KR101945868B1

KR101945868B1 - 풍란 추출물의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 풍란 추출물, 및 상기 풍란 추출물을 포함하는 화장료 조성물 및 약학 조성물

Info

Publication number: KR101945868B1
Application number: KR1020160150858A
Authority: KR
Inventors: 권오근; 백윤수; 박부희; 박필만; 안혜련
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2016-11-14
Filing date: 2016-11-14
Publication date: 2019-02-11
Also published as: KR20180053828A

Abstract

풍란 추출물의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조되어 항산화 활성 및 항염증 효능을 갖는 풍란 추출물, 및 상기 풍란 추출물을 포함하는 화장료 조성물 및 약학 조성물에 관한 것이다.

Description

풍란 추출물의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 풍란 추출물, 및 상기 풍란 추출물을 포함하는 화장료 조성물 및 약학 조성물 {NEOFINETIA FALCATA EXTRACTS, PREPARING METHOD OF THE SAME, AND COSMETIC COMPOSITION AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION INCLUDING THE SAME}

본원은, 풍란 추출물의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조되어 항산화 활성 및 항염증 효능을 갖는 풍란 추출물, 및 상기 풍란 추출물을 포함하는 화장료 조성물 및 약학 조성물에 관한 것이다.

피부는 외부 환경에 직접적으로 노출되는 신체 부위로서, 과도한 자외선이나 오염물질 등에 노출되면 홍반, 부종, 가려움 등의 피부 자극 및 염증 반응이 유발된다. 이러한 피부 트러블은 미관상 문제가 될 뿐만 아니라, 염증 반응과정에서 생성되는 물질들이 부수적으로 색소 침착을 일으키고, 피부 탄력섬유의 붕괴를 촉진시켜 피부 주름을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 또한, 피부 손상은 자유 라디칼과 관련된 것으로 알려져 있다.

상기 자유 라디칼은 세포를 파괴하거나 피부 진피층의 결합조직을 절단하거나 교차 결합을 일으켜 주름형성, 피부암, 세포 살상, 류마티즘성 관절염, 아토피성 피부염, 및 여드름 등 여러 가지 문제를 발생시킨다. 상기 자유 라디칼은 백혈구의 식작용, 미토콘드리아에서의 ATP 생산과정 중 전자 전달계, 미엘로퍼 옥사이드(Myeloper Oxide, MPO)의 작용, 자외선, 담배, 정상적인 대사 과정, 스트레스, 공해 물질, 및 세균 등에 의해 생성되는 것으로 알려져 있다. 상기 백혈구의 식작용이란 세포체가 이물질 또는 박테리아 등을 자기 체내에 받아들여서 이것을 분해, 무해화하는 작용을 의미한다.

물론 인체에는 항산화 물질(라디칼 소거제)인 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 (superoxide dismutase, SOD), 카탈라아제, 비타민 E, 비타민 C, 및 유비퀴놀(uviquinol) 등이 있지만, 나이, 공해, 자외선, 스트레스에 의해 항산화 체계가 무력화되고, 자유 라디칼이 점차 증가하게 된다. 상기 증가된 자유 라디칼은 진피의 결합조직인 콜라겐, 엘라스틴, 히아루론산을 파괴하여 피부의 일정 부위 침하 현상(주름)을 일으키며, 또한, 세포막의 지질 부분을 산화시켜 세포의 파괴 현상이 발생되어 피부염, 여드름, 피부암과 같은 질병을 유발하게 되는 것이다.　 상기 자유 라디칼은 멜라닌 형성과정 중 자발적인 산화반응(도파퀴논→멜라닌)에 관여하여 기미, 주근깨 등의 원인 및 주름생성의 원인이 되기도 한다.

염증 반응은 해로운 주위 환경, 즉 세균과 같은 외부 이물질의 침입과 기계적 손상으로부터 생체를 보호하는 생리적인 반응이다. 이 염증 반응은 여러 종류의 다핵형 백혈구와 면역 물질의 증가를 초래하고, 이들 세포들은 염증성 세포 산물인 다양한 종류의 단백질 분해효소와 사이토카인(cytokine)을 분비함으로써 치료 및 방어를 할 수 있게 한다. 엘라스타제, 히알루리니다제, 및 리폭시게나아제와 같은 효소들은 염증 시 생성되는 단백질 및 지질 분해 효소들로 잘 알려져 있다.

