KR101949990B1 - 골다공증 개선 효과가 있는 활성형 이소플라본이 강화된 전두유 및 그 제조방법 - Google Patents
골다공증 개선 효과가 있는 활성형 이소플라본이 강화된 전두유 및 그 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 활성형 이소플라본이 강화된 전두유 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 전두유를 제조하는 과정에서 대두 고형분을 인라인 믹서를 이용하여 가열 및 분쇄하여 제조된 전두유에 당질 분해 효소를 첨가하여 가수분해 시킴으로써 비배당체 이소플라본의 함량을 높여 전두유에 포함된 이소플라본의 체내 흡수율을 높이고, 전두유에 단백질 분해 효소를 첨가하여 단계적으로 가수분해 시킴으로써 활성형 이소플라본의 함량을 증진시키는 것을 특징으로 하는 활성형 이소플라본이 강화된 전두유 및 그 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 방법으로 제조된 활성형 이소플라본이 강화된 전두유는 골다공증 개선 효과가 우수하다.
Description
본 발명은 골다공증 개선 효과가 있는 활성형 이소플라본이 강화된 전두유 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 전두유를 제조하는 과정에서 대두 고형분을 인라인 믹서를 이용하여 가열 및 분쇄하여 제조된 전두유에 당질 분해 효소를 첨가하여 가수분해 시킴으로써 비배당체 이소플라본의 함량을 높여 전두유에 포함된 이소플라본의 체내 흡수율을 높이고, 전두유에 단백질 분해 효소를 첨가하여 단계적으로 가수분해 시킴으로써 활성형 이소플라본의 함량을 증진시키는 것을 특징으로 하는 활성형 이소플라본이 강화된 전두유 및 그 제조방법에 관한 것이다.
대두는 우리나라 전통 콩 발효식품의 주된 원료 및 중요한 식물 유래의 기능성 소재로서 매우 다양하게 이용되어져 왔으며, 대두에는 영양학적으로 양질의 단백질과 불포화지방산이 다량 함유되어 있다(Kim, J.S. and Yoon, S. Isoflavone contents and -glucosidase β activities of soybeans, meju and doenjang. Korean J. Food Sci. Technol. 31(6):1405-1409. 1999). 대두는 단백질 35%, 지방 17%와 탄수화물 31% 외에 phytate, saponine, trypsin inhibitor, 올리고당, 식이섬유 등의 생리활성물질이 들어 있으며, 우리가 즐겨먹는 콩 발효제품에는 콩이 가진 영양성과 기능성 이외에도 발효 미생물에 의해 생성되는 2차적 대사산물의 다양한 생리활성이 보고되고 있다.
즉, 대두에는 단백질과 지방 이외에도 필수아미노산과 불포화지방산이 균형있게 분포되어 있으며, 이러한 영양성분 이외에도 식이섬유(Dietary fiber), 레시틴(Lecithin), 사포닌(Saponin), 피틴산(Phytic acid) 및 이소플라본(Isoflavone) 등과 같이 인체에 유용한 생리활성물질이 함유되어 있어 그 기능성이 전 세계적으로 주목 받고 있다.
대두에 포함된 다양한 생리활성물질 중에서도 특히 이소플라본(Isoflavone)은 중요한 생리활성물질이라 할 수 있다.
다양한 생리적 활성을 나타내는 대두 이소플라본은 배당체 형태로 존재하고 있으며, 위산과 장내 미생물 효소인 β-글루코시다제(β-glucosidase)에 의해 유리상태의 제니스테인(genistein), 다이드제인(daidzein) 및 그 외 대사산물 등으로 전환되어 장에서 흡수되거나, 이소플라본이 지용성이므로 다른 지용성 영양소와 같은 경로로 흡수 및 대사된다. 즉, 장에서 흡수된 이소플라본은 킬로미크론(chylomicrons)에 포함되어 림프관을 따라 혈액으로 운반되어 모든 세포에 전달된다. 간에 도달한 이소플라본은 글루쿠로니드(glucuronide)나 황산염 형태로 간에 저장되었다가 담즙을 통해 소장으로 배출되는 장관 순환을 한다. 순환이 끝난 이소플라본은 주로 소변으로 배설되는데, 섭취한 이소플라본은 48시간 후 거의 모두 배설되며 그 중 절반 정도는 약 12시간 이내에 배설된다(Lamartiniere, C.A. and Fritz, W.A. Genistein:Chemoprevention, In vivo mechanism of action and bioavailability. Korea Soybean Digest 15(2):66-80. 1998). 원료 대두에서의 이소플라본은 포도당 잔기가 β-1,4-glycoside 결합을 한 배당체 형태로 대부분 존재하지만(Rostagno, M.A., Araujo, J.M.A. and Sandi, D. Supercritical fluid extraction of isoflavone from soybean flour. Food Chemistry. 78:111-117. 2002), 발효식품에서는 포도당이 분해된 아글리콘(aglycone)의 형태가 많이 존재한다(Sanders, T.AB., Dean, T.S., Gainger, D., Miller, G.J. and Wiseman, H. Moderate intakes of intact soy protein rich in isoflavone compared with ethanol-extracted soy pretein increase HDL but do not influence transforming growth factor 1 concentrations and hemostatic β risk factors for coronary heart disease in healthy subjects. Am. J. Clin. Nutr. 76:373-377. 2002). 배당체 형태의 이소플라본은 섭취 후 포도당이 제거되어 아글리콘(aglycone)의 형태로 체내에 흡수되거나 장내 미생물에 의해 파괴된다. 또한, 아글리콘(aglycone)인 게니스테인(genistein)을 섭취한 경우와 배당체인 게니스틴(genistin)을 섭취한 경우에 이들의 체내 대사는 약간 차이가 있는데, 실험동물을 이용한 실험과 인체실험에서 게니스테인(genistein)이 더 빨리 흡수되는 결과를 나타내었다. 이는 발효를 통해 배당체가 활성을 갖는 아글리콘(aglycone)의 형태로 전환되었기 때문이다. 따라서, 비발효 식품보다는 발효식품을 섭취하는 것이 이소플라본을 더 효과적으로 이용할 수 있는 것이라 할 수 있다(Lee, M.H., Park, Y.H., Oh, H.S. and Kwak, T.S. Isoflavone content in soybean and its processed products. Korean J. Food Sci. Technol. 34(3):365-369. 2002). 대두의 다양한 생리활성성분 증진과 활성형 이소플라본 등을 효과적으로 섭취하기 위한 여러 가지 대두 가공기술이 필요할 것으로 사료된다.
상기와 같이, 생리활성 효과가 뛰어난 이소플라본을 일상생활에서 용이하게 섭취하기 위하여, 이소플라본의 함유량을 증진시킨 두유 또는 기능성 식품과 같은 다양한 가공식품에 대한 연구가 진행 중에 있다.
대한민국 등록특허 제10-1146102호는 활성형 이소플라본 함량이 높은 전두유 제조방법에 관한 것으로서, 대두를 통째로 갈아 만드는 전두유 제조 시 김치로부터 추출된 베타-글루코시다아제 활성이 높은 유산균으로 발효시켜, 전두유에 함유된 이소플라본의 활성을 높이는 방법에 대해 개시되어 있다.
또한, 대한민국 등록특허 제10-1302376호는 원적외선 조사를 이용한 이소플라본 함량이 증가된 대두분말의 제조방법에 관한 것으로서, 대두를 원적외선을 이용하여 처리함으로써, 원적외선 특유의 가공 처리로 인해 대두의 제니스테인과 다이드제인 함량이 증가된 기능성 대두를 제조할 수 있고, 기능성 대두를 분말화하여 식품 및 음료 제조과정에서 원료로 사용할 수 있다고 개시되어 있다.
최근 대두를 효율적으로 섭취하기 위해 가공한 두유는 대두의 소화율과 단백질 이용률을 높인 대표적인 가공제품으로서, 필수 아미노산 및 필수지방산이 다량 함유되어 있고, 철분, 인, 칼륨 등의 무기질이 풍부하며(Kim, S.R., Park, Y.K., Seong, H.M. and Oh,S.H. Whole soybean milk produced by enzymetic solubilization of soymilk residue, and its nutritional properties. Korea Soybean Digest. 19:8-18. 2002), 유당이 함유되어 있지 않아 고단백 우유 대체식품으로서 각광받고 있다(Shin, H.C., Seong, H.S. and Sohn, H.S. The industrial development and health benefits of the soymilk. Korea Soybean Digest. 21:15-27. 2004).
최근 두유의 이소플라본(Isoflavone), 올리고당, 펩타이드 등은 만성질환에 효과가 있으며(Setchell, K.R. and Cassidy, A. Dietary isoflavone:biological effects and relevance to human health. J. Neutr. 129:758-767. 1999), 에스트로겐과 유사한 작용을 하는 phytoestrogen이 두유에 다량 함유된 것으로 보고되고 있다(Reinli, K. and Block, G. Phytoestrogen content of foods-A compendium of literature values. Nutrit. Cancer. 206:123-148. 1996). 또한, 대두 단백은 소화 및 가공 공정 중 각종 효소에 의하여 분해되면 소화, 흡수를 촉진하는 영양적 기능을 비롯하여 혈압강하, 진통마취, 칼슘흡수촉진, 항알러지 및 혈청콜레스테롤 저하작용 등의 생리활성을 가지는 펩타이드가 생성됨으로써(Pena, E., Prestamo, G. and Gomez, R. High pressure and the enzymytic hydrolysis of soybean whey proteins. Food Chem. 85:641-648. 2004), 두유에 효소를 처리하여 대두 단백질을 부분적으로 가수분해 시켜 새로운 영양 및 가공 기능성의 개선에 대한 연구가 이루어지고 있다(Choi, M.S. and Rhee, K.C. Production and processing of soybeans and safety of isoflavone and other soy products for human health. J. Med. Food. 9:1-10. 2006). 이러한 기능성은 가수분해로 인하여 단백질 구조의 변화와 분자량의 감소 등에 의한 것으로 알려져 있어 대두의 고분자 생리활성물질과 단백질을 이용하여 가공목적 및 조건에 적합한 기능성 소재 개발이 가능하다고 생각된다.
다만, 현재까지는 대두 고형분을 인라인 믹서를 이용하여 가열 및 분쇄하여 제조된 전두유에 당질 분해 효소를 첨가하여 가수분해 시켜서 단백질 분해 효소의 가수분해 활성을 증진시킨 뒤, 단백질 분해 효소를 첨가하여 단계적으로 가수분해 시킴으로써 활성형 이소플라본 함량을 증진시킨 전두유에 대한 기술 개발은 미비한 실정이다.
본 발명은 상술한 것과 같은 문제점을 해결하고 필요한 기술을 제공하기 위하여 안출된 것으로서,
본 발명은 전두유를 제조하는 과정에서 대두 고형분을 인라인 믹서를 이용하여 가열 및 분쇄하여 제조된 전두유에 당질 분해 효소를 첨가하여 가수분해 시킴으로써 비배당체 이소플라본의 함량을 높여 전두유에 포함된 이소플라본의 체내 흡수율을 높인 활성형 이소플라본이 강화된 전두유 및 그 제조방법을 제공함에 목적이 있다.
