함할 수 있다. 마이크로어레이 키트는 고체상에 결합된 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 단백질 마이크로어레이 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단, 효소(예: 항체와 융합됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 단백질 마이크로어레이를 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하는 것을 포함할 수 있다.The kit of the present invention may further include essential elements necessary for performing a protein microarray to simultaneously analyze various samples. Microarray kits contain antibodies specific for the marker protein bound to the solid phase. Protein microarray kits may comprise reagents capable of detecting bound antibodies, such as a labeled secondary antibody, a chromophore, an enzyme (e.g., fused with an antibody) and other substrates capable of binding to the substrate or antibody, . A method of analyzing a sample using a protein microarray is a method of separating a protein from a sample, hybridizing the separated protein with a protein chip to form an antigen-antibody complex, reading the resultant protein, ≪ / RTI >
본원의 제 4 측면은, 서열번호 1로 표시되는 경쇄 가변영역(VL)을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.A fourth aspect of the present invention provides a nucleic acid molecule encoding a light chain variable region (VL) represented by SEQ ID NO: 1.
본원의 제 5 측면은, 본원의 제 4 측면의 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.A fifth aspect of the invention provides a recombinant vector comprising a nucleic acid molecule of the fourth aspect of the invention.
본 명세서에서 용어벡터는 숙주세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터; 코즈미드 벡터; 그리고 박테리오파지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.As used herein, the term vector refers to a plasmid vector as a means for expressing a gene of interest in a host cell; Cosmeptide vector; And viral vectors such as bacteriophage vectors, adenovirus vectors, retroviral vectors, and adeno-associated viral vectors, and the like.
본 발명의 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001) 등에 개시되어 있다.The recombinant vector of the present invention can be constructed through various methods known in the art, and specific methods for this are disclosed in Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001).
본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ프로모터, pRλ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, gal 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주세포로서 E. coli(예컨대, HB101, BL21, DH5α 등)가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위(Yanofsky, C. J. Bacteriol. 158:1018-1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터(pLλ프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D. Ann. Rev. Genet. 14:399-445(1980))가 조절부위로서 이용될 수 있다. 숙주세포로서 바실러스 균이 이용되는 경우, 바실러스 츄린겐시스의 독소단백질 유전자의 프로모터(Appl. Environ. Microbiol. 64:3932-3938(1998); Mol. Gen. Genet. 250:734-741(1996)) 또는 바실러스균에서 발현 가능한 어떠한 프로모터라도 조절부위로 이용될 수 있다.The vector of the present invention can typically be constructed as a vector for cloning or as a vector for expression. In addition, the vector of the present invention can be constructed by using prokaryotic cells or eukaryotic cells as hosts. For example, when the vector of the present invention is an expression vector and a prokaryotic cell is used as a host, a strong promoter capable of promoting transcription (such as a tac promoter, lac promoter, lacUV5 promoter, lpp promoter, pL 貫 promoter, , the rac5 promoter, the amp promoter, the gal promoter, the recA promoter, the SP6 promoter, the trp promoter and the T7 promoter), a ribosome binding site for initiation of detoxification, and a transcription / As the host cell E. coli (e.g., HB101, BL21, DH5α, etc.), if used, E. coli promoter of the tryptophan biosynthetic pathway and the operator site (Yanofsky, CJ Bacteriol 158:. 1018-1024 (1984)) , and phage λ (PL? Promoter, Herskowitz, I. and Hagen, D. Ann. Rev. Genet. 14: 399-445 (1980)) can be used as a regulatory region. When the Bacillus bacterium is used as a host cell, the promoter of the toxin protein gene of Bacillus thuringiensis (Appl. Environ. Microbiol. 64: 3932-3938 (1998); Mol. Gen. Genet. 250: 734-741 (1996) ) Or any promoter capable of expressing in Bacillus may be used as a regulatory region.
한편, 본 발명의 재조합 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예: pCL, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지(예: λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.Meanwhile, the recombinant vector of the present invention can be prepared by using a plasmid (for example, pCL, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8 / 9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pGEX series, pET series, pUC19, etc.), phage (e.g., λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 and M13) or viruses (eg SV40 and the like).
한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터, β-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터 엡스타인바 바이러스(EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 가질 수 있다.On the other hand, when the vector of the present invention is an expression vector and a eukaryotic cell is used as a host, a promoter derived from a genome of a mammalian cell such as a metallothionein promoter, a beta -actin promoter, a human heterologous promoter, A promoter derived from mammalian viruses such as adenovirus late promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, cytomegalovirus (CMV) promoter, HSV tk promoter, mouse breast tumor virus (MMTV) promoter , The LTR promoter of HIV, the promoter of Moloney virus promoter Epstein Barr virus (EBV) and the promoter of Roussacomavirus (RSV)) can be used, and as a transcription termination sequence, a polyadenylation sequence have.
본 발명의 재조합 벡터는 그로부터 발현되는 항체의 정제를 용이하게 하기 위하여 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은, 예컨대 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA); 말토스 결합 단백질(NEB, USA); FLAG(IBI, USA); 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA), Pre-S1, c-Myc와 같은 태그 서열; OmpA, PelB와 같은 선도서열 등이 있다. 또한, 본 발명의 벡터에 의해 발현되는 단백질이 항체이기 때문에 정제를 위한 추가적인서열 없이도, 발현된 항체는 단백질 A 컬럼 등을 통하여 용이하게 정제할 수 있다.The recombinant vectors of the present invention may be fused with other sequences to facilitate purification of antibodies expressed therefrom. Fused sequences include, for example, glutathione S-transferase (Pharmacia, USA); Maltose binding protein (NEB, USA); FLAG (IBI, USA); Tag sequences such as 6x His (hexahistidine; Quiagen, USA), Pre-S1, and c-Myc; OmpA, and PelB. In addition, since the protein expressed by the vector of the present invention is an antibody, the expressed antibody can be easily purified through a protein A column or the like, without any additional sequence for purification.
한편, 본 발명의 재조합 벡터는 선택표지로서 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.Meanwhile, the recombinant vector of the present invention may include an antibiotic resistance gene commonly used in the art as a selection marker. For example, the recombinant vector may include an ampicillin, gentamycin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin, kanamycin, Neomycin, and tetracycline resistance genes, but the present invention is not limited thereto.
본 발명의 항체를 발현하는 벡터는, 경쇄와 중쇄가 하나의 벡터에서 동시에 발현되는 벡터 시스템이거나 또는 경쇄와 중쇄를 각각 별도의 벡터에서 발현시키는 시스템 모두 가능하다. 후자의 경우, 두 벡터는 동시 형질전환(co-transfomation) 및 표적 형질전환(targeted transformation)을 통하여 숙주세포로 도입될 수 있다. The vector expressing the antibody of the present invention can be a vector system in which a light chain and a heavy chain are expressed simultaneously in one vector or a system in which a light chain and a heavy chain are separately expressed in separate vectors. In the latter case, both vectors can be introduced into host cells via co-transfomation and targeted transformation.