한편, 이들의 작용은 인접해 있는 조직 세포와 비 조직세포 성분들에게도 손상을 일으켜, 만성 염증과 같이 심각한 조직 손상을 가져올 수 있다. 이처럼 과다 염증은 단백질 분해 효소들에 의해 세포 및 결합조직에 손상을 가하고, 이러한 결합 조직의 손상은 피부의 탄력을 감소시켜 주름의 원인이 될 뿐 아니라, 세포의 재생 및 증식에도 나쁜 영향을 미치게 되어 빠른 피부노화를 초래하게 되고, 피부에 국소적인 홍반과 부어오름이 나타나게 된다. 만일, 결합조직이 심각하게 손상되고 염증반응이 지속된다면 정상적인 조직구조와 기능을 회복시키는 일은 훨씬 어렵게 된다. 각종 스트레스에 의한 피부 자극 및 염증을 감소시키고, 화장품 사용으로 인한 부작용을 줄이기 위해서는, 항염증, 항산화 및 피부자극 완화 효능이 있는 물질을 개발하는 것이 절실히 요구되며, 이와 함께 인체에 부작용이 적은 천연물의 유용성분의 성분 파괴를 최소화면서 이를 효과적으로 추출할 수 있는 방법이 함께 필요하다.

이와 관련하여, 대한민국 등록특허 제1464745호는 난초 발효 추출물을 함유하는 피부 기능 개선 조성물에 관해서 개시하고 있다.

그러나, 자유 라디칼과 염증에 의한 피부 트러블의 개선을 위해 라디칼 소거능 등 정확한 분석을 통한 항산화 활성 및 항염증 효과가 우수하고, 부작용이 없는 천연 추출물의 개발, 및 상기 추출물을 함유하는 화장료에 대해서는 보고된 바 없다.

본원은, 풍란 추출물의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조되어 항산화 활성 및 항염증 효능을 갖는 풍란 추출물, 및 상기 풍란 추출물을 포함하는 화장료 조성물 및 약학 조성물을 제공하고자 한다.

그러나, 본원이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본원의 제 1 측면은, 하나 이상의 용매를 혼합한 혼합 용매를 제조하는 단계; 및, 상기 혼합 용매로 풍란을 추출하여 풍란 추출물을 수득하는 단계를 포함하는 항염증용 풍란 추출물의 제조 방법으로서, 상기 풍란 추출물은 풍란 에탄올 추출물을 포함하는 것이고, 상기 풍란 에탄올 추출물을 제조하는 것은, 30%의 물, 및 70%의 에탄올을 포함하는 혼합 용매로 풍란을 추출하여 풍란 추출물을 수득하는 단계; 수득된 상기 풍란 추출물을 여과하여 추출물에 포함되는 잔여물을 제거하는 단계; 진공 감압 농축기를 이용하여 상기 풍란 추출물을 농축하는 단계; 및, 농축된 상기 풍란 추출물을 동결건조기를 이용하여 건조하는 단계를 포함하는 것이며, 상기 풍란 추출물의 62.5 mg/mL 내지 1,000 mg/mL 농도에 따라 일산화질소(NO) 생성 억제 효과가 증가되는 항염증 효과를 가지는 것을 특징으로 하는, 항염증용 풍란 추출물의 제조 방법을 제공한다.

본원의 제 2 측면은, 본원의 제 1 측면에 따른 제조 방법에 의해 제조된 항염증용 풍란 추출물을 제공한다.

본원의 제 3 측면은, 본원의 제 2 측면에 따른 풍란 추출물을 유효성분으로 포함하는, 항염증용 화장료 조성물을 제공한다.

삭제

본원의 일 구현예에 의하면, 풍란 추출물은 항산화 활성을 나타내기 때문에, 산화작용에 의해 유발되는 질환의 예방, 개선, 또는 치료를 위한 화장품 및 의약품 등에 이용될 수 있다.