본 발명은 전두유를 제조하는 과정에서 대두 고형분을 인라인 믹서를 이용하여 가열 및 분쇄하여 제조된 전두유에 단백질 분해 효소를 첨가하여 단계적으로 가수분해 시킴으로써 활성형 이소플라본의 함량이 증진되는 장점이 있는 활성형 이소플라본이 강화된 전두유 및 그 제조방법을 제공함에 다른 목적이 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 실시형태로서,
본 발명의 일 실시형태는 대두 고형분 100중량부에 대해 물을 800 내지 1000중량부의 비율로 첨가한 뒤, 90 내지 92℃의 온도로 가열하면서 분쇄 및 교반하여 전두유를 제조하는 전두유제조단계; 상기 전두유제조단계에서 제조된 전두유를 50 내지 60℃의 온도가 되도록 냉각시키는 냉각단계; 상기 냉각단계에서 냉각된 전두유에 인산(Poly phosphate)을 첨가하여 2 내지 4시간 동안 수화시키는 인산처리단계; 상기 인산처리단계에서 수화된 전두유에 당질 분해 효소인 테르마밀(Termamyl)을 첨가하여 80 내지 90℃의 온도에서 3 내지 7시간 동안 가수분해 시키는 당분해단계; 상기 당분해단계에서 가수분해된 전두유에 단백질 분해 효소인 알카레이즈(Alcalase)를 첨가하여 50 내지 60℃의 온도에서 2 내지 5시간 동안 가수분해 시키는 1차단백질분해단계; 상기 1차단백질분해단계에서 가수분해된 전두유에 단백질 분해 효소인 플라보르자임(Flavourzyme)을 첨가하여 50 내지 60℃의 온도에서 2 내지 5시간 동안 가수분해 시키는 2차단백질분해단계; 및 상기 2차단백질분해단계에서 가수분해된 전두유를 95 내지 100℃의 온도에서 30 내지 60분 동안 가열하여 효소작용을 억제시키는 실활단계;가 포함되는 것을 특징으로 하는 활성형 이소플라본이 강화된 전두유의 제조방법을 제공할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 전두유제조단계에서는, 대두 고형분을 물에 2 내지 5시간 동안 침지하여 불린 후, 불린 대두 고형분에 물을 첨가하되 물은 대두 고형분 100중량부 대비 800 내지 1000중량부의 비율로 첨가하고, 물을 첨가한 불린 대두 고형분을 인라인 믹서 내에서 90 내지 92℃의 온도로 가열하면서 2 내지 4시간 동안 분쇄 및 교반하여 전두유를 제조하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 인산처리단계에서 첨가되는 인산의 첨가량은 대두 고형분 100중량부 대비 0.5 내지 2중량부의 비율인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 당분해단계에서 첨가되는 테르마밀의 첨가량은 대두 고형분 100중량부 대비 1 내지 2중량부의 비율인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 1차단백질분해단계에서 첨가되는 알카레이즈의 첨가량은 대두 고형분 100중량부 대비 0.5 내지 1중량부의 비율인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 2차단백질분해단계에서 첨가되는 플라보르자임의 첨가량은 대두 고형분 100중량부 대비 0.5 내지 1중량부의 비율인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태는 상기의 방법으로 제조되는 것을 특징으로 하는 활성형 이소플라본이 강화된 전두유를 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 방법으로 제조된 활성형 이소플라본이 강화된 전두유는 골다공증 개선 효과가 있다.
본 발명의 일 실시형태에 따라 제조된 활성형 이소플라본이 강화된 전두유는, 전두유를 제조하는 과정에서 대두 고형분을 인라인 믹서를 이용하여 가열 및 분쇄하여 제조된 전두유에 당질 분해 효소를 첨가하여 가수분해 시킴으로써 비배당체 이소플라본의 함량을 높여 전두유에 포함된 이소플라본의 체내 흡수율을 높이는 효과가 있다.
본 발명의 일 실시형태에 따라 제조된 활성형 이소플라본이 강화된 전두유는, 전두유를 제조하는 과정에서 대두 고형분을 인라인 믹서를 이용하여 가열 및 분쇄하여 제조된 전두유에 단백질 분해 효소를 첨가하여 단계적으로 가수분해 시킴으로써 활성형 이소플라본의 함량이 증진되는 장점이 있다.
본 발명에 따른 방법으로 제조된 활성형 이소플라본이 강화된 전두유는 골다공증 개선 효과가 우수하다.
도 1은 본 발명의 일 실시형태에 따른 활성형 이소플라본이 강화된 전두유의 제조방법을 공정 단계별로 나타낸 순서도이다.
도 2는 본 발명에 따른 전두유(TM) 및 일반 전두유(CM)를 섭취한 실험동물(ICR 생쥐)의 대퇴골 조직 형태를 보여주는 광학현미경 사진이다.
도 2는 본 발명에 따른 전두유(TM) 및 일반 전두유(CM)를 섭취한 실험동물(ICR 생쥐)의 대퇴골 조직 형태를 보여주는 광학현미경 사진이다.
이하, 본원의 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시형태를 들어 상세히 설명한다. 본 발명의 실시형태는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다. 따라서, 본 발명의 실시형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시형태로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 포함한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명의 명세서 전체에서, 어떤 단계가 다른 단계와 “상에” 또는 “전에” 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 단계가 다른 단계와 직접적 시계열적인 관계에 있는 경우뿐만 아니라, 각 단계 후의 혼합하는 단계와 같이 두 단계의 순서에 시계열적 순서가 바뀔 수 있는 간접적 시계열적 관계에 있는 경우와 동일한 권리를 포함할 수 있다.
본 발명의 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 “약”, “실질적으로” 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용 오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본 발명의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 “~(하는) 단계” 또는 “~의 단계”는 “~를 위한 단계”를 의미하지 않는다.
본 발명은 활성형 이소플라본이 강화된 전두유 및 그 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 활성형 이소플라본이 강화된 전두유의 제조방법은 전두유제조단계, 냉각단계, 인산처리단계, 당분해단계, 1차단백질분해단계, 2차단백질분해단계 및 실활단계를 포함할 수 있다.
이하, 본 발명의 일 실시형태에 따른 활성형 이소플라본이 강화된 전두유의 제조방법을 구체적으로 설명한다. 본 발명의 일 실시형태에 따른 활성형 이소플라본이 강화된 전두유는 후술하는 제조방법에 의하여 보다 명확하게 이해될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시형태에 따른 활성형 이소플라본이 강화된 전두유의 제조방법을 공정 단계별로 나타낸 순서도이다.
우선, 전두유제조단계를 수행할 수 있다(S100).
대두 고형분 100중량부에 대해 물을 800 내지 1000중량부의 비율로 첨가한 뒤, 90 내지 92℃의 온도로 가열하면서 분쇄 및 교반하여 전두유를 제조하는 전두유제조단계를 수행할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 대두 고형분은 대두를 분말화한 대두분말을 의미하는 것이 아니라, 고형 상태의 가공하지 않은 대두 자체를 의미한다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 상기 전두유제조단계에서는, 대두 고형분을 물에 2 내지 5시간 동안 침지하여 불린 후, 불린 대두 고형분에 물을 첨가하되 물은 대두 고형분 100중량부에 대비 800 내지 1000중량부의 비율로 첨가하고, 물을 첨가한 불린 대두 고형분을 인라인 믹서 내에서 90 내지 92℃의 온도로 가열하면서 2 내지 4시간 동안 분쇄 및 교반하여 전두유를 제조하는 것을 특징으로 할 수 있다.
즉, 대두의 전성분을 포함하는 전두유를 제조하기 위하여 대두 고형분을 물에 침지하여 2 내지 5시간 동안 불린 후, 대두 고형분 100중량부에 대해 물을 900중량부의 비율로 혼합하여 인라인 믹서 내에서 90 내지 92℃의 온도로 가열하면서 3시간 동안 분쇄 및 교반하여 전두유를 제조할 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 대두 고형분은 물에 침지하여 2 내지 5시간 불리는 것이 가장 바람직하다.
이는, 2시간 미만의 시간 동안 대두 고형분을 불리는 경우에는 대두의 수화가 이루어지지 않아 대두 중심부가 익지 않을 우려가 있기 때문이며, 5시간을 초과하는 시간 동안 대두 고형분을 불리는 경우에는 공정 시간이 길어짐에 따라 생산성 및 경제성이 저감될 우려가 있기 때문이다.
또한, 본 발명의 일 실시형태에 따르면, 불린 대두 고형분에 물을 첨가하되, 물은 대두 고형분 100중량부에 대비 800 내지 1000중량부의 비율로 첨가하는 것이 가장 바람직하다.
이는, 불린 대두 고형분에 물을 첨가하되 대두 고형분 100중량부 대비 800중량부 미만의 비율로 첨가하는 경우에는 전두유의 점도가 높아서 최종적으로 제조된 전두유의 조직감에 대한 소비자의 기호도가 저감되는 문제점이 발생할 수 있기 때문이며, 불린 대두 고형분에 물을 첨가하되 대두 고형분 100중량부에 대비 1000중량부를 초과하는 비율로 첨가하는 경우에는 전두유에 포함된 대두의 유효성분이 상대적으로 부족하게 되어 최종적으로 제조된 전두유에 활성형 이소플라본의 함유량이 저감될 우려가 있기 때문이다.
본 발명에서는 전두유를 제조하기 위하여 불린 대두 고형분 그대로를 인라인 믹서(Inline mixer)에 넣은 후, 인라인 믹서 내에서 가열하면서 대두 고형분을 분쇄 및 교반하여 전두유를 제조한다.
인라인 믹서는 연속 순환식 구조로 펌프와 유사한 형태이기 때문에 인라인 펌프(Inline pump)라고 부르기도 하며, 분산 및 유화 측면에서 핵심적인 기능을 가지고 있다. 또한, 흡입(suction)한 물질을 자체적으로 토출(discharge)하는 과정에서 미세한 로터(Rotor)와 스테이터(Stator)에 의한 다단 분산이 일어난다.
인라인 믹서는 일반 믹서에 비해 고정자가 2 내지 5개가 더 설치되어 있어 강한 유화와 분산력을 지니며, 한 곳에서 세척이 가능하여 위생적(CIP)이고, 다양한 부가옵션과 구조로 선택의 폭을 넓힐 수 있다. 또한, 인라인 믹서는 드레인만 연결하면 설치가 가능하여, 설치와 유지보수가 수월한 장점이 있다.
본 발명에서는 열수 순환 자켓형 탱크가 부착된 인라인 믹서를 사용함으로써, 연속 순환식 구조로 탱크 내 흡입한 물질을 자체적으로 토출하는 과정에서 미세한 로터와 스테이터에 의한 다단분산이 이루어질 수 있도록 할 수 있기 때문에, 최종적으로 제조된 전두유의 성상이 개선되어 목넘김이 우수할 뿐만 아니라, 조직감이 매우 우수한 장점이 있다.
또한, 냉온수 순환 자켓탱크에서 전두유를 제조함으로써 가열과 냉각이 동일한 탱크 내에서 이루어질 수 있어 전두유를 끓이고 냉각시키는 작업에 전두유를 이송할 필요가 없어서 생산 효율성을 증진시킬 수 있는 장점이 있다.
따라서, 전두유제조단계(S100)에서는 대두 고형분을 물에 2 내지 5시간 동안 침지하여 불린 후, 불린 대두 고형분에 물을 첨가하되 물은 대두 고형분 100중량부에 대비 800 내지 1000중량부의 비율로 첨가하고, 물을 첨가한 불린 대두 고형분을 인라인 믹서 내에서 90 내지 92℃의 온도로 가열하면서 2 내지 4시간 동안 분쇄 및 교반하여 전두유를 제조하는 것이 가장 바람직하다.
다음으로, 냉각단계를 수행할 수 있다(S200).
상기 전두유제조단계에서 제조된 전두유를 50 내지 60℃의 온도가 되도록 냉각시키는 냉각단계를 수행할 수 있다.
본 발명의 냉각단계는 추후 인산처리단계에서 인산이 활성화될 수 있도록 적정 온도로 전두유를 식히는 공정으로, 이에 따라, 냉각단계(S200)에서는 전두유를 50 내지 60℃의 온도가 되도록 냉각시키는 것이 가장 바람직하다.