본 명세서에서 용어형질전환은 본 발명의 재조합 벡터를 이용하여 숙주 세포에 목적하는 유전자를 도입하는 것을 말하며, 형질감염과 동일한 의미로 사용된다. 따라서, 숙주세포로의형질전환및/또는형질감염은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로 박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환방법 등이 포함되나, 이에 제한되지 않을 수 있다.In this specification, the term transformation refers to introduction of a desired gene into a host cell using the recombinant vector of the present invention, and is used in the same sense as transfection. Thus, transformation and / or transfection into a host cell includes any method of introducing the nucleic acid into an organism, cell, tissue or organ, and is carried out by selecting a suitable standard technique depending on the host cell, as is known in the art . Such methods include electroporation, protoplast fusion, calcium phosphate (CaPO 4 ) precipitation, calcium chloride (CaCl 2 ) precipitation, agitation with silicon carbide fibers, Agrobacterium mediated transformation, PEG, dextran sulfate, Pectamine, and dry / depressant-mediated transformation methods, and the like.
본원의 제 6 측면은, 본원의 제 5 측면의 재조합 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공한다.A sixth aspect of the invention provides a host cell comprising the recombinant vector of the fifth aspect of the invention.
본원의 제 7 측면은, 본원의 제 6 측면의 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는, 서열번호 1로 표시되는 경쇄 가변영역(VL)을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편의 제조방법을 제공한다. 숙주세포를 배양함으로써 숙주세포로부터 생성되는 목적 단백질을 수집하고 정제하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 당업계에 알려진 목적 단백질의 수집 및 정제 방법들이 제한 없이 사용될 수 있다.A seventh aspect of the present invention provides a method for producing an antibody or antigen-binding fragment comprising the light chain variable region (VL) of SEQ ID NO: 1, comprising culturing the host cell of the sixth aspect of the present application. Methods for collecting and purifying target proteins produced from host cells by culturing host cells are well known in the art and methods of collection and purification of target proteins known in the art can be used without limitation.
본원의 제 8 측면은, 본원의 제 1 측면의 항체 또는 항원 결합 단편과 시료를 접촉시키는 단계; 및 상기 항체 또는 항원 결합 단편과 신경괴사바이러스(NNV) 외피 단백질의 결합을 탐지하는 단계를 포함하는, 신경괴사바이러스(NNV) 검출 방법을 제공한다.The eighth aspect of the present application relates to a method of detecting an antibody or antigen-binding fragment thereof, comprising contacting the sample with the antibody or antigen-binding fragment of the first aspect of the invention; And detecting the binding of the antibody or antigen binding fragment to a neuronal necrosis virus (NNV) coat protein.
예를 들어, 상기 시료는 생물학적 시료일 수 있다. 상기 생물학적 시료란 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 조직 부검 시료(뇌, 피부, 림프절, 척수 등), 세포 배양 상등액, 파열된 진핵세포 및 세균 발현계 등을 들 수 있지만 이에 제한되지 않을 수 있다.For example, the sample may be a biological sample. The biological sample includes, but is not limited to, a tissue, a cell, a whole blood, a serum, a plasma, a tissue autopsy sample (brain, skin, lymph node, spinal cord etc.), a cell culture supernatant, a ruptured eukaryotic cell, have.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 시료는 검출 대상 어류의 혈청 또는 어류로부터 추출한 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.In one embodiment of the present invention, the sample may be, but is not limited to, proteins extracted from the serum or fish of the fish to be detected.
본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 더 잘 이해 될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명의 예시 목적을 위한 것이며, 첨부된 특허청구범위에 의하여 한정되는 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.The present invention may be better understood by the following examples, which are for the purpose of illustrating the invention and are not intended to limit the scope of protection defined by the appended claims.
[[ 실시예Example ]]
1. One. NNVNNV CP 효모표면발현벡터의 수집 Collection of CP yeast surface expression vector
본 실시예에서는 신경괴사바이러스(Nervous Necrosis Virus; NNV)의 외피껍질 단백질(Coat Protein)의 DNA를 이용하여 실험을 진행하였으며, 이는 미국 국립생물정보센터(National Center for Biotechnology Information: NCBI)에서 제공하는 생물체 핵산 정보 데이터베이스인 진뱅크(Genbank)에 기존에 보고된 NNV CP(Coat Protein)의 염기서열 정보(진뱅크 접근번호 (GenBank accession number): GU339227.1)를 바탕으로 합성된 것이다. 도 1 및 서열번호 3에 NNV CP의 유전자 서열이 나타나 있다. 합성에 있어서, 효모표면에 발현되는 단백질의 당단백질은 항원의 발현 효율을 떨어트릴 뿐만 아니라 바이오 패닝을 통해 바이러스 특이 반응 scFv를 선발할 때 항원결정부위가 될 수 있으므로, 당단백질 (주로 N-glycan)을 코딩하지 않도록 하기 위해 N-glycosylation 아미노산 서열 (아스파라긴-X(무작위 아미노산)-세린 또는 트레오닌)의 아스파라긴이 글루타민으로 치환될 수 있도록 하였다. 도 2a에 합성된 NNV CP와 야생형 NNV CP 단백질 서열의 비교 결과가 나타나 있으며, 도 2b에 변형된 아미노산 부위가 나타나 있다. 또한 클로닝을 위해 NNV CP 서열의 앞, 뒤로는 NheI과 BamHI 제한효소 사이트가 추가되었다. In this example, experiments were conducted using the DNA of Coat Protein of Nervous Necrosis Virus (NNV), which was provided by National Center for Biotechnology Information (NCBI) (GenBank accession number: GU339227.1) of NNV CP (Coat Protein) previously reported in Genbank, a database of information on living organism nucleic acid. 1 and SEQ ID NO: 3 show the gene sequence of NNV CP. In the synthesis, the glycoprotein of the protein expressed on the yeast surface not only lowers the efficiency of expression of the antigen but also can be an antigenic determinant when the virus-specific reaction scFv is selected through bio-panning. Therefore, glycoprotein (mainly N-glycan ) Asparagine of the N-glycosylation amino acid sequence (asparagine-X (random amino acid) -serine or threonine) could be replaced with glutamine. The results of the comparison of NNV CP and wild-type NNV CP protein sequences synthesized in FIG. 2A are shown, and the modified amino acid sites are shown in FIG. 2B. In addition, NheI and BamHI restriction sites were added before and after the NNV CP sequence for cloning.