또한, 상기 풍란 추출물은 항염증 효능을 나타내므로, 이를 통해 화장품 및 의약 분야에서 다양한 활용이 가능하다.

도 1의 (a) 및 (b)는 각각, 본원의 일 실시예에 따른 재배양된 세포의 생존력 및 풍란 추출물의 항염증 효과를 나타낸 그래프이다.

아래에서는 첨부한 도면을 참조하여 본원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본원을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.

본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 “연결”되어 있다고 할 때, 이는 “직접적으로 연결”되어 있는 경우뿐 아니라, 그 중간에 다른 소자를 사이에 두고 “전기적으로 연결”되어 있는 경우도 포함한다.

본원 명세서 전체에서, 어떤 부재가 다른 부재 “상에” 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 부재가 다른 부재에 접해 있는 경우뿐 아니라 두 부재 사이에 또 다른 부재가 존재하는 경우도 포함한다.

본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 “포함” 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 “약”, “실질적으로” 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 “~(하는) 단계” 또는 “~의 단계”는 “~ 를 위한 단계”를 의미하지 않는다.

본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 “이들의 조합(들)”의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.

본원 명세서 전체에서, “A 및/또는 B”의 기재는 “A 또는 B, 또는 A 및 B”를 의미한다.

본원 명세서 전체에서, "풍란(neofinetia falcata)"은 외떡잎식물 난초목 난초과의 여러해살이 풀로서, 조란이라고도 한다. 나무줄기와 바위 겉에 붙어서 자라는 착생란으로서 현재는 자생지인 남부 해안가에서도 보기 힘들어진 귀한 식물이다. 남해안 일대, 제주도와 다도해 도서, 서해안 홍도에서 자생하는 한국 고유의 난으로 생명력이 강해 수분함량이 많은 해안가 숲 속, 나무, 바위에 붙어산다. 상기 풍란의 뿌리는 굵은 끈 모양인데 바위나 나무의 양분, 수분을 빨아들이는 착생란 특유의 강한 생명력을 보여주며, 난 중 유일하게 뿌리를 감상할 수 있다. 잎의 길이는 10 cm 이하이고 두터우며, 7 월에는 겹친 잎 사이에서 초여름 꽃대가 뻗어 순백의 작은 꽃을 여러 송이 피우는데 그 꽃은 달콤하고 그윽한 향기를 낸다.

본원 명세서 전체에서, "플라보노이드(flavonoid)"는 그리스어로 노란색을 의미하는 플라부스(flavus)에서 유래된 것으로서, 플라본(flavone)을 기본 구조로 갖는 식물 색소를 일컫는다. 비타민 P(투과성 비타민) 또는 비타민 C₂(비타민 C의 상승제)라고도 한다. 동물에는 비교적 적고 식물의 잎, 꽃, 뿌리, 열매, 및 줄기 등에 많이 함유되어 있다. 플라보노이드는 페닐기 2개가 C₃사슬을 매개하여 결합한 C₆-C₃-C₆형 탄소골격구조이며, 이것이 여러 당류와 에테르 결합을 통해 글루코시드의 형태로 존재하는 경우가 많다. 가열하여 당이 분리되면 색깔이 더욱 진해지는데, 감자, 고구마, 옥수수의 경우가 그 예이다. 항균, 항암, 항바이러스, 항알레르기, 및 항염증 활성을 지니며, 독성은 거의 나타나지 않는 것으로 보고되고 있다. 또한 생체 내 산화작용을 억제하는 작용을 한다.

본원 명세서 전체에서, "항산화"는 세포 내 대사 또는 자외선의 영향으로 인한 산화적 스트레스에 따라 반응성이 높은 자유 라디칼(free radical) 또는 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)에 의한 세포의 산화를 억제하는 것을 의미하며, 자유 라디칼 또는 활성산소종을 제거하여 이로 인한 세포의 손상이 감소되는 것을 포함한다.