다음으로, 인산처리단계를 수행할 수 있다(S300).
상기 냉각단계에서 냉각된 전두유에 인산(Poly phosphate)을 첨가하여 2 내지 4시간 동안 수화시키는 인산처리단계를 수행할 수 있다.
본 발명의 인산처리단계는 전두유에 포함된 대두의 입자를 수화시켜 더 잘게 부수고, 효소 첨가 시 가수분해의 효율을 높이기 위하여 수행하는 공정이다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 상기 인산처리단계에서는, 전두유에 인산(Poly phosphate)을 첨가하되, 인산의 첨가량은 대두 고형분 100중량부 대비 0.5 내지 2중량부의 비율인 것을 특징으로 할 수 있다.
전두유에 첨가하는 인산의 첨가량은 상기 전두유제조단계에서 사용된 대두 고형분 100중량부 대비 0.5 내지 2중량부의 비율인 것이 가장 바람직하다.
이는, 전두유에 인산을 첨가하되 대두 고형분 100중량부 대비 0.5중량부 미만의 비율로 첨가하는 경우에는 수화가 제대로 되지 않아서 수화되지 못한 대두 입자들이 효소의 작용을 받지 못하여 가수분해 효율이 감소될 우려가 있기 때문이며, 전두유에 인산을 첨가하되 대두 고형분 100중량부 대비 2중량부를 초과하는 비율로 첨가하는 경우에는 수화력이 더 이상 증진되지 않음에도 불구하고 불필요하게 인산을 소비하게 되어 생산성 및 경제성이 저감될 우려가 있기 때문이다.
따라서, 인산처리단계(S300)에서는 상기 냉각단계에서 냉각된 전두유에 인산(Poly phosphate)을 첨가하여 2 내지 4시간 동안 수화시키되, 인산은 대두 고형분 100중량부 대비 0.5 내지 2중량부의 비율로 첨가하는 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 일 실시형태에 따른 활성형 이소플라본이 강화된 전두유를 제조하는 과정 중 인산처리단계(S300)에서 전두유에 첨가하는 인산(Poly phosphate)의 첨가량을 구체적으로 한정하는 것은 “인산의 첨가량에 따른 전두유의 총 질소 및 단백질 함량 분석 실험”의 결과를 토대로 설정한 내용이며, 이는 하기 실시예 1에 의해 보다 명확하게 이해될 수 있다.
다음으로, 당분해단계를 수행할 수 있다(S400).
상기 인산처리단계에서 수화된 전두유에 당질 분해 효소인 테르마밀(Termamyl)을 첨가하여 80 내지 90℃의 온도에서 3 내지 7시간 동안 가수분해 시키는 당분해단계를 수행할 수 있다.
대두의 이소플라본은 당과 결합한 상태로 존재하여 체내 흡수율이 떨어진다. 이소플라본의 당을 분리하여 비배당체 형태로 생산하게 될 경우 체내 흡수율을 높일 수 있으며, 이소플라본의 체내 흡수율이 높아져 배당체 형태보다 더 높은 기능성을 갖게 된다.
이에 따라, 본 발명에서는 당질 분해 효소인 테르마밀(Termamyl)을 전두유에 첨가하여 대두 껍질의 당 성분을 저분자화 함으로써 유효성분인 이소플라본 비배당체의 함량을 높이고자 하였다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 상기 당분해단계에서는, 전두유에 당질 분해 효소인 테르마밀(Termamyl)을 첨가하되, 테르마밀의 첨가량은 대두 고형분 100중량부 대비 1 내지 2중량부의 비율인 것을 특징으로 할 수 있다.
인산처리단계에서 수화된 전두유에 첨가하는 당질 분해 효소인 테르마밀의 첨가량은 상기 전두유제조단계에서 사용된 대두 고형분 100중량부 대비 1 내지 2중량부의 비율인 것이 가장 바람직하다.
이는, 인산처리단계에서 수화된 전두유에 테르마밀을 첨가하되 대두 고형분 100중량부 대비 1중량부 미만의 비율로 첨가하는 경우에는 당분해력에 저하됨에 따라 당분해가 효과적으로 이루어지지 않는 문제점이 발생할 수 있기 때문이며, 인산처리단계에서 수화된 전두유에 테르마밀을 첨가하되 대두 고형분 100중량부 대비 2중량부를 초과하는 비율로 첨가하는 경우에는 당분해력이 더 이상 증진되지 않음에도 불구하고 불필요하게 당질 분해 효소인 테르마밀이 소비되어 생산성 및 경제성이 저감될 우려가 있기 때문이다.
따라서, 당분해단계(S400)에서는 인산처리단계에서 수화된 전두유에 당질 분해 효소인 테르마밀(Termamyl)을 첨가하여 80 내지 90℃의 온도에서 3 내지 7시간 동안 가수분해 시키되, 테르마밀은 대두 고형분 100중량부 대비 1 내지 2중량부의 비율로 첨가하는 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 일 실시형태에 따른 활성형 이소플라본이 강화된 전두유를 제조하는 과정 중 당분해단계(S400)에서 전두유에 첨가하는 테르마밀(Termamyl)의 첨가량 및 가수분해 시간을 구체적으로 한정하는 것은 “당분해단계의 공정조건에 따른 전두유의 이소플라본 함량 분석 실험”의 결과를 토대로 설정한 내용이며, 이는 하기 실시예 2에 의해 보다 명확하게 이해될 수 있다.
다음으로, 1차단백질분해단계를 수행할 수 있다(S500).
상기 당분해단계에서 가수분해된 전두유에 단백질 분해 효소인 알카레이즈(Alcalase)를 첨가하여 50 내지 60℃의 온도에서 2 내지 5시간 동안 가수분해 시키는 1차단백질분해단계를 수행할 수 있다.
알카레이즈(Alcalase)는 단백질의 내부구조를 무작위로 끊어주는 endo형 효소로, 전두유에 첨가하여 단백질을 분해시킴으로써 이소플라본을 대두의 기타 성분들로부터 분리할 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 상기 1차단백질분해단계에서는, 전두유에 단백질 분해효소인 알카레이즈(Alcalase)를 첨가하되, 알카레이즈의 첨가량은 대두 고형분 100중량부 대비 0.5 내지 1중량부의 비율인 것을 특징으로 할 수 있다.
당분해단계에서 가수분해된 전두유에 첨가하는 단백질 분해 효소인 알카레이즈의 첨가량은 상기 전두유제조단계에서 사용된 대두 고형분 100중량부 대비 0.5 내지 1중량부의 비율인 것이 가장 바람직하다.
이는, 당분해단계에서 가수분해된 전두유에 알카레이즈를 첨가하되 대두 고형분 100중량부 대비 0.5중량부 미만의 비율로 첨가하는 경우에는 가수분해가 효과적으로 이루어지지 않아 단백질 분해력이 저하될 우려가 있기 때문이며, 당분해단계에서 가수분해된 전두유에 알카레이즈를 첨가하되 대두 고형분 100중량부 대비 1중량부를 초과하는 비율로 첨가하는 경우에는 가수분해물의 수득량 또는 가수분해력이 더 이상 증진되지 않음에도 불구하고 불필요하게 단백질 분해 효소인 알카레이즈가 소비되게 되어 생산성이 저하되고 이에 따라 경제성 또한 저하될 우려가 있기 때문이다.
당분해단계에서 가수분해된 전두유에 단백질 분해 효소인 알카레이즈를 적정 비율로 첨가한 뒤, 50 내지 60℃의 온도에서 2 내지 5시간 동안 가수분해 시키는 것이 가장 바람직하다.
이는, 단백질가수분해효소인 알카레이즈의 최적 단백질 분해 온도가 55℃이기 때문이다. 즉, 50℃ 미만의 온도에서 2시간 미만의 시간 동안 가수분해 시키는 경우에는 가수분해가 완전하게 이루어지지 않아 배당체 형태의 이소플라본이 남게 될 우려가 있기 때문이며, 60℃를 초과하는 온도에서 5시간을 초과하는 시간 동안 가수분해 시키는 경우에는 가수분해물의 수득량 또는 가수분해력이 더 이상 증진되지 않음에도 불구하고 불필요한 공정 시간이 소비되게 되어 생산성이 저하되는 문제점이 발생할 수 있으며, 알카레이즈의 활성이 단시간 내에 억제되어 가수분해력이 더 이상 증진되지 않는 문제점이 발생할 수 있기 때문이다.
따라서, 1차단백질분해단계(S500)에서는 당분해단계에서 가수분해된 전두유에 단백질 분해 효소인 알카레이즈(Alcalase)를 첨가하여 50 내지 60℃의 온도에서 2 내지 5시간 동안 가수분해 시키되, 알카레이즈는 대두 고형분 100중량부 대비 0.5 내지 1중량부의 비율로 첨가하는 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 일 실시형태에 따른 활성형 이소플라본이 강화된 전두유를 제조하는 과정 중 1차단백질분해단계(S500)에서 단백질 분해 효소로 알카레이즈(Alcalase)를 사용하고, 전두유에 첨가하는 알카레이즈의 첨가량을 구체적으로 한정하는 것은 “단백질분해단계의 공정조건에 따른 전두유의 총 질소 및 단백질 함량 분석 실험과 이소플라본 함량 분석 실험”의 결과를 토대로 설정한 내용이며, 이는 하기 실시예 3에 의해 보다 명확하게 이해될 수 있다.
다음으로, 2차단백질분해단계를 수행할 수 있다(S600).
상기 1차단백질분해단계에서 가수분해된 전두유에 단백질 분해 효소인 플라보르자임(Flavourzyme)을 첨가하여 50 내지 60℃의 온도에서 2 내지 5시간 동안 가수분해 시키는 2차단백질분해단계를 수행할 수 있다.
플라보르자임(Flavourzyme)은 단백질의 말단구조를 무작위로 끊어주는 exo형 효소로, 전두유에 첨가하여 단백질을 분해시킴으로써 이소플라본을 대두의 기타 성분들로부터 분리할 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 상기 2차단백질분해단계에서는, 전두유에 단백질 분해효소인 플라보르자임(Flavourzyme)을 첨가하되, 플라보르자임의 첨가량은 대두 고형분 100중량부 대비 0.5 내지 1중량부의 비율인 것을 특징으로 할 수 있다.
1차단백질분해단계에서 가수분해된 전두유에 첨가하는 단백질 분해 효소인 플라보르자임의 첨가량은 상기 전두유제조단계에서 사용된 대두 고형분 100중량부 대비 0.5 내지 1중량부의 비율인 것이 가장 바람직하다.
이는, 1차단백질분해단계에서 가수분해된 전두유에 플라보르자임을 첨가하되 대두 고형분 100중량부 대비 0.5중량부 미만의 비율로 첨가하는 경우에는 가수분해가 효과적으로 이루어지지 않아 단백질 분해력이 저하될 우려가 있기 때문이며, 1차단백질분해단계에서 가수분해된 전두유에 플라보르자임을 첨가하되 대두 고형분 100중량부 대비 1중량부를 초과하는 비율로 첨가하는 경우에는 가수분해물의 수득량 또는 가수분해력이 더 이상 증진되지 않음에도 불구하고 불필요하게 단백질 분해 효소인 플라보르자임이 과도하게 소비되게 되어 생산성이 저하되고 이에 따라 경제성 또한 저하되는 문제점이 발생할 수 있기 때문이다.
1차단백질분해단계에서 가수분해된 전두유에 단백질 분해 효소인 플라보르자임을 적정 비율로 첨가한 뒤, 50 내지 60℃의 온도에서 2 내지 5시간 동안 가수분해 시키는 것이 가장 바람직하다.