2. 2. NNVNNV CP 효모표면발현벡터의 CP yeast surface expression vector 클로닝Cloning
NNV CP 항원의 유전자들을 효모 표면에 발현시키기 위해 NNV CP 유전자를 효모표면발현 플라스미드 벡터인 pCTCON 벡터에 클로닝하는 과정을 수행하였다. 합성한 NNV CP 유전자와 pCTCON-EGFR 플라스미드 벡터를 각각 NheI과 BamHI 제한효소를 이용하여 DNA를 절단하였다. DNA 절단 과정은 제조사의 지시사항에 따라 진행하였다. DNA 결찰(ligation) 조성물의 제조를 위하여 1 ㎕의 T4 DNA Ligase 10X 버퍼 (300 mM Tris-HCl (pH 7.8), 100 mM MgCl2, 100 mM Dithiothreitol (DTT) 및 10 mM ATP), 0.5 ㎕의 T4 DNA ligase, 1 ㎕의 절단된 pCTCON-EGFR 벡터, 4 ㎕의 NNV CP 유전자를 반응튜브에 첨가한 후 혼합하였다. 혼합물은 16℃에서 12 시간 동안 결찰반응 시켰다. 상기 반응물을 대장균 균주 중 하나인 DH5α에 형질전환시켰다. -85℃에 보관된 DH5α competent 세포를 상기 반응물과 4℃에 10 분간 둔 후 반응튜브에 첨가한 후 혼합시켜 42℃에서 1 분 30 초 동안 열충격(heat shock)을 주었다. 그 후 세포를 4℃에 1 분 동안 둔 후, 200 ㎕의 Luria-Bertani(LB) 브로스 배지를 넣고 37℃ 진탕배양기에서 30 분 동안 회복시켰다. 그 후 암피실린(Amp; 50 ㎍/ml)이 포함된 LB 고형 배지(LB agar plate)에 도말하여 37℃ 박테리아배양기에서 16 시간 동안 배양시켜 단일콜로니를 형성시켰다. 단일콜로니는 3 ml의 Amp LB 브로스에 넣고 37℃ 진탕배양기에서 9 시간 동안 배양한 후, Bioneer사의 AccuPrep Nano-plus Plasmid Mini Extraction Kit를 사용하여 제조사의 지시사항에 따라 NNV CP 유전자가 삽입된 플라스미드 벡터를 분리하였다. 분리한 플라스미드 벡터는 Macrogen사에 DNA 염기서열 분석서비스를 의뢰하여 NNV CP유전자가 pCTCON 플라스미드 벡터에 삽입된 것을 확인하였다. NNV CP 유전자가 삽입된 플라스미드 벡터는 pCTCON-NNVCP'이라고 명명하였다.In order to express the genes of NNV CP antigen on the surface of yeast, the NNV CP gene was cloned into pCTCON vector which is a plasmid surface expression plasmid vector. The NNV CP gene and the pCTCON-EGFR plasmid vector were digested with NheI and BamHI restriction enzymes, respectively. The DNA cleavage process was performed according to the manufacturer's instructions. The DNA ligation (ligation) 1 ㎕ for the preparation of compositions T4 DNA Ligase 10X buffer (300 mM Tris-HCl (pH 7.8), 100
3. 효모 형질전환과 효모의 배양3. Yeast Transformation and Culture of Yeast
효모표면발현을 위해 EBY100 균주의 효모를 사용하였다. 효모를 형질전환하기 위해 먼저 EBY100 competent 세포를 제작하였다. -85℃에 보관된 EBY100 ㄱ그글리세롤 세포 스탁을 YPDA 플레이트에 스트리킹하여 30℃ 미생물배양기에서 3 일 동안 배양시켰다. 단일콜로니를 5 ml YPD 배지에 넣고 30℃의 진탕배양기에서 24 시간 동안 배양하였다. 배양 후 세포 500 ㎕를 50 ml의 YPD 배지에 넣고 30℃ 진탕배양기에서 흡광도(Optical density; OD) 파장 600 nm값 1~1.5 까지 배양한 후 원심분리기를 이용하여 세포를 수확하였다. 수확한 세포는 50 ml의 증류수를 이용하여 수세 한 후, 다시 원심분리기를 이용해 세포를 가라앉혔다. 그 후 5 ㎕의 LiAc 버퍼 (0.1M 리튬 아세테이트(LiAc), 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0)와 50 ㎕의 10 mM DTT를 반응튜브에 첨가한 후 세포와 혼합하여 25℃에서 30 분 동안 반응시켰다. 원심분리기를 이용하여 세포를 분리한 후 10 ml의 1M 소비톨(sorbitol)과 혼합하여 다시 원심분리기를 이용해 세포를 분리하였다. 그 후 1.5 ml의 1 M 소비톨로 3 번 수세하여 EBY100 competent 세포를 제작하였다. 80 ㎕의 competent 세포와 5 ㎕의 pCTCON-NNVCP를 반응튜브에 넣어 혼합한 후 얼음에 10 분간 두었다. 미리 차게 해 둔 큐벳에 혼합물을 옮긴 후 전기천공법(electroporation: 1.5 KV, 25 Ω, 200 mF)을 통해 효모를 형질전환 시켰다. 형질전환체는 YPDS 배지로 옮긴 후 30℃ 진탕배양기에서 30 분 동안 회복시켰다. 그 후 트립토판 dropout supplement minimal SD plate(-Trp SD plate)에 도말하여 30℃ 박테리아배양기에서 3 일 동안 배양시켜 단일콜로니를 형성시켰다. 단일콜로니는 5 ml의 SD-CAA배지를 넣고 30℃ 진탕배양기에서 24 시간 동안 배양시킨 후 원심분리기를 이용하여 세포를 가라앉혔다. 그 후 10 ml의 SG-CAA (2% 갈락토오스)배지를 넣고 30℃ 진탕배양기에서 3 일 동안 배양시켜 NNV CP의 효모표면발현을 진행하였다. NNV CP의 효모표면발현에 대한 모식도는 도 3a에 나타나 있다. 효모표면에 발현한 세포는 OD 600 nm값이 0.4가 되도록 세포의 양을 맞추어 항원의 발현을 확인하였다. 1 차 항체 처리 단계로 항 c-Myc 항체(anti-c-Myc antibody)를 PBS (0.1% BSA) 로 1:200 희석 후 25℃에서 1 시간 동안 반응을 진행하였으며, TBST를 이용하여 수세한 뒤 2차 항체(anti-mouse IgG TRITC conjugated)를 1:200 으로 희석 후 4℃에서 30 분 동안 반응시켰다. TBST를 이용하여 수세한 뒤 유세포분석기를 이용하여 효모표면발현의 정도를 측정했으며 그 결과를 도 3b에 나타내었다. 분석 결과 NNV CP가 효모 표면에 정상적으로 발현함을 확인하였다.Yeast strain EBY100 was used for yeast surface expression. To transform yeast, EBY100 competent cells were first prepared. EBY100 慣 -glycerol cell stock stored at -85 째 C was streaked on a YPDA plate and cultured in a 30 째 C microorganism incubator for 3 days. Single colonies were placed in 5 ml of YPD medium and cultured in a shaking incubator at 30 ° C for 24 hours. After culturing, 500 μl of the cells were placed in 50 ml of YPD medium, and incubated in a 30 ° C. shaking incubator at an optical density (OD) wavelength of 600 nm to a range of 1 to 1.5. Then, the cells were harvested using a centrifuge. The harvested cells were washed with 50 ml of distilled water, and the cells were further submerged using a centrifuge. Then, 5 μl of LiAc buffer (0.1 M lithium acetate (LiAc), 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0) and 50 μl of 10 mM DTT were added to the reaction tube and mixed with the cells. Lt; / RTI > The cells were separated using a centrifuge, mixed with 10 ml of 1 M sorbitol, and then centrifuged to separate the cells. Then EBY100 competent cells were prepared by rinsing three times with 1.5 ml of 1 M sorbitol. 80 μl of competent cells and 5 μl of pCTCON-NNVCP were mixed in a reaction tube and placed on ice for 10 minutes. The mixture was transferred to a pre-chilled cuvette and the yeast was transformed by electroporation (1.5 KV, 25 Ω, 200 mF). The transformants were transferred to YPDS medium and allowed to recover for 30 minutes in a shaking incubator at 30 ° C. After that, the cells were plated on tryptophan dropout supplemented minimal SD plate (-Trp SD plate) and cultured in a 30 ° C bacterial incubator for 3 days to form a single colony. Single colonies were cultured in 5 ml of SD-CAA medium for 24 hours in a shaking incubator at 30 ° C, and then the cells were submerged using a centrifuge. Then, 10 ml of SG-CAA (2% galactose) medium was added and cultured in a shaking incubator at 30 ° C for 3 days to proceed with yeast surface expression of NNV CP. A schematic diagram of yeast surface expression of NNV CP is shown in Figure 3A. Cells expressing on the surface of yeast were subjected to quantification of the cells so that OD 600 nm value was 0.4 and the expression of the antigen was confirmed. Anti-c-Myc antibody was diluted 1: 200 with PBS (0.1% BSA), and reacted at 25 ° C for 1 hour. After washing with TBST, The secondary antibody (anti-mouse IgG TRITC conjugated) was diluted 1: 200 and reacted at 4 ° C for 30 minutes. After washing with TBST, the extent of yeast surface expression was measured using a flow cytometer. The results are shown in FIG. 3B. Analysis revealed that NNV CP was expressed normally on yeast surface.