본원 명세서 전체에서, ‘항염증’은 염증을 억제하는 것을 의미하며, 상기 염증은 어떤 자극에 대한 생체 조직의 방어반응의 하나로서, 조직 변질, 순환 장애와 삼출, 조직 증식의 세 가지를 병발하는 복잡한 병변을 의미한다. 보다 구체적으로, 상기 염증은 선천성 면역의 일부이며 다른 동물에서처럼 인간의 선천성 면역은 병원체에 특이적으로 존재하는 세포 표면의 패턴을 인식한다. 식세포는 그런 표면을 가진 세포를 비자기로 인식하고 병원체를 공격한다. 만일 병원균이 신체의 물리적 장벽을 깨고 들어온다면 염증반응이 일어난다. 염증반응은 상처부위에 침입한 미생물들에 대한 적대 환경을 만드는 비특이적인 방어작용이다. 염증반응에서, 상처가 나거나 외부 감염체가 체내로 들어왔을 때, 초기단계 면역반응을 맡고 있는 백혈구들이 몰려들어 사이토카인을 발현한다. 따라서 세포 내 사이토카인의 발현양이 염증반응 활성화의 지표가 된다. 염증과 관련된 피부질환의 예로는 아토피 피부염, 건선, 방사선, 화학물질, 화상 등에 의해 촉발되는 홍반성 질환, 산 화상, 수포성 피부병, 태선 모양 종류 질환, 알레르기에 기한 가려움증, 지루성 습진, 장미 여드름, 심상성 천포창, 다형 삼출성 홍반, 결절 홍반, 귀두염, 음문염, 원형 탈모증과 같은 염증성 모발 손실, 또는 피부 T-세포 림프종을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본원의 구현예 및 실시예를 상세히 설명한다. 그러나, 본원이 이러한 구현예 및 실시예와 도면에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 제 1 측면은, 하나 이상의 용매를 혼합한 혼합 용매를 제조하는 단계; 및, 상기 혼합 용매로 풍란을 추출하여 풍란 추출물을 수득하는 단계를 포함하는, 풍란 추출물의 제조 방법을 제공한다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 용매는 물, 에탄올, n-펜탄, 디에틸에테르, 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 본원의 일 구현예에 있어서, 상기 풍란을 추출하는 혼합 용매에 따라 수득되는 풍란 추출물 유효 성분의 추출 정도 및 손실 정도가 차이 날 수 있기 때문에, 적절한 혼합 용매를 선택해야 한다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 풍란 추출물은 풍란 에탄올 추출물 또는 풍란 에센셜 오일을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 풍란 에탄올 추출물을 제조하는 것은, 혼합 용매로 풍란을 추출하여 풍란 추출물을 수득하는 단계; 수득된 상기 풍란 추출물을 여과하여 추출물에 포함되는 잔여물을 제거하는 단계; 진공 감압 농축기를 이용하여 상기 풍란 추출물을 농축하는 단계; 및, 농축된 상기 풍란 추출물을 동결건조기를 이용하여 건조하는 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 혼합 용매는 바람직하게는 30%의 물, 및 70%의 에탄올을 포함할 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 풍란 에센셜 오일을 제조하는 것은, 연속 수증기 증류 추출 장치에서 재증류한 혼합 용매로 풍란을 추출하는 단계; 상기 추출된 풍란에 무수 Na₂SO₄를 첨가하여 수분을 제거하여 풍란 에센셜 오일을 수득하는 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 혼합 용매는 바람직하게는 50%의 n-펜탄, 및 50%의 디에틸에테르를 포함할 수 있다.

본원의 제 2 측면은, 본원의 제 1 측면에 따른 제조 방법에 의해 제조되어 항산화 활성 및 항염증 효능을 갖는 풍란 추출물을 제공한다.

본원의 일 구현예에 있어서, 본원의 제 1 측면에 따른 제조 방법에 의해 제조된 상기 풍란 추출물은 항산화 활성 및 항염증 효능이 우수하여 화장료 조성물 및/또는 약학 조성물에 적용하기 적합할 수 있다.

본원의 제 3 측면은, 본원의 제 2 측면에 따른 풍란 추출물을 함유하는, 화장료 조성물을 제공한다.