이는, 단백질가수분해효소인 플라보르자임의 최적 단백질 분해 온도가 알카레이즈와 마찬가지로 55℃이기 때문이다. 즉, 50℃ 미만의 온도에서 2시간 미만의 시간 동안 가수분해 시키는 경우에는 가수분해가 완전하게 이루어지지 않아 배당체 형태의 이소플라본이 남게 될 우려가 있기 때문이며, 60℃를 초과하는 온도에서 5시간을 초과하는 시간 동안 가수분해 시키는 경우에는 가수분해물의 수득량 또는 가수분해력이 더 이상 증진되지 않음에도 불구하고 불필요한 공정 시간이 소비되게 되어 생산성이 저하되는 문제점이 발생할 수 있으며, 플라보르자임의 활성이 단시간 내에 억제되어 가수분해력이 더 이상 증진되지 않는 문제점이 발생할 수 있기 때문이다.
따라서, 2차단백질분해단계(S600)에서는 1차단백질분해단계에서 가수분해된 전두유에 단백질 분해 효소인 플라보르자임(Flavourzyme)을 첨가하여 50 내지 60℃의 온도에서 2 내지 5시간 동안 가수분해 시키되, 플라보르자임은 대두 고형분 100중량부 대비 0.5 내지 1중량부의 비율로 첨가하는 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 일 실시형태에 따른 활성형 이소플라본이 강화된 전두유를 제조하는 과정 중 2차단백질분해단계(S600)에서 단백질 분해 효소로 플라보르자임(Flavourzyme)을 사용하고, 전두유에 첨가하는 플라보르자임의 첨가량을 구체적으로 한정하는 것은 “단백질분해단계의 공정조건에 따른 전두유의 총 질소 및 단백질 함량 분석 실험과 이소플라본 함량 분석 실험”의 결과를 토대로 설정한 내용이며, 이는 하기 실시예 3에 의해 보다 명확하게 이해될 수 있다.
본 발명에서는 전두유에 단백질 분해 효소를 첨가하여 가수분해 시키되, 알카레이즈(Alcalase)를 첨가하여 1차로 가수분해 시키고, 1차로 가수분해된 전두유에 플라보르자임(Flavourzyme)을 첨가하여 2차로 가수분해 시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
이는, 전두유에 단백질 분해 효소를 첨가하여 가수분해 시킴으로써 활성형 이소플라본의 함량을 증진시키되, 단백질 분해 효소의 종류를 다르게 하여 단계적으로 가수분해 시켜서 활성형 이소플라본 함량을 최적의 조건으로 증진시키기 위함이다.
본 발명에서는 단백질 분해 효소의 종류를 알카레이즈(Alcalase), 플라보르자임(Flavourzyme), 프로타멕스(Protamex) 및 누트라제(Neutrase)로 다양하게 설정하고, 1종의 단백질 분해 효소로 가수분해 시켜서 전두유를 제조하는 경우와 2종 이상의 단백질 분해 효소를 이용하여 단계적으로 가수분해 시켜서 전두유를 제조하는 경우를 비교하여 최적의 조건을 확립하였다.
본 발명에서 확립한 최적의 가수분해 조건은 “단백질분해단계의 공정조건에 따른 전두유의 총 질소 및 단백질 함량 분석 실험과 이소플라본 함량 분석 실험”을 실시한 결과를 토대로 확립하였으며, 실험 내용은 하기 실시예 3에 구체적으로 기재되어 있다.
“단백질분해단계의 공정조건에 따른 전두유의 총 질소 및 단백질 함량 분석 실험과 이소플라본 함량 분석 실험”을 실시한 결과에 따르면, 당분해단계에서 가수분해된 전두유에 단백질 분해 효소인 알카레이즈(Alcalase)를 첨가하여 1차로 단백질 가수분해 시킨 뒤, 1차단백질분해단계에서 가수분해된 전두유에 단백질 분해 효소인 플라보르자임(Flavourzyme)을 첨가하여 2차로 단백질 가수분해 시키는 경우에, 전두유에 포함된 비배당체 활성형 이소플라본의 함량이 가장 높은 것으로 나타났다.
따라서, 전두유에 포함된 비배당체 활성형 이소플라본의 함량을 증진시키기 위해서는 전두유에 단백질 분해 효소를 첨가하여 가수분해 시키되, 알카레이즈(Alcalase)를 첨가하여 1차로 가수분해 시키고, 1차로 가수분해된 전두유에 플라보르자임(Flavourzyme)을 첨가하여 2차로 가수분해 시키는 것이 가장 바람직하다.
다음으로, 실활단계를 수행할 수 있다(S700).
상기 2차단백질분해단계에서 가수분해된 전두유를 95 내지 100℃의 온도에서 30 내지 60분 동안 가열하여 효소작용을 억제시키는 실활단계를 수행할 수 있다.
본 발명의 실활단계는 가수분해단계에서 가수분해된 전두유를 가열함으로써 효소의 작용을 억제하여 안정성을 확보하기 위한 공정으로, 이에 따라, 실활단계(S700)에서는 2차단백질분해단계에서 가수분해된 전두유를 95 내지 100℃의 온도에서 30 내지 60분 동안 가열하여 효소작용을 억제시키는 것이 가장 바람직하다.
이하, 다양한 형태에 따라 전두유를 제조한 뒤, 총 질소 함량 분석 실험, 단백질 함량 분석 실험 및 이소플라본 함량 분석 실험을 실시하여 활성형 이소플라본이 강화된 전두유를 제조하기 위한 최적의 공정조건을 확립하였다. 본 발명의 일 실시형태에 따른 활성형 이소플라본이 강화된 전두유는 후술하는 실시예에 의하여 보다 명확하게 이해될 수 있다.
인산의 첨가량에 따른 전두유의 총 질소 및 단백질 함량 분석 실험
본 발명의 일 실시형태에 따른 전두유의 비배당체 활성형 이소플라본의 함유량을 증진시키기 위하여, 단백질 분해 효소 첨가 시 가수분해의 효율성을 높일 수 있도록 전두유에 인산(Poly phosphate)을 첨가하는 인산처리단계(S300)에서 전두유에 첨가하는 인산의 첨가량을 한정하기 위한 실험을 실시하였다.
인산처리단계(S300)에서 전두유에 첨가하는 인산의 첨가량을 한정하기 위한 실험은, 전두유에 첨가하는 인산의 첨가량을 다르게 설정하여 제조한 시험액(Sample)에 포함된 총 질소(Total nitrogen, TN)의 함량을 분석하고, 단백질의 함량을 분석하는 것으로 수행하였다. 이는, 전두유에 포함된 총 질소 함량이 높을수록 인산처리단계에서 전두유가 효과적으로 수화되었다고 판단될 수 있기 때문이다.
시험액(Sample)에 포함된 총 질소(Total nitrogen, TN)의 함량을 분석하고, 단백질의 함량을 분석함으로써, 총 질소 함량 및 단백질 함량을 기준으로 인산처리단계(S300)에서 전두유에 첨가하는 인산의 첨가량을 구체적으로 한정하였다.
[실시예 1의 시험액(Sample) 제조]
전두유는 대두 고형분 함량이 10%가 되도록 공정수를 첨가하여 제조하였으며, 90℃로 설정 된 자켓탱크에 투하 후 인라인믹서 시스템을 이용해 분쇄하였다. 분쇄를 마친 전두유는 50 내지 60℃의 온도 수준으로 냉각 후, 전두유에 인산을 첨가하되, 인산을 대두 고형분 100중량부 대비 0.5중량부(P1), 1.0중량부(P2) 및 2.0중량부(P3)의 비율로 각각 첨가하여 3시간 동안 수화를 진행하였다. 수화를 마친 전두유는 감압여과를 통해 시험액으로서 여과액을 사용하였다. 상기에서 설명한 바와 같이, 시험액(Sample) 제조 과정에서 전두유에 첨가하는 인산의 첨가량은 하기 표 1에 자세히 나타내었다.
| 시험액 | 폴리인산(%) (대두 고형분 100 중량부 대비 인산의 중량부) |
| P1 | 0.5 중량부 |
| P2 | 1.0 중량부 |
| P3 | 2.0 중량부 |
[실시예 1의 총 질소 및 단백질 함량 분석 실험 방법 및 결과]
총 질소 함량은 단백질 자동분석기(Kjelflex K-360)를 이용하여 마이크로 ㅋ킬달(cro-kjeldahl) 시험법으로 분석하였으며, 질소계수를 이용하여 단백질 함량을 계산하였다.
시험액(Sample) P1, P2 및 P3에 포함된 총 질소(Total nitrogen, TN) 함량과, 질소계수를 이용하여 단백질 함량을 계산한 분석 결과는 하기 표 2에 나타내었다.
| 시험액 | 총 질소 | 단백질(%) | |
| mgN/100g | gN/100g | ||
| P1 | 600.8 | 0.60 | 3.4 |
| P2 | 496.0 | 0.50 | 2.8 |
| Pe | 534.5 | 0.53 | 3.1 |
상기 표 2에 나타난 바와 같이, 대두 고형분 100중량부를 기준으로 인산이 0.5중량부의 비율로 첨가된 P1 시험액(Sample)의 총 질소 함량은 600.8㎎%로 처리구들 중 가장 많은 총 질소 함량이 확인되었으며, 단백질 함량 역시 3.4%로 가장 많은 함량이 확인되었다. 대두 고형분 100중량부를 기준으로 인산이 1.0중량부의 비율로 첨가된 P2 시험액(Sample)의 총 질소 함량 및 단백질 함량은 496.0㎎%와 2.8%로 P1 시험액(Sample)에 비해서는 적은 것으로 나타났다. 대두 고형분 100중량부를 기준으로 인산이 2.0중량부의 비율로 첨가된 P3 시험액(Sample)은 총 질소 함량이 534.5㎎%, 단백질이 3.1%로 분석됨에 따라 P2 시험액(Sample)과 마찬가지로 P1 시험액(Sample) 보다는 총 질소 함량과 단백질 함량이 적은 것으로 확인되었다.
즉, 인산의 첨가량에 따른 전두유의 총 질소 함량 및 단백질 함량을 복합적으로 고려할 경우, 전두유에 인산을 첨가하여 수화시키되, 인산의 첨가량은 대두 고형분 100중량부 대비 0.5중량부의 비율인 것이 가장 바람직하며, 대두 고형분 100중량부 대비 2중량부의 비율까지 인산의 첨가량을 한정할 경우 전두유가 효과적으로 수화되었다고 판단될 수 있는 것으로 나타났다.
따라서, 실시예 1을 통해 본 발명의 일 실시형태에 따른 활성형 이소플라본이 강화된 전두유를 제조하는 과정 중 인산처리단계(S300)에서는 전두유에 인산(Poly phosphate)을 첨가하여 2 내지 4시간 동안 수화시키되, 인산이 대두 고형분 100중량부 대비 0.5 내지 2중량부의 비율로 첨가되도록 공정조건을 한정하는 것이 가장 바람직함을 확인하였다.
당분해단계의 공정조건에 따른 전두유의 이소플라본 함량 분석 실험
본 발명의 일 실시형태에 따른 전두유의 비배당체 활성형 이소플라본의 함유량을 증진시키기 위하여, 이소플라본의 당을 분리하여 비배당체 형태로 생산하여 체내 흡수율을 높일 수 있도록 전두유에 당질 분해 효소인 테르마밀(Termamyl)을 첨가하는 당분해단계(S400)에서 전두유에 첨가하는 테르마밀의 첨가량 및 가수분해 시간을 한정하기 위한 실험을 실시하였다.