4. 인간 4. Human scFvscFv 라이브러리로부터 From library NNVNNV CP에 결합하는 Coupled to CP scFvscFv 분리 detach
NNV CP가 표면에 발현된 효모와 scFv 라이브러리를 이용하여 NNV CP에 결합하는 scFv 분리 실험을 진행하였다. 본 실시예에서 사용된 scFv 라이브러리는 아주대학교 의과대학 미생물학교실의 권명희 교수 연구실로부터 제공받은 pRGA-scFv(A) 인간 scFv 라이브러리를 이용하였다. pRGA-scFv(A) 스탁으로부터 파지(phage) 라이브러리를 준비하는 과정은 Tomlinson I+J 라이브러리 프로토콜을 참고하여 준비하였으며 그 역가는 3.27x1013 cfu/ml이었다.NNV CPs were screened for scFv binding to NNV CP using surface expressed yeast and scFv libraries. The scFv library used in this example was the pRGA-scFv (A) human scFv library provided by Kwon Myung-Hui, professor of microbiology at Ajou University School of Medicine. The preparation of the phage library from the pRGA-scFv (A) stock was prepared by reference to the Tomlinson I + J library protocol and the reverse was 3.27x10 13 cfu / ml.
NNV CP를 발현한 효모를 PBS 1 ml에 OD 600nm 값이 2가 되도록 희석한 후 96 웰 면역플레이트(immunoplate)의 60 개 웰에 세포를 웰 당 100 ㎕씩 넣어 4℃에서 24 시간 동안 웰을 코팅시켰다 (NNV 웰). 이와 동시에 NNV CP를 발현하지 않은 효모를 같은 과정을 통해 코팅시켰고 (네거티브 웰), PBS만 넣은 웰도 준비하였다(블랭크 웰). 상층액을 제거한 후 각 웰에 200 ㎕의 3% BSA가 포함된 PBS(PBSB)를 넣어주어 37℃에서 2 시간 동안 블로킹(blocking) 시켰다. 1010 cfu/ml의 라이브러리를 PBSB에 희석시킨 후 블랭크 웰에 있던 블로킹 용액을 버리고 웰 당 100 ㎕씩 첨가시킨 후 25℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 그 후, 네거티브 웰에 있던 블로킹 용액을 버리고 블랭크 웰에 있던 용액을 100 ㎕씩 네거티브 웰에 옮긴 후 25℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 그 다음, NNV 웰에 있던 블로킹 용액을 버리고 네거티브 웰에 있던 용액을 100 ㎕씩 NNV 웰에 옮긴 후 25℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. NNV 웰 상층액을 버린 후 TBS-T (0.5% tween-20이 포함된 TBS) 버퍼로 각 플레이트를 3 회 수세한 후, 웰 당 100 ㎕의 100 mM 트리에틸아민(triethylamine)을 넣어 25℃에서 10 분 동안 용리(elution)시켰다. 그 후 각 웰 당 50 ㎕의 1 M 트리스(tris, pH 7.5)를 넣은 후 새로운 튜브에 상층액을 모두 모았다. 여기까지의 과정을 바이오 패닝(bio-panning)이라고 한다.The yeast expressing NNV CP was diluted in 1 ml of PBS to an OD 600nm value of 2, and then 100 μl of each cell was added to 60 wells of a 96-well immunoplate, and the wells were coated at 4 ° C for 24 hours (NNV well). At the same time, yeast not expressing NNV CP was coated through the same procedure (negative well), and a well containing PBS alone was also prepared (Blankwell). After removal of the supernatant, 200 [mu] l of 3% BSA in PBS (PBSB) was added to each well, and the mixture was blocked at 37 [deg.] C for 2 hours. 10 10 The cfu / ml library was diluted in PBSB, and the blocking solution in blank wells was discarded and 100 μl / well was added, followed by reaction at 25 ° C for 1 hour. Then, the blocking solution in the negative well was discarded, and the solution in the blank well was transferred to a negative well at a rate of 100 μl each, followed by reaction at 25 ° C for 1 hour. The blocking solution in the NNV wells was then discarded and the solution in the negative wells was transferred to the NNV wells in 100 μl aliquots and reacted at 25 ° C for 1 hour. After the NNV well supernatant was discarded, each plate was washed three times with TBS-T (TBS containing 0.5% tween-20) buffer, and then 100 μl of 100 mM triethylamine was added per well. And elution was carried out for 10 minutes. Then 50 μl of 1 M Tris (pH 7.5) was added per well and the supernatant was collected in a new tube. The process so far is called bio-panning.
바이오 패닝 이후 수확한 파지를 증폭하는 실험을 수행했다. 용리를 통해 얻은 파지 scFv를 대장균 균주 중 하나인 5 ml 부피의 XL1-Blue에 감염시켜 37℃에서 진탕시키지 않고 1 시간 동안 배양하였다. 배양 후 원심분리기를 이용해서 ㅅ세포를 침전시킨 후 상층액을 버리고 세포만 모아서 테트라사이클린(Tet: 10 ㎍/ml)과 Amp가 포함된 2TY 플레이트에 도말하여 박테리아배양기에서 37℃에서 16 시간 동안 배양하였다. 플레이트에 생성된 콜로니 군집을 모두 긁어 모아 50 ml의 1% 글루코오스가 포함된 2TY Amp(100 ㎍/ml) 배지에 넣고 37℃에서 OD 600 nm값이 0.4가 될 때까지 배양시켰다. 그 후 2x1011 cfu/ml의 VSCM13 헬퍼 파지(helper phage)를 넣고 진탕하지 않고 37℃에서 30 분 동안 감염시켰다. 원심분리기를 이용하여 세포를 가라앉힌 후 100 ml의 0.1%의 글루코오스가 포함된 Amp (100 ㎍/ml), 카나마이신 (50 ㎍/ml)이 포함된 2TY 배지를 넣고 30℃ 진탕배양기에서 24 시간 동안 배양시켰다. 원심분리기를 이용하여 세포를 가라앉힌 후 80 ml의 상층액을 새 반응튜브에 넣고 20 ml의 PEG/NaCl (20% 폴리에틸렌 글리콜 6000, 2.5 M NaCl)을 첨가하여 혼합한 후 얼음 위에서 1 시간 동안 방치하였다. 그 후, 원심분리기를 이용하여 침전물을 가라앉힌 후 PEG/NaCl을 깔끔히 제거하였다. 침전물을 4 ml의 PBS 용액으로 섞어준 후 원심분리기를 이용하여 남은 박테리아 찌꺼기를 가라앉혔다. 파지 용액을 새 튜브에 넣고 15%의 글리세롤을 첨가하여 -85℃에 보관하였다. 바이오 패닝 두 번째 라운드에서는 scFv 라이브러리 대신 첫 번째 라운드에서 수확하여 증폭한 파지를 이용함으로써 NNV CP에 대해 결합능력이 높은 파지의 농도를 증가시켰다. Experiments were performed to amplify the harvested phage after bio-panning. Phage scFv obtained from elution was infected with 5 ml of XL1-Blue, one of the Escherichia coli strains, and cultured at 37 ° C for 1 hour without shaking. After incubation, the cells were precipitated using a centrifuge, and the supernatant was discarded. The cells were collected and plated on a 2TY plate containing tetracycline (Tet: 10 μg / ml) and Amp and cultured in a bacterial incubator at 37 ° C. for 16 hours Respectively. The colonies formed on the plate were all scraped off and placed in 2 TY Amp (100 / / ml) medium containing 50 ml of 1% glucose and cultured at 37 째 C until OD 600 nm value reached 0.4. Then, 2x10 11 cfu / ml VSCM13 helper phage was added and infected at 37 ° C for 30 minutes without shaking. After centrifuging the cells using a centrifuge, 100 ml of 2TY medium containing Amp (100 μg / ml) and kanamycin (50 μg / ml) containing 0.1% glucose was added and incubated in a shaking incubator at 30 ° C. for 24 hours Lt; / RTI > After submerging the cells using a centrifuge, 80 ml of the supernatant was placed in a new reaction tube and mixed with 20 ml of PEG / NaCl (20% polyethylene glycol 6000, 2.5 M NaCl) Respectively. Thereafter, the precipitate was settled using a centrifuge, and then PEG / NaCl was removed. The precipitate was mixed with 4 ml of PBS solution, and the residual bacterial debris was submerged using a centrifuge. The phage solution was placed in a new tube and 15% glycerol was added and stored at -85 ° C. In the second round of bio-panning, instead of the scFv library, harvested and amplified phage in the first round were used to increase the phage concentration with high binding capacity to NNV CP.