본원의 제 3 측면에 따른 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분인 풍란 추출물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료, 색소, 또는 향료와 같은 통상적인 보조제, 및 담체를 포함할 수 있다.

본원의 제 3 측면에 따른 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 또는 스프레이로 제형화 되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 팩, 아이크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이, 또는 파우더의 제형으로 제조되는 것일 수 있다.

본원의 제 4 측면은, 본원의 제 2 측면에 따른 풍란 추출물을 함유하는, 약학 조성물을 제공한다.

본원의 제 4 측면에 따른 약학 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분인 풍란 추출물 이외에, 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효 성분을 1 종 이상 함유할 수 있다. 즉, 공지의 항산화 및 항염증 성분을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 추가적인 항산화 및 항염증 성분을 포함할 경우, 본원의 제 4 측면에 따른 약학 조성물의 항산화 및 항염증 효과가 더욱 증진될 수 있다. 더불어, 상기와 같이 성분을 추가할 경우 복합 사용에 따른 안정성 및 제형화의 용이성, 유효 성분들의 안정성을 고려할 수 있다.

또한, 본원의 제 4 측면에 따른 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 담체는 완충액, 주사용 멸균수, 일반 식염수 또는 인산염 완충 식염수, 슈크로스, 히스티딘, 염, 및 폴리솔베이트 등과 같은 여러 성분을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 제 4 측면에 따른 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있으며, 일반 의약품 제제의 형태, 예를 들어, 임상 투여 시 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

이하, 본원의 실시예를 상세히 설명한다. 그러나, 본원이 이에 제한되지 않을 수 있다.

[ 실시예 ]

풍란 추출물을 제조하기 위하여, 상기 풍란은 서울특별시 서초구 양재동 화훼공판장에서 구입하였고, 전북 완주군 이서면 국립원예특작과학원 화훼과 난선인장연구실에서 검정하였으며, 유전자원으로 등록하였다. 상기 풍란을 70% 에탄올 용매를 사용하여 추출하였다. 구체적으로는 상기 풍란 꽃(생체) 120 g을 2 L 용기에 넣고, 2차 대사 산물을 효율적으로 추출하기 위해 물과 에탄올 혼합용매(3:7, v/v)를 제조하여 추출용매로 추출을 진행하였다. 3 일(72 시간) 동안 교반기에서 25℃로 추출을 진행한 후, 거름종이(filter paper No.2)를 사용하여 추출액에 포함되어 있는 잔사물을 제거하였다. 이어서, 진공 감압농축기를 이용하여 시료 농축을 진행하였고, 농축된 시료를 동결건조기를 이용하여 건조하였다(수율 5.77%).

또한, 풍란 에센셜 오일은 연속수증기증류추출장치(Likens & Nickerson type simultaneous steam distillation & extraction apparatus, SDE, Normschliff, Wertheim, Germany)를 이용하여 추출하였다. 구체적으로는 상기 연속수증기증류추출장치에서 재증류한 n-펜탄(n-pentane)과 디에틸에테르(diethylether)의 혼합용매(1:1, v/v) 200 mL를 사용하여 상압 하에서 3 시간 동안 추출하였다. 추출 후, 추출용매에 무수 Na₂SO₄를 첨가하여 하룻밤 동안 방치하여 수분을 제거함에 따라 실험에 사용할 에센셜 오일을 수득하였다(수율 0.13%).

상기 풍란 꽃 70% 에탄올 추출물 및 에센셜 오일 시료는 난선인장연구실 보관고(-4℃)에 보관하였다.

[ 실험예 ]

1. 총페놀 함량 분석

총페놀 함량은 폴린-시오칼토의 페놀 시약(Folin-Ciocalteu’s phenol reagent)을 이용한 발색법(singleton and rossi, 1965)을 변형하여 이용하여 분석하였다. 추출물 200μL에 증류수 2.5 mL와 200 μL의 폴린-시오칼토의 페놀 시약을 혼합 후 6분간 상온에서 반응시켰다. 혼합한 용액에 7% Na₂CO₃ 용액을 2 mL 첨가하였다. 총 90 분 동안 반응시킨 후 750 nm에서 흡광도를 측정하였고, 갈산(gallic acid)을 이용하여 표준곡선의 검량선을 작성하였다. 풍란 추출물에 대한 총페놀 함량은 mg gallic acid equivalents(GAE)·100 g^- ¹dry weight으로 나타내었다. 하기 표 1에 개시된 바와 같이, 풍란 추출물의 총페놀 함량은 에탄올 추출물과 에센셜 오일에서 각각 470.20 ± 6.59 mg gallic acid equivalents(GAE)·100 g^-1, 1.80 ± 0.11 mg GAE·100 g^-1로 나타났다.