당분해단계(S400)에서 전두유에 첨가하는 테르마밀의 첨가량 및 가수분해 시간을 한정하기 위한 실험은, 전두유에 첨가하는 테르마밀의 첨가량을 다르게 설정하여 제조하고, 가수분해 시간을 다르게 설정하여 제조한 시료(Sample)에 포함된 비배당체 이소플라본 함량 분석 실험을 수행하는 것으로 실시하였으며, 비배당체 이소플라본 함량 분석 실험 결과를 기준으로 당분해단계(S400)에서 전두유에 첨가하는 테르마밀의 첨가량 및 가수분해 시간을 구체적으로 한정하였다.
[실시예 2의 시료(Sample) 제조]
전두유는 대두 고형분 함량이 10%가 되도록 공정수를 첨가하여 제조하였으며, 90℃로 설정 된 자켓탱크에 투하 후 인라인믹서 시스템을 이용해 분쇄하였다. 분쇄를 마친 전두유는 50 내지 60℃의 온도 수준으로 냉각 후, 전두유에 대두 고형분 100중량부 대비 0.5중량부의 비율로 인산을 첨가하여 3시간 동안 수화시켰다.
인산처리단계에서 수화된 전두유에 당질 분해 효소인 테르마밀(Termamyl)을 대두 고형분 100중량부 대비 1중량부(T1), 2중량부(T2) 및 3중량부(T3)의 비율로 각각 첨가하였다. 테르마밀(Termamyl)이 첨가된 전두유 각각을 80 내지 90℃의 온도에서 1시간(T1-1, T2-1, T3-1), 3시간(T1-2, T2-2, T3-2), 5시간(T1-3, T2-3, T3-3) 및 7시간(T1-4, T2-4, T3-4) 동안 각각 가수분해 하였다. 가수분해된 각각의 전두유(가수분해물)를 동결건조(Freeze drying)하여 시료(Sample)로 제조하였다. 상기에서 설명한 바와 같이, 시료(Sample) 제조 과정에서 전두유에 첨가하는 테르마밀(Termamyl)의 첨가량 및 가수분해 시간은 하기 표 3에 자세히 나타내었다.
| 시료 | 처리 | |
| 테르마밀(%) | 가수분해(hr) | |
| T1-1 | 1 | 1 |
| T1-2 | 3 | |
| T1-3 | 5 | |
| T1-4 | 7 | |
| T2-1 | 2 | 1 |
| T2-2 | 3 | |
| T2-3 | 5 | |
| T2-4 | 7 | |
| T3-1 | 3 | 1 |
| T3-2 | 3 | |
| T3-3 | 5 | |
| T3-4 | 7 | |
[실시예 2의 비배당체 활성형 이소플라본 함량 분석 실험 방법]
다이진(daidzin), 다이드제인(daidzein), 게니스틴(genistin), 게니스테인(genistein), 글리시틴(glycitin) 및 글리시테인(glycitein) 시약을 구매하여, 75% 에탄올 용액을 용매로 하여 표준시약을 농도별로 제조한 뒤, 표준 곡선(standard curve)을 작성하였다. 시료(Sample)에 포함된 비배당체 활성형 이소플라본의 함량은 표준 곡선(standard curve)을 이용하여 계산하였다.
동결건조하여 제조된 일정량의 시료(Sample)(5g)를 환류플라스크에 넣은 후 75% 에탄올 용액 50㎖L를 가하고, 80℃의 온도로 유지되는 수욕조에서 3시간 동안 환류 추출하여 추출용액을 제조하였으며, 추출용액을 거름종이를 이용 여과 후 75% 에탄올 용액으로 100㎖로 정용한 뒤, 0.45㎛ 실린지 필터(syringe filter)로 여과하고 마이크로 비알(micro vial)에 담아서 HPLC(고성능 액체 크로마토그래피, high performance liquid chromatography)를 이용하여 정량하였다. 분석조건은 하기 표 4와 같이 설정하였으며, HPLC를 이용하여 비배당체의 활성형 이소플라본의 함량을 분석하였다.
| 구분 | 조건 | ||
| 검출기 | UV-254 nm | ||
| 컬럼 | Agilent Eclipse XDB-C18, 5μm, 4.6 * 250 nm | ||
| 컬럼 오븐 온도 | 30℃ | ||
| 이동 상 | A: 탈이온수 중 아세트산 0.1% | ||
| B: 아세토니트릴 중 아세트산 0.1% | |||
| 시간(min) | A(%) | B(%) | |
| 0 | 88 | 12 | |
| 25 | 75 | 25 | |
| 30 | 70 | 30 | |
| 35 | 65 | 35 | |
| 40 | 60 | 40 | |
| 42 | 88 | 12 | |
| 50 | 88 | 12 | |
| 유량(Flow rate) | 1.0 ml/min | ||
| 주입 용량 (injection volume) |
10 μl | ||
[실시예 2의 비배당체 활성형 이소플라본 함량 분석 실험 결과]
시료(Sample) T1-1, T1-2, T1-3, T1-4, T2-1, T2-2, T2-3, T2-4, T3-1, T3-2, T3-3 및 T3-4에 포함된 비배당체 활성형 이소플라본의 함량을 분석한 결과는 하기 표 5에 나타내었다.
| 처리* | 이소플라본 함량(mg/100g) | ||||||||
| 글리코시드 | 아글리콘 | 글리코시드 | 아글리콘 | 계 | |||||
| 다이드진 | 게니스틴 | 글리시틴 | 다이드제인 | 게니스테인 | 글리시테인 | ||||
| T1-1 | 5.6 | 61.5 | 0.0 | 7.5 | 17.4 | 0.0 | 67.1 | 24.9 | 92.0 |
| T1-2 | 5.3 | 59.6 | 1.5 | 4.5 | 4.3 | 0.0 | 66.5 | 8.8 | 75.3 |
| T1-3 | 5.6 | 61.8 | 0.0 | 0.0 | 16.9 | 0.0 | 67.4 | 16.9 | 84.3 |
| T1-4 | 5.5 | 61.2 | 15.4 | 0.0 | 23.3 | 0.0 | 82.0 | 23.3 | 105.3 |
| T2-1 | 5.3 | 60.0 | 14.9 | 4.3 | 3.3 | 0.0 | 80.2 | 7.6 | 87.8 |
| T2-2 | 5.4 | 61.1 | 15.0 | 4.3 | 29.4 | 0.0 | 81.5 | 33.7 | 115.2 |
| T2-3 | 5.6 | 61.7 | 14.9 | 0.0 | 20.6 | 0.0 | 82.2 | 20.6 | 102.8 |
| T2-4 | 5.5 | 61.1 | 15.2 | 4.5 | 29.2 | 0.0 | 81.8 | 33.7 | 115.5 |
| T3-1 | 5.3 | 60.3 | 14.7 | 5.1 | 4.3 | 0.0 | 80.3 | 9.4 | 89.7 |
| T3-2 | 5.3 | 59.8 | 14.7 | 4.3 | 3.5 | 0.0 | 79.7 | 7.8 | 87.5 |
| T3-3 | 5.5 | 60.8 | 0.0 | 0.0 | 17.1 | 0.0 | 66.4 | 17.1 | 83.4 |
| T3-4 | 5.6 | 61.0 | 0.0 | 0.0 | 16.8 | 0.0 | 66.6 | 16.8 | 83.3 |
상기 표 5에 나타난 바와 같이, 인산처리단계에서 수화된 전두유에 당질 분해 효소인 테르마밀(Termamyl)을 대두 고형분 100중량부 대비 2중량부(T2)의 비율로 첨가한 뒤, 80 내지 90℃의 온도에서 7시간(T2-4) 동안 가수분해 시킨 T2-4 시료(Sample)에 비배당체 활성형 이소플라본이 가장 많이 포함되어 있는 것으로 나타났다.
즉, 전두유에 포함된 비배당체 활성형 이소플라본의 함량을 테르마밀의 첨가량과 가수분해 시간을 복합적으로 고려할 경우, 전두유에 당질 분해 효소인 테르마밀을 첨가하여 가수분해 시키되, 테르마밀의 첨가량은 대두 고형분 100중량부 대비 2중량부의 비율인 것이 가장 바람직하며, 7시간 동안 가수분해 시키는 것이 가장 바람직한 것으로 나타났다.
따라서, 실시예 2를 통해 본 발명의 일 실시형태에 따른 활성형 이소플라본이 강화된 전두유를 제조하는 과정 중 당분해단계(S400)에서는 인산처리단계에서 수화된 전두유에 당질 분해 효소인 테르마밀(Termamyl)을 첨가하여 80 내지 90℃의 온도에서 3 내지 7시간 동안 가수분해 시키되, 테르마밀이 대두 고형분 100중량부 대비 1 내지 2중량부의 비율로 첨가되도록 공정조건을 한정하는 것이 가장 바람직함을 확인하였다.
단백질분해단계의 공정조건에 따른 전두유의 총 질소 및 단백질 함량 분석 실험과 이소플라본 함량 분석 실험
본 발명의 일 실시형태에 따른 전두유의 비배당체 활성형 이소플라본의 함유량을 증진시키기 위하여, 단백질 분해 효소의 종류를 알카레이즈(Alcalase), 플라보르자임(Flavourzyme), 프로타멕스(Protamex) 및 누트라제(Neutrase)로 다양하게 설정하고, 1종의 단백질 분해 효소로 가수분해 시켜서 전두유를 제조하는 경우와 2종 이상의 단백질 분해 효소를 이용하여 단계적으로 가수분해 시켜서 전두유를 제조하는 경우를 비교하여 최적의 조건을 확립하였다.
단백질분해단계의 조건을 구체적으로 한정하기 위한 실험은, 단백질 분해 효소의 종류, 단백질 분해 효소의 첨가량 및 복합처리(2종 이상의 단백질 분해 효소를 이용하여 단계적으로 가수분해 시킴) 조건 등을 다르게 설정하여 제조한 시료(Sample)에 포함된 총 질소(Total nitrogen, TN)의 함량, 단백질 함량 및 비배당체 이소플라본 함량 분석 실험을 수행하였다.
시료(Sample)에 포함된 총 질소(Total nitrogen, TN)의 함량, 단백질 함량 및 비배당체 이소플라본 함량을 복합적으로 분석함으로써, 단백질분해단계의 조건을 구체적으로 한정하였다.
[실시예 3의 시료(Sample) 제조]
당분해단계에서 가수분해된 전두유에 알카레이즈(Alcalase), 플라보르자임(Flavourzyme), 프로타멕스(Protamex) 및 누트라제(Neutrase)와 같은 단백질 분해 효소를 각각 첨가하여 55℃의 온도에서 3시간 동안 가수분해 하였다. 가수분해된 각각의 전두유(가수분해물)를 동결건조(Freeze drying)하여 시료(Sample)로 제조하였다.
2종 이상의 단백질 분해 효소를 이용하여 단계적으로 가수분해 시키는 경우에는, 단백질 분해 효소를 첨가하여 55℃의 온도에서 3시간 동안 가수분해 시키는 과정을 단계적으로 실시하여 최종적으로 가수분해된 전두유(가수분해물)를 동결건조(Freeze drying)하여 시료(Sample)로 제조하였다.
시료(Sample) A는 당분해단계에서 가수분해된 전두유에 단백질 분해 효소인 알카레이즈(Alcalase)를 첨가하되 대두 고형분 100중량부 대비 1중량부의 비율로 첨가한 뒤, 55℃의 온도에서 3시간 동안 가수분해 시켜서 제조된 가수분해물을 동결건조하여 제조하였다.
시료(Sample) F는 당분해단계에서 가수분해된 전두유에 단백질 분해 효소인 플라보르자임(Flavourzyme)을 첨가하되 대두 고형분 100중량부 대비 1중량부의 비율로 첨가한 뒤, 55℃의 온도에서 3시간 동안 가수분해 시켜서 제조된 가수분해물을 동결건조하여 제조하였다.