5. 5. ScFvScFv 유전자 분리 및 분석 Gene separation and analysis
바이오 패닝은 총 3 라운드를 거쳐 2.4x1013 cfu/ml의 역가를 갖는 파지를 분리하였고 이중 무작위로 7 개의 파지 scFv를 선발하였고 선발된 파지 scFv 클론들을 공통적으로 증폭시키는 프라이머 세트를 제작하여 도 4에 나타내었다 (pCANTAB5_S1 : 정방향 프라이머, 서열번호 4, pCANTAB5_S6: 역방향 프라이머, 서열번호 5). 파지 scFv가 감염된 7 종의 XL1-Blue 세포를 Bioneer사의 AccuPrep Nano-plus Plasmid Mini Extraction Kit를 사용하여 제조사의 지시사항에 따라 scFv 유전자가 삽입된 파지미드(phagemid)를 분리하였다. 분리한 파지미드는 PCR을 통해 scFv DNA를 증폭하였다. 상기 프라이머 조성물의 제조를 위하여 10 ㎕의 2X PCR 프리믹스(premix), 1 ㎕의 10 pM 정방향 프라이머, 2 ㎕의 10 pM역방향 프라이머, 1 ㎕의 파지미드 및 증류수 7 ㎕를 반응튜브에 첨가한 후 혼합하였다. 제조된 증폭 반응 조성물을 96℃에서 10 분 동안 반응시킨 후 95℃에서 30 초 (DNA 변성), 55℃에서 30 초 (프라이머의 결합), 72℃에서 1 분 (DNA의 합성) 반응시켰다. 이 세 단계 과정을 35 회 반복하여 DNA를 증폭하였다. 총 20 ㎕의 반응물을 EtBr이 포함된 1% 아가로스 겔에서 전기영동(electrophoresis)하여 유전자가 증폭되었는지 확인하였다. 1Kb 내외의 scFv 유전자가 증폭된 것을 확인하였고 이를 도 5에 나타내었다. 나타난 DNA를 면도칼을 이용하여 자른 후, Intron 사의 MEGAquick-spin Total fragment DNA Purification Kit를 사용하여 제조사의 지시사항에 따라 DNA 증폭산물을 분리하였다. 분리한 DNA 절편은 Macrogen사에 DNA 염기서열 분석서비스를 의뢰하여 선발 scFv 유전자 염기서열이 증폭된 것을 확인하였고, 이들의 염기서열을 아미노산 서열로 번역한 후 IgBLAST를 이용하여 scFv 절편의 상보성 결정 영역(complementarity determining region, CDR)위치를 추정하여 도 6에 나타내었다.Bio-panning was carried out for a total of three rounds to separate the phage having a titer of 2.4 x 10 < 13 > cfu / ml. Seven phage scFvs were randomly selected and a primer set for commonly amplifying the selected phage scFv clones was prepared. (PCANTAB5_S1: forward primer, SEQ ID NO: 4, pCANTAB5_S6: reverse primer, SEQ ID NO: 5). Seven species of XL1-Blue cells infected with phage scFv were purchased from Bioneer AccuPrep Using the Nano-plus Plasmid Mini Extraction Kit, the phagemid inserted with the scFv gene was isolated according to the manufacturer's instructions. The isolated phagemid amplified the scFv DNA by PCR. To prepare the primer composition, 10 μl of 2 × PCR premix, 1 μl of 10 μM forward primer, 2 μl of 10 μM reverse primer, 1 μl of phagemid and 7 μl of distilled water were added to the reaction tube, Respectively. The prepared amplification reaction composition was reacted at 96 ° C for 10 minutes and reacted at 95 ° C for 30 seconds (DNA denaturation), 55 ° C for 30 seconds (primer binding) and 72 ° C for 1 minute (synthesis of DNA). These three steps were repeated 35 times to amplify the DNA. A total of 20 ㎕ of the reaction product was electrophoresed on 1% agarose gel containing EtBr to confirm whether the gene was amplified. It was confirmed that scFv gene of about 1 Kb was amplified and it is shown in FIG. The resulting DNA was cut using a razor blade, and DNA amplification products were isolated according to the manufacturer's instructions using an Intron MEGAquick-spin Total Fragment DNA Purification Kit. The separated DNA fragments were amplified by DNA sequencing service to Macrogen, and the selected scFv gene sequences were amplified. After translating the nucleotide sequences into amino acid sequences, IgBLAST was used to determine the complementarity determining region of the scFv fragment complementarity determining region (CDR) positions are estimated and shown in FIG.