2. 총플라보노이드 함량 분석

총플라보노이드 함량은 AlCl₃용액을 이용한 발색법(Zhishen et al., 1999)을 이용하여 측정하였다. 추출물 0.5 mL에 증류수 3.2 mL을 첨가한 후 5% NaNO₂ 용액 0.15 mL을 더하여 5 분간 반응시켰다. 이어서 10% AlCl₃용액 0.15 mL을 첨가하여 다시 1 분간 반응시킨 후, 1 M NaOH를 넣고 혼합하여 곧바로 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총플라보노이드 함량은 카테킨(catechin)을 이용하여 만들어진 표준곡선을 이용하였고, 풍란 추출물에 대한 총플라보노이드 함량은 mg catechin equivalents(CAE)·100 g^- ¹dry weight로 나타내었다. 하기 표 1에 개시된 바와 같이, 풍란 추출물의 총플라보노이드 함량은 에탄올 추출물과 에센셜 오일에서 각각 51.23 ± 0.65 mg CAE·100 g^-1, 0 mg CAE·100 g^-1로 나타났다.

[표 1]

3. DPPH 라디칼 소거 활성 분석

DPPH 라디칼 소거능 실험은 Brand-Williams et al.(1995)의 방법을 변형하여 측정하였다. 80%(v/v) 수용성 메탄올을 사용하여 100 μM의 DPPH 라디칼 용액을 제조한 후에, 이 DPPH 라디칼 용액을 80%(v/v) 수용성 메탄올을 이용하여 517 nm에서 0.650 ± 0.020의 흡광도로 희석하였다. 각 시료 50 μL와 DPPH 라디칼 용액 2.95 mL을 첨가하여 23℃에서 30 분간 빛이 차단된 장소에서 반응시킨 후 DPPH 라디칼 감소량을 517 nm에서 측정하였다. 상기 DPPH 라디칼 소거능을 통한 풍란 추출물 함량에 대한 항산화 활성은 127.44 ± 4.62 mg VCE·100 g^-1dry weight로 나타내었다.

4. ABTS 라디칼 소거 활성 분석

ABTS 라디칼을 ABTS 라디칼 소거능 실험을 이용하여 측정하였다(Kim et al., 2003). 1.0 mM AAPH에 2.5 mM ABTS와 PBS 용액 100 mL를 섞어서 70℃ 항온수조에서 30 분간 반응시켜 ABTS 라디칼 용액을 만들고 완충용액인 PBS 용액을 이용하여 734 nm에서 0.650 ± 0.020의 흡광도로 ABTS 라디칼 용액을 희석하였다. ABTS 라디칼 용액 980 μL와 시료 20 μL를 10 분간 반응 후 37℃에서 734 nm에서 흡광도 감소를 측정하였다. 상기 ABTS 라디칼 소거능을 통한 풍란 추출물 함량에 대한 항산화 활성은 227.73 ± 8.32 mg vitamin C equivalents(VCE)·100 g^-1dry weight로 나타내었다.