시료(Sample) P는 당분해단계에서 가수분해된 전두유에 단백질 분해 효소인 프로타멕스(Protamex)를 첨가하되 대두 고형분 100중량부 대비 1중량부의 비율로 첨가한 뒤, 55℃의 온도에서 3시간 동안 가수분해 시켜서 제조된 가수분해물을 동결건조하여 제조하였다.
시료(Sample) N은 당분해단계에서 가수분해된 전두유에 단백질 분해 효소인 누트라제(Neutrase)를 첨가하되 대두 고형분 100중량부 대비 1중량부의 비율로 첨가한 뒤, 55℃의 온도에서 3시간 동안 가수분해 시켜서 제조된 가수분해물을 동결건조하여 제조하였다.
시료(Sample) A-F는 당분해단계에서 가수분해된 전두유에 알카레이즈(Alcalase)를 첨가하되 대두 고형분 100중량부 대비 0.5중량부의 비율로 첨가한 뒤, 55℃의 온도에서 3시간 동안 가수분해 시킨다. 그 후에, 가수분해된 가수분해물에 플라보르자임(Flavourzyme)을 첨가하되 대두 고형분 100중량부 대비 0.5중량부의 비율로 첨가한 뒤, 55℃의 온도에서 3시간 동안 가수분해 시켜서 제조된 최종 가수분해물을 동결건조하여 제조하였다.
시료(Sample) A-P는 당분해단계에서 가수분해된 전두유에 알카레이즈(Alcalase)를 첨가하되 대두 고형분 100중량부 대비 0.5중량부의 비율로 첨가한 뒤, 55℃의 온도에서 3시간 동안 가수분해 시킨다. 그 후에, 가수분해된 가수분해물에 프로타멕스(Protamex)를 첨가하되 대두 고형분 100중량부 대비 0.5중량부의 비율로 첨가한 뒤, 55℃의 온도에서 3시간 동안 가수분해 시켜서 제조된 최종 가수분해물을 동결건조하여 제조하였다.
시료(Sample) A-N은 당분해단계에서 가수분해된 전두유에 알카레이즈(Alcalase)를 첨가하되 대두 고형분 100중량부 대비 0.5중량부의 비율로 첨가한 뒤, 55℃의 온도에서 3시간 동안 가수분해 시킨다. 그 후에, 가수분해된 가수분해물에 누트라제(Neutrase)를 첨가하되 대두 고형분 100중량부 대비 0.5중량부의 비율로 첨가한 뒤, 55℃의 온도에서 3시간 동안 가수분해 시켜서 제조된 최종 가수분해물을 동결건조하여 제조하였다.
시료(Sample) F-P는 당분해단계에서 가수분해된 전두유에 플라보르자임(Flavourzyme)을 첨가하되 대두 고형분 100중량부 대비 0.5중량부의 비율로 첨가한 뒤, 55℃의 온도에서 3시간 동안 가수분해 시킨다. 그 후에, 가수분해된 가수분해물에 프로타멕스(Protamex)를 첨가하되 대두 고형분 100중량부 대비 0.5중량부의 비율로 첨가한 뒤, 55℃의 온도에서 3시간 동안 가수분해 시켜서 제조된 최종 가수분해물을 동결건조하여 제조하였다.
시료(Sample) F-N은 당분해단계에서 가수분해된 전두유에 플라보르자임(Flavourzyme)을 첨가하되 대두 고형분 100중량부 대비 0.5중량부의 비율로 첨가한 뒤, 55℃의 온도에서 3시간 동안 가수분해 시킨다. 그 후에, 가수분해된 가수분해물에 누트라제(Neutrase)를 첨가하되 대두 고형분 100중량부 대비 0.5중량부의 비율로 첨가한 뒤, 55℃의 온도에서 3시간 동안 가수분해 시켜서 제조된 최종 가수분해물을 동결건조하여 제조하였다.
시료(Sample) A-F-P는 당분해단계에서 가수분해된 전두유에 알카레이즈(Alcalase)를 첨가하되 대두 고형분 100중량부 대비 0.33중량부의 비율로 첨가한 뒤, 55℃의 온도에서 3시간 동안 가수분해 시킨다. 그 후에, 가수분해된 가수분해물에 플라보르자임(Flavourzyme)을 첨가하되 대두 고형분 100중량부 대비 0.33중량부의 비율로 첨가한 뒤, 55℃의 온도에서 3시간 동안 가수분해 시킨다. 그 후에, 가수분해된 가수분해물에 프로타멕스(Protamex)를 첨가하되 대두 고형분 100중량부 대비 0.33중량부의 비율로 첨가한 뒤, 55℃의 온도에서 3시간 동안 가수분해 시켜서 제조된 최종 가수분해물을 동결건조하여 제조하였다.
시료(Sample) A-F-P-N은 당분해단계에서 가수분해된 전두유에 알카레이즈(Alcalase)를 첨가하되 대두 고형분 100중량부 대비 0.25중량부의 비율로 첨가한 뒤, 55℃의 온도에서 3시간 동안 가수분해 시킨다. 그 후에, 가수분해된 가수분해물에 플라보르자임(Flavourzyme)을 첨가하되 대두 고형분 100중량부 대비 0.25중량부의 비율로 첨가한 뒤, 55℃의 온도에서 3시간 동안 가수분해 시킨다. 그 후에, 가수분해된 가수분해물에 프로타멕스(Protamex)를 첨가하되 대두 고형분 100중량부 대비 0.25중량부의 비율로 첨가한 뒤, 55℃의 온도에서 3시간 동안 가수분해 시킨다. 그 후에, 가수분해된 가수분해물에 누트라제(Neutrase)를 첨가하되 대두 고형분 100중량부 대비 0.25중량부의 비율로 첨가한 뒤, 55℃의 온도에서 3시간 동안 가수분해 시켜서 제조된 최종 가수분해물을 동결건조하여 제조하였다.
시료(Sample) 제조 과정에서 사용된 단백질 분해 효소의 종류, 단백질 분해 효소의 첨가량 및 복합처리(2종 이상의 단백질 분해 효소를 이용하여 단계적으로 가수분해 시킴) 조건 등은 하기 표 6에 자세히 나타내었으며, 대조군(Control)은 대두 분말을 의미한다.
| 시료 | 첨가량(%) | |||
| 알카레이즈 | 플라보르자임 | 프로타멕스 | 누트라제 | |
| A | 1 | - | - | - |
| F | - | 1 | - | - |
| P | - | - | 1 | - |
| N | - | - | - | 1 |
| A-F | 0.5 | 0.5 | - | - |
| A-P | 0.5 | - | 0.5 | - |
| A-N | 0.5 | - | - | 0.5 |
| F-P | - | 0.5 | 0.5 | - |
| F-N | - | 0.5 | - | 0.5 |
| A-F-P | 0.33 | 0.33 | 0.33 | - |
| A-F-P-N | 0.25 | 0.25 | 0.25 | 0.25 |
| 대조군 | - | - | - | - |
[실시예 3의 총 질소 및 단백질 함량 분석 실험 방법 및 결과]
총 질소 함량은 단백질 자동분석기(Kjelflex K-360)를 이용하여 Micro-kjeldahl 시험법으로 분석하였으며, 질소계수를 이용하여 단백질 함량을 계산하였다.
시료(Sample) A, F, P, N, A-F, A-P, A-N, F-P, F-N, A-F-P 및 A-F-P-N에 포함된 총 질소(Total nitrogen, TN) 함량과, 질소계수를 이용하여 단백질 함량을 계산한 분석 결과는 하기 표 7에 나타내었다.
| 처리 | 시료 중량 | 총 질소 | 단백질(%), 5.71* (*:질소계수) |
|
| mg/100g | g/100g | |||
| A | 0.306 | 6357.4 | 6.36 | 36.3 |
| F | 0.303 | 6886.1 | 6.89 | 39.3 |
| P | 0.301 | 6565.2 | 6.57 | 37.5 |
| N | 0.307 | 6544.2 | 6.54 | 37.4 |
| A-F | 0.505 | 6519.3 | 6.52 | 37.2 |
| A-P | 0.508 | 6481.9 | 6.48 | 37.0 |
| A-N | 0.507 | 6482.7 | 6.48 | 37.0 |
| F-P | 0.505 | 6524.7 | 6.52 | 37.3 |
| F-N | 0.506 | 6530.3 | 6.53 | 37.3 |
| A-F-P | 0.306 | 6515.3 | 6.52 | 37.2 |
| A-F-P-N | 0.300 | 6446.1 | 6.45 | 36.8 |
| 대조군 | 0.284 | 6098.9 | 6.10 | 34.8 |
상기 표 7에 나타난 바와 같이, 총 질소 함량 및 단백질 함량 분석 결과에 따르면, 단백질 분해 효소로 가수분해된 시료(Sample)들은 대조구인 대두분말에 비하여 총 질소 함량 및 단백질 함량이 증가한 것으로 나타났다. 특히, 플라보르자임(Flavourzyme) 단백질 분해 효소로 처리한 시료 F의 총 질소 함량은 6886.1㎎%로 가장 높았으며, 알카레이즈(Alcalase) 단백질 분해 효소로 처리한 시료 A는 총 질소 함량이 6357.4㎎%로 가장 적게 포함된 것으로 확인되었다. 또한, 단백질 분해 효소의 복합처리시에는 총 질소 및 단백질 함량을 증대시키는 데에는 크게 관련성이 없는 것으로 나타났다.
[실시예 3의 비배당체 활성형 이소플라본 함량 분석 실험 방법 및 결과]
실시예 3의 비배당체 활성형 이소플라본 함량 분석 실험 방법은 실시예 2의 비배당체 활성형 이소플라본 함량 분석 실험 방법과 동일하며, HPLC(고성능 액체 크로마토그래피, high performance liquid chromatography)를 이용하여 비배당체의 활성형 이소플라본의 함량을 분석하였다. HPLC의 분석조건 또한 상기 실시예 2의 표 4와 같다.
시료(Sample) A, F, P, N, A-F, A-P, A-N, F-P, F-N, A-F-P 및 A-F-P-N에 포함된 비배당체 활성형 이소플라본의 함량을 분석한 결과는 하기 표 8에 나타내었다.
| 처리* | 이소플라본 함량(mg/100g) | ||||||||
| 글리코시드 | 아글리콘 | 글리코시드 | 아글리콘 | 계 | |||||
| 다이드진 | 게니스틴 | 글리시틴 | 다이드제인 | 게니스테인 | 글리시테인 | ||||
| A | 47.3 | 124.2 | 15.7 | 42.4 | 482.8 | 0.0 | 187.1 | 525.2 | 712.3 |
| F | 38.4 | 104.6 | 16.1 | 43.8 | 36.8 | 0.0 | 159.0 | 80.7 | 239.7 |
| P | 47.4 | 122.7 | 13.8 | 41.7 | 55.0 | 0.0 | 183.9 | 96.6 | 280.5 |
| N | 47.2 | 122.6 | 15.9 | 42.2 | 51.4 | 0.0 | 185.8 | 93.6 | 279.3 |
| A-F | 20.7 | 91.3 | 12.8 | 64.7 | 546.7 | 0.0 | 124.8 | 611.4 | 736.2 |
| A-P | 21.6 | 89.0 | 14.3 | 54.0 | 73.0 | 0.0 | 124.9 | 127.0 | 251.9 |
| A-N | 26.2 | 104.9 | 16 | 57.1 | 72.2 | 0.0 | 147.1 | 129.4 | 276.5 |
| F-P | 21.9 | 87.6 | 14.9 | 58.6 | 74.8 | 0.0 | 124.4 | 133.4 | 257.9 |
| F-N | 19.9 | 76.9 | 13.6 | 51.4 | 456.0 | 0.0 | 110.4 | 507.3 | 617.8 |
| A-F-P | 22.3 | 89.8 | 9.5 | 57.6 | 71.2 | 51.3 | 121.6 | 180.1 | 301.7 |
| A-F-P-N | 23.4 | 94.6 | 0.0 | 55.9 | 76.1 | 0.0 | 117.9 | 132.0 | 249.9 |
| 대조군 | 28.1 | 119.7 | 0.0 | 27.3 | 66.0 | 6.4 | 147.7 | 99.7 | 247.5 |
상기 표 8에 나타난 바와 같이, 당분해단계에서 가수분해된 전두유에 알카레이즈(Alcalase)를 첨가하되 대두 고형분 100중량부 대비 0.5중량부의 비율로 첨가한 뒤, 55℃의 온도에서 3시간 동안 가수분해 시키고, 가수분해된 가수분해물에 플라보르자임(Flavourzyme)을 첨가하되 대두 고형분 100중량부 대비 0.5중량부의 비율로 첨가한 뒤, 55℃의 온도에서 3시간 동안 가수분해 시켜서 제조된 최종 가수분해물을 동결건조하여 제조한 시료 A-F에 비배당체 활성형 이소플라본이 가장 많이 포함되어 있는 것으로 나타났다.