6. 6. ScFvScFv VHVH , , VLVL 단독발현을 위한 For single expression 클로닝Cloning
아미노산 서열 분석을 완료한 scFv중 3 종류 각각의 유전자에서 VH, VL 부분을 대장균에서 발현시키는 플라스미드에 클로닝 하기 위해 이들을 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 제작하였다. 선발된 B2VL을 증폭하기 위한 프라이머 세트를 도 7의 a)에 나타내었다. 정방향 프라이머(F) (서열번호 6)와 역방향 프라이머(R) (서열번호 7)에는 각각 클로닝을 위해 각각 XmaI과 AflⅡ 제한효소 사이트를 추가하였고 정방향 프라이머에는 정제를 위한 His-Tag서열을 추가하였다. 상기 프라이머 조성물의 제조를 위하여 10 ㎕의 2X PCR premix, 1 ㎕의 10 pM 정방향 프라이머, 1 ㎕의 10 pM 역방향 프라이머, 1 ㎕의 파지미드(phagemid), 및 증류수 7 ㎕를 반응튜브에 첨가한 후 혼합하였다. 제조된 증폭 반응 조성물을 96℃에서 10 분 동안 반응시킨 후 95℃에서 30 초 (DNA 변성), 55℃에서 30 초 (프라이머의 결합), 72℃에서 1 분 (DNA의 합성) 반응시켰다. 이 세 단계 과정을 35 회 반복하여 DNA를 증폭하였다. 총 20 ㎕의 반응물을 EtBr이 포함된 1% 아가로스 겔에 전기영동(electrophoresis)하여 유전자가 증폭되었는지 확인하고, 나타난 DNA를 면도칼을 이용하여 자른 후, Intron 사의 MEGAquick-spin Total fragment DNA Purification Kit를 사용하여 제조사의 지시사항에 따라 DNA 증폭산물을 분리하였다. 그 후, 증폭한 선발 scFv의 VH, VL 유전자를 클로닝하기 위해서 TA 클로닝을 수행하였으며, TA 플라스미드를 DH5α에 형질전환 시켰다. TA 클로닝과 대장균 형질전환 과정은 실시예 2에 기술한 것과 동일한 과정으로 실시하였다. 형질전환된 대장균으로부터 플라스미드 벡터를 분리한 후 분리한 플라스미드 벡터를 Macrogen사의 DNA 염기서열 분석서비스를 의뢰하여 각각의 VH, VL 유전자가 올바르게 증폭이 된 것을 확인하였다. 이 중 이후에 선발된 B2VL의 유전자가 증폭된 모습을 도 7의 b)에 나타내었다.A primer set capable of amplifying the VH and VL portions was prepared for cloning into plasmids expressing the VH and VL portions in E. coli in each of three kinds of scFvs after completion of the amino acid sequence analysis. A primer set for amplifying the selected B2VL is shown in Fig. 7 (a). XmaI and AflII restriction sites were added to the forward primer (F) (SEQ ID NO: 6) and reverse primer (R) (SEQ ID NO: 7), respectively, for cloning respectively. His-Tag sequence for purification was added to the forward primer. To prepare the primer composition, 10 μl of 2 × PCR premix, 1 μl of 10 μM forward primer, 1 μl of 10 μM reverse primer, 1 μl of phagemid, and 7 μl of distilled water were added to the reaction tube . The prepared amplification reaction composition was reacted at 96 ° C for 10 minutes and reacted at 95 ° C for 30 seconds (DNA denaturation), 55 ° C for 30 seconds (primer binding) and 72 ° C for 1 minute (synthesis of DNA). These three steps were repeated 35 times to amplify the DNA. A total of 20 μl of the reaction mixture was electrophoresed on a 1% agarose gel containing EtBr to confirm that the gene was amplified. The resulting DNA was cut off using a razor blade, and then the MEGAquick-spin Total fragment DNA Purification Kit DNA amplification products were isolated using the manufacturer's instructions. Then TA cloning was performed to clone the VH and VL genes of the selected scFv amplified, and TA plasmid was transformed into DH5α. TA cloning and E. coli transformation were carried out in the same manner as described in Example 2. [ The plasmid vector was isolated from the transformed E. coli, and the isolated plasmid vector was subjected to DNA sequencing service of Macrogen, confirming that the VH and VL genes were correctly amplified. The amplified version of the B2VL gene selected in the subsequent step is shown in Fig. 7 (b).
확보한 TA 플라스미드의 VH/VL 유전자를 대장균에 발현시키기 위해 대장균 발현 플라스미드 벡터인 pIg20 벡터에 클로닝하는 과정을 수행하였다. 상기 실험에서 제작한 VH/VL TA 플라스미드 벡터와 pIg20 플라스미드 벡터를 각각 XmaI(G2는 Age1)과 AflⅡ 제한효소를 이용하여 DNA를 절단하였다. DNA 절단 과정은 제조사의 지시사항에 따라 진행하였다. 절단한 각각의 scFv VH/VL 유전자와 pIg20 벡터를 4:1로 혼합한 후 실시예 2에 명기된 T4 DNA ligase와 결찰 버퍼(ligation buffer)를 반응튜브에 첨가한 후 혼합하였다. 혼합물은 16℃에서 12 시간동안 결찰반응시켰다. 반응물을 DH5α에 형질전환 하였으며 대장균 형질전환 과정은 실시예 3에 기술한 것과 동일한 과정으로 실시하였다. 형질전환된 대장균으로부터 플라스미드 벡터를 분리한 후 분리한 플라스미드 벡터는 Macrogen사에 DNA 염기서열 분석서비스를 의뢰하여 각각의 scFv 유전자가 pIg20 플라스미드 벡터에 삽입된 것을 확인하였다. 플라스미드 벡터 pIg20-VH/VL의 모식도는 도 8에 나타내었다. The VH / VL gene of the TA plasmid thus obtained was cloned into an E. coli expression plasmid vector pIg20 vector for expression in E. coli. The VH / VL TA plasmid vector and pIg20 plasmid vector prepared in the above experiment were digested with XmaI (G2 is Age1) and AflII restriction enzyme, respectively. The DNA cleavage process was performed according to the manufacturer's instructions. The scFv VH / VL gene and the pIg20 vector were mixed at a ratio of 4: 1, and then the T4 DNA ligase and ligation buffer described in Example 2 were added to the reaction tube and mixed. The mixture was ligated for 12 hours at 16 < 0 > C. The reaction product was transformed into DH5α and E. coli transformation was carried out in the same manner as described in Example 3. The plasmid vector was isolated from the transformed E. coli, and the isolated plasmid vector was subjected to DNA sequencing service by Macrogen, and each scFv gene was inserted into the pIg20 plasmid vector. A schematic diagram of the plasmid vector pIg20-VH / VL is shown in Fig.
7. 7. VHVH // VLVL 단백질의 발현 테스트 및 정제 Protein expression testing and purification
대장균 발현 플라스미드 벡터인 pIg20은 phoA 리더(leader) 서열이 존재하여 발현한 단백질이 주변세포질(periplasm)에 위치하게 한다. 그 결과 발현한 단백질이 배지에 존재하게 된다. 6x히스티딘(Histidine) 태그는 정제를 위한 태깅 단백질로 이용할 수 있다. 서열이 확인된 pIg-scFv 플라스미드 벡터는 단백질 발현 균주인 BL21(DE3)pLysE에 형질전환 하였다. -85℃에 보관된 BL21(DE3)pLysE competent 세포를 상기 플라스미드와 4℃에 10 분간 둔 후 반응튜브에 첨가한 후 혼합시켜 42℃에 1 분 15 초 동안 열충격을 가하였다. 그 후 세포를 4℃에 1 분 동안 둔 후, 200 ㎕의 LB 브로스 배지를 넣고 37℃ 진탕배양기에서 30 분 동안 회복시켰다. 그 후 암피실린(Amp) 및 클로람페니콜(chloramphenicol, Cam, 25 ㎍/ml)이 포함된 LB 아가 플레이트에 도말하여 37℃ 박테리아배양기에서 16 시간 동안 배양시켜 단일콜로니를 형성시켰다. scFv 발현 테스트는 발현유도체인 IPTG(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)의 농도에 따라 단백질의 발현 유무를 확인하였다. 단일콜로니는 3 ml의 Amp Cam LB 브로스를 넣고 37℃ 진탕배양기에서 9 시간 동안 배양한 후 새로운 3 ml의 Amp Cam LB 브로스에 1% 접종하여 OD 600 nm 값이 0.6이 되도록 37℃ 진탕배양기에서 배양하였다. 배양한 대장균에 각각 0.1, 0.25, 0.5, 1 mM의 IPTG를 넣어 단백질의 발현을 유도하였으며 26℃에서 16 시간 동안 단백질을 발현시켰다.The E. coli expression plasmid vector, pIg20, has a phoA leader sequence so that the expressed protein is located in the periplasm. As a result, the expressed protein is present in the medium. The 6x Histidine tag can be used as a tagging protein for purification. The pIg-scFv plasmid vector whose sequence was confirmed was transformed into BL21 (DE3) pLysE, a protein expression strain. BL21 (DE3) pLysE competent cells stored at -85 ° C were incubated with the plasmid at 4 ° C for 10 minutes, added to a reaction tube, mixed, and heat shocked at 42 ° C for 1 minute and 15 seconds. The cells were then placed at 4 ° C for 1 min, then 200 μl of LB broth medium was added and allowed to recover for 30 min in a 37 ° C shaker incubator. The cells were then plated on LB agar plates containing ampicillin (Amp) and chloramphenicol (chloramphenicol, Cam, 25 μg / ml) and cultured in a 37 ° C. bacterial incubator for 16 hours to form a single colony. In the scFv expression test, the expression of the protein was confirmed according to the concentration of the expression derivative IPTG (isopropyl beta-D-1-thiogalactopyranoside). Single colonies were incubated in a 3 ml Amp Cam LB broth for 9 hours at 37 ° C in a shaker incubator, incubated in a new 3 ml Amp Cam LB broth at 1%, and cultured in a 37 ° C shaking incubator at an OD 600 nm value of 0.6 Respectively. Protein expression was induced by adding 0.1, 0.25, 0.5, and 1 mM IPTG to the cultured Escherichia coli, respectively, and the protein was expressed at 26 ° C for 16 hours.