5. ORAC 라디칼 소거 활성 분석

과산화 라디칼(peroxy radical)의 생성과 소멸에 의한 형광 감소율을 측정하는 Huang et al.(2002)의 방법을 사용하여 ORAC 라디칼 소거능 실험을 수행하였다. 풍란 추출물 시료 및 비타민 C 표준용액의 제조에는 인산 완충액(phosphate buffer)(75 mM K₂HPO₄, 75 mM KH₂PO₄)를 사용하였다. 96 well에 시료 또는 표준용액 25 μL와 81.6 nM 형광 용액 150 μL를 혼합하고 37℃에서 3 분간 교반한(shaking) 후, 10 분간 배양(incubation)시켰다. 이 혼합용액에 153 mM의 AAPH 25 μL를 첨가한 뒤 형광광도계(microplate reader, Tecan infinite M200, San Jose, CA, USA)로 90 분간 매 분마다 측정하였다. 상기 형광광도계의 여기(excitation)는 485 nm, 방출(emission)은 520 nm로 설정하였다. 비타민 C의 곡선하면적(area under the curve) 표준곡선을 이용하여 풍란 추출물 항산화 활성은 544.31 ± 2.23 mg VCE·100 g^-1fresh weight로 나타내었다.

[표 2]

표 2에 개시된 바와 같이, 풍란 추출물의 항산화 활성은 DPPH, ABTS, 및 ORAC법을 사용하여 측정한 결과 에탄올 추출물에서 각각 127.44 ± 4.62 mg vitamin C equivalents(VCE)·100 g^-1, 227.73 ± 8.32 mg VCE·100 g^-1, 및 544.31 ± 2.23 mg VCE·100 g^- ¹으로 나타났고, 에센셜 오일에서 각각 1.14 ± 0.00 mg VCE·100 g^-1, 4.03 ± 0.08 mg VCE·100 g^-1, 및 8.17 ± 0.15 mg VCE·100 g^- ¹으로 나타났다.

6. 산화 질소 생성량 측정

RAW 264.7 cell은 DMEM 배지를 이용하여 2.5 × 10⁵cells/mL로 조절한 후 24 well plate에 접종하고 5% CO₂인큐베이터에서 20 시간 전 배양하였다. 세포에 1 μg/mL의 LPS와 62.5 μg/mL, 125 μg/mL, 250 μg/mL, 500 μg/mL, 및 1,000 μg/mL의 추출물을 처리하여 24 시간 재배양하였다. 상기 세포의 생존력은 도 1의 (a)에 도시하였다. 배양액의 상층액을 수득한 후, 동량의 그리스 시약(10 mg/mL 설파닐아미드:1 mg/mL 나프틸렌디아민 디하이드로클로라이드, 1:1)을 첨가하여 실온에서 10 분 동안 반응시키고, 마이크로플레이트 리더를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 상기 세포 배양액 내 일산화질소(NO)의 농도는 아질산 나트륨(sodium nitrite, NaNO₂)의 농도별 표준곡선과 비교하여 산출하였다. 도 1의 (b)에 도시된 바와 같이, 풍란 추출물의 항염증 효과가 농도 의존적(62.5 mg/mL 내지 1,000 mg/mL)으로 나타나 NO 생성 억제 효과를 나타냈다.

전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

하나 이상의 용매를 혼합한 혼합 용매를 제조하는 단계; 및,
상기 혼합 용매로 풍란을 추출하여 풍란 추출물을 수득하는 단계
를 포함하는 항염증용 풍란 추출물의 제조 방법으로서,
상기 풍란 추출물은 풍란 에탄올 추출물을 포함하는 것이고,
상기 풍란 에탄올 추출물을 제조하는 것은,
30%의 물, 및 70%의 에탄올을 포함하는 혼합 용매로 풍란을 추출하여 풍란 추출물을 수득하는 단계;
수득된 상기 풍란 추출물을 여과하여 추출물에 포함되는 잔여물을 제거하는 단계;
진공 감압 농축기를 이용하여 상기 풍란 추출물을 농축하는 단계; 및,
농축된 상기 풍란 추출물을 동결건조기를 이용하여 건조하는 단계를 포함하는 것이며,
상기 풍란 추출물의 62.5 mg/mL 내지 1,000 mg/mL 농도에 따라 일산화질소(NO) 생성 억제 효과가 증가되는 항염증 효과를 가지는 것을 특징으로 하는, 항염증용 풍란 추출물의 제조 방법.
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제 1 항에 따른 제조 방법에 의해 제조된, 항염증용 풍란 추출물.
제 8 항에 따른 풍란 추출물을 유효성분으로 함유하는, 항염증용 화장료 조성물.
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