즉, 당분해단계에서 가수분해된 전두유에 단백질 분해 효소인 알카레이즈(Alcalase)를 첨가하여 1차로 단백질 가수분해 시킨 뒤, 1차단백질분해단계에서 가수분해된 전두유에 단백질 분해 효소인 플라보르자임(Flavourzyme)을 첨가하여 2차로 단백질 가수분해 시키는 경우에, 전두유에 포함된 비배당체 활성형 이소플라본의 함량이 가장 높은 것으로 나타났다.
따라서, 실시예 3을 통해 본 발명의 일 실시형태에 따른 활성형 이소플라본이 강화된 전두유를 제조하는 과정 중 단백질분해단계에서는 전두유에 단백질 분해 효소를 첨가하여 가수분해 시키되, 알카레이즈(Alcalase)를 첨가하여 1차로 가수분해(1차단백질분해단계(S500)) 시키고, 1차로 가수분해된 전두유에 플라보르자임(Flavourzyme)을 첨가하여 2차로 가수분해(2차단백질분해단계(S600)) 시키는 것으로 공정조건을 한정하는 것이 가장 바람직함을 확인하였다.
또한, 실시예 3을 통해 본 발명의 일 실시형태에 따른 활성형 이소플라본이 강화된 전두유를 제조하는 과정 중 1차단백질분해단계(S500)에서는 당분해단계에서 가수분해된 전두유에 단백질 분해 효소인 알카레이즈(Alcalase)를 첨가하여 50 내지 60℃의 온도에서 2 내지 5시간 동안 가수분해 시키되, 알카레이즈가 대두 고형분 100중량부 대비 0.5 내지 1중량부의 비율로 첨가되도록 공정조건을 한정하는 것이 가장 바람직함을 확인하였다.
아울러, 실시예 3을 통해 본 발명의 일 실시형태에 따른 활성형 이소플라본이 강화된 전두유를 제조하는 과정 중 2차단백질분해단계(S600)에서는 1차단백질분해단계에서 가수분해된 전두유에 단백질 분해 효소인 플라보르자임(Flavourzyme)을 첨가하여 50 내지 60℃의 온도에서 2 내지 5시간 동안 가수분해 시키되, 플라보르자임이 대두 고형분 100중량부 대비 0.5 내지 1중량부의 비율로 첨가되도록 공정조건을 한정하는 것이 가장 바람직함을 확인하였다.
결론적으로, 상기 실시예 1 내지 3을 실시한 결과를 통해, 본 발명의 일 실시형태에 따라 제조된 활성형 이소플라본이 강화된 전두유는 전두유를 제조하는 과정에서 대두 고형분을 인라인 믹서를 이용하여 가열 및 분쇄하여 제조된 전두유에 당질 분해 효소를 첨가하여 가수분해 시킴으로써 비배당체 이소플라본의 함량을 높여 전두유에 포함된 이소플라본의 체내 흡수율을 높일 수 있으며, 전두유에 단백질 분해 효소를 첨가하여 단계적으로 가수분해 시킴으로써 활성형 이소플라본 함량이 증진되는 장점이 있음을 확인하였다.
이소플라본 강화 전두유의 골다공증 개선 효능 평가 시험
본 발명의 일 실시형태에 따라 제조된 이소플라본 강화 전두유의 골다공증 개선 효과를 측정하였다.
[실시예 4의 시료 제조]
제조예 1- 이소플라본 강화 전두유(TM) 제조
전두유는 대두 고형분 함량이 10%가 되도록 공정수를 첨가하여 제조하였으며, 90℃로 설정된 자켓탱크에 투하 후 인라인믹서 시스템을 이용해 분쇄하였다. 분쇄를 마친 전두유는 50 내지 60℃의 온도 수준으로 냉각 후, 전두유에 대두 고형분 100중량부 대비 0.5중량부의 비율로 인산을 첨가하여 3시간 동안 수화시켰다(인산처리단계). 상기 수화된 전두유에 당질 분해 효소인인 테르마밀(Termamyl)을 대두 고형분 100중량부 대비 2중량부 비율로 첨가한 뒤, 80~90℃온도에서 7시간 가수분해 하였다(당분해단계). 가수분해된 전두유에 단백질 분해효소인 알카레이즈(Alcalase)를 대두 고형분 100중량부 대비 1 중량부의 비율로 첨가한 뒤 55℃에서 3시간 동안 가수분해 시켰다. 그 후에 가수분해된 가수분해물에 플라보르자임(Flavourzyme) 대두 고형분 100중량부 대비 0.5 중량부의 비율로 첨가한 뒤 55℃에서 3시간 동안 가수분해 시켜서, 이소플라본 강화 전두유(TM)를 제조하였다.
제조예 2 -일반 전두유(CM) 제조
전두유는 대두 고형분 함량이 10%가 되도록 공정수를 첨가하여 제조하였으며, 90℃로 설정된 자켓탱크에 투하 후 인라인믹서 시스템을 이용해 분쇄하여 일반 전두유(CM)를 제조하였다.
[실시예 4의 골다공증 개선 효능 평가를 위한 실험 방법 및 결과]
본 실험은 한림대학교 동물실험윤리위원회의 승인 하에 동물실험 규정에 따라 수행되었다.
(1) 실험동물
실험동물은 특정 병원체(specific pathogen free)가 없는 7주령, 난소절제 ICR 생쥐를 (주)두열바이오텍에서 구입하여 사용하였다. 1주일간의 검역 및 적응과정을 거친 뒤, 체중감소 없는 건강한 동물을 선별하여 실험에 사용하였다. 실험동물은 온도 23±3℃, 상대습도 50±10%, 환기횟수 10~15회/시간, 조명시간 12시간(08:00~20:00), 조도 150~300 Lux로 설정된 사육환경에서 사육하였다. 적응 기간 동안 실험동물은 실험동물용 고형사료((주)카길애드리퓨리나)와 음수를 자유 섭취하였다.
(2) 시험군 구성 및 시험식이 급여
1주간의 적응 기간을 거져 선별된 동물은 난괴법에 의거하여 6개의 실험군으로 분류하였다. 즉, (G1) 정상(sham-operation) 대조군, (G2) 난소절제(ovariectomy) 대조군, (G3) 난소절제 + 2% TM 함유 식이섭취군, (G4) 난소절제 + 10% TM 함유 식이섭취군, (G5) 난소절제 + 20% TM 함유 식이섭취군, (G6) 난소절제 + 20% CM 함유 식이섭취군으로 분류하였고, 각 시험군은 10마리의 실험동물을 사용하였다. 골다공증을 유도하기 위해 시험군을 분류한 후, 4주간 기본 식이(AIN-93G 식이, Research Diets Inc.)을 공굽하여 실험동물을 사육하였고, 8주간 시험물질이 함유된 시험식이를 공급하여 실험동물을 사육하였다. 시험식이는 AIN-93G 식이에 TM을 2%, 10%, 20% 혼합하거나, CM을 20% 혼합하여 제조하였다. 시험기간 동안 실험동물은 식이와 음수를 자유로이 섭취하였다. 각 시험군의 식이섭취량과 실험동물의 체중은 시험군 분류일을 0일로 하여 시험 종료일까지 1주일 간격으로 측정하였고, 그 결과를 표 9에 도시하였다.
| G1 | G2 | G3 | G4 | G5 | G6 | |
| Ovariectomy | - | + | + | + | + | + |
| 실험 식이 |
- | - | 2% TM | 10% TM | 20% TM | 20% CM |
| 0주 | 26.8±0.3 | 27.8±0.4 | 27.8±0.4 | 27.6±0.3 | 27.6±0.3 | 27.8±0.2 |
| 1주 | 29.3±0.4 | 32.1±0.6** | 31.4±0.8 | 32.8±0.4 | 32.8±0.8 | 32.8±0.9 |
| 2주 | 30.4±0.4 | 33.0±0.8** | 32.4±1.0 | 33.8±0.8# | 33.5±0.9# | 34.1±1.1# |
| 3주 | 32.8±0.6 | 35.6±1.2** | 35.2±1.2 | 36.9±0.9## | 36.4±1.2# | 36.9±1.5# |
| 4주 | 32.5±0.8 | 37.3±1.2** | 36.8±1.5 | 38.9±1.0## | 38.1±1.2# | 38.6±1.6# |
| 5주 | 34.4±0.9 | 40.2±1.2** | 38.0±1.8 | 42.3±1.1## | 42.4±1.3## | 43.0±1.6## |
| 6주 | 34.4±1.1 | 40.9±1.5** | 40.5±1.8 | 44.3±1.0### | 43.2±1.5## | 43.4±1.5## |
| 7주 | 35.4±1.1 | 42.7±1.6** | 42.2±1.9 | 45.9±1.1### | 44.6±1.6## | 46.0±1.5### |
| 8주 | 35.8±0.9 | 43.9±1.7** | 43.6±2.0 | 47.1±1.2### | 45.7±1.6## | 46.7±1.6## |
| 9주 | 35.0±1.3 | 45.4±1.7** | 42.7±2.0 | 46.9±1.3## | 46.6±1.6## | 48.0±1.5## |
| 10주 | 38.6±1.2 | 46.9±1.6* | 45.7±1.9 | 48.1±1.2 | 47.7±1.7 | 49.5±1.5 |
| 11주 | 39.3±1.3 | 47.4±1.4*** | 46.6±1.9 | 49.9±1.4 | 48.3±1.7 | 50.2±1.5 |
| 12주 | 40.9±1.7 | 49.0±1.3** | 47.4±1.9 | 51.0±1.4 | 49.2±1.6 | 51.1±1.5 |
| 체증 증가량 (g/day) |
0.17±0.02 | 0.25±0.01** | 0.23±0.02 | 0.28±0.02 | 0.26±0.02 | 0.28±0.02 |
*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 G1 그룹의 값과 상당한 차이가 있음
# p<0.05, ## p<0.01, ### p<0.001 G2 그룹의 값과 상당한 차이가 있음
표 9를 보면, 시험 전 기간 동안 난소절제한 대조군(G2)의 체중은 정상대조군(G1)에 비해 현저히 증가하였다. 2주차에서 9주차까지 10% TM(G4), 20% TM(G5), 20% CM(G6)을 섭취한 시험군은 시험물질을 섭취하지 않은 대조군(G2)에 비해 체중이 유의적으로 증가하였다. 다만, 이는 시험물질을 공급하지 않은 2주차~4주차에서에서도 G4~G6의 체중이 증가하였으므로, 이는 동물 개체 차이에 기인한 것으로 판단된다. 시험동물의 최종 체중은 난소절제를 한 모든 군(G2, G3, G4, G5 및 G6)간에 유의적인 차이가 없었고, 시험 전 기간 동안의 일일체중증가량도 유의적인 차이를 보이지 않았다. 이는 본 발명의 전두유가 실험동물의 체중에는 영향을 미치지 않는다는 것을 보여준다.