단백질 발현 확인을 위해 각각의 세포들을 1 ml 취해 반응튜브에 옮겨 원심분리기를 통해 세포를 가라앉혔다. 상층액 40 ㎕를 새 튜브에 옮긴 후 10 ㎕의 5X 샘플 버퍼(60 mM Tris-HCl (pH 6.8), 25% 글리세롤, 2% SDS, 14.4 mM 2-머캅토에탄올, 0.1% 브로모페놀 블루 수용액)을 혼합해 5 분 동안 끓인 후 10% SDS-PAGE 전기영동하였다. 전기영동한 PAGE 겔의 단백질을 웨스턴 블로팅(western blotting)으로 분석하기 위해 PVDF 블로팅 멤브레인(GE healthcare)에 트랜스퍼하였다. 단백질이 트랜스퍼된 멤브레인을 TBSM (5% 탈지유와 TBS 버퍼의 혼합)을 이용하여 블로킹시켰다. 1 차 항체 처리 단계로 항-6xHis 항체를 TBSM 버퍼로 1:2000 희석 후 4℃에서 12 시간 동안 반응시켰으며, TBST를 이용하여 수세한 뒤 2 차 항체(anti-mouse IgG HRP conjugated)를 1:5000 으로 희석 후 25℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. TBST를 이용하여 수세한 뒤 과산화수소(peroxide)와 ECL 용액을 이용하여 ㄷ디벨로핑시켰으며 그 결과를 도 9a에 나타내었다. N은 야생형 효모인 EBY100이며 1,2,3,4는 각각 0.1, 0.25, 0.5, 1 mM IPTG로 단백질을 발현한 것이다. To confirm protein expression, 1 ml of each cell was taken, transferred to a reaction tube, and the cells were submerged through a centrifuge. 40 μl of the supernatant was transferred to a new tube and then 10 μl of 5 × sample buffer (60 mM Tris-HCl (pH 6.8), 25% glycerol, 2% SDS, 14.4 mM 2-mercaptoethanol, 0.1% ) Were mixed, boiled for 5 minutes, and subjected to 10% SDS-PAGE electrophoresis. The proteins of the electrophoresed PAGE gels were transferred to a PVDF blotting membrane (GE healthcare) for analysis by western blotting. Protein-transferred membranes were blocked using TBSM (mixture of 5% skim milk and TBS buffer). Anti-6xHis antibody was diluted 1: 2000 with TBSM buffer and reacted at 4 ° C for 12 hours. Anti-mouse IgG HRP conjugate was washed 1: 5000, and reacted at 25 DEG C for 1 hour. After washing with TBST, the cells were dribbled using peroxide and ECL solution. The results are shown in FIG. 9A. N is EBY100, a wild-type yeast, and 1,2,3,4 is a protein expressed in 0.1, 0.25, 0.5, and 1 mM IPTG, respectively.
발현테스트를 통해 단백질 발현을 확인한 세포들을 500 ml의 Amp Cam LB 브로스에 1% 접종하여 OD 600 nm 값이 0.6이 되도록 37℃ 진탕배양기에서 배양하였다. 배양한 대장균에 각각 0.5 mM의 IPTG를 넣어 단백질의 발현을 유도하였으며 26℃에서 16 시간 동안 단백질을 발현시켰다.The cells were incubated at 37 ° C in a shaking incubator at an OD 600 nm value of 0.6 by inoculating 1% in 500 ml Amp Cam LB broth. Protein expression was induced by adding 0.5 mM IPTG to the cultured Escherichia coli, and the protein was expressed at 26 ° C for 16 hours.
단백질 정제를 위해 각각의 세포들을 원심분리기를 통해 세포를 가라앉힌 후, 상층액을 0.22 μm stericup (Millipore)을 이용하여 여과하였다. 여과액을 Ni-NTA 아가로스 레진을 이용하여 정제하였으며 centricon 10,000 NMWL (Merck)을 이용하여 단백질을 농축하였다. 정제한 scFv는 상기 발현테스트와 같은 항체를 이용하여 웨스턴 블로팅을 수행하였으며 그 결과를 도 9b에 나타내었다. For protein purification, each cell was centrifuged and the supernatant was filtered using 0.22 μm stericup (Millipore). The filtrate was purified using Ni-NTA agarose resin and the protein was concentrated using Centricon 10,000 NMWL (Merck). The purified scFv was subjected to Western blotting using an antibody such as the above expression test, and the result is shown in FIG. 9B.
8. 정제된 8. Refined VL을VL 이용한 ELISA ELISA used
정제한 B2VL의 NNV CP에 대한 효과를 확인하기 위해 ELISA분석을 진행하였다. EBY 100과 NNV CP 발현 효모를 카보네이트 코팅 버퍼(carbonate coating buffer)에 1:200으로 희석하여 96 웰 플레이트에 각 웰 당 100 ㎕씩 코팅시켰다. 코팅은 25℃에서 4 시간 동안 진행하였다. TBST로 수세한 후 TBSM (블로킹 버퍼)로 블로킹하고, 정제한 scFv를 PBS에 희석하여 20ug/ml로 농도를 일치시킨 후 블로킹 버퍼에 1:100으로 희석하여 96 웰 플레이트에 각 웰 당 100 ㎕씩 반응시켰다. VL을 반응시킨 웰에 100 ㎕씩 마우스 유래 Anti-HisX6 항체와 항-마우스 HRP 컨쥬게이트 항체(Cell signaling technology)를 TBSM(블로킹 버퍼)에 1:1000로 희석하여 각 웰에 100 ㎕씩 넣어주었다. TBST를 이용하여 수세한 뒤 각 웰에 100 ㎕의 TMB용액을 넣어 발색반응을 진행했으며 15 분 뒤 100 ㎕M H2SO4를 넣어 발색반응을 멈추었다. 분광광도계를 통해 반응결과를 정량적으로 측정하였으며 발색반응과 정량적 측정값을 각각 도 10a 및 도 10b에 나타내었다. 정제한 B2VL 단백질은 낮은 비특이 반응을 보였으며 목적 NNV CP에는 높은 특이성을 보이는 것을 확인하였다. 이렇게 선발된 B2VL의 유전자 염기서열을 도 11에 나타내었다.ELISA analysis was performed to confirm the effect of purified B2VL on NNV CP.