(3) 채혈 및 혈청 분리
실험동물을 희생 전 12시간 동안 절식시킨 후 트리브로모에탄올(tribromoethanol)을 3급 아밀 알코올(tertiary amyl alcohol)로 희석한 마취제를 사용하여 마취한 후 안와에서 채혈하였다. 혈액을 serum separate tube(Becton Dickinson)에 담아 30분간 실온에서 방치하고 3,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 혈청을 분리하고, 분석 전까지 -70℃에서 보관하였다.
(4) 대퇴골 적출 및 골밀도 측정
시험종료일에 채혈 후 대퇴골을 적출하여 골격에 붙어있는 근육, 인대 및 지방을 제거한 후 대퇴골의 무게를 측정하고, 골밀도측정기(PIXImusTM, GE Lunar)를 사용하여 골밀도(bone mineral density, BMD)를 측정하였다. 그 측정결과를 표 10에 나타냈다.
| G1 | G2 | G3 | G4 | G5 | G6 | |
| Ovariectomy | - | + | + | + | + | + |
| 실험 식이 |
- | - | 2% TM | 10% TM | 20% TM | 20% CM |
| 좌 (g/cm2) |
0.093±0.001 | 0.083±0.001*** | 0.085±0.002 | 0.090±0.002## | 0.088±0.002# | 0.086±0.001# |
| 우 (g/cm2) |
0.094±0.001 | 0.083±0.001**** | 0.086±0.001 | 0.090±0.001## | 0.088±0.002# | 0.085±0.002 |
| 좌+우 (g/cm2) |
0.093±0.001 | 0.083±0.001*** | 0.086±0.001 | 0.090±0.001## | 0.088±0.002# | 0.086±0.001 |
*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 G1 그룹의 값과 상당한 차이가 있음
# p<0.05, ## p<0.01, ### p<0.001 G2 그룹의 값과 상당한 차이가 있음
표 10을 보면, 모의 수술(Sham-operation)을 한 정상대조군(G1)의 대퇴골(좌+우) 골밀도는 0.093±0.001 g/cm2이고, 난소절제 대조군(G2)의 대퇴골 골밀도는 0.083±0.001 g/cm2로서, 난소절제에 의해 골밀도가 유의적으로 감소하였다. 본 발명의 전두유(TM)를 2% 섭취한 군(G3)과 일반 전두유(CM)를 20% 섭취한 군(G6)은 난소절제 대조군(G2)에 비해 골밀도 증가 결향을 나타냈으나 유의적인 차이는 없었다. 하지만 10% TM 섭취군(G4)과 20% TM 섭취군(G5)의 골밀도는 난소절제 대조군(G2)에 비해 유의적으로 증가하였다.
(5) 대퇴골 조직형태 관찰
대퇴골은 4% 파라포름 알데히드 용액(Paraform Aldehyde Solution)(PFA, Biosesang Co.)에 담가 24시간 동안 고정하였다. 고정 후, Calci-Clear Rapid(National diagnostics, Inc)에 24시간 담가 탈회한 후 일반적인 조직처리 과정에 준하여 처리하였고, 파라핀에 포매(embedding)하고 10 μm 두께로 박절(cutting)하여 절편을 만들었다. 일반적인 방법에 따라 헤마토실린 & 에오신htematocylin & eosin, H&E) 염색을 실시하고 광학현미경(Zeiss)으로 대퇴골의 조직형태학적 변화를 관찰하였다. 그 결과를 도 2에 나타냈다.
도 2를 보면, 난소절제 대조군(G2)은 정상대조군(G1)에 비해 피질골(compact bone)이 감소하고 해면골이 증가하였고, 전체적으로 조직이 다공성의 치밀하지 않은 구조를 나타냈다. 하지만, 식이에서 TM의 함량이 증가할수록 피질골의 증가와 골조직이 치밀해지는 것을 관찰할 수 있다.
(6) 혈청 내 ALP, Ca, P 및 오스테오칼신(osteocalcin) 함량 측정
시험동물의 부검 당일 채혈하여 분리한 혈청을 혈액생화학분석기(KnoeLAB 20 XT, Thermo Fisher Scientific)을 이용하여 알카라인 포스페이트(alkaline phosphate, ALP), 칼슘(Ca), 및 인(P) 함량을 측정하였다. 또한 혈청 내 오스테오칼신(osteocalcin) 함량은 오스테오칼신 ELISA 키트(osteocalcin ELISA Kit, Elabscience Birtechnology)를 사용하여 제조회사가 제시한 방법에 따라 측정하였다. 그 결과를 표 11에 나타냈다.
| G1 | G2 | G3 | G4 | G5 | G6 | |
| 난소절제(Ovariectomy) | - | + | + | + | + | + |
| 실험 식이 |
- | - | 2% TM | 10% TM | 20% TM | 20% CM |
| Ca (mg/dL) |
5.34±0.13 | 4.96±0.14 | 5.17±0.12 | 5.69±0.10 | 5.58±0.10 | 5.55±0.08 |
| P(mg/dL) | 5.07±0.21 | 4.38±0.23 | 4.99±0.26 | 5.18±0.19 | 4.68±0.22 | 4.93±0.31 |
| ALP (U/L) |
129.6±6.9 | 142.6±5.7 | 127.9±7.0 | 114.1±4.2### | 114.5±5.1# | 124.3±1.4## |
| 오스테오칼신 (ng/mL) |
46.71±5.51 | 28.61±3.61* | 24.60±2.87 | 37.76±2.87 | 46.68±5.42# | 40.66±4.44# |
*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 G1 그룹의 값과 상당한 차이가 있음
# p<0.05, ## p<0.01, ### p<0.001 G2 그룹의 값과 상당한 차이가 있음
본 발명의 전두유가 체내 무기질 항상성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 혈청 내 Ca와 P의 함량을 측정하였다. 표 11을 보면, 혈청 내 Ca와 P의 함량은 난소절제 대조군(G2)에서 정상 대조군(G1)에 비해 감소 경향을 나타내었고 시험물질 투여군(G3, G4, G5)의 혈청 내 Ca과 P 함량은 난소절제 대조군(G2)에 비해 증가하는 경향을 보였으나, 유의적인 차이는 나타내지 않았다.
ALP는 골아세포에서 분비되는 효소로 조골세포의 활성을 반영하여 골 형성의 중요한 지표가 된다. 난소절제로 골다공증이 유발되면 골 교체가 증가하여 조골세포의 활성이 증가하여 혈청 ALP가 증가하는 것으로 보고되고 있다.
표 11을 보면, 혈청 ALP 활성은 정상 대조군(G1)에 비해 난소절제 대조군(G2)에서 유의적으로 증가하였고 시험물질 투여군(G3, G4, G5)의 혈청 ALP 활성은 난소 절제 대조군(G2)에 비해 유의적으로 감소하였다. 또한, 동일 함량(20%)에서, 본 발명의 전두유(TM)를 식이한 경우 일반 전두유(CM)를 식이한 경우보다 혈청 ALP 활성이 유의적으로 낮았다.
오스테오칼신(osteocalcin)은 골아 상아질에 특이성을 가지는 단백질로서 조골세포에서 만들어져 조골세포의 활성을 반영하여 골 형성의 중요한 지표이다. 표 11을 보면, 혈청내 osteocalcin의 함량은 정상 대조군(G1)에 비해 난소절제 대조군(G2)에서 유의적으로 감소하였다. 10% TM, 20% TM 및 20% CM 섭취군의 혈청 내 오스테오칼신 함량은 난소절제 대조군(G2)에 비해 유의적으로 증가하였으며, 20% TM 섭취군의 혈청 내 오스테오칼신 함량이 가장 높게 나타났다.
상기 실시예 4의 결과를 통해, 본 발명의 활성형 이소플라본이 강화된 전두유는 난소절제에 의해 유도된 골다공증 개선에 우수한 효과를 가지며, 뼈 건강 기능성 소재로 사용가능하다는 것을 알 수 있다.
이상, 실시예를 들어 본 발명을 상세하게 설명하였으나, 본 발명은 상기 구현예에 한정되지 않으며, 여러 가지 다양한 형태로 변형될 수 있고, 본 발명의 기술적 사상 내에서 당 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의하여 여러 가지 많은 변형이 가능함이 명백하다. 또한, 청구범위의 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 형태의 치환, 변형 및 변경이 가능할 것이며, 이 또한 본 발명의 범위에 속한다고 할 것이다.
Claims (9)
- 대두 고형분 100중량부에 대해 물을 800 내지 1000중량부의 비율로 첨가한 뒤, 90 내지 92℃의 온도로 가열하면서 분쇄 및 교반하여 전두유를 제조하는 전두유제조단계;
상기 전두유제조단계에서 제조된 전두유를 50 내지 60℃의 온도가 되도록 냉각시키는 냉각단계;
상기 냉각단계에서 냉각된 전두유에 인산(Poly phosphate)을 대두 고형분 100중량부 대비 0.5 내지 2중량부로 첨가하여 2 내지 4시간 동안 수화시키는 인산처리단계;
상기 인산처리단계에서 수화된 전두유에 당질 분해 효소인 테르마밀(Termamyl)을 대두 고형분 100중량부 대비 1 내지 2중량부로 첨가하여 80 내지 90℃의 온도에서 3 내지 7시간 동안 가수분해시키는 당분해단계;
상기 당분해단계에서 가수분해된 전두유에 단백질 분해 효소인 알카레이즈(Alcalase)를 대두 고형분 100중량부 대비 0.5 내지 1중량부로 첨가하여 50 내지 60℃의 온도에서 2 내지 5시간 동안 가수분해시키는 1차단백질분해단계;
상기 1차단백질분해단계에서 가수분해된 전두유에 단백질 분해 효소인 플라보르자임(Flavourzyme)을 대두 고형분 100중량부 대비 0.5 내지 1중량부로 첨가하여 50 내지 60℃의 온도에서 2 내지 5시간 동안 가수분해시키는 2차단백질분해단계; 및
상기 2차단백질분해단계에서 가수분해된 전두유를 95 내지 100℃의 온도에서 30 내지 60분 동안 가열하여 효소작용을 억제시키는 실활단계;가 포함되는 것을 특징으로 하는 활성형 이소플라본이 강화된 전두유의 제조방법. - 청구항 1에 있어서,
상기 전두유제조단계에서는,
대두 고형분을 물에 2 내지 5시간 동안 침지하여 불린 후, 불린 대두 고형분에 물을 첨가하되 물은 대두 고형분 100중량부에 대비 800 내지 1000중량부의 비율로 첨가하고, 물을 첨가한 불린 대두 고형분을 인라인 믹서 내에서 90 내지 92℃의 온도로 가열하면서 2 내지 4시간 동안 분쇄 및 교반하여 전두유를 제조하는 것을 특징으로 하는 활성형 이소플라본이 강화된 전두유의 제조방법. - 청구항 1 또는 2에 있어서,
상기 활성형 이소플라본이 강화된 전두유는 골다공증 개선 효과가 있는 것을 특징으로 하는, 활성형 이소플라본이 강화된 전두유의 제조방법. - 청구항 1 또는 2의 방법으로 제조되는 것을 특징으로 하는 활성형 이소플라본이 강화된 전두유.
- 청구항 4에 있어서,
상기 전두유는 골다공증 개선 효과가 있는 것을 특징으로 하는, 활성형 이소플라본이 강화된 전두유. - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
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