<110> Korea Institute of Ocean Science and Technology <120> ANTIBODY FOR NERVOUS NECROSIS VIRUS AND ITS USE <130> 0 <160> 7 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B2VL amino acid sequence <400> 1 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr 20 25 30 Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Gly Leu 35 40 45 Ile Ile Tyr Asp Val Ile Arg Arg Pro Ser Gly Val Ser Ile Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Met Ser Tyr Thr Ser Ser 85 90 95 Gly Thr Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 2 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B2VL nucleic acid sequence <400> 2 cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgcg tccgggtctc ctggacagtc agtcaccatc 60 tcctgcactg gaaccagcag tgacgttggt ggttataact atgtctcctg gtaccagcaa 120 cacccaggca aagcccccgg actcatcatt tatgatgtca ttcgtcggcc ctcaggggtt 180 tctattcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctggactc 240 caggctgagg acgaggctga atattactgc atgtcatata caagcagcgg cacttatgtc 300 ttcggaactg ggaccaagct gaccgtccta 330 <210> 3 <211> 1017 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> nervous necrosis virus coat protein <400> 3 atggtacgca aaggtgagaa gaaattggca aaacccgcga ccaccaaggc cgcgaatccg 60 caaccccgcc gacgtgctaa caatcgtcgg cgtagtaatc gcactgacgc acctgtgtct 120 aaggcctcga ctgtgactgg atttggacgt gggaccaatg acgtccatct ctcaggtatg 180 tcgagaatct cccaggccgt cctcccagcc gggacaggaa ctgacggata cgtcgttgtt 240 gacgcaacca tcgtccccga cctcctgcca cgactgggac acgctgctag aatcttccag 300 cgatacgctg ttgaaacatt ggagtttgaa attcagccaa tgtgccccgc aaacacgggc 360 ggtggttacg ttgctggctt cctgcctgat ccaactgaca acgaccacac cttcgacgcg 420 cttcaagcaa ctcgtggtgc agtcgttgcc aaatggtggg aaagcagaac agtccgacct 480 cagtacaccc gtacgctcct ctggacctcg tcgggaaagg agcagcgtct cacgtcacct 540 ggtcggctga tactcctgtg tgtcggcaac aacactgatg tggtcaacgt gtcggtgctg 600 tgtcgctgga gtgttcgact gagcgttcca tctcttgaga cacctgaaga gaccaccgct 660 cccatcatga cacaaggtcc cctgtacaac gattcccttt ccacaaatga ctttaagtcc 720 atcctcctag gatccacacc actggatatt gcccctgatg gagcagtctt ccagctggac 780 cgtccgctgt ccattgacta cagccttgga actggagatg ttgaccgtgc tgtttattgg 840 cacctcaaga agtttgctgg aaatgctggc acacctgcag gctggtttcg ctggggcatc 900 tgggacaact tcaataagac gttcacagat ggcgttgcct actactctga tgagcagccc 960 cgtcaaatcc tgctgcctgt tggcactgtc tgcaccaggg ttgactcgga aaactaa 1017 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pCANTAB5_S1_primer F <400> 4 caacgtgaaa aaattattat tcgc 24 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pCANTAB5_S6_primer R <400> 5 gtaaatgaat tttctgtatg agg 23 <210> 6 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B2VL_primer F <400> 6 cccgggatca tcatcatcac catcaccagt ctgccctg 38 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B2VL_primer R <400> 7 cttaagccat atgtaggacg gtcagcttgg 30 <110> Korea Institute of Ocean Science and Technology <120> ANTIBODY FOR NERVOUS NECROSIS VIRUS AND ITS USE <130> 0 <160> 7 <170> KoPatentin 3.0 <210> 1 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B2VL amino acid sequence <400> 1 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Serp Val Gly Gly Tyr 20 25 30 Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Gly Leu 35 40 45 Ile Ile Tyr Asp Val Ile Arg Arg Pro Ser Gly Val Ser Ile Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Met Ser Tyr Thr Ser Ser 85 90 95 Gly Thr Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 2 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> ≪ 223 > B2VL nucleic acid sequence <400> 2 cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgcg tccgggtctc ctggacagtc agtcaccatc 60 tcctgcactg gaaccagcag tgacgttggt 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Sequence <220> <223> B2VL_primer R <400> 7 cttaagccat atgtaggacg gtcagcttgg 30
Claims (12)
1. An antibody or antigen-binding fragment that specifically binds to neurotoxic virus (NNV), comprising a light chain variable region (VL) represented by SEQ ID NO: 1.
The antibody or antigen-binding fragment of claim 1, which specifically binds to a coat protein of neurotoxic virus.
1. A composition for detecting neuronal necrosis virus (NNV) comprising an antibody or antigen-binding fragment comprising a light chain variable region (VL) represented by SEQ ID NO: 1.
A kit for detecting neuronal necrosis virus (NNV) comprising an antibody or antigen-binding fragment according to claim 1 or 2, or a composition according to claim 3.
5. The kit according to claim 4, wherein the kit is an immunoassay kit.
The kit according to claim 5, wherein the immunoassay kit is a protein microarray or an ELISA assay kit.
1. A nucleic acid molecule encoding a light chain variable region (VL) represented by SEQ ID NO: 1.
8. A recombinant vector comprising a nucleic acid molecule according to claim 7.
9. A host cell comprising the recombinant vector according to claim 8.
1. A method for producing an antibody or an antigen-binding fragment comprising the light chain variable region (VL) of SEQ ID NO: 1, comprising culturing the host cell according to claim 9.
상기 항체 또는 항원 결합 단편과 신경괴사바이러스(NNV) 외피 단백질의 결합을 탐지하는 단계
를 포함하는, 신경괴사바이러스(NNV) 검출 방법.
Contacting the sample with the antibody or antigen-binding fragment of claim 1; And
Detecting binding of the antibody or antigen binding fragment to a neuronal necrosis virus (NNV) coat protein
(NNV). ≪ / RTI >
상기 시료는 검출 대상 어류의 혈청 또는 어류로부터 추출한 단백질인, 신경괴사바이러스(NNV) 검출 방법.12. The method of claim 11,
Wherein the sample is a protein extracted from serum or fish of a fish to be detected.
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020160130545A KR101791503B1 (en) | 2016-10-10 | 2016-10-10 | Antibody for nervous necrosis virus and its use |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101791503B1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108251356A (en) * | 2017-12-29 | 2018-07-06 | 中山大学 | A kind of fish-egg cleaning solution of anti-fish nervous necrosis virus |
-
2016
- 2016-10-10 KR KR1020160130545A patent/KR101791503B1/en active IP Right Grant
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Journal of Life Science 2014 Vol. 24. No. 9. 995-1000 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108251356A (en) * | 2017-12-29 | 2018-07-06 | 中山大学 | A kind of fish-egg cleaning solution of anti-fish nervous necrosis virus |
| CN108251356B (en) * | 2017-12-29 | 2021-06-22 | 中山大学 | Fish egg cleaning solution for resisting fish nervous necrosis virus |
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